parámetros cinéticos para la hidrólisi enzimática de aceites vegetales usando una estación de...

7/25/2019 Parmetros cinticos para la hidrlisi enzimtica de aceites vegetales usando una estacin de titulacin automatica

1/78

i

UNIVERSIDAD DE SONORA

DIVISION DE INGENIERIADEPARTAMENTO DE INGENIERA QUIMICA Y METALURGIA

PARMETROS CINTICOS PARA LA HIDRLISISENZIMTICA DE ACEITES VEGETALES USANDO UNAESTACIN DE TITULACIN AUTOMTICA (PH-STAT)

TESIS

Que para obtener el Ttulo de:

INGENIERO QUMICO

Presenta:

ADILENE MARGARITA LARES MOLINA

Hermosillo, Sonora Septiembre de 2013


2/78

i

TABLA DE CONTENIDO

NOMENCLARURA ................................................................................................................ iii

ABREVIATURAS ..................................................................................................................... v

LISTA DE TABLAS ................................................................................................................ vi

LISTA DE FIGURA ................................................................................................................ vii

RESUMEN ................................................................................................................................ x

1. INTRODUCCIN ................................................................................................................. 1

2. ANTECEDENTES ................................................................................................................ 3

3. Lipasas ................................................................................................................................... 4

3.1. Clasificacin de las Lipasas ............................................................................................ 5

3.2. Mecanismo de Reaccin Catalizada por Lipasas ............................................................ 6

3.3. Aplicaciones Industriales de las Lipasas ........................................................................ 8

3.4. Factores que Influyen en la Actividad de las Lipasas ..................................................... 9

3.4.1 Actividad de agua ...................................................................................................... 9

3.4.2.Temperatura y pH .................................................................................................... 11

3.4.3. Cofactores ............................................................................................................... 12

4. Cintica de las Reaccin Enzimticas.................................................................................. 12

4.1 Mtodo integral de la ecuacin de Michaelis-Menten ................................................... 17

4.2 Modelo de desactivacin ................................................................................................ 18

5. Reactor Continuo En Tanque Completamente Agitado (CSTR) ..................................... 20

6. Caractersticas Generales De La Lipasa F-AP15 ............................................................. 23

7. pH-STAT .......................................................................................................................... 24

OBJETIVOS ............................................................................................................................ 26

Objetivos Especficos ........................................................................................................... 26

JUSTIFICACIN .................................................................................................................... 27

8. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................................ 28

8.1. Sustancias Qumicas ...................................................................................................... 28

8.1.1. Caractersticas y propiedades de la enzima ............................................................ 29

8.1.2. Preparacin de reactivos ......................................................................................... 29

8.2 Instrumentos y equipos................................................................................................... 30

8.2.1 Estacin de Titulacin Automtica ............................................................................. 31

8.2.2 Programacin y Operacin de Titralab 856 ............................................................. 31


3/78

ii

8.2.3 Reactor tipo tanque agitado ..................................................................................... 36

8.3 Diseo de Experimentos................................................................................................. 37

8.4 Anlisis de Datos ............................................................................................................ 37

9. RESULTADOS Y DISCUSION ......................................................................................... 39

9.1 Errores Experimentales .................................................................................................. 39

9.2 Hidrlisis de Aceite de Oliva ......................................................................................... 41

9.3 Hidrlisis de Aceite Comercial ..................................................................................... 50

9.4. Criterios de Diseo para un Reactor CSTR .................................................................. 55

10. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 57

11. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 59

12. ANEXOS ........................................................................................................................... 61

12.1. Programando electrodos .............................................................................................. 61

12.2. Programando los reactivos .......................................................................................... 63

12.3. Programando mtodos ................................................................................................. 65


4/78

iii

NOMENCLATURA

Smbolo Unidad Definicin

a Actividad de la enzima a tiempo t

a0 Actividad de la enzima a tiempo cero

Ad Actividad de desactivacin de la enzima

[AGL] mol/ml concentracin de cidos grasos libres

D min-1 velocidad de dilucin

E enzima

[E] mol/ml concentracin de enzima

[E0] mol/ml concentracin inicial de enzima

Ed energa de activacin

ES complejo enzima-sustrato

porosidad o espacios vacos en la partcula

F m3

/s flujo de alimentacin

%H porciento de hidrlisis

k 1/h constante de velocidad

kcat 1/h eficiencia cataltica de la enzima

kD 1/h constante de desactivacin de lipasa

KM mol/L constante de Michaelis-Menten

Ks mol/ml constante de disociacin

k 1/h constante de primer orden

k0 mol/mol h constante de velocidad inicial de hidrlisis [molAGL/molaceiteh]

k1 ml/(mol h) constante de velocidad de reaccin de segundo orden

k-1 1/h constante de velocidad de reaccin para una reaccin reversible

de primer orden


5/78

iv

k2 1/h constante de velocidad de reaccin de primer orden

P producto

Q m3s-1 caudal, velocidad de flujo

R cal/mol K constante de la ley de los gases ideales

rv mol/h velocidad de reaccin

S sustrato

[S] mol/ml concentracin de sustrato

[S]0 mol/ml concentracin inicial de sustrato

[S0] mol/ml concentracin de sustrato o reactante en la alimentacin

[mol/m3]

t h tiempo

T C temperatura

V m3 volumen del reactor

Vmax mol/h velocidad mxima de reaccin

X fraccin de conversin del reactante

factor de efectividad de la partcula de enzima inmovilizada

Mdulo de Thile


6/78

v

ABREVIATURAS

CSTR Reactor de tanque agitado continuo (siglas en ingls Continuous Stirred Tank

Reactor)TAG Triacilglicerol

DAG Diacilglicerol

MAG Monoacilglicerol

AGL cido Graso Libre

AG cido Graso

Asp Asparangina

Glu Glutmico

His Histidina

Ser Serina


7/78

vi

LISTA DE TABLASTabla Pgina

1. Clasificacin de las lipasas de acuerdo a su especificidad. 7

2. Aplicaciones Industriales de las Lipasas para la Industria de Alimentos 10

3. Aplicaciones de las lipasas en la hidrlisis de aceites en reactores delecho empacado 13

4. Composicin de cidos grasos del aceite de oliva 28

5. Composicin promedio de cidos grasos de un aceite vegetalcomercial 29

6. Iconos que aparecern en las pestaas del equipo Titralab 856

dependiendo de su estado de programacin 33

7. Diseo de experimentos para conocer la cintica de la lipasa F-AP15en dos aceites 37

8. Parmetros cinticos de la hidrlisis enzimtica del aceite de oliva 49

9. Parmetros cinticos de la hidrlisis enzimtica de aceite comercial 55

10. Calculo de los flujos a utilizar para llevar a cabo la reaccin de hidrlisisenzimtica de aceites de origen vegetal para un reactor continuo 56

11. Parmetros para un reactor de 50 litros para hidrlisis enzimtica deaceites vegetales con la lipasa F-AP15 56


8/78

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura Pgina

1. Reaccin de hidrlisis del triacilglicerol en presencia de lipasa 5

2. Crecimiento anual de la industria enzimtica 2009, Fuente: BusinessCommunications Company, Inc. 9

3. Representacin esquemtica de un reactor completamente agitado 21

4. HongoRhizopus oryzaeen vista microscpica 23

5. Rhizopus oryzaeen frutos en degradacin 24

6. Equipo de titulacin electrnica Titralab 856 de Radiometer Analitical 32

7. Pantalla principal que se muestra en el equipo para titulacinelectrnica Titralab 856 33

8. Configuracin del cable para conectar el Titralab 856 a unacomputadora 35

9. Ejemplo de grfica arrojada por titramaster para el anlisis deresultados 35

10. Esquema del reactor a usar para seguir la cintica de hidrlisisenzimtica 36

11. Cintica de hidrlisis de aceite de oliva grado analtico con enzimaF-AP15.Estos datos fueron tomados con Titralab 856. Tanto la corrida

1 y 2 (exp. 1) son a las mismas condiciones, temperatura de 25C y0.25% en peso de lipasa F-AP15. 40

12. Promedio de las concentraciones de AGL de las dos corridas del

experimento 1 contra el tiempo para calcular el error entre corridas.Los puntos anaranjados son los promedios de los datos experimentalesy las barras negras son los errores entre corridas. 40

13. Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten para conocer lacintica de la reaccin de aceite de oliva con lipasa F-AP15 de formalineal de la reaccin. La pendiente de las lneas corresponde a laconstante km/Vmax y la ordenada en el origen es corresponde elinverso de la velocidad mxima. 41


9/78

viii

LISTA DE FIGURAS (Continuacin)

Figura Pgina

14. El modelo cintico de hidrlisis de aceite de oliva grado analtico conlipasa F-AP15 a 25C con una concentracin de enzima del .25% w/wde aceite. La lnea continua representa el modelo cintico dedesactivacin de primer orden y los crculos representan los datosexperimentales de la corrida 1. 42

15. Modelo cintico y datos experimentales de la corrida 2 a las mismascondiciones que la corrida 1.Los datos experimentales se igualaron almodelo de desactivacin para conocer el comportamiento de lacintica. 42

