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CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DE ENSENADA
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS
DE LA VIDA
Papel de proteínas con actividad glucanosiltransferasa en la
rigidización de la pared celular de Neurospora crassa
TESIS
que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS
Presenta:
Ana Lucía Cabello Aguirre
Ensenada, Baja California, México, 2012.
ii
las cepas mutantes resistían menor tiempo a este agente (Δmwg-1: 00:28 ± 8.12
seg.; Δgas-5: 00:21 ± 8.54 seg.; Δmwg-1/Δgas-5: 00:17 ± 4.59 seg.), en
comparación con la cepa control silvestre (00:47 ± 7.76 seg.). También se observó que inicialmente se producían aberraciónes morfológicas probablemente debido a un debilitamiento de la pared celular, con una posterior lisis celular en algunos
casos en la parte distal (wt y Δmwg-1) y en otros casos en la parte apical y
subapical (cepas mutantes Δgas-5, Δmwg-1/Δgas-5 y Δmwg-1). Los resultados
obtenidos sugieren, que las proteínas MWG-1 y GAS-5 están involucradas en la formación de la pared celular ya que las cepas mutantes de estas proteínas son hipersensibles al CR. Finalmente, tomando en consideración la presencia de diversas aberraciones morfológicas, la posterior lisis celular, y la disminución de ciertos procesos como velocidad de crecimiento hifal, menor producción de biomasa, hifas aéreas y conidios, es probable que las proteínas GAS-5 y MWG-1 tengan un papel importante en la rigidización de la pared celular de N. crassa.
Palabras clave: ScCrh1p/ScCrh2p, ScGas1p, Saccharomyces cerevisiae, MWG-1, GAS-5, Neurospora crassa, Congo rojo.
iii
ABSTRACT of the thesis presented by Ana Lucía Cabello Aguirre as a partial requirement to obtain the MASTER OF SCIENCE degree with orientation in MICROBIOLOGY. Ensenada, Baja California, México. March 2012.
“The role of proteins with predicted glucanosyltransferase activity in the
rigidification of the cell wall of Neurospora crassa”
Neurospora crassa is a filamentous fungus which belongs to the Phylum Ascomycota. One of the major topics in the biology of N. crassa, is the study of cell wall function and morphogenesis. The cell wall is composed of two layers: an internal fibrilar layer and an external amorphous layer. The external layer is formed by proteins and polysaccharides such as α-glucans, mannans, galactans and
heteropolysaccharides. The internal layer is formed by chitin, branched 1,3-β-glucans with 1,6-β linkage and 1,3-β-glucans crosslinked to chitin. In
Saccharomyces cerevisiae it is known that the enzyme ScGas1p acts first as an endoglucanase and then transfers the newly generated reducing end to the non-
reducing end of another oligosaccharide forming a new 1,3-β linkage. Moreover, it
is known that enzymes ScCrh1p/ScCrh2p are involved in the cross-linking between
1,3-β glucan and chitin by a transglycosylation reaction. The goal of this work was
to analyze the role of homologous proteins in N. crassa, through analysis of mutant strains lacking the genes mwg-1 (homologue of CRH1/CRH2) and gas-5 (homologue of GAS1). Therefore, we measured growth rate, biomass production, branching, formation of aerial hyphae and conidial production of the mutant strains
Δmwg-1, Δgas-5 and Δmwg-1/Δgas-5. Mutant strains did not show an affected
phenotype overall in terms of hyphal morphology, except for a decrease in branch production and an increasein conidial production. However, given an increase in susceptibility to Congo red (CR) is indicative of cell wall defects, the mutant strains were exposed to CR to test their predicted increased susceptibility to this agent.
The mutant strains Δmwg-1, Δgas-5 and Δmwg-1/Δgas-5 showed a decrease in
biomass production, aerial hyphae and conidial production. The growth rate of the
double mutant strain Δmwg-1/Δgas-5 was higher than that of the wild strain, while it
was diminished in the mutant strains Δmwg-1 and Δgas-5. In addition, the hyphal
morphology of the mutant strains and the wild type was analyzed, and the resistance of these strains to this agent (time before lysis) was measured. The
results showed that the mutant strains were less resistant to this agent (Δmwg-1:
00:28 ± 8.12 sec.; Δgas-5: 00:21 ± 8.54 sec.; Δmwg-1/Δgas-5: 00:17 ± 4.59 sec.),
when compared to the wild type strain (00:47 ± 7.76 sec). It was also noted that initially morphological aberrations were produced likely due to a weakening of the cell wall, with subsequent cell lysis in some cases at the distal area (strain wild type wt and strain mutant Δmwg-1) and in other cases in the apical and subapical area (strains mutants Δgas-5 and Δmwg-1/Δgas-5, Δmwg-1). The results suggest that proteins GAS-5 and MWG-1 are involved in cell wall formation since mutant strains for these proteins are hypersensitive to CR. Finally, taking into
iv
consideration the presence of various morphological aberrations, the subsequent cell lysis and the reduction of certain processes as hyphal growth rate, the lower biomass production, aerial hyphae and conidia, it is probable that proteins MWG-1 and GAS-5 have an important role in the rigidification of the cell wall of N. crassa.
Keywords: ScCrh1p/ScCrh2p, ScGas1p, Saccharomyces cerevisiae, MWG-1, GAS-5, Neurospora crassa, Congo red.
v
AGRADECIMIENTOS
Al CONACyT por apoyo económico otorgado durante la realización de mis
estudios.
Al CICESE por darme la oportunidad de continuar con mi preparación académica.
A la Dra. Meritxell Riquelme Pérez por el apoyo brindado para la realización de
este trabajo, así como por la asesoría y el conocimiento que me aportó.
A la Dra. M. del Pilar Sánchez Saavedra y al Dr. Salomón Bartnicki García por
aceptar ser parte de mi comité de tesis y, sobre todo, por sus valiosas
observaciones que mejoraron este trabajo.
A mis compañeros de laboratorio por su asesoría y apoyo brindado, y porque su
presencia hizo muy amena mi experiencia en el laboratorio.
A mi familia por todo el apoyo, comprensión, consejos, paciencia y amor que me
han otorgado a lo largo de toda mi vida, y sobre todo por ser también mis amigos,
los quiero mucho.
A mi novio Sergio Castillo por todos los buenos momentos, sus consejos, su
paciencia, por su inmenso amor, y por hacer que mi estancia en Ensenada fuera
parte de una de las experiencias más agradables de mi vida.
A todas las nuevas amistades que formé durante mi estancia en CICESE, que
compartieron conmigo cosas buenas y no tan buenas, por todas las cosas que me
enseñaron y porque hicieron que tuviera una experiencia realmente agradable
durante todo este tiempo, ustedes saben quienes son y simplemente no se
necesita de mucho tiempo para conocer y querer a personas tan agradables como
ustedes.
A todas mis amistades de toda mi vida que siempre estuvieron al pendiente de mi,
aconsejándome, apoyándome, queriéndome desde lejos, gracias por seguir ahí
todo este tiempo, forman parte de mi vida y los quiero mucho.
Muchas gracias a todos.
vi
CONTENIDO
Página
I-Introducción..........................................................................................................................1
II-Antecedentes........................................................................................................................5
II.1-Crecimiento apical y morfogénesis hifal........................................................................5
II.2-Composición química de la pared celular.....................................................................7
II.3-Organización molecular de la pared celular...............................................................10
II.4-Modelos de síntesis de la pared celular........................................................................13
II.5-Biosíntesis de los componentes de la pared celular………………………….............17
Biosíntesis de quitina..................................................................................................18
Biosíntesis de β-glucanos............................................................................................20
II.6-Entrecruzamiento de los polisacáridos de la pared celular.......................................21
II.7-Localización de las proteínas Gas1p y Crh1p/Crh2p en Saccharomyces
cerevisiae.................................................................................................................................31
Localización de Gas1p en S. cerevisiae......................................................................31
Localización de Crh1p y Crh2p en S. cerevisiae........................................................33
II.8-Justificación....................................................................................................................35
II.9-Hipótesis..........................................................................................................................36
II.10-Objetivo general...........................................................................................................36
II.11-Objetivos específicos....................................................................................................36
III-Metodología......................................................................................................................37
III.1 Análisis Bioinformático................................................................................................37
III.2-Crecimiento y mantenimiento de cepas de Neurospora crassa.................................37
a) Conidios...................................................................................................................37
b) Micelio.....................................................................................................................38
III.3-Colecta y conteo de células de Neurospora crassa.....................................................39
vii
CONTENIDO (CONTINUACIÓN)
Página
a) Conidios..................................................................................................................39
III.4-Caracterización de cepas de Neurospora crassa........................................................40
a) Análisis molecular de cepas mutantes de N. crassa...............................................40
Corroboración de la eliminación de los genes mwg-1 y gas-5.......................40
b) Obtención de cepas mutantes de mwg-1 homocariones.........................................41
c) Obtención de cepa doble mutante (Δmwg-1/Δgas-5)..............................................41
d) Activación y selección de ascosporas mutantes......................................................42
e) Determinación de la concentración subinhibitoria de congo rojo para la cepa
silvestre de N. crassa....................................................................................................43
f) Velocidad de crecimiento hifal y morfología microscópica de cepas
de N. crassa..................................................................................................................43
g) Medición de biomasa de cepas de N. crassa por peso seco....................................44
h) Cuantificación de ramificaciones de cepas de N. crassa........................................44
i) Medición de hifas aéreas y producción de conidios.................................................45
j) Análisis estadísticos..................................................................................................46
III.5-Técnicas de biología molecular....................................................................................46
a) Diseño de oligonucleótidos......................................................................................46
b) Extracción de ADN genómico de Neurospora crassa.............................................48
c) Amplificación de mwg-1, gas-5 y gfp......................................................................49
d) Construcciones genéticas de los genes mwg-1 y gas-5...........................................51
e) Construcción de vectores recombinantes................................................................53
Construcción de los plásmidos TOPO-mwg-1 y TOPO-gas-5........................53
Construcción de los plásmidos pALC01 y pALC02........................................54
viii
CONTENIDO (CONTINUACIÓN)
Página
Construcción de los plásmidos pALC03 y pALC04.........................................55
f) Clonación en bacterias E. coli TOP10....................................................................56
Preservación de células...................................................................................57
g) Purificación y análisis de restricción de vectores recombinantes..........................58
Purificación de vectores recombinantes..........................................................58
Análisis de restricción de vectores recombinantes..........................................58
h) Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)........................................................59
i) Electroforesis en gel de agarosa..............................................................................60
j) Secuenciación...........................................................................................................60
III.6-Obtención de cepas de Neurospora crassa etiquetadas con GFP.............................61
a) Linearización de plásmidos para la transformación de N. crassa.........................61
b) Transformación de N. crassa..................................................................................62
c) Recuperación de transformantes de N. crassa........................................................63
d) Comprobación de la integración de los plásmidos en el genoma de N. crassa......63
III.7-Microscopía confocal....................................................................................................64
IV-Resultados.........................................................................................................................65
VI.1 Análisis Bioinformático.................................................................................................65
IV.2-Conteo de conidios.........................................................................................................67
IV.3-Caracterización de cepas mutantes.............................................................................67
a) Análisis molecular de cepas mutantes de N. crassa................................................67
b) Obtención de cepas homocariones mutantes sencillas Δmwg-1.............................69
c) Obtención de cepas doble mutantes Δmwg-1/Δgas-5..............................................70
ix
CONTENIDO (CONTINUACIÓN)
Página
d) Determinación de la concentración subinhibitoria de congo rojo de la cepa
silvestre de N. crassa...................................................................................................71
e) Velocidad de crecimiento hifal y morfología microscópica de cepas de N. crassa72
f) Medición de biomasa de cepas de N. crassa por peso seco.....................................85
g) Cuantificación de ramificaciones de cepas de N. crassa........................................86
h) Medición de hifas aéreas y producción de conidios................................................87
IV.4-Técnicas de Biología Molecular...................................................................................89
a) Extracción de ADN genómico de Neurospora crassa.............................................89
b) Amplificación de los fragmentos de los genes mwg-1, gas-5 y gfp.........................90
c) Construcciones genéticas de los genes mwg-1 y gas-5...........................................91
d) Construcción, clonación y análisis de restricción de vectores recombinantes.......92
Plásmidos TOPO-mwg-1 y TOPO-gas-5.........................................................92
Plásmidos pALC01 y pALC02.........................................................................93
Plásmidos pALC03 y pALC04.........................................................................96
e) Secuenciación..........................................................................................................99
IV.5-Obtención de cepas de Neurospora crassa etiquetadas con GFP............................104
a) Linearización de plásmidos y transformación de N. crassa..................................104
b) Comprobación de la integración de los plásmidos en el genoma de N. crassa....105
V-Discusión...........................................................................................................................107
VI-Conclusiones...................................................................................................................116
VII-Bibliografía...................................................................................................................117
Anexos (videos suplementarios)
x
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Ciclo de reproducción de Neurospora crassa. Imagen extraída de Davis,
2000.
3
2 Unidad hifal de crecimiento que muestra la zona de crecimiento
periférico y zona de extensión. Imagen extraída de Gooday y Trinci,
1980.
5
3 Ápice de N. crassa en crecimiento. Imagen extraída de Harris et al.,
2005.
7
4 Arquitectura de una hifa de N. crassa mediante digestión enzimática
secuencial diseñada por Hunsley y Burnett, 1970. Imagen extraída de
Deacon, 2006.
10
5 Polisacáridos de la pared celular de Aspergillus fumigatus y
Saccharomyces cerevisiae. Se presentan los componentes de las
fracciones álcali-insoluble y álcali-soluble. Imagen extraída de Latgé,
2007.
