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Parte 1 – PCR en Tiempo Real

Adriana Freire Machado

Febrero/2010

Eppendorf do Brasil


Aplicaciones

• Cuantificación absoluta y relativa

• Perfil de la expresión génica

• Determinación del número de copias de genes

• Discriminación alélica

• Tasa de SNP

• Identificación génica

• Validación de los datos de Microarrays

• Detección de patógenos

• Cuantificación de carga viral

• Identificación y cuantificación de transgenes

Realplex


Eppendorf do Brasil

PCR Basic Technology

Reacíón da polimerase en cadena (PCR)

T T T TT A AAC C CC C

A A A AT TTC C C C CCT

A

A

G G G G GG

G G GG G

Pol

Reativos de PCR

• Template/ DNA target

• Primer (2)

• dNTPs

• DNA polimerasa (encima)

• Tampon de la reacción

(KCl, Mg2+, pH 8.3)

Realplex


Eppendorf do Brasil


94°C

~55°C

PCR



A

A

G G G G GG

G G GG G5‘ 3‘

5‘3‘

Separação

das fitas

“Anealling” do primer

72°C

Elongação pela

polimerase

Etapas do PCR

Realplex


Eppendorf do Brasil


Amplificación de PCR

Amplificación

Exponencial

21 =

2 copies22 =

4 copies 8 copies 16 copies

Realplex


Eppendorf do Brasil

PCR Convencional - Prós e Contras

Ventajas de la PCR

•Sensibilidad

•Especificidad

Desventajas de la PCR

•Quantificaçión no es tan fácil

•Complexa manipulación pós PCR

Realplex


Eppendorf do Brasil

PCR quantitativa - Prós y Contras

PCR quantitativa:

Combina amplificación de PCR y detección fluorescente

Detección sensíble e específica

•Quantificación fácil y precisa

•Sem manipulación pós PCR „Detecção en tubo“

Possui todos los benefícios de PCR convencional y

compensa sus desventajas!



Reacción de la polimerasa en cadena (PCR)

Reativos de PCR

• Template/ DNA target

• Primer (2)

• dNTPs

• DNA polimerasa (encima)

• Tampon de la reacción

(KCl, Mg2+, pH 8.3)



A

A

G G G G GG

G G GG G

Pol

+marcador

fluorescente


Eppendorf do Brasil

Marcadores del DNA

Ej. SYBR Green I

Excitación 494 nm

Formatos de detección I

Emisión 521 nm


Sistemas basados en hibridización de sonda

•Hibridización de las sondas internas en el produto del PCR

•Interacción de los dos fluorocromos a una corta distancia:

FRET

Fluorescence Resonance Energy Transfer

(Resonancia de la fluorescencia por transferencia energética)

Formatos de Detección II

T A G C C T G CA G A G

R QReporter Quencher

Dyes

(JOE,VIC,FAM,TET

,ROX,TAMRA...

Realplex


Eppendorf do Brasil

SYBR® Green

• Intercalarte de DNA doble cadena

• Fluoróforo em suspensión

• Inespecífico

• Curva de disociación o melting

• Noão permite multiplex

• La emisión de fluorescencia es proporcional al

número de moléculas y al tamaño del amplicon

• Mas barato

Realplex


Eppendorf do Brasil

Curva de melting o de disociación

• Checa la especificidad de los productos generados

• Aumento de laa temperatura= reducción del sinal de

Sybr Green denaturación

• Diferentes amplicons=diferentes

picos en la curva de melting

* tamaños de amplicon e

cuantidad GC

• Posibilidad de identificación

de cepas diferentes

diseño de la reacción

Realplex


Eppendorf do Brasil

Curva de melting o de disociación

Temperature [°C]

949290888684828078767472706866646260

- dI / dT (%)

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-60

Primer dimers

Product of Interest


T T T TT A AAC C CC CA G G G G GG T T T TT A AAC C CC CA G G G G GGT T TAA C CC CG GG


R Q

El principio TaqMan

Taq Polimerasa:

una encima, dos actividades

•5´-3´DNA Polimerasa

•5´-3´Exonucleasa (actividad TaqMan)

A

G

C C

A

C C

T

T

T T T T TGGG CCCC A A AAGCCGA

T

R

T T CAGCCGA


Multiplexing

Dos o más sondas y Dyes (marcadores) en un tubo


FAM Q Quencher

TAGCCTGC AGAG

Vic Q Quencher

Albo 1

Albo 2


Tipos de Cuantificación

Cuantificación Absoluta:

- Determinación del número exacto de moléculas.