16. Modelo cintico cuando se aumenta la concentracin enzima a 0.75%y la temperatura es 25C 44

17. Mtodo integral de la experimento 3 con ms enzima 44

18. Mtodo integral de la experimento 3 donde se aumenta concentracinde enzima a 0.75% y 40C 45

19. Modelo cintico cuando se aumenta la concentracin la de enzima a0.75% y la temperatura a 40C 46

20. Modelos cinticos de la hidrlisis 47

21. Determinacin grafica de la constante de velocidad de primer orden(k) para el experimento 1 48

22. Determinacin de la k experimento 2 48

23. Determinacin de k de experimento 3 49

24. Cintica de hidrlisis en aceite comercial con enzima F-AP15. Estosdatos fueron tomados con Titralab 856. Tanto la corrida 1 y 2 (exp. 1)son a las mismas condiciones, temperatura de 25C y 0.25% en peso delipasa F-AP15. 50

25. Promedio de las concentraciones de AGL de las dos corridas delexperimento 4 contra el tiempo para calcular el error entre corridas.Los puntos azules son los promedios de los datos experimentales y las

barras negras son los errores entre corridas siendo este un error del0.028 con una desviacin estndar del 1.44. 51


10/78

ix

LISTA DE FIGURAS (Continuacin)

Figura Pgina

26. Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten para conocer lacintica de la reaccin del aceite comercial con lipasa F-AP15 deforma lineal de la reaccin. La pendiente de las lneas correspondea la constante km/Vmax y la ordenada en el origen es correspondeel inverso de la velocidad mxima. 52

27. Modelos cinticosde los experimentos 4 y 5 en aceite comercial y0.25% w/w en peso de aceite de F-AP15 y a 25C (exp 4) y a 0.75%w/w en peso de aceite de F-AP15 a 40C (exp 5). La lnea continuarepresenta al modelo de primer orden propuesto y la lnea punteada

representa los datos experimentales obtenidos con el equipo elctricoTitralab 856. 53

28. Determinacin de kpara el experimento 4 54

29. k para el experimento 5 cuando es aumentada su concentracin deenzima y temperatura 54


11/78

x

RESUMEN

El mecanismo de la hidrlisis enzimtica de aceites est bien conocido y estudiado. El

mtodo comn para seguir a la reaccin es tomando muestras de la mezcla a reaccionar

durante el tiempo de reaccin y titulando manualmente. (Gamez et al 2003). Usando un

mtodo pH-Stat se pudo estudiar la cintica de reaccin en un periodo largo de tiempo.

El objetivo de este trabajo es determinar los parmetros cinticos de la enzima F-

AP15 para una hidrlisis enzimtica de un aceite de oliva y otro de origen vegetal pero

comercial.

La lipasa F-AP15 deRhizopus oryzae(Amano Enzyme Inc.) fue evaluada a diferentes

concentraciones de enzima (0.025 y 0.75% w/w de aceite) y a temperaturas (25C y 40C).

Todos los experimentos fueron corridos en una estacin de titulacin electrnica (Titralab

856 de Radiometer Analytical). Un reactor enchaquetado (50 ml) fue conectado en un bao

maria con recirculacin para mantener la temperatura. La mezcla de reaccin fue preparada

mezclando un buffer de fosfato 0.1 M de pH 7. La lipasa fue disuelta en 3 ml del buffer de

fosfato y se titulo con una solucin de KOH 0.1 M, el cual se encontraba en una de las

buretas del equipo, para que esta fuera aadido conforme ocurra la reaccin para mantener

un pH optimo (set point) de 7.0. Con el algoritmo PID ya programado en el controlador del

equipo fue posible conseguir los resultados. Los experimentos fueron monitoreados durante

24 horas de reaccin.

Para determinar los parmetros de la reaccin se utiliz un modelo de pseudo-primer

orden de desactivacin para determinar los datos cinticos y el mtodo integral de la ecuacin

de Michaelis-Menten fue utilizado para determinar KM, Vmax, y la eficiencia cataltica.


12/78

xi

El modelo de pseudo-primer orden de desactivacin encajo muy bien con los datos

experimentales (R2>0.98) para el estudio cintico. Se pudo observar que la constante de

velocidad k0 es mucho ms grande a 25C que a 40C, pero no hubo mucha variacin al

momento de aumentar la concentracin tanto para los dos aceites. La explicacin a esto es

que la enzima trabaja ptimamente a 30C (Ben Salah A, 1994).

El programa pH-Stat y los modelos aplicados permitieron determinar los parmetros

cinticos de hidrlisis de aceites.


13/78

1

1. INTRODUCCIN

Las enzimas son molculas proteicas que catalizan reacciones qumicas

termodinmicamente posibles, quiere decir que, no interfieren en el equilibrio qumico sino

en la velocidad de reaccin ya que modifica la energa de activacin. Las enzimas trabajan

selectivamente sobre sustratos, que son molculas que reaccionan con ellas, debido a su sitio

activo, que tiene una estructura como la que sugiere Koshland de una cavidad rgida

geomtrica con una disposicin precisa espacial de grupos de aminocidos que se ponen en

contacto con el sustrato.

La lipasa es una enzima que se usa en el organismo para disgregar las grasas de los

alimentos de manera que se puedan absorber. Su funcin principal es catalizar la hidrlisis de

triacilglicerol a glicerol y cidos grasos libres.

La hidrlisis de aceites ha sido un mecanismo utilizado para la obtencin de cidos

grasos libres y gliceroles para diversos fines. En la actualidad, existen tres formas de llevar a

cabo la hidrlisis de aceites: de alta presin, hidrlisis alcalina o hidrlisis enzimtica. Aun

cuando la hidrlisis enzimtica ofrece ventajas sobre el otro tipo de procesos, su aplicacin

no se ha generalizado debido a que depende de la disponibilidad de enzima que se utiliza, la

cual requiere de condiciones apropiadas para su manipulacin, lo que ocasiona costos de

operacin muy elevados.

En este trabajo nos enfocaremos en seguir la cintica de reaccin de una lipasa sobre

un sustrato de aceite de oliva y otro de origen vegetal que es comercial para la produccin de

cidos grasos libres y gliceroles utilizando una estacin de titulacin electrnica. Todo esto es


14/78

2

para disear y caracterizar un reactor continuo completamente agitado CSTR para comparar

resultados y poder ver si es ms factible el usos de este tipo de reactores para la hidrlisis

enzimtica de aceites. Para este estudio se usar la lipasa de Rhizopus oryzae F-AP15

(Nagoya).


15/78

3

2. ANTECEDENTES

La hidrlisis es una reaccin qumica donde interactan una molcula de agua y otra

molcula, en este caso, de steres. La molcula de agua se divide y sus tomos pasan a formar

parte de la otra molcula.

En la industria, la hidrlisis es de gran importancia en el procesamiento de steres

naturales, como son las que presentan las grasas, ceras y aceites vegetales o animales. La

produccin de cidos grasos por hidrlisis de aceites naturales es muy importante en la

explotacin econmica (Ramachandra, 2002). La hidrlisis de aceites y grasas es una

operacin industrial importante en el mundo, alrededor de 1.6 X 106 toneladas de cidos

grasos son producidos por ao. En algunas fbricas en Japn actualmente usan lipasas

(hidrlisis enzimtica) para la produccin de jabn en polvo y alta purificacin de cidos

grasos (Pronk, 1988). Sin embargo, el uso de enzimas para este proceso (hidrlisis de aceites)

no ha sido viable econmicamente para la industria.

En 1981, Miyoshi Oil Company report por primera vez la hidrlisis de aceites

catalizada por lipasas para la produccin de jabones. Se report que el proceso no era

econmicamente eficiente pero los productos eran de gran calidad (Hou, 2002).

Los aceites y grasas son parte de un grupo de componentes conocidos como steres

grasos o triglicridos, y su hidrlisis esencialmente envuelve reacciones con agua para

producir cidos grasos libres y gliceroles. Las tres principales rutas usadas para la hidrlisis

de las grasas y los aceites para la produccin de cidos grasos son; por inyeccin de vapor a

altas presiones, por hidrlisis alcalina o bien por medio de hidrlisis enzimtica. Estetrabajo

enfocado en la hidrlisis de aceites por medio de enzimas llamadas lipasas.


16/78

4

2.1. Lipasas

Las lipasas son enzimas solubles en agua que actan en sustratos insolubles en agua y

son estables en ambientes tantos en polares como no polares. Se usan como catalizadores en

biotecnologa por su alta especificidad y selectividad en compuestos orgnicos. Las lipasas

pueden actuar en el centro de la solucin o en la interfase, sin embargo, su actividad es

mucho mayor en la interfase(Marangoni A. G., 2002). Se ha generalizado ms su uso por su

alta selectividad y que sus condiciones de uso son estndar (tpicamente 35C, 1 atmosfera de

presin)(Ramachandra, 2002).

Las lipasas catalizan la hidrlisis de triacilgliceroles (TAGs) formando cidos grasos

libres (AGL), diacilgliceroles (DAG), monoacilgliceroles (MAG) y glicerol (Figura 1).

Cuando las condiciones de reaccin estn estrictamente controladas, las lipasas tambin

pueden catalizar la formacin de acilgliceroles a partir de cidos grasos libres y gliceroles

(Van Camp, 1998). Por lo general, las lipasas trabajan a condiciones moderadas de

temperatura y presin (35C y 1 atm). En esta tecnologa, una solucin acuosa de lipasa se

pone en contacto con el aceite, formando una dispersin lquido-lquido. Como los TAG,

tambin llamados lpidos, no se disuelven en agua, entonces la reaccin toma lugar en la

interfase del agua y el lpido. De la reaccin de hidrlisis se obtiene 1 mol de glicerol y 3

moles de cidos grasos por mol de TAG. Como la reaccin es reversible, tanto la hidrlisis y

la composicin final depende de la concentracin de los AGL en la fase de aceite y la

concentracin de glicerol en la fase del agua (Ramachandra, 2002). Para llevar ms rpido la

reaccin se usa un emulsificante para que exista mayor contacto de la enzima con el sustrato.