11
6 Esquema del modelo unitario de crecimiento de la pared celular.
Bartnicki-García, 1973.
14
7 Modelo de crecimiento hifal basado en estudios en N. crassa. Zona A:
pared primaria, que contiene microfibrillas. El grosor de la pared se
mantiene constante y extensible por fusión de vesículas, que contienen
precursores de pared y/o enzimas líticas. La extensión de la hifa depende
del índice de suministro de vesículas. Zona B: región de diámetro hifal
constante. La pared no se extiende y tiene aproximadamente el mismo
grosor que la zona A. La rigidez de la pared puede involucrar la
formación de entrecruzamientos de polímeros o la adición de pequeñas
cantidades de nuevo material. Es posible que las vesículas no se fusionen
en esta región. Zona C: región de formación de pared secundaria. La
pared incremente en grosor con la distancia desde la punta,
convirtiéndose en una pared madura de un grosor constante. Zona D:
bajo condiciones de escasez de carbono algunos polímeros de la pared
pueden ser degradados para proveer sustratos para el metabolismo
endógeno. Imagen extraída de Trinci y Collinge, 1975.
15
8 Esquema del modelo “Steady-State” de Wessels y Sietsma, 1981. El
material depositado se hace rígido en la zona subapical. Extraído de
Deacon, 2006.
16
9 Modelo que representa el grado de entrecruzamiento entre los polímeros
de β-glucano y quitina en la región apical de la hifa durante el
crecimiento (A) y cuando la hifa no presenta crecimiento (B). La
densidad del punteado en la pared celular de la hifa representa el grado
de entrecruzamiento. Extraído de Wessels et al., 1983.
17
xi
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
10 Diagrama de algunos componentes de la síntesis de pared celular
trasnportados por vesículas a los ápices de las hifas. Se piensa que hay
vesículas que liberan las enzimas encargadas de la formación de la pared
(Quitina sintetasa y Glucano sintetasa) a la punta, en donde se unen a la
membrana plasmática como proteínas integrales. Imagen extraída de
Deacon, 2006
18
11 Esquema en donde se representa que las subunidades catalíticas de
enzimas sintasas son almacenadas y transportadas (inactivas) a partir de
vesículas de Golgi a la membrana plasmática. Se activan in situ en la
membrana plasmática por subunidades reguladoras y usan azucares
unidos a nucleótidos (NDP) como sustratos. Imagen extraída de Latgé,
2007
22
12 Esquema que representa los pasos hipotéticos sucesivos que permiten la
producción de la fracción álcali-insoluble de la pared celular de los
hongos. Imagen extraída de Latgé, 2007.
22
13 Función putativa de las proteínas de anclaje mediante el motivo GPI
durante la construcción de la pared celular de los hongos. (i) Las
proteínas de anclaje mediante el motivo GPI (P1) que permanecen
ancladas a la membrana plasmática remodelan los polisacáridos de la
pared celular (Ejemplos: proteínas Gel/Gas o Crh). (ii) Las proteínas de
anclaje mediante el motivo GPI (P2) se enlazan covalentemente a los β-
1,3-glucanos a través de β-1,6-glucanos. Esta es una manera en que la
proteína P2 puede permanecer en la superficie de la pared celular para
cumplir su función biológica. Imagen extraída de Latgé, 2007.
23
14 Análisis HPAEC de los productos de la incubación de las proteínas
recombinantes Gel1p, Gas1p, Phr1p y Phr2p con laminarioligosacáridos.
(A) Análisis del producto después de 0, 1, 8 y 20 horas de incubación
con Gel1p. (B) Análisis de los productos obtenidos con Gas1p, Phr1p y
Phr2p (To idéntico a (A)). Imagen extraída de Mouyna et al., 2000.
26
15 (A) Imágenes de los ensayos de sensibilidad al Calcofluor (CF), las
células se hicieron crecer hasta la fase log en YPD a 30°C. Se realizaron
diluciones 10-2 a 10-4, de la suspensión concentrada 10-1 de la cepa
W303-1A, un derivado de la cepa mutante de gas1 (WAH) y JC9, una
mutante de gas1 que contiene una copia integrada de mRFP-Gas1,
fueron inoculadas en placas con medio YPDA. Después de 48 hrs a 30°C
de la cepa diploide AN120, un derivado homocigoto de la mutante gas1
que llevan el plásmido YEp24 (ER333) (control), YEp24-GAS1-GFP
(ER337) o pRS416-Gas1-GFP (ER336). (B y D) Morfología de las
células fijadas en formalina. Imagen extraída de Rolli et al., 2009.
27
xii
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
16 Determinación de las fracciones álcali-insoluble/ácido-soluble, álcali-
soluble y álcali-insoluble/ácido-soluble de los glucanos de la pared
celular de la cepa silvestre y de las cepas mutantes: Δcrh1, Δcrh2 y
Δcrh1/Δcrh2. Toda la fracción de glucano que permanece después del
tratamiento con proteasa de las paredes celulares purificadas se considero
el 100%, y el contenido de quitina para cada cepa, en microgramos de
glucosamina por miligramo (peso seco) de las células. Imagen extraída
de Rodríguez-Peña et al., 2000.
29
17 Imágenes que muestran los ensayos de sensibilidad al Congo rojo (CR) y
Calcofluor (CF) de las cepas mutantes Δcrh1 y Δcrh2, de la cepa doble
mutante Δcrh1/Δcrh2 y de la cepa silvestre. Las células se hicieron crecer
en medio YED, y se inoculó una serie de diluciones 1/10 de cada cepa en
placas con medio YED que contenían CR y CF en las concentraciones en
la que indica la imagen. Imagen extraída de Rodríguez-Peña et al., 2000.
30
18 Ensayos de crecimiento en medio YED con CR en las cantidades
indicadas, de las cepas mutantes de los genes crh1 y crh2 transformadas
con los plásmidos que contenían los genes de interés (pRS416:
centromérico, YEp352: episómico). Imagen extraída de Rodríguez-Peña
et al., 2000.
30
19 La proteína Gas1p etiquetada con mRFP y GFP está asociada a la
membrana plasmática, el cuello de la yema y en las cicatrices de la
gemación. Las puntas de flecha y los puntos señalan el cuello de la yema
o el septo. Las flechas indican las cicatrices de las gemas. Escala 3 µm.
Imagen extraída de Rolli et al., 2009.
32
20 Microscopía confocal de la localización celular de Crh1-GFP y Crh2-
GFP. (A a F) Imágenes de células mutantes del gen crh1 transformadas
con el plásmido pJV89G que tiene el constructo Crh1-GFP. (H a Q) Serie
de tiempo de la cepa mutante de crh2 transformada con el plásmido
pJV40G que tiene la construcción Crh2-GFP. Imagen extraída de
Rodríguez-Peña et al., 2000.
34
21 Representación esquemática de la cámara de Neubauer. El color
anaranjado, indica los cuadrantes considerados durante el conteo celular.
(valor de profundidad: 10,000).
39
22 Representación esquemática para la medición de hifas aéreas. (M:
Medición).
45
23 Representación esquemática de la amplificación de los fragmentos
mediante PCR. En el inciso A se representan los fragmentos de 557 pb y
1,064 pb del gen mwg-1 (en azul) y en el inciso B los fragmentos de 356
pb y 1,520 pb del gen gas-5 (en rosa).
50
xiii
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN) Figura Página
24 Representación esquemática de la amplificación de los genes mwg-1 y
gas-5 mediante PCR. En el inciso A se representa el gen mwg-1 de 1,159
pb (en morado) y en el inciso B el gen gas-5 de 1,552 pb (en rojo).
51
25 Representación esquemática de la fusión de los fragmentos de mwg-1 y
gas-5 con gfp mediante PCR. En el inciso A se representa la fusión del
fragmento UTR-ORF de mwg-1 (en azul) con el gen gfp (en verde) de
1,255 pb y la fusión del fragmento ORF de mwg-1 (en azul) con el gen
gfp (en verde) de 1,830 pb. En el inciso B se representa la fusión del
fragmento UTR-ORF del gen gas-5 (en rosa) con el gen gfp (en verde)
de 1,071 pb y la fusión del fragmento ORF de gas-5 (en rosa) con el gen
gfp (en verde) de 2,235 pb.
52
26 Representación esquemática de las construcciones moleculares (CG´s)
realizadas mediante PCR. En el inciso A se representa la CG UTR/ORF
5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1 (en azul y verde) de 2,297 pb y en el inciso B
se encuentra la CG UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5 (en rosa y verde)
de 2,552 pb.
53
27 Representación esquemática del método de bloque de agar invertido
(modificado de Hickey et al., 2004).
64
28 Representación esquemática de la secuencia proteica del gen mwg1 (Cell
Wall Glucanosyltransferase) de 364 aminoácidos.
66
29 Representación esquemática de la secuencia proteica del gen gas5
(Glycolipid-anchored surface protein5) de 457 aminoácidos.
66
30 Las bandas en el gel de electroforesis indican el ADN genómico de las
cepas mutantes y la cepa silvestre control (wt). M: Marcador molecular
Lambda (ʎ)1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
67
31 Las bandas en el gel de electroforesis con tamaño de aproximadamente
1kb corresponden a la amplificación del gen mwg1, y las bandas con
tamaño de aproximadamente 500pb corresponden a la amplificación del
gen control Chi2. M: Marcador molecular Lambda (ʎ)1Kb ADN (3µl)
(BioLabs®).
68
32 Las bandas en el gel de electroforesis con tamaño de aproximadamente
1.5kb corresponden a la amplificación del gen gas5, y las bandas con
tamaño de aproximadamente 1Kb corresponden a la amplificación del
gen mwg1 como control positivo. M: Marcador molecular Lambda
(ʎ)1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
68
33 Las bandas en el gel de electroforesis indican el ADN genómico de los
conidios provenientes de las ascosporas mutantes de mwg1 y la cepa
silvestre control. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
69
xiv
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN) Figura Página
34 Las bandas en el gel de electroforesis correspondientes a la cepa wt y con
tamaño de aproximadamente 1kb, representan la amplificación del gen
mwg1 y del gen control Chi2. Las bandas de aproximadamente 1kb de
las cepas #9, #11 y #12 corresponden al gen control Chi2. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
69
35 La banda en el gel de electroforesis corresponde al ADN genómico de
los conidios provenientes de las ascosporas mutantes de mwg1/gas5. M:
Marcador molecular Lambda (ʎ)1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
70
36 La banda en el gel de electroforesis correspondiente a la cepa doble
mutante de mwg1/gas5 y con tamaño de aproximadamente 1kb,
representa la amplificación del gen control Chi2. No se presentaron
bandas indicativas de la presencia de los genes mwg1 y gas5. M:
Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
71
37 Esquema en donde se representa el comportamiento de la cepa silvestre
bajo distintas concentraciones de congo rojo (CR).
71
38 Crecimiento hifal (µm/min) de las cepas mutantes y su control la cepa
silvestre, en presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos
superíndices indican diferencia significativa entre los tratamientos
(p˂0.05 en donde a˃b˃c). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
72
39 Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa silvestre, en presencia y
ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices indican el
tiempo transcurrido durante el crecimiento (h:min:seg). Bajo la presencia
de congo rojo se puede observar un cambio en la morfología hifal. Las
barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la escala.
74
40 Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de mwg-1, en
presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices
indican el tiempo transcurrido durante el crecimiento (h:min:seg). Bajo
la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la morfología
hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la
escala.
77
41 Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de gas-5, en
presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices
indican el tiempo transcurrido durante el crecimiento (h:min:seg). Bajo
la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la morfología
hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la
escala.
80
xv
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
42 Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de mwg-1/gas-
5, en presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos
subíndices indican el tiempo transcurrido durante el crecimiento
(h:min:seg). Bajo la presencia de congo rojo se puede observar un
cambio en la morfología hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de
cada imagen indican la escala.
83
43 Tiempo de resistencia a congo rojo (segundos) de las cepas mutantes y
su control la cepa silvestre, en presencia de congo rojo (10 µg/µl). Los
distintos superíndices indican diferencia significativa entre el
comportamiento de las cepas (p˂0.05 en donde a˃b).
85
44 Peso seco (mg) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en
presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos superíndices
indican diferencia significativa entre los tratamientos (p˂0.05 en donde
a˃b˃c˃d˃e). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
86
45 Ramificaciones/mm de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre.
Los distintos superíndices indican diferencia significativa entre las cepas
(p˂0.05 en donde a˃b˃c).
87
46 Hifas aéreas (cm) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en
presencia y ausencia de CR (10 µg/µl). Los distintos superíndices
indican diferencia significativa entre los tratamientos (p˂0.05 en donde
a˃b˃c˃d). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
88
47 Conidiación (conidios/ml) de las cepas mutantes y su control la cepa
silvestre, en presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos
superíndices indican diferencia significativa entre los tratamientos
(p˂0.05 en donde a˃b˃c). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
89
48 La banda en el gel de electroforesis corresponde al ADN genómico de
los conidios provenientes de la cepa silvestre. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (BioLabs®).
89
49 Las bandas en los geles de electroforesis corresponden a los fragmentos
de los genes mwg1 y gas5, y al gen gfp. M: Marcador molecular Lambda
(ʎ) 1Kb ADN (3µl) (BioLabs®) (Fermentas®).