Valores numéricos con alguna unidad,

como número de copias o nanogramas de DNA.

Cuantificación Relativa:

- Análise comparativa del ácido nucléico alvo com o do controle interno

ou do calibrador.

Son comparados os Ct’s de cada muestra

los resultados representan ordenes de grandeza

(p.e: 5x más o menos expresión de un determinado gene).


PCR Fase I

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 10 20 30 40

ciclos

Produto

Vista linear

1

10

100

1000

1 10 20 30 40

ciclos

Vista log

exponencial

linear

platô


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Detecció cinética

(PCR cuantitativa )

cycles

Product

Detección End point

(PCR convencional)

PCR - cinética vs. Detección End point

Ct (Threshold Cycle)- representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia

cruza el umbral establecido. El cálculo del Ct siempre se realiza en la fase exponencial de

la curva.

Nº de ciclos

Fluorescencia

Cantidad Inicial

Ct

Curva Estándar

CtCtCt

Baseline o línea base -se refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios

detectables en la cantidad de fluorescencia, y sólo se detecta la fluorescencia .

Threshold

Threshold (Umbral)- es el umbral en el que se produce un cambio significativo en la

fluorescencia

Background Fluorescence

Curva de amplificación

El Princípio Real Time


Cuantificación absoluta

Desconhecido

Ef=10[-1/slope]-1


Cuantificación Relativa

Usado principalmente para estudios de expresión génica

•Expresa los valores relativos a una muestra de referencia (calibrador, control, etc)

•Control (Calibrador): Muestra sin tratar o a tiempo 0, un tejido, etc.•Requiere usar un gen de referencia (control endógeno) para normalizar

- Generalmente genes housekeepings o RNA ribosomal

- No debe variar con el tratamiento

Sistema control (calibrador) Sistema Experimental

Gen referencia

Gen target

∆∆Ct= ∆Ct of sample – ∆Ct of calibrator

∆Ct= endogenous Ct – gene of interest Ct



∆CtSample

∆CtCalibrator

Housekeeping Gene

∆Ct

∆Ct

∆ ∆ Ct

2- ∆ ∆ Ct = Change in Expression Level

Gene of Interest


Número de ciclo

fluorescence

GAPDH (control)

GAPDH (treatment)

TNFα (control)

TNFα (treatment)

analysis line

Como obtener el punto

correcto de

cuantificación?

threshold level – 10x SD


Algoritimo CalQPlex en el software realplex


CalQplex-Algorithm

x x x x x x x x x x x x xxx

x

x

xxxx x x x x x

Fluorescence

Cycle-Number

CalQplex-Ct-value

(reference point)

Change over from

the exponential to

the non-exponential

phase


real-time PCR efficiency and

amplification performance

PCR inhibitors:

Hemoglobin, Urea, Heparin

Organic or phenolic compounds

Glycogen, Fats, Ca2+

Tissue matrix effects

Laboratory items, powder, etc.

RNA / DNA

degradation

PCR reaction

components

DNA

concentration

tissue

degradation

PCR enhancers:

DMSO, Glycerol, BSA

Formamide, PEG, TMANO, TMAC etc.

Special commercial enhancers:

Gene 32 protein, Perfect-Match, Taq-

Extender, AccuPrime, E. Coli ss DNA binding

unspecific

PCR productsDNA dyes

lab management

hardware:

PCR platform & cups

cycle conditions

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