17/78

5

Figura 1. Reaccin de hidrlisis del triacilglicerol en presencia de lipasa (Snchez F., 1998)

Las lipasas pueden modificar la estructura de los lpidos que no se puede obtener tan

fcilmente por mtodos qumicos convencionales. Adems algunas lipasas muestran cierta

especificidad hacia algunos tipos de cidos grasos en una molcula de TAG. Esta rego

especificidad (especificidad por la posicin) o selectividad puede facilitar de la formacin de

lpidos estructurados, con cidos grasos especficos en lugares especficos dentro de la

molcula del TAG. Las condiciones de reaccin moderadas, durante las cuales las lipasas

operan, pueden contribuir positivamente al incremento de la estabilidad y calidad del

producto final. Sin embargo, para reducir costos de produccin e incrementar la calidad de la

produccin se deben desarrollar y optimizar los mtodos de operacin de biorreactores a gran

escala para el reuso de las enzimas (Marangoni, 1995).

2.1.1. Clasificacin de las Lipasas

Se han encontrado y purificado lipasas de ms de cincuenta especies de fuentes

vegetales, animales y microorganismos nativos o modificados genticamente. Basado en sus

propiedades, las lipasas se pueden subdividir en cinco diferentes clases.La Tabla 1 resume las


18/78

6

caractersticas de los grupos de lipasas y menciona ejemplos de dnde has sido aisladas y

caracterizadas.

2.1.2. Mecanismo de Reaccin Catalizada por Lipasas

La hidrlisis de los enlaces steres de los cidos grasos (AG) carboxlicos catalizada

por lipasas es lenta. Los sustratos preferidos por lipasas son los steres de AG hidrfobicos y

TAG con cadenas largas de AG. La solubilidad de estos componentes en agua es baja, agua-

lipasas solubles en agua son forzados a catalizar la hidrlisis de los enlaces ster en la

interfase entre la fase del sustrato insoluble y la fase acuosa en que las enzimas estn

disueltas. Los gliceroles y jabones formados parcialmente durante la reaccin de la lipasa son

activados superficialmente y tienden a acumularse cerca de la interfase. Esto debe dificultar

el acceso de las lipasas a acercarse al sustrato, haciendo difcil el mantener una velocidad de

reaccin constante sobre el largo periodo de tiempo que es requerido para la extensa

hidrlisis del sustrato (Macrea, 1985).

Al restringir la cantidad de agua en la mezcla de reaccin, las lipasas pueden catalizar

selectivamente inter-esterificaciones. La reactividad de los TAG es primeramente relacionado

con elcarbonocarboniloparcialmentecargado positivamente, cual es susceptible al ataque

nuclefilico.


19/78

7


20/78

8

El lado activo de las enzimas contiene una triada de aminocidos asparangina (Asp) o

glutmico (Glu), histidina (His) y serina (Ser). Los residuos de serina actan como nuclefilo,

mientras que el Asp (o Glu) y el His participan en el cambio del sistema de paso que mejora

la reaccin de catlisis. Cuando la lipasa entra en la interfase, un corto segmento helicoidal

que proyecta la triada es desplazado y permite a la triada a interactuar con el sustrato. El

ambiente hidrofbico cerca de la triada es responsable de contener a la enzima en la

interfase(Marangoni, 1995). Este tipo de mecanismo ha sido demostrado para la lipasa

pancretica humana (Winkler, 1990)(Brzozowski, 1991), lipasa triglicrido Mucormiehei

(Brzozowski, 1991)(Brady, 1990), y lipasa Geotrichum candidum (Scrag, 1990).

2.1.3. Aplicaciones Industriales de las Lipasas

Se han reportado algunas actividades de lipasas para ciertos sustratos y aplicaciones.

En la tabla. Se reportan algunas actividades de ciertas enzimas en los sustratos tambin

mencionados (Ramachandra et al, 2002). Como nos podemos dar cuenta se toman dos tipos

de sustratos, productos lcteos y aceites, a condiciones parecidas las mismas enzimas

aplicadas a los sustratos dan actividades iguales, segn lo reportan.

El uso industrial de las enzimas y en particular las lipasas ha tenido un gran impacto

econmico global. El mercado global de enzimas, Communications Company, Inc. se estim

en 2 billones de dlares en el 2004 (Communications Company Inc).En la Figura 2 se puede

observar que el crecimiento de las industrias enzimticas ha sido de alrededor de 4% a 5%

(promedio de crecimiento anual).


21/78

9

Figura 2.Crecimiento anual de la industria enzimtica 2009, Fuente: Business Communications Company,Inc.

2.1.4. Factores que Influyen en la Actividad de las Lipasas

2.1.4.1. Actividad de agua

La actividad de agua como medio es uno de los mayores factores que determina el

resultado de la reaccin de catlisis de la lipasa. La adicin de agua es tambin importante

para la activacin de las enzimas inmovilizadas. Las reacciones lipolticas son muy sensibles

a la cantidad de agua presente. Una actividad alta del agua va a favorecer la lipolisis, mientras

un contenido bajo de agua resultar en esterificacin (reaccin inversa). Como consecuencia,

para la produccin de triglicridos requiere cantidades mnimas de agua. Adems, toda el

agua que es producida durante la esterificacin se debe remover con el fin de sostener el

proceso de reaccin. Esto se puede llevar a cabo usando una cmara de vaco o una

membrana micro porosa.


22/78

10


23/78

11

2.1.4.2. Temperatura y pH

La funcionalidad de la lipasa es alta dependiendo del pH y temperatura. A valores de

pH muy bajos o muy altos de pH resultar en la desnaturalizacin parcial o completa de la

lipasa, reduciendo su actividad enzimtica. El pH ptimo de las lipasas usualmente se

encuentra entre 6 y 9. Este rango ptimo se desplazara hacia el lado cido si hay presente de

salesy emulsionantes.

Tambin, cuando los cidos grasos son producidos durante la hidrlisis, disminuye el

pH. La esterificacin consecuentemente va a resultar en un pH ms alcalino si es que no se

utiliza una solucin amortiguadora (buffer). Verhaege (Verhaege, 1990) investig la lipolisis

de crema por la lipasa Rhizopus arrhizus. La fase acuosa de la crema recombinada fue

remplazada por un regulador (buffer) tris 1.5 con un pH 7.0. Despus de 4 horas de reaccin a

37C, el pH descendi a 5.5. En la crema nativa result lo mismo despus de 4 horas de

reaccin en un pH de 4.5.

La temperatura tambin puede aumentar o reducir la actividad enzimtica durante el

proceso. La inactivacin trmica sigue aproximadamente el modelo de decadencia de primer

orden descrito por Wang (Garcia, 1992):

. En la cual ay a0 son las actividades de las enzimas a un tiempo t y a un tiempo cero,

respectivamente; Ad=k0 exp(-Ed/RT0), donde k0es la constante de Arrhenius, Edes la energa

de activacin, R es la constante de los gases, T es la temperatura absoluta en la proceso, y T0

es la temperatura de referencia.


24/78

12

La temperatura de estabilidad de las lipasas ha sido extensamente investigada en vista

de inters para procesos a altas temperaturas en aplicaciones industriales. Algunas grasas

siguen solidas a bajas temperaturas, otras solo empiezan a derretirse a 40C. Por dems, a

altas temperaturas se reduce la viscosidad de la mezcla.

2.1.4.2. Cofactores

La actividad de las lipasas es influenciada significativamente por la presencia de sales.

Sales de calcio, sales biliares y cloruro de sodio puede mejorar la actividad lipoltica

enzimtica contrarrestando los efectos inhibidores de los jabones. Sin embargo, el efecto de

estas sales depende del tipo de lipasas que se use.

2.2. Cintica de las Reaccin Enzimticas

La razn de uso de las enzimas es porque ellas actan como catalizadores,

promoviendo la formacin de reactivos a productos. En general los catalizadores trabajan de

manera que hacen un mecanismo alterno de reaccin disminuyendo la energa de activacin,

facilitando la conversin sustratos a productos.

Al estudiar la posible aplicacin comercial de un catalizador enzimtico, existen tres

puntos principales que deben ser tomados en cuanta (Gacesa, 1990):

La velocidad de reaccin (actividad cataltica)

La extensin de la reaccin (constante de equilibrio)

La duracin de la actividad (estabilidad)


25/78

13


26/78

14

Se han propuestos varios mecanismos de la catlisis enzimtica de la lipasa. El

modelo cintico ms simple para describir la reaccin cataltica est basado en el clsico

mecanismo de Michaelis-Menten(Richardson, 1992).

E= enzima

S= Sustrato

ES= El complejo enzima-sustrato

P= Productos

El mecanismo propone una combinacin o reaccin entre enzima y el sustrato para

formar un complejo entre ellos (ES). Es un complejo porque no es un producto sino un

acoplamiento entre ellos. La reaccin es reversible y la relacin entre sus constantes de

velocidad es llamadaconstante de disociacin (Ks).

Entre el complejo y los productos hay otra reaccin con una constante k2.La rotura del

complejo a productos es exotrmica y es irreversible (Gacesa, 1990). Por esta razn la

constante k2es considerada como la kcat que representa la constante cataltica de velocidad.

La kcates una medida directa de la produccin cataltica del producto en condiciones

ptimas (enzima saturada). Las unidades de kcat son segundos-1. El inverso puede ser

interpretado con el tiempo requerido por una molcula de enzima para convertir una


27/78

15

molcula de sustrato. Alternativamente mide el nmero de molculas de sustratos en

convertirse por segundo. Por eso a veces se le llama el nmero conversin de recambio.