90
50 Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a los genes mwg1 y
gas5. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
90
51 Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a la fusión de los
fragmentos de los genes mwg1 y gas5 con el gen gfp. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
91
52 Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a las construcciones
genéticas de los genes mwg1 y gas5. M: Marcador molecular Lambda (ʎ)
1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
91
xvi
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
53 Los patrones de restricción en el gel de electroforesis corresponden a las
plásmidos TOPO-mwg1 y TOPO-gas5. Las figuras rojas indican los
plásmidos seleccionados para la construcción de los plásmidos pALC01
y pALC02, respectivamente. Controles: 1, plásmido PMF272, 2,
plásmido PMF272 digerido con EcoRI, 3, plásmido PMF272 extraído y
digerido con EcoRI, 4, plásmido 2-6. M: Marcador molecular Lambda
(ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
92
54 Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las
plásmidos TOPO-mwg1 (1-2 y 1-7), los cuales liberaron el fragmento de
1,159 pb que corresponden al gen mwg1 y TOPO-gas5 (2-3 y 2-8), los
cuales liberaron el fragmento de 1,552 pb que corresponden al gen gas5.
M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
93
55 La imagen A esquematiza el plásmido pALC01, el gen mwg1 se
encuentra en color rojo. La imagen B esquematiza el plásmido pALC02,
donde el gen gas5 se encuentra en color morado. La etiqueta con el gen
gfp se encuentra en color verde y en el extremo 3´ en ambos genes.
94
56 Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 1kb
corresponden a la amplificación del gen mwg1 y las de 1.5 kb a la
amplificación del gen gas5. Las figuras rojas indican los plásmidos
seleccionados para el análisis de restricción. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
95
57 Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las
plásmidos pALC01 y pALC02 extraídos de las colonias positivas
seleccionadas por PCR. Las figuras rojas indican los plásmidos
seleccionados para la transformación de N. crassa. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
96
58 La imagen A esquematiza el plásmido pALC03, el gen mwg1 se
encuentra en color azul. La imagen B esquematiza el plásmido pALC04,
donde el gen gas5 se encuentra en color rosa. La etiqueta con el gen gfp
se encuentra en ambos genes de color verde y después de la secuencia
que codifica el péptido señal.
97
59 Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a las construcciones
genéticas de mwg1 (2.2 Kb) y gas5 (2.5 Kb) digeridas con EcoRI y
XbaI. La C indica el control PMF272 sin digestión y la P indica el
plásmido PMF272 digerido con EcoRI y XbaI. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
97
xvii
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
60 La banda en el gel de electroforesis de aproximadamente 1kb
corresponde a la amplificación del gen mwg1 y las bandas de 1.5 kb a la
amplificación del gen gas5. Las figuras rojas indican los plásmidos
seleccionados para el análisis de restricción. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
98
61 Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las
plásmidos extraídos de las colonias positivas para la presencia de
pALC03 y pALC04. El plásmido pALC03.4 liberó la construcción
genética PSgfp::mwg-1 de 2.2 kb. Los plásmidos pALC04 liberaron la
construcción genética PSgfp::gas-5 de 2.5 kb. El control P indica el
plásmido PMF272. Las figuras rojas indican los plásmidos seleccionados
para la transformación de N. crassa. M: Marcador molecular Lambda (ʎ)
1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
99
62 Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia
in silico del plásmido pALC03.4 y la secuencia UTR/ORF 5´::gfp del
constructo genético de mwg-1. No se observan cambios que perjudiquen
el marco de lectura del constructo genético.
100
63 Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia
in silico del plásmido pALC04.2 y la secuencia UTR/ORF 5´::gfp del
constructo genético de gas-5. No se observan cambios que perjudiquen el
marco de lectura del constructo genético.
102
64 Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia
in silico del plásmido pALC04.2 y la secuencia ORF 3´ del constructo
genético de gas-5. Los recuadros rojos al igual que el símbolo # indican
los lugares de mutación de la secuencia.
103
65 Las bandas 01.1-7.2L, 02.2-8.3L, 03.4L y 04.2L en el gel de
electroforesis corresponden a los plásmidos linerizados. La P indica el
plásmido control PMF272. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb
ADN (3µl) (Fermentas®).
104
66 Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 2.1kb
corresponden a la amplificación de la región His-3
/ccg-1 de las
transformantes TpALC01.1-7.2 y TpALC02.2-8.3. C+ indica el control
positivo. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
105
67 Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 4.2kb
corresponden a las amplificaciones de las regiones gfp::mwg-1/His-3
y
gfp::gas-5/His-3
de las transformantes TpALC03.4 y TpALC04.2,
respectivamente. C+ indica el control positivo. Las flechas rojas señalan
las bandas. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
106
xviii
LISTA DE FIGURAS (CONTINUACIÓN)
Figura Página
68 Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 2.1kb
corresponden a la amplificación de la región His-3
/ccg-1 de las
transformantes TpALC03.4 y TpALC04.2. C+ indica el control positivo.
M: Marcador molecular Lambda (ʎ)1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
106
xix
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
I Principales carbohidratos que componen la pared celular de los hongos
durante su estadio vegetativo. Extraído de Latgé y Calderone, 2006 tomado
de Bartnicki-García, 1968.
9
II Familias de enzimas involucradas en la síntesis de los componentes de la
pared celular de los hongos, encargadas de la formación de enlaces intra- e
inter-poliméricos. GH*: Glucosilhidrolasa, GPI*: Glucosilfosfatidilinositol
(Klis et al., 2007).
24
III Cepas de N. crassa que se utilizaron en este estudio. 38
IV Oligonucleótidos utilizados en este estudio. Las secuencias para el corte por
enzimas de restricción están señaladas en negritas. Las secuencias para la
complementación con gfp están subrayadas. El codón que codifica para la
prolina se encuentra en cursiva.
48
V Número de conidios de cepas de N. crassa que se utilizaron en este estudio. 67
VI Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la
cepa control wt en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de muestra
corresponde a los números de muestras de las imágenes de las series de
tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
75
VII Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la
cepa mutante Δmwg-1 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de
muestra corresponde a los números de muestras de las imágenes de las
series de tiempo. X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
78
VIII Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la
cepa mutante Δgas-5 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de
muestra corresponde a los números de muestras de las imágenes de las
series de tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
81
IX Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la
cepa mutante Δmwg-1/Δgas-5 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número
de muestra corresponde a los números de muestras de las imágenes de las
series de tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
84
Capítulo I
Introducción
El reino Fungi comprende más de 1.5 millones de especies, la mayoría de las
cuales corresponden a hongos filamentosos. Algunos miembros de este diverso
grupo de organismos pueden encontrarse en casi cualquier ecosistema, ya que
son los principales agentes saprobios y tienen un papel crítico en el reciclaje de
nutrientes (Borkovich et al., 2004; Carlile et al., 2001; May y Adams, 2010). Los
hongos se encuentran comúnmente formando asociaciones benéficas o
perjudiciales con organismos como plantas, animales y humanos. Por ejemplo,
algunos hongos filamentosos son patógenos importantes de plantas causando
pérdidas significativas y devastadoras a nivel mundial. Por otra parte, pueden
formar micorrizas, una simbiosis con las raíces de las plantas, que las provee de
una mejor absorción de nutrientes (Borkovich et al., 2004; Carlile et al., 2001; May
y Adams, 2010). En biotecnología, son los organismos más utilizados para
sintetizar un amplio rango de componentes importantes para la industria de
alimentos, y para la producción de enzimas y metabolitos secundarios, incluyendo
antibióticos y otros fármacos (Borkovich et al., 2004; May y Adams, 2010).
Recientemente muchas especies de hongos se han utilizado como modelo para el
estudio de la estructura y función de genes específicos, y de procesos celulares
fundamentales, como la generación de energía (NADH, FADH), el control del
metabolismo y los mecanismos de la herencia. Lo anterior gracias a que estos
organismos pueden desarrollarse fácilmente en cultivo con altos índices de
crecimiento, y tienen un estadio haploide, lo que permite que el cambio de un gen
no sea inhibido por la actividad de un alelo dominante y se facilite la aplicación de
la tecnología del ADN recombinante (Carlile et al., 2001).
2
Uno de los organismos fúngicos modelo más estudiado es Neurospora crassa, un
hongo filamentoso que pertenece al Phylum Ascomycota. En 1843 fue descrito
como el agente causal de “la infestación naranja del pan”, y fue usado por primera
vez como organismo experimental por Bernard O. Dodge y Carl C. Lindegren a
principios del siglo XX (Borkovich et al., 2004).
La reproducción de N. crassa comprende dos ciclos: asexual y sexual (Figura 1).
Durante el ciclo asexual se diferencían las hifas aéreas, que crecen de manera
perpendicular a la superficie. Las hifas diferenciadas son conocidas como
conidióforos, y mediante mitosis dan lugar a los macroconidios, que tienen uno o
más núcleos haploides. Cuando los macroconidios están maduros tienen una
capa de proteínas hidrofóbicas que los mantienen secos, para que al ser
liberados, el aire permitasu dispersiónperse. Bajo condiciones adecuadas, el
conidio germina con la sucesiva extensión del tubo germinativo hasta la formación
de una hifa septada, la cual continúa creciendo por extensión y ramificación,
formando un micelio típico. El micelio, particularmente los conidios, desarrollan un
intenso color anaranjado, debido al pigmento carotenoide que poseen. Una vez
agotados los nutrientes, las hifas aéreas producen macroconidios y el ciclo se
repite, permitiendo la reproducción del hongo (Borkovich et al., 2004; Davis,
2000).
En el ciclo sexual, el micelio puede producir estructuras reproductivas masculinas
y femeninas; sin embargo, la reproducción puede tomar lugar solo entre cepas
que contengan diferentes formas genéticas, es decir, diferente tipo de
apareamiento (mat A y mat a) (Borkovich et al., 2004; Davis, 2000). La estructura
reproductiva femenina, conocida como protoperitecio, comienza a formar una
masa compacta de hifas que rodean a un grupo de células, éstas se diferencian y
forman un ascogonio; una de estas células actúa como gameto femenino y
produce hifas especializadas denominadas tricóginas. Las tricóginas presentan
quimiotropismo hacia las feromonas emitidas por conidios con diferente tipo de
apareamiento. Luego se lleva a cabo el contacto y la fusión celular, que permite la
3
entrada de los núcleos masculinos a la tricógina y su posterior transporte a la
célula ascogonial del protoperitecio (Borkovich et al., 2004; Davis, 2000). Los
núcleos de ambos tipos de apareamiento se dividen por mitosis hasta formar una
masa ascógena hifal. Las puntas de las hifas ascógenas (crozier), incluyen
células binucleadas en las cuales la cariogamia (fusión nuclear) toma lugar. Cada
célula diploide entra a meiosis, seguida de una mitosis, para dar lugar a un asca
que contiene ocho ascosporas (Borkovich et al., 2004; Davis, 2000). Las puntas
de las ascas se acercan al ostiolo del peritecio, y por efecto de la presión
osmótica, disparan las ascosporas, las cuales tienen una sustancia para asegurar
su adherencia al sustrato en que caigan (Borkovich et al., 2004; Davis, 2000).
Figura 1. Ciclo de vida de Neurospora crassa. Imagen extraída de Davis, 2000.
4
Ya que el genoma de N. crassa ha sido secuenciado, los análisis genéticos son
más simples (Borkovich et al., 2004). Por consiguiente, se han realizado diversos
programas de investigación, que abarcan desde análisis de poblaciones, genética
molecular, bioquímica, fisiología y biología celular y molecular, hasta estudios más
recientes acerca de su desarrollo, fotobiología, ritmos circadianos, silenciamiento
de genes, ecología y evolución (Borkovich et al., 2004). Uno de los tópicos más
importantes en la biología de N. crassa, es el de la función y morfogénesis de la
pared celular, la cual es esencial para proteger a la célula contra daños y para
crear y conservar la forma celular. Todo ello ha constituido la base para llevar a
cabo estudios extensivos diseñados para elucidar la composición y síntesis de la
pared celular (Borkovich et al., 2004; De Groot et al., 2005; Hartland et al., 1996;
Kollár et al., 1997).
5
Capítulo II
Antecedentes
II.1-Crecimiento apical y morfogénesis hifal
La pared celular de las hifas se extiende de acuerdo a un gradiente de síntesis, el
cual es mayor en la punta de la hifa y disminuye conforme se acerca a la base de
la zona de extensión (Figura 2), por lo tanto la mayor parte del crecimiento de la
hifa ocurre en los ápices, es decir, su crecimiento es de tipo apical (Reinhardt,
1892). Esto posteriormente fue demostrado mediante estudios de autoradiografía,
en donde se observó un gradiente de síntesis de pared (quitina y quitosana) en
las hifas de Mucor rouxii (Bartnicki-García y Lippman, 1969; Wessels et al., 1983),
lo que después se confirmó de igual manera en hifas de N. crassa, Schizophyllum
commune y Phytophthora parasítica (Gooday, 1971).
Se descubrió el Spitzenkörper (del alemán Spitzen= punta + körper= cuerpo) en
hifas de Coprinus sterquilinus y C. narcoticus fijadas y teñidas con hematoxilina
de hierro (Brunswik, 1924); y se observó que esta estructura estaba relacionada
Figura 2. Unidad hifal de crecimiento que muestra la zona de crecimiento periférico y zona de
extensión. Imagen extraída de Gooday y Trinci, 1980.
6
con el crecimiento apical de la hifa (Girbart, 1957). Girbart describió al
Spitzenkörper (Spk) como un complejo proteico de fase oscura mediante
exámenes de hifas vivas de Polystictus versicolor en el microscopio de contraste
de fases. Se observó que cuando las hifas dejaban de crecer el Spk desaparecía,
y cuando el crecimiento se reanudaba el Spk reaparecía. Por lo tanto, se concluyó
que esta estructura estaba relacionada en el crecimiento apical y tiene la
capacidad de controlar la dirección de crecimiento de la hifa (Girbardt, 1957). Por
medio de microscopía electrónica de transmisión se encontró que el Spk de
diferentes especies fúngicas, incluyendo a N. crassa, contiene vesículas apicales,
microvesículas y ribosomas (Girbardt, 1969; Grove y Bracker, 1970).