Tomando todo esto en cuenta de ahora en adelante la k2que tenamos en la ecuacin

(2) ser kcat.

Considerando estado estacionario; la formacin de la rotura del complejo es:

Siendo esta ecuacin el balance de materia (los corchetes denotan concentraciones

molares de las especies) si consideramos que la formacin de la rotura del complejo es muy

rpida, es decir, cercana a cero se puede considerar una reaccin lineal. Separando variables

de la ecuacin 4, nos quedara:

Para que esto sea vlido, la velocidad de reaccin debe ser lineal (cercana a cero).

Reordenando la ecuacin 5:

Donde KM es la constante de Michaelis-Menten, y basndonos en la ley de la

conservacin de la materia donde se requiere que no cambie la concentracin de enzima

([E0])


28/78

16

Por lo tanto

Sustituyendo la ecuacin 8 en 6 y reordenando, queda

Multiplicando ambos lados de la ecuacin 9 por k2 obtendremos la velocidad de

cambio de la concentracin del producto con el tiempo en funcin de la velocidad mxima

posible, la constante de Michaelis-Menten y la concentracin de reactante (Gacesa, 1990).

Esta misma ecuacin se escribe comnmente como la ecuacin de Michaelis-Menten

Donde:

Vmax= es la velocidad observada cuando la lipasa est saturada con el sustrato

KM= es la constante de Michaelis-Menten


29/78

17

La KM es un valor aproximado de la afinidad que hay entre la enzima y el sustrato y

dependiendo de su valor indica si favorece el curso de la reaccin. El sustrato con ms bajo

valor de KMtendr una mayor afinidad o especificidad selectividad con la enzima. El mejor

sustrato ser aquel que presente valores grandes de la relacin Vmax/KM grande.

2.2.1. Mtodo integral de la ecuacin de Michaelis-Menten

Cuando se toman los datos de una cintica, por lo regular la forma de la grfica

volumen agregado contra tiempo es una curva que va creciendo hasta formar una lnea

horizontal porque alcanza el equilibrio. Una manera para evaluar el progreso de la reaccin es

usando el mtodo integral de Michaelis-Menten, que para esto se necesita recalcular cada

punto de la grfica para darle a esta una forma ms lineal.

Retomando la ecuacin 11 y separando variables:

Integrando ec. 14 desde la concentracin inicial de sustrato [S]0a t=0 hasta [S] a t=t

Resolviendo, obtenemos

O bien,


30/78

18

La concentracin del sustrato ([S]) a lo largo de la reaccin no es conocida o no se

puede calcular exactamente su valor, entonces para conocer como esta variando desde la

concentracin inicial que si es conocida. Como esta variacin es igual a la cantidad de AGL

que estas obteniendo que sean conocidos por los valores de titulacin, por lo tanto:

Aplicando la ecuacin (13) a la (12), obtenemos:

Al graficar la ecuacin (13) (

contra

), obtendremos una recta con

ordenada en el origen 1/Vmy pendiente Km/Vmax. La pendiente para este caso ser positiva,

porque lo estamos viendo del lado de la formacin de productos.

2.2.2. Modelo de desactivacin

La ecuacin del porciento de hidrlisis de aceites esta daba por una ecuacin de

primer orden


31/78

19

Para describir los perfiles de concentracin de AGL como funcin del tiempo, Dicks y

Lee (1999) incorporaron el proceso de desactivacin de la lipasa usando una ecuacin de

primer orden.

Donde:

k0: constante de velocidad inicial de hidrlisis [molAGL/(molaceiteh)]

kD: constante de desactivacin de lipasa [1/h]

Combinando la ecuacin (16) con la (15), obtenemos

Integrando (17)

Donde la solucin factorizada es:

Aplicando la exponencial

Separando el termino [S]

Como el porciento de hidrlisis o conversin se expresa como:

Al sustituir (21) en (22), obtenemos:


32/78

20

La k0representa la constante de velocidad si es que consideramos una cintica de

primer orden. En la actualidad se estudia este tipo de cinticas como si fueran de primer

orden, la ventaja de usar este modelo es que consideramos todos los puntos de la curva

haciendo ms exacto los resultados.

2.3. Reactor Continuo En Tanque Completamente Agitado (CSTR)

Las diferentes configuraciones de CSTR han sido empleadas por un nmero de

investigadores (Kosugu, 1990). Los reactores CSTR poseen algunas ventajas particulares

sobre reactores de lecho fijo, son de menores costos de construccin y la agitacin eficiente

elimina la presencia de concentracin y/o gradientes de temperatura de tal forma que la

concentracin de los componentes en el flujo de salida es igual que en la masa del fluido en el

tanque. Aunque, un reactor CSRT debe ser ms grande que un reactor de lecho empacado

para conseguir la misma conversin de reaccin. Si la enzima esta inmovilizada se puede

operar un reactor CSTR de forma continua.

El balance de masa para este tipo de reactores (Figura 4) se puede dar por la siguiente

ecuacin:


33/78

21

Figura 3.Representacin esquemtica de un reactor completamente agitado

Donde

V = volumen del reactor (m3)

Q = caudal, velocidad de flujo (m3 s-1)

[S0] = concentracin de sustrato o reactante en la alimentacin (kg mol m-3)

[S] = concentracin de reactante en el tanque (kg mol m-3)

v= velocidad de reaccin (kg mol m-3s-1)

En la prctica, un reactor continuo es operado en condiciones de estado estable o

estacionario, es decir, sin acumulacin de reactante o producto en el reactor, por lo tanto la

expresin utilizada para este tipo de reactores es la siguiente, la cual tambin se le asume la

cintica simple de Michaelis-Menten.

Donde D = Q/V = es la velocidad de dilucin (tiempo-1) y el termino de conversin

esta dado por la ecuacin (26).

Por lo tanto

Desarrollando la ecuacin (30).


34/78

22

Sustituyendo la ecuacin (32) en (33) y en trminos de X, nos queda,

Si se asume un estado pseudo-estable la ecuacin de diseo para el CSTR puede

expresarse como:

Donde:

= porosidad o los espacios vacios en la partcula

= factor de efectividad de la partcula de enzima inmovilizada

La relacin para x y (-rs) est discutido en la parte de reactores de lecho empacado.

Dependiendo en la difusin intraparticula y la pelcula. Esta ecuacin se modifica en las

siguientes formas:

a). No limitaciones de difusin (=1.0): Cuando la velocidad de reaccin de la partcula de

enzima inmovilizada no est influenciada por la difusin intraparticula y la capa limite,

entonces la ecuacin de diseo para un CSTR se vuelve a:


35/78

23

b). Difusin influye a la cintica de primer orden (


36/78

24

Figura 5Rhizopus oryzaeen frutos en degradacin

Comercialmente, esta lipasa, se vende de forma purificada en forma de polvo con un

color caf claro y su actividad ptima se encuentra a 40C con un pH de 7.2. Su aplicacin en

la industria es para la resolucin de los componentes quirales y la produccin de trans-

esterificacin de biodiesel (Sigma-Aldrich).

2.5. pH-Stat

. La gran mayora de las cinticas de las reacciones concierne a la qumica de la

reaccin que libera o consume iones H3O+ u OH- . Para el estudio de la cintica se necesita

mantener un pH constante o estacionario, de ah el nombre pH-Stat (pH stationary). El pH-

Stat es el mtodo a utilizar contitramaster para el anlisis del experimento. Se basa en

mantener un pH ptimo de referencia (set point) de la reaccin por un periodo de tiempo. El

set point se determina y vara dependiendo de la naturaleza de la reaccin, regularmente

este valor ya se encuentra en bibliografa. Cuando tenemos el valor de pH ptimo, el equipo

trata de mantener ese valor de pH, con ayuda de un potencimetro para el monitoreo del pH,

agregando un reactivo acido o bsico dependiendo de la direccin de la reaccin. La cintica


37/78

25

se obtiene con base el consumo de reactivo agregado a la reaccin. Independientemente de

que tipo de reaccin sea (primer, segundo u orden cero) un reactivo titulador es aadido para

mantener el pH constante sobre el tiempo. Esta velocidad de reaccin del reactivo es una

representacin de la velocidad de reaccin estudiada. Esta tcnica fue usada por primera vez

por Knaff-Lenz en 1923 para estudiar una estereasa. En esos tiempos, el reactivo era aadido

manualmente por el operador que tena que estar vigilando y ajustar el pH del sustrato.

El valor experimental usado en el sistema para regular la velocidad de reaccin deltitulador es pH que es la diferencia entre el pH medido de la solucin y el pH de set point.


38/78

26

3. OBJETIVOS

Disear y caracterizar un reactor continuo CSTR para la hidrlisis enzimtica de aceites de

oliva y comercial.

3.1. Objetivos Especficos

-

Establecer la mejor forma de operacin de un pH Stat para el monitoreo continuo de lareaccin de hidrlisis de aceites vegetales.

- Aplicar los modelos matemticos para determinar los parmetros de la cintica de

hidrlisis enzimtica de aceites vegetales con la lipasa FAP-15.

- Evaluar el efecto de la temperatura y concentracin de sustrato sobre la actividad

enzimtica de la Lipasa FAP-15.

- Proponer criterios de diseo de un reactor continuo tipo tanque agitado para la hidrlisis

de aceites vegetales a nivel industrial.