En el Spk aparece una pequeña zona especializada dentro del conjunto de
vesículas que contiene microvesículas, microtúbulos y algunos ribosomas. Esta
zona se encuentra rodeada por vesículas y carecede un límite o de una
membrana. Posteriormente se descubrieron vesículas con actividad quitina
sintetasa, a las cuales denominaron quitosomas (Bracker et al., 1976).
Tomando en consideración el reduccionismo fisiológico y modelos matemáticos,
se diseñó el software Fungus Simulator. Este programa simula el crecimiento
basado en una descarga continua de vesículas; con eso acuñan el término Centro
Suministrador de Vesículas (VSC por sus siglas en inglés). La posición y
movimiento del VSC se convierte en el determinante de la morfogénesis, un VSC
estacionario libera vesículas a la superficie celular en cantidades iguales en todas
las direcciones, y la célula crece de forma esférica. Cualquier desplazamiento del
VSC de su original posición central distorsiona la forma esférica. Sin embargo, un
constante desplazamiento linear del VSC genera la forma cilíndrica de las hifas
fúngicas y por lo tanto simula el crecimiento apical (Bartnicki-García et al., 1989).
Subsecuentemente, se realizaron trabajos en donde imitaron el comportamiento
del Spk de Rhizoctona solani con el software Fungus Simulator. Con esto se
concluyó que existía una correlación entre el Spk y el VSC, la cual produce un
fuerte gradiente de exocitosis, que involucra el movimiento ordenado de vesículas
7
desde las regiones más distales de la hifa hasta el ápice, y que determina la
dirección de la deposición de material, y por consiguiente la dirección de
crecimiento apical (Figura 3) (Bartnicki-García et al., 1995; Riquelme et al., 1998;
2002).
Mediante la manipulación del Spk con el uso de un láser, fué posible cambiar la
dirección de crecimiento de las hifas así como ocasionar otras alteraciones
morfológicas (Bracker y López-Franco, 1997), y con ello confirmar la hipótesis de
que el patrón de crecimiento apical es dirigido por la posición del Spk.
II.2-Composición química de la pared celular
La pared celular define a los hongos y los distingue de otras formas de vida. Es un
componente permanente y altamente versátil, continuamente se expande durante
el crecimiento, y lleva a cabo una remodelación extensiva durante su desarrollo.
Mediante la manipulación de la construcción de la pared celular, los hongos
pueden asumir una variedad de morfologías para realizar una amplia diversidad
de funciones, tales como: crecimiento vegetativo, colonización de sustratos,
reproducción, dispersión, supervivencia, penetración de hospederos y predación
animal, entre otras (Bartnicki-García, 1968).
Es importante elucidar las propiedades de la pared celular para determinar hasta
qué magnitud está involucrada en las diversas actividades fisiológicas y
Figura 3. Ápice de una hifa de N. crassa en crecimiento. (a) Imagen en contraste de fases de una hifa
no teñida, muestra el Spk como una estructura oscura (Uchida y Roberson, unpublished data). (b)
Imagen en confocal, hifa teñida con FM464, muestra una pronunciada tinción en el Spk (Hickey y
Read, unpublished data). Barra: 2.5 µm. Imagen extraída de Harris et al., 2005.
8
bioquímicas en la célula. Dichas actividades son manifestadas por la localización
de ciertas enzimas que están físicamente integradas a la pared celular y están
involucradas en la síntesis de sus componentes. La relación entre las propiedades
de la pared celular y el crecimiento de la célula ha sido tema de investigación y
discusión durante varias décadas (Sussman et al., 1957).
Existe una relación entre la clasificación taxonómica y la composición de la pared
celular de los hongos. Se describió que la pared celular de los hongos está
conformada de 80% a 90% de polisacáridos y el resto de lípidos y proteínas. En
ocasiones están presentes pigmentos (melanina), polifosfatos e iones inorgánicos.
Físicamente, la pared celular de los hongos está conformada de microfibrillas
entrelazadas, embebidas en una matriz amorfa. Las microfibrillas están formadas
de quitina, mientras que la matriz está formada de proteínas y otros polisacáridos
como glucanos, mananos, galactanos y heteropolisacáridos. Finalmente todos
estos componentes se unen formando un complejo macromolecular (Bartnicki-
García, 1968).
Mediante métodos de extracción de pared celular y cromatografía en papel para
caracterizar sus componentes monoméricos, los hongos se subdividieron en
varias categorías de acuerdo a la naturaleza química de sus paredes celulares. La
Tabla I muestra la clasificación de las paredes celulares basada en
combinaciones de polisacáridos, principales componentes de las paredes
celulares durante su estadio vegetativo, además muestra que estas categorías
están estrechamente relacionadas con la clasificación convencional de los hongos
(Bartnicki-García, 1968).
9
En 1965 Mahadevan y Tatum determinaron la composición de la pared celular de
N. crassa. Removieron selectivamente sus diferentes componentes mediante
degradación enzimática. De acuerdo a estos autores, la pared celular de N.
crassa contiene cuatro diferentes componentes, denominados como fracciones I,
II, III y IV. La fracción I es un complejo péptido-polisacárido álicali-soluble que esta
conformado de glucosa, aminoácidos y galactosamina. La fracción II está
conformada también de glucanos con enlaces entre moléculas de hexosa. La
fracción III está conformada de cadenas de β-(1,3)-glucanos y es fácilmente
digerido por laminarinasa. Finalmente la fracción IV esta compuesta de quitina
(Cardemil y Pincheira, 1979).
Estudios posteriores permitieron conocer con más detalle la composición de la
pared celular de N. crassa. Esta contiene entre 7-10% de quitina (polímero de N-
acetilglucosamina [GlcNAc]), 25% de β-(1,3)-glucano, 35% de otros glucanos y
10% de proteínas (Borkovich et al., 2004; De Groot et al., 2005; Hartland et al.,
1996; Klis et al., 2007; Kollár et al., 1997). Se divide en dos capas: una capa
interna fibrilar y una capa externa gelatinosa. La capa externa contiene complejos
proteína y polisacárido, dentro de los cuales se incluyen las galactosaminas
(~10%) (Figura 4a). La capa interna contiene complejos β-(1,3)-glucano y quitina
Tabla I. Principales carbohidratos que componen la pared celular de los hongos durante su estadio
vegetativo. Extraído de Latgé y Calderone, 2006 tomado de Bartnicki-García, 1968.
10
(~10%) (Figura 4d). Sin embargo, no hay evidencia de la presencia de β-(1,6)-
glucano en N. crassa ni en otros hongos filamentosos como A. fumigatus
(Borkovich et al., 2004; Klis et al., 2007).
II.3-Organización molecular de la pared celular
Se estableció un esquema general de la composición de la pared celular para los
hongos Ascomycetes y Basidiomycetes. Este consiste en una fracción álcali-
insoluble y en una fracción álcali-soluble (Latgé y Calderone, 2006).
En el caso de la fracción álcali-insoluble, el principal componente estructural de la
pared celular es el glucano, un polímero de glucosa. El glucano es el principal
componente que se puede encontrar en forma de cadenas largas con enlaces tipo
β-(1,3) ó cadenas cortas con enlaces tipo β-(1,6), conforman del 30 al 60% del
peso seco de la pared celular. La quitina, es el segundo componente estructural
de la pared celular; está conformado de cadenas largas de β-(1,4)-N-
acetilglucosamina, forma el 2% del total del peso seco de la pared celular de las
levaduras y del 10 al 15% en los hongos filamentosos (Osherov y Yarden, 2010).
La Figura 5 muestra un esquema de las fracciones álcali de la pared celular de
Aspergillus (Hongo filamentoso) y Saccharomyces (Levadura), así como su
conformación y organización.
Figura 4. Arquitectura de una hifa de N. crassa mediante digestión enzimática secuencial diseñada
por Hunsley y Burnett, 1970. Imagen extraída de Deacon, 2006.
11
La imagen indica que las cadenas centrales de β-(1,3)/β-(1,4)-glucanos en el caso
de A. fumigatus, y β-(1,6)-glucano en el caso de S. cerevisiae, están ramificadas
por cadenas de β-(1,3)/β-(1,6)-glucanos las cuales están unidos a quitina
mediante enlaces tipo β-(1,4) (Fontaine et al., 2000; Latgé y Calderone, 2006).
Dependiendo de las especies fúngicas, este esquema presenta diferentes tipos de
ramificaciones. En el caso de A. fumigatus, la cadena de β-(1,3)/β-(1,4)-glucanos
Figura 5. Polisacáridos de la pared celular de Aspergillus fumigatus y Saccharomyces cerevisiae. Se
presentan los componentes de las fracciones álcali-insoluble y álcali-soluble. Imagen extraída de
Latgé, 2007.
12
tiene uniones covalentes con unidades repetitivas de [3Glcβ1-4Glcβ1], y
ramificaciones de galactomananos compuestas de α-mananos que tienen
unidades repetitivas de oligosacáridos de manosa [6Man-α1-2Man-α1- 2Man-α1-
2Manα] y cadenas cortas de β-(1,5)-galactofuranosa (Fontaine et al., 2000).
Desde trabajos realizados previamente se conoce que son esenciales los
entrecruzamientos entre cadenas de β-(1,3)-glucano y quitina para la formación
del esqueleto fibrilar en la mayoría de los Ascomycetes y Basidiomycetes.
Posteriormente estudiaron la conformación estructural de los componentes de la
pared celular en el Basidiomiceto Schizophyllum commune, y encontraron que los
glucanos de la fracción álcali-insoluble tienen enlaces β-(1,3) y β-(1,6), forman
una matriz y contienen microfibrillas de quitina embebidas. Después, mediante
técnicas enzimáticas y químicas, estos autores encontraron que al degradar la
quitina, la solubilidad de los β-glucanos cambia, haciéndolos más solubles en
agua (Sietsma y Wessels, 1979; 1981).
En todos los Basidiomycetes y Ascomycetes examinados, inlcuyendo A.
fumigatus, Agaricus bisporus, Coprinus cinereus, y en las levaduras S. cerevisiae,
S. pombe y Candida albicans, la despolimerización de la quitina provoca que los
β-glucanos insolubles en agua se hagan solubles. En todos estos casos se
supone que la insolubilidad de los β-glucanos es debida a enlaces covalentes con
la quitina (Fontaine et al., 2000; Hartland et al., 1996; Kollár et al., 1995; 1997;
Manners et al., 1973a,b; Surarit et al., 1988).
Por otra parte, la fracción fibrilar (complejo glucano-álcali-insoluble) está
embebida en una fracción amorfa álcali-soluble, cuya composición varía entre las
diferentes especies de hongos y su solubilidad en álcali no está asociada con una
específica composición de polisacáridos. En el caso de Aspergillus y
Schizosaccharomyces, está compuesta de α-(1,3)/α-(1,4)-glucanos y
galactomananos con galactopiranosa en S. pombe o galactofuranosa en A.
fumigatus (Grün et al., 2005; Latgé y Calderone, 2006; Sugawara et al., 2004).
13
Finalmente, las proteínas también forman parte de la fracción álcali-soluble, y a
diferencia de los polisacáridos que son los mayores componentes de la pared
celular, las proteínas están presentes solo en menores cantidades. Éstas se
encuentran, ya sea de manera transitoria en la pared celular antes de ser
secretadas o como parte de la estructura de la pared celular. Se dividen en: (a)
proteínas con enlaces disulfuro S-S, (b) proteínas sitio de unión a GPI (GPI-
CWP´s por sus siglas en inglés) y (c) proteínas con repeticiones internas (PIR por
sus siglas en inglés) (Fleet, 1991; Kapteyn et al., 2000; 1997; Latgé y Calderone,
2006; Moukadiri y Zueco, 2001).
II.4-Modelos de síntesis de la pared celular
Existen diversos modelos que explican los factores responsables de la
morfogénesis característica de las hifas. Inicialmente, se sugirió que la pared
celular está elaborada a partir de la participación de procesos de síntesis y lisis.
De acuerdo a esta hipótesis, la pre-existente y rígida estructura de pared celular
es primero atacada por hidrolasas de polisacáridos que se encuentran unidas a la
pared celular, luego los huecos formados son rellenados con material de pared
celular recién sintetizado. La continua repetición de este proceso asegura el
crecimiento de la pared celular (Johnson, 1968).
En base a lo anterior, uno de los modelos que explica la morfogénesis hifal, es el
modelo unitario de crecimiento de la pared. Se considera que el crecimiento de la
pared celular es el resultado de la acumulación de unidades de crecimiento en la
superficie de la pared. Se supone que estas unidades de crecimiento contienen
enzimas de síntesis y de lisis, ambas involucradas en la formación de la pared
celular (Figura 6). Por consecuencia, la morfología celular es determinada por el
patrón de distribución de las unidades de crecimiento (Bartnicki-García, 1973a).
Así que, el crecimiento y la morfología apical serían el resultado de la
concentración de estas unidades de crecimiento en la punta de la hifa, mientras
que la morfología esférica sería el resultado de la uniforme distribución de
14
unidades de crecimiento sobre toda la superficie de la pared celular. Dicho
modelo es apoyado por el patrón de descarga de vesículas secretorias a partir del
Centro Suministrador de Vesículas (VSC por sus siglas en inglés) (Bartnicki-
García et al., 1989).
Lo anterior basado en estudios previos en donde sometieron hifas de hongos a
diversos tratamientos (ej. cambios de pH, salinidad, temperatura, etc.) y
observaron la fragilidad de las puntas de las hifas. Las cuales se expandieron o
estallaron, lo que los llevó a la conclusión de que el crecimiento expansivo de la
hifa requiere un equilibrio delicado entre la lisis de los polímeros existentes y la
síntesis de nuevos polímeros (Figura 7, Zona A) (Bartnicki-García y Lippman,
1972; Bartnicki-García, 1973b; Gooday y Trinci, 1980).
Figura 6. Esquema del modelo unitario de crecimiento de la pared celular. Bartnicki-García, 1973.
15
Los resultados de diferentes estudios han mostrado que, cada vez que el balance
es perturbado, se producen aberraciones morfológicas ó lisis ó bien ambos
ocurren. Por ejemplo, la inhibición de la síntesis de quitina por polioxina D causa
hinchazón y lisis de las hifas de M. rouxii (Bartnicki-García y Lippman, 1972).
De manera similar en levaduras, la inhibición de la síntesis de glucano, por 2-
deoxiglucosa o 2-deoxi-2-fluoroglucosa produce cambios morfológicos y en
ocasiones la lisis celular. La inhibición de la síntesis de quitina y la estimulación
de las hidrolasas de la pared celular por el incremento de temperatura ocasiona
disturbios y lisis de las paredes celulares de las hifas de A. nidulans. Por otra
parte, en células de levaduras inducidas por auxina, la inhibición de la
plastificación de la pared mediante glucanasas causa la suspensión del
crecimiento de la pared (Farkás, 1979).
Figura 7. Modelo de crecimiento hifal basado en estudios en N. crassa. Zona A: pared primaria, que
contiene microfibrillas. El grosor de la pared se mantiene constante y extensible por fusión de
vesículas, que contienen precursores de pared y/o enzimas líticas. La extensión de la hifa depende
del índice de suministro de vesículas. Zona B: región de diámetro hifal constante. La pared no se
extiende y tiene aproximadamente el mismo grosor que la zona A. La rigidez de la pared puede
involucrar la formación de entrecruzamientos de polímeros o la adición de pequeñas cantidades de
nuevo material. Es posible que las vesículas no se fusionen en esta región. Zona C: región de
formación de pared secundaria. La pared incremente en grosor con la distancia desde la punta,
convirtiéndose en una pared madura de un grosor constante. Zona D: bajo condiciones de escasez
de carbono algunos polímeros de la pared pueden ser degradados para proveer sustratos para el
metabolismo endógeno. Imagen extraída de Trinci y Collinge, 1975.
16
Otro modelo que explica la causa de la morfogénesis de las hifas es “el modelo
Steady-State”. Este modelo sugiere que el material añadido en el ápice es
inicialmente plástico, pero gradualmente se hace rígido en la base de la zona de
extensión (Figura 8). La rigidez se debe a un proceso de entrecruzamiento de
cadenas de quitina y β-glucano catalizado por enzimas que se encuentran en la
pared (Figura 7, Zona B) (Bartnicki-García, 1999; Robertson, 1968; Sietsma y
Wessels, 1981; Wessels et al., 1983).
Mediante estudios de fraccionamiento químico se encontró que las fracciones
glucano soluble en agua y glucano álcali-insoluble predominan en el ápice, y
considerando que el homopolímero N-acetilglucosamina álcali-insoluble se
incorpora en los ápices de las hifas, otros autores (Gooday y Trinci, 1980; López-
Romero et al., 1982; Schneider y Seaman, 1982) mostraron que la quitina
naciente es sensible a la quitinasa y ácido. Con esto se concluyó que la quitina en
el ápice puede estar presente en una condición amorfa, lo cual significa que en
este estadio de ensamblaje de pared las cadenas de quitina pueden estar
disponibles para el entrecruzamiento con otros polímeros.
Además, se mostró que la mayoría de la fracción de estos glucanos solubles es
gradualmente convertida a una forma álcali insoluble, ya que en hifas en
Figura 8. Esquema del modelo “Steady-State” de Wessels y Sietsma, 1981. El material depositado se
hace rígido en la zona subapical. Extraído de Deacon, 2006.
17
crecimiento este proceso comienza bajo el extremo del ápice y continua
subapicalmente. Sin embargo, cuando el crecimiento cesa, todo el β-glucano que
se encuentra en el ápice, es gradualmente convertido a una forma álcali insoluble,
es decir, las cadenas de β-(1,3)-glucano y quitina son gradualmente
entrecruzadas en la pared, produciendo un complejo β-glucano-quitina álcali-
insoluble (Wessels et al., 1983).
En experimentos realizados con el hongo Fusarium oxysporum se observó que se
hizo rígido todo el ápice al detener el crecimiento por más de 40 segundos. Por lo
tanto, se concluyó que inicialmente la nueva pared formada es plástica y que la
rigidez desarrollada en el ápice dependía de la duración del arresto en el
crecimiento de la hifa (Figura 9) (Robertson, 1958; 1968; Wessels et al., 1983).
II.5-Biosíntesis de polisacáridos de la pared celular
La biosíntesis de los componentes de la pared celular es uno de los procesos que
permite el crecimiento de los hongos filamentosos. El crecimiento consiste en la
elongación de las puntas de las hifas, la cual implica una extensión de pared que
ocurre a través de la incorporación apical de polímeros de carbohidratos que se
Figura 9. Modelo que representa el grado de entrecruzamiento entre los polímeros de β-glucano y
quitina en la región apical de la hifa durante el crecimiento (A) y cuando la hifa no presenta
crecimiento (B). La densidad del punteado en la pared celular de la hifa representa el grado de
entrecruzamiento. Extraído de Wessels et al., 1983.
18
sintetizan “de novo” (ej. β-(1,3)-glucano, quitina). Las enzimas responsables de su
producción son transportadas a las puntas de las hifas en forma inactiva (Ruíz-
Herrera et al., 1977) y dentro de vesículas que se fusionan con la membrana
plasmática, por lo tanto, se localizan en la cara extracelular (Figura 10) (Borkovich
et al., 2004).
“Biosíntesis de quitina”
La quitina es un polisacárido esencial que forma parte de la pared celular y está
presente en la mayoría de los hongos filamentosos. Es un polímero constituido de
unidades de N-acetilglucosamina unidas mediante enlaces tipo β-(1,4) (Farkás
1979). Las isoenzimas denominadas quitina sintasas (de integración a membrana
y con un tamaño de 100-130KDa) están encargadas de la formación de quitina y
requieren del sustrato UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc), el cual es
Figura 10. Diagrama de algunos componentes de la síntesis de pared celular trasnportados por
vesículas a los ápices de las hifas. Se piensa que hay vesículas que liberan las enzimas encargadas de
la formación de la pared (Quitina sintetasa y Glucano sintetasa) a la punta, en donde se unen a la
membrana plasmática como proteínas integrales. Imagen extraída de Deacon, 2006.
19
sintetizado a partir de la fructosa-6-fosfato por la vía Leloir (Glaser y Brown, 1957;
Leloir y Cardin, 1953)
En la producción de UDP-GlcNAc mediante la vía de Leloir, la primera enzima
denominada cetol-isomerasa sintetiza glucosamina-6-fosfato (GlcN-6-P) y
glutamato a partir de glutamina y fructosa-6-fosfato. Luego, la enzima
acetiltransferasa, forma N-acetilglucosamina-6-fosfato y CoA a partir de GlcN-6-P
y acetil-CoA. Posteriormente, la enzima mutasa, forma N-acetilglucosamina-1-
fosfato (GlcNAc-1P) a partir de GlcNAc-6-P. Finalmente, la enzima pirofosforilasa,
cataliza la formación de UDP-GlcNAc y pirofosfato a partir de UTP y GlcNAc-1-P.
Se ha encontrado que las levaduras y los hongos filamentosos presentan una
copia de gen que codifica para cada enzima de esta vía (Borkovich et al., 2004;
Latgé y Calderone, 2006).
Por otra parte, mediante análisis de secuencia de aminoácidos, se han
identificado 7 clases de quitina sintasas entre los hongos, de las cuales tres son
específicas para los hongos filamentosos (classes III, V and VI) (Bowen et al.,
1992). Los hongos filamentosos contienen mayor cantidad de genes quitina
sintetasa. A. oryzae tiene más de 11 genes. La presencia de un alto número de
genes en los hongos filamentosos Ascomycetes está relacionada con un alto
contenido en quitina en la pared celular de los hongos filamentosos.
Los estudios realizados con el modelo S. cerevisiae explican la biosíntesis de la
quitina. Se conoce que tres enzimas quitina sintetasa (Chs1p, Chs2p y Chs3p)
son las responsables de la síntesis de quitina. La enzima Chs1p actúa como
reparadora durante la separación celular. La enzima Chs2p es responsable de la
biosíntesis de quitina en la septación. La enzima Chs3p está involucrada en la
síntesis de la mayor parte de quitina de la pared celular de la célula madre y del
septo, y para la síntesis de quitina en respuesta al estrés celular. Las enzimas
Chs4p a Chs7p están involucradas en la regulación de la actividad de la enzima
Chs3p. Se cree que la enzima Chs4p es un activador de la actividad de la Chs3p
20
cuando está en la membrana. La enzima Chs7p actúa como una chaperona para
Chs3p durante su elongación en el RE. Las enzimas Chs5p y Chs6p son
proteínas de Golgi requeridas para la correcta localización de Chs3p a la
membrana. Chs5p es responsable del transporte de Chs3p dentro de los
quitosomas (endosomas tempranos). Chs6p está asociada con la endocitosis
retrógada de Chs3p (Latgé y Calderone, 2006; Latgé, 2007; Valdivesio et al.,
1997).
“Biosíntesis de β-glucano”
El polisacárido β-(1,3)-glucano se encuentra en mayor proporción en la pared
celular de los hongos. Es un polímero constituido de unidades de glucosa unidas
mediante enlaces tipo β-(1,3). El sustrato para la síntesis de las cadenas de β-
(1,3)-glucano es la UDP-glucosa, producida a partir de la glucosa-6-fosfato por la
actividad de la fosfoglucomutasa para producir glucosa-1-fosfato, la cual es
transformada a UDP-glucosa por la uridiltransferasa. La UDP-glucosa es después
transportada a la membrana plasmática en donde la síntesis del polímero β-(1,3)-
glucano es llevada a cabo por el complejo proteico de la glucano sintasa,
compuesto de al menos dos proteínas: la subunidad catalítica β-(1,3)-glucano
sintasa (FKS) y la subunidad reguladora (Rho) (Kang y Cabib, 1986). Se han
identificado otras proteínas involucradas en la síntesis de β-(1,3)-glucano como
Knr4p/Smi1p en S. cerevisiae y GS-1 en N. crassa (Enderlin y Selitrennikoff,
1994; Hong et al., 1994). La reacción consiste en la adición de una molécula de
glucosa por cada molécula de UDP-glucosa hasta la producción de largas
cadenas. En levaduras, se estima que las cadenas están formadas de 60-80
residuos de glucosa. En A. fumigatus, cada cadena está formada de 1,500
residuos de glucosa (Borkovich et al., 2004, Latgé y Calderone, 2006, Osherov y
Yarden, 2010).
La proteína GS-1 está asociada con diferentes tipos de vesículas que se
acumulan en la capa externa del Spk en el ápice de la hifa (Verdín et al., 2009).
21
La subunidad FKS es una proteína transmembranal que contiene un motivo
hidrofílico altamente conservado. La subunidad reguladora es una Rho GTPasa,
cuya actividad está regulada por cambios conformacionales que alteran la unión a
GDP, el cual es un estado inactivo y la unión a GTP el cual es el estado activo,
así como la geranilación (requerida para el transporte y la unión a membrana). La
subunidad FKS es transportada de forma inactiva a la membrana plasmática a
través de una vía de secreción clásica. Luego, Rho que se encuentra en la
membrana plasmática es activada por Rom, el factor de intercambio de GDP/GTP
de Rho localizado también en la membrana plasmática. Esta activación, permite la
producción y la correcta localización de los β-(1,3)-glucanos (Latgé y Calderone,
2006, Osherov y Yarden, 2010).
Finalmente, el número de genes que codifica para las subunidades β-(1,3)-
glucano sintetasas varía entre las diferentes especies. En S. cerevisiae, se
encuentran tres genes FKS, de lo cuales solo dos están involucrados en la
síntesis de β-1,3-glucano (Lesage et al., 2004). A diferencia de las levaduras,
todos las secuencias de hongos filamentosos Ascomycetes tienen sólo un
ortólogo de FKS (Latgé y Calderone, 2006).
II.6-Entrecruzamiento de polisacáridos de la pared celular
A pesar de la falta de datos de la estructura de las sintasas transmembranales de
glucanos y quitinas, básicamente está dilucidada la biosíntesis de los dos
principales polisacáridos fibrilares de la pared celular. Las sintasas de β-glucano y
quitina son transportadas de forma inactiva a la membrana plasmática, donde se
organizan como complejos y luego son activadas (Figura 11) (Latgé, 2007).
22
Por otra parte, sigue sin conocerse con exactitud como se llevan a cabo los
arreglos de polisacáridos, es decir, como se llevan a cabo las ramificaciones y
entrecruzamientos de los polisacáridos. La Figura 12 muestra los pasos sucesivos
hipotéticos en la formación de síntesis y ramificaciones de los polisacáridos de la
pared celular (Latgé, 2007).
Figura 12. Esquema que representa los pasos hipotéticos sucesivos que permiten la producción de la
fracción álcali-insoluble de la pared celular de los hongos. Imagen extraída de Latgé, 2007.
Figura 11. Esquema en donde se representa que las subunidades catalíticas de enzimas sintasas son
almacenadas y transportadas (inactivas) a partir de vesículas de Golgi a la membrana plasmática.
Se activan in situ en la membrana plasmática por subunidades reguladoras y usan azúcares unidos a
nucleótidos (NDP) como sustratos. Imagen extraída de Latgé, 2007.