39/78

27

4. JUSTIFICACIN

Actualmente la hidrlisis de aceites se utiliza para la produccin de jabones y la

purificacin de cidos grasos esenciales, para diversos tratamientos mdicos. Aun cuando

mltiples investigaciones recomiendan la tecnologa enzimtica para la obtencin productos

de alto valor agregado, en Mxico son bastantes empresas donde se utiliza este proceso pero

no es tan utilizada la hidrlisis enzimtica, comparado con pases desarrollados donde es

comn esta tecnologa. La razn es que la obtencin de los catalizadores (enzimas) es

bastante costosa y la reaccin es lenta, haciendo por lo tanto no redituable.

El propsito de una estacin de titulacin electrnica es monitorear la cintica de una

manera prctica, precisa, confiable y ms fcil de hacer. La determinacin de los parmetros

cinticos usando modelos matemticos adecuados, puede ayudar a proponer el diseo de

reactores de distinta configuraciones para aplicacin a nivel industrial. En este trabajo se

propone un reactor continuo tipo tanque agitado (CSTR) para la obtencin de cidos grasos

libres como principal producto y glicerol como subproducto.


40/78

28

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1. Sustancias Qumicas

Para la realizacin de estudio de la cintica de hidrlisis de la lipasa F-AP15 en

aceites de origen vegetal se necesito: lipasa F-AP15 en forma de polvo de Amano Enzyme

Inc. lote LFX02504. Aceite de oliva grado analtico lote #0001428703 Pcode 100923616 de

Sigma-Aldrich, aceite vegetal marca Kartamus (como aceite comercial) lote #114L0512. Para

preparar el buffer de fosfato se utilizo fosfato de sodio dibsico 99% lote #034K0132 y

fosfato de sodio monohidratado monobsico 98.0-102% lote #130K0086. Para la calibracin

del electrodo se utilizo dos soluciones tapn pH 4.0 lote #6005T09435 y 7.0 marca MERCK.

El anlisis del aceite de oliva fue proporcionado por Sigma y se hizo con

cromatografa gases dando como composicin:

Tabla 4 Composicin de cidos grasos del aceite de oliva

Acido graso % Composicin

Palmtico C16:0 11.27

Esterico C18:0 2.93

Oleico C18:1 72.99

Linoleico C18:2 10.85

Con estos datos se calculo un peso molecular de 912.47 g/mol.

La composicin del aceite vegetal se tomo como promedio:


41/78

29

Tabla 5Composicin promedio de cidos grasos de un aceite vegetal comercial

Acido graso % Composicin

Palmtico C16:0 12.71

Esterico C18:0 6.95

Oleico C18:1 35.95

Linoleico C18:2 43.32

El peso molecular promedio se tom como 927.71 g/mol.

5.1.1. Caractersticas y propiedades de la enzima

La lipasa F-AP15 es de color amarillo claro, en estado fsico en forma de polvo

liofilizado. El pH ptimo de trabajo es de 6.5-7.5 a 0.01 g/L. Trabaja a temperatura ambiental

(25-40C). Actividad de registradas de 150,000 U/g. Proviene de un hongo filamentosoRhizopus oryzae.

5.1.2. Preparacin de reactivos

Para preparar un litro de buffer de fosfato 0.1 M a pH 7.0 se necesit dos soluciones:

una de NaH2PO4(fosfato monobsico de sodio) 0,2 M, que se prepara disolviendo 27.6 g en

un litro de agua destiladas y la otra solucin es Na2HPO40,2 M (fosfato dibsico de sodio),

que se prepara con 53.65 g de Na2HPO4en un litro de agua destilada. Se toma 195 ml de la

solucin de NaH2PO40.2 M, 305 ml de Na2HPO4 0,2 My 500 ml de agua destilada.

Para la solucin titulante se utiliz 5.61 gramos de hidrxido de potasio en grageas

disueltas en un poco de agua destilada y despus aforando a un litro.


42/78

30

Para conocer la velocidad de reaccin de la enzima en el aceite de oliva se hicieron

varias experimentos con diferentes concentraciones de enzima (0.25 y 0.75% en peso de

aceite) y temperatura (25C y 40C).Todas los experimentos se hicieron en un equipo de

titulacin automtica Titralab modelo 856 de la compaa Radiometer Analytical. Para las

experimentos a 40C se tuvo que usar menos volumen de muestra, ya que el vaso con

chaqueta para pasar agua a temperatura de 40C es ms pequeo, siendo este volumen de

muestra total inicial de 33 ml (12 ml de aceite, 18 ml de buffer de fosfato pH 7 0.1 M y

enzima disuelta en 3 ml de buffer). Las experimentos a 25C se hicieron con volmenes

inciales de 66 ml (24 ml de aceite, 36 ml de buffer de fosfato pH 7 0.1 M y enzima disuelta

en 6 ml de buffer). Los experimentos se hicieron con aceites de origen vegetal como se

observa en la tabla 6, la enzima que se uso fue la Lipasa F-AP15 de Amano y todas las

experimentos fueron sin emulsificante, para esto se uso una licuadora manual tipo braun.

Como solucin titulante se usa KOH 0.1 M para mantener un pH de 7.0. Los experimentos

se hicieron para un intervalo de entre 12 y 24 horas de reaccin.

La mezcla de reaccin se obtuvo en mezclando con un batidor manual,de marca Braun,

24 o 12 ml de aceite, de oliva o vegetal dependiendo del experimento con 36 o 18 ml de

buffer de fosfato 0.1 M pH 7.0 preparado anteriormente. Posteriormente se coloca en el vaso

de reaccin del equipo.

5.2 Instrumentos y equipos

El anlisis de la cintica de hidrlisis se hizo mediante un equipo de titulacin

electrnica (o automtica), la cual esta previamente programado con un pH-Stat. Para la


43/78

31

recopilacin de datos se necesito del programa Titramaster, tambin de Radiometer

Analytical en una computadora con las siguientes especificaciones tcnicas:

Window XP

Procesador Intel Pentium

1 GB de memoria RAM

Para preparar la solucin, se necesito de un vaso de precipitado de 500 ml, 2 pipetas

de 10 ml, una micropipeta con puntas de 1 ml, succionadores para las pipetas. Para la

agitacin de la mezcla durante la reaccin se necesito de un agitador magntico de 1 cm.

5.2.1. Estacin de Titulacin Automtica

La estacin de Titulacin Automtica Titralab (Figura 6) consta de 2 recipientes de

vidrio que se encuentran a los lados, por ser un equipo de configuracin Bi-buretal, donde se

colocan los reactivos. En cada uno de los recipientes hay una manguera roja, como se puede

ver en la figura 7, que es por donde pasan los reactivos al ser succionados por una bomba que

se encuentra en el interior del equipo. Los reactivos son dirigidos hacia las buretas que se

encuentran en la parte superior del titralab. La reaccin es medida por la diferencia de pH que

hay durante la reaccin por un potencimetro que se encuentra en la parte superior y cae

adentro del vaso de reaccin. Conforme el potencimetro detecta una variacin en el pH, este

manda una seal a la bureta para que agregue un poco de reactante neutralizante hasta que la

reaccin llegue a un pH establecido o set point.

5.2.2. Programacin y Operacin de Titralab 856

El equipo puede ser programando directamente desde la pantalla integrada o en forma

remota a travs de una computadora con un programa de comunicacin llamado titramaster.


44/78

32

La versin a utilizar fue Titramaster 85 versin Bidirectional FDA21CF11. Para este trabajo

se decidi programar desde el equipo, el software se utilizo para capturar datos.

Figura 6 Equipo de titulacin electrnica Titralab 856 de RadiometerAnalitical

El equipo cuenta con dos controladores uno que es AAA (Adaptive Addition

Algorithm) y PID (Proportional Integral and Derivative).

Consta de 4 pestaas, la primera es para la programacin del mtodo a seguir para la

reaccin, la siguiente es para la programacin, instalacin y calibracin de los reactivos y de

la bureta, la tercera es igualmente que el anterior pero en este caso solo para el electrodo o

potencimetro, y por ltimo, la cuarta pestaa, es para la velocidad de agitacin.

Dependiendo del estado de programacin en el que se encuentre el equipo los iconos de las

pestaas pueden variar.


45/78

33

La pantalla en el equipo se muestra de esta manera:

Figura 7 Pantalla principal que se muestra en el equipo para titulacin automtica Titralab 856

Tabla 6 Iconos que aparecern en las pestaas del equipo Titralab 856 dependiendo de su estado deprogramacin

Es necesario para que se pueda correr un mtodo, que las pestaas que corresponden a

los reactivos y el electrodo tengan un sol.

Para empezar a trabajar con el equipo, despus de conectar todas las partes, primero se

tiene que programar el electrodo o potencimetro, se instala y por ltimo se calibra como se

menciona en el anexo 1. Para la calibracin del electrodo se usaron dos soluciones buffer de

4.0 y 10.0 de pH. De igual manera, los reactivos se tienen que instalar como se menciona el

anexo 2.


46/78

34

El reactante o reactivo de titulacin, que este caso fue KOH 0.1 M fue colocado en el

recipiente de vidrio del lado derecho, ya que no era necesario otro reactivo.

Para este trabajo se utiliz un mtodo predeterminado en el equipo, que se llama OQ

Method 2 PID, este mtodo trae una configuracin pH-Stat con un controlador de algoritmo

PID. Los parmetros que se ingresaron para la programacin del mtodo fueron:

Editando Mtodo

Nota: Tanto en ID del electrodo y el titulador hay que seleccionar los que estn

instalados y calibrados en el equipo.