23
Estudios realizados en S. cerevisiae sugieren que las proteínas con dominio de
unión a un ancla glucosilfosfatidilinositol (GPI) tienen un papel estructural en la
organización de la pared celular y en el entrecruzamiento de los diferentes
polisacáridos que conforman la pared celular (Kapteyn et al., 1996; Klis et al.,
2002; Kollár et al., 1997; Smits et al., 1999). La Figura 13 muestra la localización y
actividad putativa de este tipo de proteínas, en donde el ancla GPI les permite
anclarse a la membrana plasmática, para poder permanecer en la superficie de la
pared celular y cumplir su función biológica (Latgé, 2007).
Actualmente, un evento importante que podría explicar como se llevan a cabo las
ramificaciones y entrecruzamiento de polisacáridos es que mediante análisis
genómicos y proteómicos comparativos de A. fumigatus, se encontró que existen
seis familias de proteínas con dominio de unión al grupo GPI para anclaje a
membrana, las cuales se denominan SPS2, GAS/GEL, DFG, PLB, CRH, YPS.
Estás familias son ortólogas a las familias ECM33/SPS2, GAS/GEL/PHR,
DFG/DCW1, CRH y BGL2, las cuales llevan a cabo enlaces intra- e inter-
Figura 13. Función putativa de las proteínas de anclaje mediante el ancla GPI durante la
construcción de la pared celular de los hongos. (i) Las proteínas de anclaje mediante el ancla GPI
(P1) que permanecen ancladas a la membrana plasmática remodelan los polisacáridos de la pared
celular (Ejemplos: proteínas Gel/Gas o Crh). (ii) Las proteínas de anclaje mediante el ancla GPI
(P2) se enlazan covalentemente a los β-1,3 glucanos a través de β-1,6-glucanos. Esta es una manera
en que la proteína P2 puede permanecer en la superficie de la pared celular para cumplir su función
biológica. Imagen extraída de Latgé, 2007.
24
poliméricos y se encuentran en S. cerevisiae (Tabla II) (Bernard et al., 2002;
Borkovich et al., 2004; Klis et al., 2007).
Se ha encontrado que cuatro proteínas con grupo de anclaje GPI pertenecientes a
las familias SPS2, GAS/GEL, DFG, CRH, están involucradas en la construcción
de la pared celular. Las mutantes de SPS2 (ECM33), DFG1/DCW5, CRH1/CRH2
y GEL/GAS presentan defectos en la pared celular que están asociados con una
reducción en el crecimiento (Cabib et al., 2007; Kitagaki et al., 2002; Mouyna et
al., 2000; Rodríguez-Peña et al., 2000).
La caracterización de la enzima Gel1p con actividad β-(1,3)-glucanosiltransferasa,
aislada de la pared celular de A. fumigatus, permitió conocer que esta enzima
divide una molécula de β-(1,3)-glucano y transfiere el extremo reductor generado
a un extremo no reductor de otra molécula de β-(1,3)-glucano. La generación de
nuevos enlaces β-(1,3) entre las moléculas aceptoras y donadoras produce la
elongación de la cadena de β-(1,3)-glucano (Mouyna et al., 2000). La secuencia
de aminoácidos de Gel1p, es homóloga a diversas familias de proteínas de
Tabla II. Familias de enzimas involucradas en la síntesis de los componentes de la pared celular de
los hongos, encargadas de la formación de enlaces intra- e inter-poliméricos. GH*:
Glucosilhidrolasa, GPI*: Glucosilfosfatidilinositol (Klis et al., 2007).
25
levaduras, codificadas por GAS1 en S. cerevisiae y PHR1, PHR2 en C. albicans,
los cuales son requeridos para una correcta morfogénesis y el crecimiento polar
de estos organismos (Mouyna et al., 2000; Popolo y Vai, 1999).
Para determinar la actividad enzimática de las proteínas recombinantes (sin señal
de unión a GPI) Gel1p, Gas1p, Phr1p y Phr2p expresadas en Pichia pastoris y
posteriormente purificadas, se incubaron con laminaritridecaosa y se realizaron
análisis de los productos obtenidos mediante cromatografía de intercambio
aniónico de alta resolución (HPAEC, High Performance Anion Exchange
Chromatography) (Figura 14). La Figura 14A muestra la cinética enzimática
obtenida con la proteína recombinante Gel1p (sin señal de unión a GPI). Después
de 1 hora de incubación, los productos principales fueron rG6, rG7, rG8, rG18,
rG19 y rG20 de acuerdo con los pasos de la reacción esquematizados
previamente (Hartland et al., 1996) (E + rG13 → E.G5 + rG8 + E.G6 + rG7+ E.G7
+ rG6; E.G5 + E.G6 + E.G7 + rG13→ E + rG18 + rG19 + rG20) (E corresponde a
la enzima Gel1p, y los oligosacáridos que se encuentran en negritas son el
producto de la reacción). Los datos obtenidos de la cromatografía indicaron que
todos los productos contenían solo enlaces tipo β-(1,3), ya que previamente se ha
descrito que la introducción de otro enlace a partir del enlace glucosídico β-(1,3)
resultaría en un cambio en el tiempo de retención de los oligosacáridos
ramificados (Mouyna et al., 1998). Sin embargo, con un mayor tiempo de
incubación (8-20h) se observó una serie de oligosacáridos con un grado de
polimerización de 5 a 40 (Figura 14A). Por otra parte, el análisis de los productos
de la incubación de las proteínas recombinantes Gas1p, Phr1p y Phr2p con
laminaritridecaosa, mostró un patrón idéntico al obtenido con la proteína
recombinante Gel1p (Figura 14B), por lo tanto, Gas1p, Phr1p y Phr2p mostraron
una actividad β-(1,3)-glucanosiltransferasa similar a la caracterizada para Gel1p
(Mouyna et al., 2000).
26
Por otra parte, en la Figura 15A y B, se observa el crecimiento de la cepa de S.
cerevisiae mutante de Gas1p transformada con el plásmido mRFP-GAS1. La
presencia del plásmido hizo que las células que eran mutantes perdieran su
Figura 14. Análisis HPAEC de los productos de la incubación de las proteínas recombinantes Gel1p,
Gas1p, Phr1p y Phr2p con laminarioligosacáridos. (A) Análisis del producto después de 0, 1, 8 y 20
horas de incubación con Gel1p. (B) Análisis de los productos obtenidos con Gas1p, Phr1p y Phr2p
(To idéntico a (A)). Imagen extraída de Mouyna et al., 2000.
27
hipersensibilidad al calcofluor. Además, suprimió otros rasgos fenotípicos como la
morfología redonda, el gran tamaño de la célula, la maduración defectuosa de la
yema y la separación celular, estos dos últimos rasgos siendo responsables de la
aparición de células tipo “Mickey mouse” y de agrupaciones de células mutantes
de Gas1p (Figura 15D) (Popolo et al., 1993; Rolli et al., 2009).
En esencia, los ensayos bioquímicos realizados con las proteínas recombinantes
obtenidas de P. pastoris y los experimentos de cepas mutantes que recuperaron
el fenotipo con la presencia de la enzima Gas1p, han mostrado que estas
proteínas también tienen una actividad β-(1,3)-glucanosiltransferasa similar a
Figura 15. (A) Imágenes de los ensayos de sensibilidad al Calcofluor (CF), las células de S. cerevisiae
se hicieron crecer hasta la fase log en YPD a 30°C. Se realizaron diluciones 10-2 a 10-4, de la
suspensión concentrada 10-1 de la cepa W303-1A, un derivado de la cepa mutante de gas1 (WAH) y
JC9, una mutante de gas1 que contiene una copia integrada de mRFP-Gas1, fueron inoculadas en
placas con medio YPDA. Después de 48 hrs a 30°C de la cepa diploide AN120, un derivado
homocigoto de la mutante gas1 que llevan el plásmido YEp24 (ER333) (control), YEp24-GAS1-GFP
(ER337) o pRS416-Gas1-GFP (ER336). (B y D) Morfología de las células fijadas en formalina.
Imagen extraída de Rolli et al., 2009.
28
Gel1p (Latgé y Calderone, 2006; Latgé, 2007; Mouyna et al., 2000; Rolli et al.,
2009).
Otra familia de proteínas que se ha encontrado relacionada con el
entrecruzamiento de polisacáridos, es la familia CRH en S. cerevisiae. Se ha
encontrado que el dominio GH de las proteínas Crh es homólogo al dominio
catalítico CH de las bacterias, el cual produce ramificaciones con enlaces
glucosídicos β-(1,4) de la cadena principal, la cual posee enlaces glucosídicos β-
(1,3). Como la quitina se encuentra unida mediante enlaces tipo β-(1,4) a las
cadenas β-(1,3)-glucano, se considera que puede involucrar una reacción de
transglucosidasa que acopla quitina a β-(1,3)-glucano (Klis et al., 2007).
Por lo anterior, se realizaron experimentos de fraccionamiento químico de las
paredes celulares aisladas de las cepas mutantes de CRH1, CRH2, CRH1/CRH2
y de la cepa silvestre control para detectar cualquier posible modificación en la
distribución de los polímeros de la pared celular. Se aislaron las paredes celulares
de varias clonas de cada cepa, se digirieron con pronasa para eliminar
manoproteínas, y se trataron con álcali caliente para obtener la fracción álcali-
soluble. El residuo insoluble fue sometido a un tratamiento con ácido, permitiendo
el aislamiento de una fracción mínima ácido-soluble y una parte residual ácido-
insoluble, fracción álcali-insoluble. Considerando que la insolubilidad del β-
glucano en el álcali se debe a enlaces con la quitina, las variaciones de las
proporciones normales de los β-glucanos solubles e insolubles puede reflejar ya
sea una proporción alterada de quitina y β-glucano en la pared celular o un grado
anormal de entrecruzamiento entre los polímeros. En la Figura 16 se muestra el
porcentaje promedio (peso seco) de cada fracción obtenida de estos
experimentos se muestra (todo el residuo de polisacáridos tratados con pronasa
se consideró el 100%). De acuerdo a estos datos, la fracción álcali-soluble
incrementó en las cepas mutantes de CRH1 comparada con la cepa silvestre. Por
otra parte, no se encontraron variaciones significativas en la cepa mutante de
29
CRH2. Sin embargo, la eliminación simultánea de CRH1 y CRH2 mostró que la
fracción álcali-soluble fue casi el doble comparada con la cepa silvestre, además
de una disminución en la fracción álcali-insoluble. Finalmente, se midieron los
niveles de quitina en estas cepas (Figura 16) y no se observaron variaciones
significativas en el contenido de quitina que pudieran explicar la diferencia en los
niveles de los β-glucanos álcali-soluble entre la cepa silvestre y las cepas
mutantes (Rodríguez-Peña et al., 2000).
Por otra parte, se realizaron experimentos para observar el desarrollo
macroscópico de las cepas mutantes y se encontró que la eliminaciónde los
genes CRH1 o CRH2, les produjo una sensibilidad a los colorantes calcofluor y
congo rojo (CR) que se unen a la pared celular (se sabe que ambos colorantes
interfieren en el correcto ensamblaje de los componentes de la pared celular),
denominados Crh por su hipersensibilidad al CR (Congo red hypersensitive). Sin
embargo, la cepa mutante de ambos genes homólogos, CRH1 y CRH2, muestra
un fenotipo más sensible a CR y calcofluor que cualquiera de las mutantes
Figura 16. Determinación de las fracciones álcali-insoluble/ácido-soluble, álcali-soluble y álcali-
insoluble/ácido-soluble de los glucanos de la pared celular de la cepa silvestre y de las cepas
mutantes: Δcrh1, Δcrh2 y Δcrh1/Δcrh2. Toda la fracción de glucano que permanece después del
tratamiento con proteasa de las paredes celulares purificadas se considero el 100%, y el contenido
de quitina para cada cepa, en microgramos de glucosamina por miligramo (peso seco) de las células.
Imagen extraída de Rodríguez-Peña et al., 2000.
30
simples (Figura 17). Posteriormente, se transformaron las cepas mutantes con
plásmidos (centromérico o episómico) que contenían los genes y se observó que
la sensibilidad al CR desapareció, lo cual puede reflejar una función común de los
dos genes en el mantenimiento de la arquitectura de la pared celular (Figura 18)
(Rodríguez-Peña et al., 2000).
Figura 18. Ensayos de crecimiento en medio YED con CR en las cantidades indicadas, de las cepas
mutantes de los genes crh1 y crh2 transformadas con los plásmidos que contenían los genes de
interés (pRS416: centromérico, YEp352: episómico). Imagen extraída de Rodríguez-Peña et al.,
2000.
Figura 17. Imágenes que muestran los ensayos de sensibilidad al Congo rojo (CR) y Calcofluor (CF)
de las cepas mutantes Δcrh1 y Δcrh2, de la cepa doble mutante Δcrh1/Δcrh2 y de la cepa silvestre.
Las células se hicieron crecer en medio YED, y se inoculó una serie de diluciones 1/10 de cada cepa
en placas con medio YED que contenían CR y CF en las concentraciones en la que indica la imagen.
Imagen extraída de Rodríguez-Peña et al., 2000.