Para la recopilacin de los datos en el programa titramaster fue necesario conectar a la

computadora un cable doble DB9 hembra desde el puerto que se encuentra en la parte inferior

del equipo donde se puede colocar la impresora o la computadora, con la siguiente

configuracin:


47/78

35

Figura 8 Configuracin del cable para conectar el Titralab 856 a una computadora

Titramaster nos arroja un tipo de grfica volumen contra tiempo de este tipo

Figura 9 Ejemplo de grfica arrojada por titramaster para el anlisis de resultados

Haciendo click derecho encima de la grfica con el apuntador nos vamos a la opcin

de exportar a Excel y se nos guardara un archivo de Excel con todos los datos de la curva.

Con estos datos se hace el anlisis de resultados.


48/78

36

5.2.3. Reactor tipo tanque agitado

El tanque que se utilizo para llevar a cabo la reaccin fue un vaso de precipitado con

chaqueta de 100 ml de vidrio. El control de temperatura fue por medio de una bao mara con

bomba que recirculaba agua destilada por dentro de la chaqueta a 25 y 40C.

La mezcla de aceite-buffer emulsificada se agregaba al reactor con el agitador

encendido a 400 RPM para homogenizar la temperatura antes de la reaccin por 3 minutos.

Despus de pasar el tiempo se encenda el equipo Titralab para medir el pH de la mezcla y

este lo ajustaba hasta 7.0 de pH. Posteriormente se agregaba la enzima disuelta en 3 ml de

buffer y comenzaba la reaccin.

Figura 10 Esquema del reactor a usar para seguir la cintica de hidrlisis enzimtica


49/78

37

5.3. Diseo de Experimentos

Los experimentos fueron realizados completamente al azar modificando una variable

a la vez. Se estudio el efecto de la temperatura (25 y 40C) y la cantidad de lipasa FAP-15

(0.25 y 0.75% p/p aceite) sobre la hidrlisis enzimtica de aceite de oliva y comercial como

se describe en la Tabla 6.

Tabla 7 Diseo de experimentos para conocer la cintica de la lipasa F-AP15 en dos aceites

5.4 Anlisis de Datos

Los datos obtenidos en el programa Titramaster fueron exportados a Excel. La

concentracin de AGL se calcul por medio de la frmula propuesta por la AOCS, que es

para calcular el cido oleico.

Con los datos de concentracin se calcula la variacin en el tiempo de la

concentracin para el mtodo integral de Michaelis-Menten. Con estos datos se forma la

grfica para determinar Vmaxy KM.

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5

[enzima] 0.25% 0.75% 0.75% 0.25% 0.75%

Sustrato Oliva Oliva Oliva Comercial Comercial

Vol. Sustrato 24 ml 24 ml 12 ml 24 ml 12 ml

Vol. Buffer 36 ml 36 ml 18 ml 36 ml 18 ml

Temperatura 25 25 40 25 40

Tiempo 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas 24 horas


50/78

38

Los dems parmetros se calcularon, con base a la ecuacin 18. El lado izquierdo de

la ecuacin pertenece a los datos experimentales, donde se relaciona la concentracin de

AGL en ese momento y la concentracin de sustrato. La parte derecha es el modelo propuesto.

Se utiliz el paquete Solver de Excel para determinar las constantes que no se conocen hasta

que se ajustara a los puntos experimentales, tratando de tener un error de correlacin mnimo.


51/78

39

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Errores Experimentales

Para cada experimento se registr el volumen usado de KOH 0.1 M que se necesit

para que se mantuviera en un pH 7.0 y el tiempo. La figura 11 muestra la concentracin

AGL que se forman en la mezcla por la accin de la lipasa F-AP15 al romper los enlaces

ester en la molcula del aceite. Este experimento realizado a 25C y tuvo un tiempo de

reaccin de 12 y 24 horas respectivamente. Los puntos en verdes muestra la corrida 1 y en

morados la corrida 2 para corroborar la reproductibilidad de los experimentos.

Se observo la misma tendencia en ambos experimentos pudiendo concluir que la

calibracin del equipo en buena.

Se calcul la desviacin estndar y el error experimental dndonos como resultado

1.55 equivalente a una de desviacin estndar, 3.11% desviacin estndar relativa y 6% de

error experimental entre corridas. Debido a que las desviaciones entre replicas son muy

pequeas se decidi no realizar duplicados para los posteriores experimentos.


52/78

40

Figura 11 Cintica de hidrlisis de aceite de oliva grado analtico con enzima F-AP15. Estos datos fuerontomados con Titralab 856. Tanto la corrida 1 y 2 (exp. 1) son a las mismas condiciones, temperatura de25C y 0.25% en peso de lipasa F-AP15.

Figura 12Promedio de las concentraciones de AGL de las dos corridas del experimento 1 contra el tiempo

para calcular el error entre corridas. Los puntos anaranjados son los promedios de los datos experimentalesy las barras negras son los errores entre corridas.


53/78

41

6.2. Hidrlisis de Aceite de Oliva

Para conocer los parmetros cinticos de estas dos reacciones de hidrlisis de aceite

de oliva se utiliz el mtodo integral de Michaelis-Menten, que nos dar la linealizacin de la

cintica de la reaccin. Basndonos en la ecuacin (17), se obtuvo la grfica que se muestra

en la Figura 13.

Tomando el promedio de las dos corridas obtenemos una constante km/Vmax =

128.510.03 y 1/Vmax= 0.417450.03mol/h. Por lo tanto km y Vmaxson 307.830.03 y 2.3954

0.03 respectivamente. Entonces la ecuacin de Michaelis-Menten nos queda:

La conversin de la reaccin o modelo cintico se analiz por el modelo de

desactivacin enzimtica (ecuacin 24).

Figura 13 Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten para conocer la cintica de la reaccin de aceite

de oliva con lipasa F-AP15 de forma lineal de la reaccin. La pendiente de las lneas corresponde a laconstante km/Vmax y la ordenada en el origen es corresponde el inverso de la velocidad mxima.

y = 135.24x + 0.1766

R = 0.9745

y = 121.78x + 0.6583

R = 0.984

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

[AGL]/t(mol/Lh)

(Ln(([AGL]/[Ao]-[AGL])+1))/t

Corrida 1

Corrida 2


54/78

42

Figura 14 El modelo cintico de hidrlisis de aceite de oliva grado analtico con lipasa F-AP15 a 25C conuna concentracin de enzima del .25% w/w de aceite. La lnea continua representa el modelo cintico dedesactivacin de primer orden y los crculos representan los datos experimentales de la corrida 1.

Figura 15 Modelo cintico y datos experimentales de la corrida 2 a las mismas condiciones que la corrida1.Los datos experimentales se igualaron al modelo de desactivacin para conocer el comportamiento de lacintica.


55/78

43

En las dos figuras anteriores se modela el comportamiento de la cintica. Los puntos

rojos son los datos experimentales y la lnea continua negra es el modelo. Para hacer estos

clculos se us la ecuacin 27 y 29.

La ecuacin anterior (26) son los datos experimentales que tenemos, estos son

graficados contra el tiempo para ver su tendencia.

El modelo de desactivacin utiliza las constantes de inicio y de desactivacin. La

constante de desactivacin es como la explicacin del fenmeno de que a veces las enzimas

tardan o se detienen para empezar su funcionamiento. Tambin se le puede atribuir como una

constante biolgica de la naturaleza de la enzima. Como estas constantes son desconocidas se

utiliz el paquete Solver de Excel que ayuda a resolver ecuaciones por medio de mtodos

matemticos.

Para el modelo cintico corrida 1 las constantes fueron k0= 0.095677 y kD= 0.07028

con R2= 0.999y para el modelo cintico corrida 2 k0= 0.081703 y kD= 0.058244 con R2=

0.997. Por lo tanto el modelo cintico queda:

()

En las figuras 16 y 17 se ve el fenmeno que ocurre cuando en la reaccin se le

aumenta la concentracin de enzima. El cambio en la constante KMcasi no es notorio pero su


56/78

44

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 5 10 15 20

Hid

rlisis([AGL/S0])

Tiempo (h)

Exp 2 Exp 1

velocidad mxima aument, eso quiere decir que hay ms enzima en contacto con el rea de

aceite, pero la cintica es muy parecida.

Figura 16 Modelo cintico cuando se aumenta la concentracin ms de enzima a 0.75% y la temperaturaes 25C

Figura 17 Mtodo integral de la experimento 3 con enzima

y = 135.24x + 0.1766

R = 0.9745

y = 151.42x - 4.443

R = 0.9807

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

[AGL]/t

(Ln(([AGL]/[Ao]-[AGL])+1))/t

Exp 1 Exp 2


57/78

45

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 5 10 15 20 25

Hidrlisis[AGL/S0]

Tiempo (h)

exp 2

exp 3

Para el modelo cintico exp 2, las constantes k0 y kD fueron 0.1938 y 0.17173

respectivamente, con una R2igual a 0.997.

[()] Cuando se aumenta la temperatura y la concentracin de la enzima no se not un

cambio en la constante kM, pero en su velocidad mxima disminuy, como se muestra en las

figuras 18 y 19.

Figura 18 Mtodo integral de la experimento 3 donde se aumenta la concentracin de enzima a 0.75% y 40C


58/78

46

y = 144.94x - 0.2595R = 0.999

y = 135.24x + 0.1766R = 0.9745

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 0.02 0.04 0.06

[AGL]/t

(Ln(([AGL]/[S0]-[AGL])+1))/t

Figura19 Modelo cintico cuando se aumenta la concentracin de enzima a 0.75% y la temperatura a 40C

Para esta cintica k0 fue 0.03942 y kDigual a 0.3398 con una R2de 0.996.