31
II.7-Localización de las proteínas Gas1p y Crh1p/Crh2p en
Saccharomyces cerevisae
“Localización de Gas1p en S. cerevisiae”
Se ha investigado la localización celular de Gas1p y se ha encontrado que el
anclaje de Gas1p en sitios específicos de la superficie celular contribuye en la
morfogénesis de S. cerevisiae (Rolli et al., 2009). Los experimentos realizados
mostraron que al transformar las cepas mutantes ΔGAS1 con el plásmido que
contenía la construcción genética mRFP-GAS, la proteína Gas1p presentó varias
localizaciones. Primero se observó en la periferia celular mostrando que la
localización de la proteína recombinante es en la membrana plasmática (Figura
19). Además, en células que se encontraban en gemación la fluorescencia
apareció como dos puntos brillantes en cada lado del cuello de las células madre
e hija y cuando las células en gemación presentaron mayor tamaño se observó
que se localizó en el septo (Figura 19B y C). Por otra parte, se observaron
estructuras fluorescentes en forma de anillo o en forma de cráter, lo que sugirió
que mRFP-Gas1p se localizó en las cicatrices de la yema (Figura 19D). Además,
también se detectaron segmentos brillantes en forma de media luna en el borde
de las células. Estos segmentos pueden representar una o más cicatrices de
gemación adyacentes (Figura 19D). La localización de Gas1p-GFP en la mutante
ΔGAS1 se observó en la membrana plasmática (Figura 19E), en el cuello de las
células madre e hija durante la gemación (Figura 19F–H), en el septo de las
células en gemación con mayor tamaño (Figura 19H) y en cicatrices de gemación
(Figura 19I–K) (Rolli et al., 2009).
32
Figura 19. La proteína Gas1p etiquetada con mRFP y GFP está asociada a la membrana
plasmática, el cuello de la yema y en las cicatrices de la gemación. Las puntas de flecha y los puntos
señalan el cuello de la yema o el septo. Las flechas indican las cicatrices de las gemas. Escala 3 µm.
Imagen extraída de Rolli et al., 2009.
33
En conclusión, estos análisis demostraron que Gas1p se localiza en tres sitios: en
la membrana plasmática, en el anillo del cuello de las células madre e hija durante
la gemación, y en las cicatrices post-gemación (Rolli et al., 2009).
“Localización de Crh1p y Crh2p en S. cerevisiae”
Para determinar la localización celular de las proteínas Crh1p y Crh2p in vivo, se
construyeron plásmidos con las construcciones genéticas CRH1-GFP y CRH2-
GFP y se realizó la transformación de las cepas con estos plásmidos. Mediante
microscopía confocal se realizaron series de tiempo durante el ciclo celular de la
cepa Crh1p-GFP (Figura 20A a F). Se observó un parche fluorescente en los
sitios de gemación, en la membrana plasmática de la célula madre poco antes de
que la yema apareciera (Figura 20A) y en células con yemas emergiendo (Figura
20C), pero la fluorescencia ya no se observó en células con yemas de tamaño
mediano (Figura 20B y D). Sin embargo, la proteína apareció de nuevo en un
estadio mas avanzado del ciclo celular, cuando la yema alcanzó un mayor tamaño
y se presentó en la constricción célula madre-hija, marcando el plano de
citocinesis (Figura 20E), y permaneció ahí después de que se alcanzó la
separación celular (Figura 20F). La construcción genética Crh2p-GFP se localizó
en la membrana plasmática durante todos los estadios del ciclo celular. Se
visualizó alrededor del cuello de las células que se encontraban a punto de iniciar
la gemación (Figura 20H). Mientras la yema crecía, Crh2p-GFP aparecía como un
anillo conspicuo en la base del cuello de la yema (Figura 20I a M). La proteína se
acumuló en el área del septo entre las células madre e hija durante el estadio de
citocinesis (Figura20N a O). Crh2p también se encontró rodeando a toda la pared
celular, especialmente en las células hijas durante los estadios tardíos de la
división celular (Figura 20N a O). Finalmente, la proteína se localizó en el sitio que
marcó la previa división, especialmente en la célula madre (cicatriz de la yema)
(Figura 20P a Q) (Rodríguez-Peña et al., 2000; 2002).
34
En conclusión, estos análisis demostraron que Crh1p y Crh2p se localizan en la
membrana plasmática. Crh1p se localizó en sitios de gemación, sitios de
citocinesis y en cicatrices de gemas. Crh2p se localizó en todos los estadios del
ciclo celular (Rodríguez-Peña et al., 2000; 2002).
El estudio de los componentes que intervienen en la formación de la pared celular
nos permitirá contribuir al conocimiento sobre la morfogénesis y el desarrollo de
los hongos filamentosos. Ya que actualmente se desconoce si las proteínas
homólogas a ScCrh1p/ScCrh2p y ScGas1p desempeñan una función similar en
ascomicetos filamentosos, el objetivo de este trabajo es analizar el papel de estas
proteínas homólogas en N. crassa.
Figura 20. Microscopía confocal de la localización celular de Crh1-GFP y Crh2-GFP. (A a F)
Imágenes de células mutantes del gen crh1 transformadas con el plásmido pJV89G que tiene el
constructo Crh1-GFP. (H a Q) Serie de tiempo de la cepa mutante de crh2 transformada con el
plásmido pJV40G que tiene la construcción Crh2-GFP. Imagen extraída de Rodríguez-Peña et al.,
2000.
35
II.8 Justificación
Los hongos son organismos importantes utilizados en la industria para la
producción de enzimas, antibióticos y otros componentes de gran importancia
económica, también juegan un papel ecológico como desintegradores de materia
orgánica y en algunos casos pueden causar enfermedades en los productos del
sector agrícola y de salud pública.
Es relevante conocer las bases celulares y moleculares del crecimiento de estos
organismos, para así, en un futuro poder hacer bioprospección de componentes
antifúngicos para evitar problemas causados por hongos, o mejorar algunas de
sus características con la finalidad de hacer más eficientes algunos procesos
industriales basados en la utilización de hongos.
La pared celular de los hongos es una estructura dinámica que funciona en un
importante número de procesos. Debe proveer suficiente estabilidad para resistir
la presión osmótica que se ejerce en la pared celular, una adecuada plasticidad
para permitir los procesos de crecimiento, ser capaz de iniciar la formación de
nuevas ramificaciones a partir de hifas ya existentes y permitir que la pared
celular del hongo interactúe con su ambiente.
Existen pocos estudios enfocados a esclarecer el papel que desempeñan los
diversos componentes encargados de la formación de la pared celular de los
hongos filamentosos. Es por eso que este trabajo se enfoca en determinar el
papel de proteínas con dominio glucosilhidrolasa encargadas de formar enlaces
entre los polímeros que conforman la pared celular. De esta manera, se pretende
contribuir con información sobre los procesos de construcción de la pared celular
en hongos filamentosos.
36
II.9 Hipótesis
En Neurospora crassa, las proteínas homólogas a Crh1p/Crh2p y Gas1p de
Saccharomyces cerevisiae, con actividad glucanosiltransferasa, están
involucradas en la rigidización de la pared celular y se localizan en subápices y
septos.
II.10 Objetivo general
Determinar el papel en la rigidización de la pared celular de las proteínas con
actividad glucanosiltransferasa homólogas a Crh1p/Crh2p y Gas1p de S.
cerevisiae en N. crassa y su dinámica y localización.
II.11 Objetivos específicos
1. Análisis de las secuencias proteicas con potencial actividad
glucanosiltranferasa de N. crassa, homólogas a ScCrh1p/ScCrh2p y ScGas1p de
S. cerevisiae, mediante bioinformática.
2. Establecer el papel de las proteínas homólogas a ScCrh1p/ScCrh2p y
ScGas1p en la rigidización de la pared celular de N. crassa, mediante ensayos
con congo rojo y microscopía.
3. Análisis de la distribución y localización de las proteínas homólogas a
ScCrh1p/ScCrh2p y ScGas1p etiquetadas con proteínas fluorescentes en N.
crassa, mediante técnicas de microscopía confocal de escaneo con Laser.
37
Capítulo III
Metodología
III.1-Análisis Bioinformático
Se realizó la búsqueda del marco abierto de lectura correspondiente a las
secuencias de N. crassa homólogas a ScCrh1p/ScCrh2p (C: congo, r: red, h:
hipersensitive) y Gas1p (Glycolipid-Anchored Surface protein) de S. cerevisiae en
la base de datos Broad Institute (http://www.
broad.mti.edu./annotation/genome/neurospora). Con el uso del programa ExPAS
y Proteomics Server (Swiss Institute of Bioinformatics) (http://expasy.org/), que
incluye los programas SignalP 4.0 Server (Center of Biological Sequence
analysis) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), BIG-PI Fungal Predictor (IMP
Bioinformatics Group) (http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/fungi_server.html) y Pfam
HMM Search at Sanger Center (Sanger Institute)
(http://pfam.sanger.ac.uk/search) se realizaron análisis de sus secuencias
proteicas para observar la presencia o ausencia de secuencias péptido señal
(PS), sitios de unión a grupos glucosilfosfatidilinositol (GPI) y dominios con
actividad enzimática glucosilhidrolasa (GH), y con el uso del programa CAZY
(Carbohydrate Active Enzymes) (http://www.cazy.org) se buscaron las familias a
las que pertenecen las proteínas.
III.2-Crecimiento y mantenimiento de cepas de Neurospora crassa
a) Conidios
Para la obtención de conidios, las cepas de N. crassa (Tabla III) se cultivaron en
matraces de 250ml con 100ml de Medio Mínimo de Vogel (MMV) sólido (2 ml de
38
Sales de Vogel (50X), 1.5 g de Sacarosa, 1.5 g de Agar) y se incubaron a 28 °C.
Para el crecimiento de cepas de N. crassa auxótrofas para L-histidina, el MMV se
suplementó con este aminoácido (Histidina Calbiochem®) a una concentración
final de 0.5 mg/ml.
b) Micelio
Para la obtención de ADN genómico de N. crassa, se indujo la producción de
micelio. En un matraz de 125 ml con 50 ml MMV líquido (1 ml de sales de Vogel
(50X), 0.75 g de sacarosa), se inocularon conidios (una asada de conidios fue
suficiente) de la cepa silvestre FGSC# 988 (Tabla III). Este matraz se cubrió con
papel aluminio para evitar el paso de la luz y evitar la producción de conidios. Se
incubaron a 30ºC durante 2 días, en agitación (200 rpm) y oscuridad constantes.
El micelio se cosechó mediante filtración con un embudo estéril cubierto por papel
filtro Whatman®, se lavó con H2O bidestilada estéril (aproximadamente 150 ml),
se secó y se introdujo en tubos de microcentrífuga (1.7 ml) y se almacenó a -70°C
hasta ser liofilizado.
Tabla III. Cepas de N. crassa que se utilizaron en este estudio.
39
III.3-Colecta y conteo de conidios de Neurospora crassa
a) Conidios
Los conidios de cada cepa de la Tabla III se cosecharon en condiciones de
esterilidad. Se agregaron 50 ml de agua bidestilada estéril para lavar las paredes
del matraz y se agitó vigorosamente para desprender el micelio y los conidios. La
solución se filtró con un embudo y con tela Magitel® estéril para eliminar el micelio
y los restos de agar; se recuperó la suspensión de conidios en tubos falcon® de
50 ml y se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos. Dicha suspensión se lavó
dos veces con 20 ml de agua bidestilada estéril y se centrifugó a 3000 rpm
durante 5 minutos. Finalmente, los conidios se resuspendieron en 1 ml de Sorbitol
(1 M) frío, se hicieron alícuotas en tubos de microcentrífuga (1.7ml) y se
almacenaron a -20°C.
Para la cuantificación de los conidios se prepararon diluciones 1:100 con agua
destilada (bajo condiciones de esterilidad) en tubos de microcentrífuga de 1.7 ml.
Se colocaron 10 µl de la dilución celular en ambos lados de la cámara de
Neubauer y se realizó el conteo en 5 cuadrantes de cada lado (Figura 21).
Una vez obtenidos los conteos, se hizo un promedio de estos y se aplicó la
siguienteformula:
(No. conidios)(No. cuadrantes)(Fact. de dilución)(*Profundidad) = No. conidios/ml
*Profundidad: 10,000 (basada en la cámara de Neubauer)
Figura 21. Representación esquemática de la cámara de Neubauer. El color anaranjado, indica los
cuadrantes considerados durante el conteo celular (valor de profundidad: 10,000).
40
III.4-Caracterización de cepas de Neurospora crassa
a) Análisis molecular de cepas mutantes de N. crassa
Bajo condiciones de esterilidad, se inocularon los papeles filtro recibidos del
FGSC que contenían conidios de las cepas mutantes: FGSC# 15710 (Δmwg-1;
mat A), FGSC# 15711 (Δmwg-1; mat a), FGSC# 12959 (Δgas-5; mat a) y FGSC#
12960 (Δgas-5; mat A) en cajas Petri con MMV sólido y se incubaron a 28°C
durante 3 días. Luego, se realizaron cortes de bloques del medio con la cepa ya
crecida, se inocularon en matraces de 250 ml con 100 ml de medio MMV sólido y
se incubaron a 28°C durante una semana para la obtención de conidios.
Posteriormente se realizó la extracción de ADN genómico a partir de los conidios
de las cepas mutantes mediante el método Fenol-Cloroformo. Para la observación
del material genómico, se tomaron 5 µl de cada muestra y se realizó una
electroforesis en gel de agarosa.
“Corroboración de la eliminación del gen mwg-1 y gas-5 en cepas mutantes”
Se realizó una PCR con la enzima GoTaq (5 U/µl), como control el ADN genómico
de la cepa silvestre (FGSC#988) y con el uso del termociclador Labnet (Labnet
International Inc®).
Para la corroboración de la eliminación del ORF-3´ del gen mwg-1 se usaron los
oligonucleótidos sentido gfp-ORF/Pro/mwg-1-F/P3 y antisentido EcoRI-ORF/mwg-
1-R/P4 que amplifican un fragmento de 1,064 pb, y como controles los
oligonucleótidos sentido y antisentido para la amplificación de los fragmentos de
aproximadamente 500 pb y 1,000 pb del gen quitinasa Chi-2, respectivamente.