[()]

Si comparamos los resultados de k0 y kD de los experimentos 1 y 2 donde la

temperatura fue la misma al aumentar la concentracin de enzima al triple, la k0 y kD

aumentan ms del doble pero su relacin (k0/kD) son muy parecidas. En el experimento 3 la

k0es ms pequea que en los otros experimentos, pero su kDes mucho ms grande. Esto se

debe a que, la lipasa F-AP15 trabaja ptimamente alrededor de 30C provocando que al

trabajar a 40C su actividad la desactivacin de la enzima sea ms rpida que su activacin

(Ben Salah et al. 1994).


59/78

47


60/78

48

Figura 21 Determinacin grafica de la constante de velocidad de primer orden (k) para elexperimento 1

Figura 22 Determinacin de la k experimento 2


61/78

49

Figura 23 Determinacin de k de experimento 3

Tabla 8 Parmetros cinticos de la hidrlisis enzimtica del aceite de oliva

ExperimentoVmax KM k0 kD k kcat km/kcat

(mol/h) (mol/L) (mol/mol h) (h-1) (h-1) (1/h) (mol/l h)

1 2.3954 307.84 0.0886 0.06426 43.842 1.3018 236.4638

2 0.225 34.0805 0.1938 0.17173 22.106 0.0407 836.1082

3 3.8535 558.53 0.0621 0.2367 65.423 4.1885 133.3456


62/78

50

6.3 Hidrlisis de Aceite Comercial

Se us un aceite de marca comercial para conocer la afinidad que tiene la lipasa

cuando se encuentra con un sustrato que no es puro como el que se uso en la parte anterior.

La mayora de los aceites comerciales contienen aceites derivados del maz, girasol, crtamo,

soya, entre otros. En general la composicin promedio de los aceites actualmente

comercializados tienen una composicin de cidos grasos como se menciona en la tabla 5.

Las condiciones de experimentos fueron; 0.25 y 0.75% w/w de aceitede enzima lipasa F-

AP15 Amano y temperatura de 25 y 40C.

Figura 24Cintica de hidrlisis en aceite comercial con enzima F-AP15. Estos datos fueron tomados conTitralab 856. Tanto la corrida 1 y 2 (exp. 1) son a las mismas condiciones, temperatura de 25C y 0.25% enpeso de lipasa F-AP15.

Al igual que en los experimentos en aceite de oliva, se utiliz las ecuacin (38) para

calcular la concentracin de AGL formados por la reaccin de hidrlisis.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

[AGL](m

ol/l)

tiempo (h)

Corrida 1

Corrida 2


63/78

51

Al ser las corrida 1 y 2, del experimento 4, rplicas, se calcul la desviacin estndar

que dio 1.44, desviacin relativa de 2.13% y con un error de 0.028.

Figura 25Promedio de las concentraciones de AGL de las dos corridas del experimento 4 contra el tiempopara calcular el error entre corridas. Los puntos azules son los promedios de los datos experimentales y lasbarras negras son los errores entre corridas siendo este un error del 0.028 con una desviacin estndar del1.44.

Si tomamos un promedio entre los dos experimentos nos resulta km igual de

139.810.02

mol

/Ly Vmax1.0850.02

mol

/s.

Usando el mismo mtodo para el anlisis de datos que el caso del aceite de oliva, el

modelo con aceite comercial queda de la siguiente manera.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20

[AGL

](mol/L)

Tiempo (h)


64/78

52

Figura 26 Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten para conocer la cintica de la reaccin del

aceite comercial con lipasa F-AP15 de forma lineal de la reaccin. La pendiente de las lneas corresponde ala constante km/Vmax y la ordenada en el origen es corresponde el inverso de la velocidad mxima.

La velocidad de hidrolisis nos queda:

Al aumentar la concentracin de enzima a 0.75% w/wy la temperatura a 40C, obtenemos

y = 144.44x - 0.1076R = 0.9997

y = 128.85x + 0.9216

R = 0.992

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

[AGL]/t

(Ln(([AGL]/[S0]-[AGL])+1))/t


65/78

53

Figura 27 Modelos cinticos de los experimentos 4 y 5 en aceite comercial y 0.25% w/wen peso de aceitede F-AP15 y a 25C (exp 4) y a 0.75% w/w en peso de aceite de F-AP15 a 40C (exp 5). La lnea continuarepresenta al modelo de primer orden propuesto y la lnea punteada representa los datos experimentalesobtenidos con el equipo elctrico Titralab 856.

Al igual forma, para el anlisis de datos obtenidos con la experimentacin, se us el

modelo de desactivacin enzimtica. La k0 del primera corrida con aceite comercial nos dio

0.09754 y kD fue 0.0899 con una R2 de 0.999. Para el segunda corrida fue k0= 0.10733 y kD=

0.083499 con R2= 0.9961. Si tomamos un promedio (k0=0.102430.02 y kD=0.08670.02)

entre las dos para ponerla en el modelo (ecuacin 23), al final se obtuvo:

()

k0nos queda 0.0417 y kD= 0.2799 con R2= 0.9981

[()]

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 5 10 15 20 25

Hidrlisis[AGL/S0]

Tiempo (h)

exp 4

exp 5


66/78

54

Figura 28 Determinacin de k para el experimento 4

Figura 29 kpara el experimento 5 cuando es aumentada su concentracin de enzima y temperatura


67/78

55

Tabla 9Parmetros cinticos de la hidrlisis enzimtica de aceite comercial

Experimento Vmax KM k0 kD k kcat km/kcat

(mol/h) (mol/L) (mol/mol h) (h

-

) (h

-

) (h

-

) (mol/l h)

4 1.085 139.81 0.10243 0.0867 32.15 0.5896 237.0971

5 9.2936 1342.37 0.0417 0.2799 70.83 10.1017 132.8850

6.4. Criterios de Diseo para un Reactor CSTR

Para el diseo del reactor se debe conocer las dimensiones que este debe tener. Se

estableci un volumen inicial de 60 ml de mezcla de reaccin, a cual se le ira agregando el

flujo necesario de reactivos para obtener un reactor continuo.

En promedio se obtuvo 3.3705 mol/h en la reaccin equivalente a 0.01213 mol/s,

esto quiere decir que se necesita 82.42 segundos para formar una mol de AGL (cido oleico).

Se fijo un volumen inicial del reactor de 60 ml.

Basndonos en el balance de masa de la ecuacin 34 con los resultados obtenidos en

los experimentos, se puedo establecer las dimensiones, velocidades de flujo de entrada de

reactantes y salida de productos en base al factor de dilucin (D).

Se calcul con base a la mxima conversin de hidrlisis que se obtuvo en los

experimentos:


68/78

56

Tabla 10 Clculo de los flujos a utilizar para llevar a cabo la reaccin de hidrlisis enzimtica de aceitesde origen vegetal para un reactor continuo

Experimento

Vmax

(mol/s)

KM

(mol/L) Conversin

[S0]

(mol/L) D (s-1

) Q (m3

/s) Q (cm3

/s) V (ml)

1 0.00862 0.000308 0.6 0.000147 15.6739 0.00094 940.432 60

2 0.00081 0.000034 0.7 0.000147 4.4403 0.00027 266.416 60

3 0.01387 0.000559 0.2 0.000147 82.0706 0.00492 4924.236 60

4 0.00391 0.000140 0.6 0.000145 13.1641 0.00079 789.849 60

5 0.03346 0.001342 0.12 0.000145 166.9240 0.01002 10015.442 60

Tabla 11Parmetros para un reactor de 50 litros para hidrlisis enzimtica de aceites vegetales con lalipasa F-AP15

ExperimentoVmax

(mol/s)KM

(mol/L)Conversin

[S0](mol/L)

D(s-1)

Q(m3/s)

Q(cm3/s)

1 0.00862 0.000308 0.6 0.000147 15.6739 0.78369 783693.360

2 0.00081 0.000034 0.7 0.000147 4.4403 0.22201 222013.710

3 0.01387 0.000559 0.2 0.000147 82.0706 4.10353 4103530.386

4 0.00391 0.000140 0.6 0.000145 13.1641 0.65821 658207.371

5 0.03346 0.001342 0.12 0.000145 166.9240 8.34620 8346202.077


69/78

57

7. CONCLUSIONES

Se pudo determinar los parmetros cinticos de hidrlisis enzimtica de aceites

vegetales utilizando el programa pH-Stat de la estacin de titulacin automtica para la

obtener los cambios de variacin de pH en la reaccin, que posteriormente, esos resultados

fueron procesados en Excel para analizarlos, teniendo como resultado parmetros con una R2

de alrededor de 0.97 en promedio.

Al utilizar la estacin de titulacin Automtica se estableci la programacin del

equipo, se obtuvo el programa Titramaster, como tambin se compraron los aditamentos del

equip para el monitoreo y recopilacin de datos de una reaccin cualquiera donde implique

un cambio de pH.

Se aplic el modelo de integracin de Michaelis-Menten para obtener los parmetros

cinticos de velocidad (Vmaxy KM) y el modelo de pseudo-primer orden de activacin (k0y

kD), donde en el ltimo modelo se pudo observa que los parmetros obtenidos son ms reales

que cuando se aplica un modelo de primer orden, ya que el modelo toma en cuenta todos los

puntos de la curva experimental, ajustando estos al modelo.

Se observ, tanto en los dos aceites, que el porcentaje de hidrlisis disminua al

aumentar la temperatura de 25 a 40C. En experimento 3 del aceite de oliva la disminucin

de hidrlisis fue del 66% en comparacin al experimento 1. De igual forma se puede ver este

efecto en los experimentos 4 y 5 del aceite comercial.

Cuando se aumento la concentracin de enzima de 0.25% w/w de aceite a 0.75%,

hubo un claro aumento en la hidrlisis de un 62% (exp 1) a un 70% (exp 2). Aunque si hubo


70/78

58

un aumento en la hidrlisis, tomando en cuenta que se aadi tres veces ms de enzima, se

pudo concluir a que no era factible aumentar la concentracin de enzima para obtener poca

respuesta de la reaccin cuando la reaccin es de 24 horas, pero si, cuando solo se quiere

hacer una reaccin corta de mximo cinco horas, ya que la pendiente del experimento 2 es

mucho ms grande que la del experimento 1, diciendo que se puede obtener ms rpido los

productos en la primera parte de la reaccin.

Cuando se vari ambas variables (temperatura y concentracin de enzima) se observ

una disminucin de la hidrlisis por efecto de la temperatura (exp 3 y exp 5). Concluyendo

que un rango de temperatura optimo de operacin sera de 25 a 30C.

Se propuso con base a las tablas 8, 9 y 10 un reactor nivel laboratorio para la sntesis

de AGL. Para un reactor de 50 litros para nivel industrial se proponen los siguientes flujos

dependiendo del tipo de experimento (tabla 11).


71/78

59

8. BIBLIOGRAFIA

(s.f.). Recuperado el 4 de Abril de 2012, de http://milksci.unizar.es/adit/emul.html

Brady, L. e. (1990). A Serine Protease Triads Forms the Catalytic Centre of a TriglycerolLipase.Nature, 343, 767-770.

Brzozowski, A. e. (1991). A Model for Interfacial Activation in Lipases from the Structure ofa Fungal Lipase-Inhibitor Complex .Nature, 351,491-494.

Ben Salah, A. et al. (1994) Revue franaise des corps gras, (41):133-137

Gacesa, P. (1990). Tecnologia de las Enzimas.Editorial Acribia S.A.

Gmez, N. e. (2003). Concentration of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid from

fish oil by hydrolysis and urea complexation.Food Research International, 36, 721-727.

Garcia, H. S. (1992). Use of Candida rugosa Lipase Immobilized in a Spiral WoundMembrane Reactor for Hydrolysis of Milkfat.Enzyme Microb. Technol., 14, 535-545.

Hou, C. T. (2002). Industrial Uses of Lipases. En H. W. Tsung Min Kuo. Gardner, LipidBiotechnology(pgs. 387-397). Peoria, Illinois: Marcel Dekker, Inc.

Jensen, R. D. (1983). Determination of Lipase Specificity .Lipids, 18(3), 239-252.

Kosugu, Y. T. (1990). Continuos hydrolysis of oil by immobilized lipase in a counter current

reactor.Biotechnol. Bioeng., 36:617-622.

Macrea, A. R. (1985). Biocatalysts in Organic Synthesis. En J. v. Tramper. Elevier,Amsterdam.

Macrea, A. R. (1985). Present and Future Applications of Lipases. Biotechnol. Genet. Eng.Rev., 3, 193-217.

Marangoni, A. G. (1995). Engineering Triacylglycerols: The role of interesterification.Trends Food Sci. Tecnhol., 6:329-335.

Marangoni, A. G. (2002). Lipases: Structure, Function, and Properties. En H. W. Tsung MinKuo. Gardner,Lipid Biotechnology(pgs. 357-386). Peoria, Illinois: Marcel Dekker, Inc.

Noriega, J. A. (2010). Purificacin de una Lipasa de las Vsceras de la Sardina (Sardinopsdagaz caerulea) y Evaluacin de su Actividad Lipoltica Sobre los cidos GrasosPoliinsaturados Instituto Tecnologico de Veracruz. Veracruz, Ver., Mxico.

ONeill, S. P. (1971). A comparative study of immobilized amyloglucosidase in a packed bedreactor and a continuos feed stirred tank reactor.Biotchnol. Bioeng., 13:337-352.

Paiva, A. L. (s.f.). Kinetics and Mechanisms of Reactions Catalyzed by Immobilized Lipases.Porto, Portugal: Escuela Superior de Biotecnologa, Universidad Catlica Portuguesa.


72/78

60

Pronk, W. e. (1988). The hydrolysis of tryglicerides by immobilized lipase in a hydrophilicmembrane reactor.Biotechnol Bioeng, 32:512-518.

Ramachandra, V. B. (2002). Hydrolysis of oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: AReview.Biotechnol. Bioprocess Eng., 7:57-66.

Richardson, F. H. (1992). Hydolysis of butter oil by immobilized lipase using a hollow-fiberreactor: Part 2 Uniresponse kinetic studies.Biotechnol. Bioeng., 984-1001.

Snchez F., A. (1998). Recuperacin, Purificacin, y Caracterizacin de Lipasas Producidaspor Candida rugosa. Aplicacin a la Resolucin de Compuestos Quirales y Diseo delReactor Enzimatico. Tsis Doctoral. Barcelona, Espaa.

Scrag, J. D. (1990). Ser-His-Glu Triads Forms the Catalytic Site of the Lipase fromGeotrichum candidum.Nature, 351, 761-764.

Segel, I. H. (1976).Biochemical calculations: How to solve mathematical problems inbiocgeneral biochemistry.New York: Wiley.

Taylor, F. K. (s.f.). Kinetics of Continuous Hydrolysis of Tallow in a Multi-Layered Flat-Plate Immobilized-Lipase Reactor.Recuperado el 5 de Abril de 2012, dehttp://wyndmoor.arserrc.gov/Page/D5700/5727-a.pdf

Tsai, S. L. (1990). Kinetics, mechanism, and time course analysis of lipase-catalyzedhydrolysis of high concentration olive oil in AOT-isooctone reverd micelles. Biotechnol.

Bioeng., 38:206-211.

Van Camp, J. H. (1998). Enzymatic Synthesis of Structure Modified Fats. En A. B.Christophe, Structural Modified Food Fats: Synthesis, Biochemistry, and Use(pgs. 20-45). Champaign, Illinois: AOCS Press.

Verhaege, D. F. (1990). Controlled Lipolysis of Milk Fat with Rhizopus arrhizus Lipase.Milchwissenschaft, 45(5), 275-280.

Winkler, F. K. (1990). Structure of Human Pancreatic Lipase.Nature, 343,771-774.

Yamane, T. S. (1987). Evaluation of half-life of immobilized enzyme during continuousreaction in bioreactors: A theorical study.Biotechnol. Bioeng. , 30:963-969.


73/78

61

9. ANEXOS

9.1. Programando electrodos

Ir a la librera de electrodos Seleccionar Nuevo electrodo Seleccionar funcin y ID

Seleccionar ID del catalogo o Presionar 1 para confirmar Para un electrodo combinadoDe otra lista. Presionar 1 la creacin del nuevo electrodo o sencillo o para un electrodo

De referencia, poner elpotencial (en mV) de lareferencia contra el electrodode hidrogeno estndar (SHE).

Para un electrodo combinadoo sencillo, si seleccionaron laotra lista, poner el pH internodel electrodo.Colocar la direccin delelectrodo.Seleccionar Si, si se requierede una calibracin. Paso 7Seleccionar No, para nocalibrar, presionar ESC parasalir del men. Programacincompleta.


74/78

62

Colocar los parmetros de Presionar 1 Poner los parmetros deCalibracin calibracin. Presionar ESC

y luego 2

Seleccionar las soluciones de Colocar los parmetros de los Poner los parmetros deBuffer a usar. Presionar ESC resultados. Presionar ESC y impresin. Presionar ESC

Y luego 3. Luego 4. Dos veces. La programacinEsta completa.


75/78

63

9.2. Programando los reactivos

Ir a la librera de reactivos Presionar 1Presione Cambiar

Selecciones un ID del catalogo Confirme la creacin del Colocar la direccin de laPoner objetivo a titular y nuevo reactivo. Bureta y la locacin del puntoUnidad. Punto de entrega.

Seleccionar titular= calibrarsi

Es necesario.Seleccionar titular = ponercolocar manualmente.Presionar ESC para salir delmen. Programacincompleta.


76/78

64

Colocar los parmetros de Presionar 1 Seleccionar el electrodo aCalibracin. Usar para la calibracin. Este

Electrodo debe ser el queest definido en el mtodousando este reactivo. Colocar

los parmetros de calibracin.Presionar ESC y luego 2.

Poner los parmetros de los Colocar los parmetros de los Poner los parmetros deEstndares a usar para la resultados. Presionar ESC y impresin. Presionar ESC 2Calibracin. Presiona ESC luego 4. Veces. La programacin estaY luego 3. Completa.


77/78

65

9.3. Programando mtodosCreando o editando mtodos

Seleccionar la librera de Presione 1 Poner ID. Presionar 1 para

Mtodos confirmar

Poner los parmetros del Presionar 1 y poner los Presionar cambiar y sele-Mtodo. Parmetros. ccionar el electrodo de la

lista.No olvidar seleccionar elmismo electrodo que secre en el mtodo decalibracin del reactivo.

Poner los otros parmetros.Presionar ESC y luego 2.


78/78

Poner los parmetros de la Poner los parmetros de los Colocar los parmetros de

Muestra. Presionar ESC y resultados. Presionar ESC y 4. Impresin. Sr se selecci-Luego 3. on una muestra QC en

el paso 4, presionar ESCy luego 5.

Colocar los datos QC. PresionarES

parámetros cinéticos para la hidrólisi enzimática de aceites vegetales usando una estación de...

Documents