Para la corroboración de la eliminación del gen gas-5 se usaron los
oligonucleótidos sentido Xba1-gas-5-F/P1 y antisentido PacI-gas-5-R/P2 que
amplifican un fragmento de 1,552 pb, y como controles se utilizaron los
41
oligonucleótidos sentido XbaI-mwg-1-F/P1 y antisentido PacI-mwg-1-R/P2 que
amplifican el gen mwg-1 de 1,159 pb.
Finalmente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa de los productos de
PCR.
b) Obtención de cepas mutantes de mwg-1 homocariones
Se prepararon cajas Petri (60 x 15 mm) con medio sintético de cruzas (Sacarosa
2%, agar 2%, medio SC 2X stock, agua bidestilada) y se realizaron las siguientes
cruzas:
Cepa Δmwg-1 FGSC#15710 (mat A) x Cepa silvestre FGSC#988 (mat a)
Cepa silvestre FGSC#9013 (mat A) x Cepa Δmwg-1 FGSC#15710 (mat a)
Se inocularon 5 µl de conidios (1x105/µl) de la cepa mat A, se incubaron a 30°C
hasta la formación de micelio, y encima de esa cepa se esparcieron 5 µl de
conidios (1x105/µl) de la cepa mata. Se dejaron crecer durante tres semanas
(aprox.) a 25°C en condiciones de oscuridad (cajas Petri envueltas en papel
aluminio) hasta la formación de peritecios y liberación de ascosporas.
Posteriormente, bajo condiciones de esterilidad se usó el microscópio
estereoscopio Olympus modelo SZX12 con el objetivo 90X para la observación de
ascosporas y su recuperación con 1 ml de agua destilada estéril, se almacenaron
en tubos de microcentrífuga de 1.7 ml a 4°C hasta su uso.
c) Obtención de cepa doble mutante (Δmwg-1/Δgas-5)
Se prepararon cajas Petri (60 x 15 mm) con medio sintético de cruzas y se
realizaron las siguientes cruzas:
Cepa Δmwg-1 #11 (mat A) x Cepa Δgas-5 FGSC #12959 (mat a)
Cepa Δgas-5 FGSC #12960 (mat A) x Cepa Δmwg-1 #9 (mat a)
42
Se inocularon 5 µl de conidios (1x105/µl) de la cepa mat A, se incubaron a 30°C
hasta la formación de micelio, y encima de esa cepa se inocularon 5 µl de
conidios (1x105/µl) de la cepa mata. Se dejaron incubando durante tres semanas
(aprox.) a 25°C en condiciones de oscuridad (cajas Petri envueltas en papel
aluminio) hasta la formación de peritecios y liberación de ascosporas.
Posteriormente, bajo condiciones de esterilidad se usó el estereoscopio con el
objetivo 90X para la observación de ascosporas y su recuperación con 1 ml de
agua destilada estéril, se almacenaron en tubos de microcentrífuga de 1.7 ml a
4°C hasta su uso.
d) Activación y selección de ascosporas mutantes
Se transfirieron 100 µl de cada solución de ascosporas a tubos de microcentrífuga
de 1.7 ml, se activaron a 60°C durante 1 hora y se espatularon en cajas Petri (150
x 15 mm) con MMV suplementado con higromicina (300 µg/ml) y se incubaron a
28°C durante 12-14 horas, con la finalidad de permitir la germinación de solo
aquellas ascosporas que tuvieran integrado el gen de resistencia a higromicina en
lugar de los genes mwg-1 y gas-5.
Bajo condiciones de esterilidad, con el uso del estereoscopio y el objetivo 32X, se
seleccionaron las ascosporas germinadas, se transfirieron a tubos de borosilicato
con medio MMV suplementado con higromicina (300 µg/ml), y se incubaron a
28°C con luz constante durante 7 días para la obtención de micelio. Transcurrido
este tiempo se realizó una extracción de ADN genómico a partir de conidios por el
método Fenol-Cloroformo y un análisis por PCR para determinar la presencia o
ausencia de los genes mwg-1 y gas-5.
Una vez obtenido el resultado de la PCR, se tomaron asadas de las cepas que no
presentaron la amplificación de los genes mwg-1 y gas-5, se inocularon en
matraces de 250 ml con 100 ml de medio MMV y se incubaron a 28°C bajo
43
condiciones de luz, hasta la formación de conidios. Finalmente, la recuperación de
conidios se realizó como se mencionó anteriormente.
e) Determinación de la concentración subinhibitoria de congo rojo para la cepa silvestre de N. crassa
Para la determinación de la concentración subhinibitoria de la cepa silvestre de N.
crassa, en una caja Petri con medio MMV sólido, se inocularon 1x102 conidios de
la cepa silvestre FGSC# 988 en cada extremo de la caja, luego se incubaron a
30°C hasta la formación de micelio (5 cms de micelio) y posteriormente se
colocaron los filtros sumergidos en una solución de CR en agua destilada (˃pH
5.5) con diferentes concentraciones (5 µg/µl, 10 µg/µl, 15 µg/µl, 20 µg/µl, 25 µg/µl
y 30 µg/µl) con una distancia de 1 cm entre el micelio y el filtro. Se incubó de
nuevo la cepa, hasta que el micelio creciera más y tuviera contacto con los filtros
(aproximadamente 4 horas), esto se observó bajo el estereoscopio con el objetivo
90X en condiciones de esterilidad y finalmente se seleccionó la concentración
subinhibitoria para la cepa silvestre de N. crassa para los siguientes ensayos.
f) Velocidad de crecimiento hifal y morfología microscópica de cepas de N. crassa
Con la finalidad de observar y medir el crecimiento de las hifas de las cepas
mutantes de N. crassa bajo la presencia del CR se prepararon cámaras húmedas.
Se esparcieron 500 µl de MMV sobre la superficie de cubreobjetos estériles (Virag
y Griffiths, 2004) y posteriormente, se inocularon las cepas mutantes Δmwg-1,
Δgas-5, Δmwg-1/Δgas-5 y como control la cepa silvestre FGSC #988. Una vez
inoculadas, se colocaron en las cajas Petri de vidrio junto con papel filtro
Whatman® inmerso en agua destilada estéril y se incubaron a 30°C durante toda
la noche (aproximadamente 12 horas).
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se observaron las cepas con el uso
del microscopio invertido Zeiss (Carl Zeiss Axiovert 200), con la lámpara de
halógeno y el objetivo 100X. Para cada cepa se realizaron series de tiempo de 10
44
hifas diferentes que fueron tratadas con 10 µl de solución de CR (10 µg/µl) (se
colocó la solución encima de la hifa una vez que fue enfocada), al igual que se
realizaron series de tiempo de 10 hifas diferentes por cepa sin el tratamiento.
Luego, se midió la velocidad de crecimiento por hifa para cada cepa, en presencia
y ausencia del tratamiento con CR.
g) Medición de biomasa de cepas de N. crassa por peso seco
Matraces de 250 ml se llenaron con 50 ml de MMV líquido y 10 µg/µl de CR. Se
inocularon 1x104 conidios de las cepas FGSC# 988, Δmwg-1, Δgas-5 y Δmwg-
1/Δgas-5, luego se incubaron a 30°C y agitación constante a 200 rpm durante 72
horas. El ensayo se realizó por triplicado para cada cepa. De igual manera, se
hizo el ensayo control, el cual se realizó bajo las mismas condiciones a excepción
de la presencia del CR.
Al finalizar el ensayo, el micelio producido por cada cepa se cosechó mediante
filtración con un embudo, cubierto por Magitel®, se lavó con H2O bidestilada y se
secó completamente con la ayuda de papel filtro; el micelio se colocó en tubos de
microcentrífuga de 1.7 ml, la boca de cada tubo se cubrió con parafilm® y se
hicieron cuatro agujeros pequeños con una aguja. Luego, se colocaron en el
liofilizador FreeZone® 2.5 DrySystems (LABCONCO) durante 18-25 horas a una
presión 0.133 mBar y una temperatura de -40 °C. Una vez transcurrido este
tiempo las muestras fueron rápidamente transferidas a una cámara con perlitas
desecantes (gel de sílice) y finalmente se midió su peso con el uso de la balanza
analítica.
h) Cuantificación de ramificaciones de cepas de N. crassa
Para la realización del ensayo, se inocularon 1x104 conidios de cada cepa a
analizar (FGSC #988, Δmwg-1, Δgas-5 y Δmwg-1/Δgas-5) en cajas Petri con MMV
y en cajas Petri con MMV más CR (10 µg/µl). Se incubaron a 30oC a luz constante
45
durante 12 horas. Una vez crecidas las cepas, bajo el estereoscopio y con el
objetivo 12.5X, se contaron las ramificaciones presentes en 30 hifas en un rango
de 1 mm desde el ápice hasta la región basal.
i) Medición de hifas aéreas y producción de conidios
Para la medición de hifas aéreas, se prepararon tubos de borosilicato con 2 ml de
MMV con y sin CR (10 µg/µl). Se inocularon 1x104 conidios de cada cepa a
analizar (#988, Δmwg-1, Δgas-5 y Δmwg-1/Δgas-5) y se incubaron a 30oC con luz
constante, hasta su conidiación (aprox. 7 días). El ensayo se hizo por triplicado
para cada cepa y para cada tratamiento. Finalmente, se midió la altura de las
hifas desde el medio hasta donde terminaban las mismas (Figura 22).
Para el conteo de conidios, éstos se recuperaron con 1 ml de agua destilada
estéril a partir de los cultivos en donde se midieron las hifas aéreas y se
cuantificaron en la cámara de Neubauer, siguiendo las especificaciones
mencionadas anteriormente.
j) Análisis estadísticos
Los datos obtenidos fueron analizados con la prueba paramétrica ANOVA para
determinar diferencias significativas entre las cepas y en caso de ser necesario se
realizó una prueba posteriori de Tukey para determinar que cepas fueron
diferentes entre sí. En caso de que los datos no cumplieran con los supuestos de
la estadística paramétrica, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis.
Figura 22. Representación esquemática para la medición de hifas aéreas. (M: Medición).
46
Los resultados fueron esquematizados en un gráfico de cajas y bigotes. Todos los
análisis estadísticos se realizaron con el uso del software STATISTICA 8.0 ®.
III.5-Técnicas de biología molecular
a) Diseño de oligonucleótidos
Se diseñaron doce oligonucleótidos, para la amplificación de los genes mwg-1 y
gas-5, con el uso de los programas FastPCR Professional Versión 5.2.0.12
(Primer Digital Ltd http://primerdigital.com) y ApE (A plasmid Editor, Copyright ©
2003-2007 por M. Wayne Davis versión 1.11.0.0).
Para la amplificación de los fragmentos de los genes mwg-1 y gas-5 que
contienen la secuencia que codifica el péptido señal de 557 pb y 356 pb,
respectivamente y correspondientes al extremo 5´, se diseñaron los
oligonucleótidos sentido XbaI-PS/mwg-1-F/P1 y XbaI-PS/gas-5-F/P1 a los cuales
se les adicionó una secuencia de 8 nt (5´GCT▼CTAGA 3´) que corresponde al
sitio de restricción de la enzima XbaI (Biolabs®) y los oligonucleótidos antisentido
gfp-PS/Pro/mwg-1-R/P2 y gfp-PS/Pro/gas-5-R/P2 a los cuales se les adicionó un
codón para prolina según lo reportado anteriormente (Rodríguez-Peña et al.,
2000), y una secuencia de 20 nt que corresponde al extremo 5’ del gen de la
proteína verde fluorescente (gfp).
Para la amplificación de los fragmentos de los genes mwg-1 y gas-5 que
comprenden el marco de lectura abierto correspondiente al extremo 3´, de 1,064
pb y 1,520 pb respectivamente; se diseñaron los oligonucleótidos sentido gfp-
ORF/Pro/mwg-1-F/P3 y gfp-ORF/Pro/gas-5-F/P3 a los cuales se les adicionó una
secuencia de 20 nt que corresponde al extremo 3’ del gen codificante de la
proteína verde fluorescente (gfp) y un codón para prolina y los oligonucleótidos
antisentido EcoRI-ORF/mwg-1-R/P4 y EcoRI-ORF/gas-5-R/P4 a los cuales se les
47
adicionó una secuencia de 7 nt (5´GG▼AATTC 3´) que corresponde al sitio de
restricción de la enzima EcoRI-HF (Biolabs®).
Por otra parte, para la amplificación de los genes mwg-1 y gas-5 de 1,159 pb y
1,552 pb, respectivamente; se diseñaron dos oligonucleótidos sentido para cada
uno: XbaI-mwg-1-F/P1 y XbaI-gas-5-F/P1 a los cuales se les añadió una
secuencia de 8 nt (5´GCT▼CTAGA 3´) que corresponde al sitio de restricción de
la enzima XbaI (Biolabs®) y dos oligonucleótidos antisentido PacI-mwg-1-R/P2 y
PacI-gas-5-R/P2 a los cuales se les añadió una secuencia de 10 nt
(5´CCTTAAT▼TAA3´) que corresponde al sitio de restricción de la enzima PacI
(Biolabs®). En la Tabla IV se encuentran descritos los oligonucleótidos utilizados
en este estudio, que fueron solicitados a IDT® (Integrated DNA Technologies,
San Diego, California).
48
b) Extracción de ADN genómico de Neurospora crassa
Se tomó el tubo de microcentrífuga que contenía el micelio de la cepa silvestre
FGSC# 988, se cubrió la boca del tubo con parafilm® y se hicieron cuatro
agujeros pequeños con una aguja. El tubo se colocó en el liofilizador FreeZone®
2.5 DrySystems (LABCONCO) durante 18-25 horas a una presión 0.133 mBar y
Tabla IV. Oligonucleótidos utilizados en este estudio. Las secuencias para el corte por enzimas de
restricción están señaladas en negritas. Las secuencias para la complementación con gfp están
subrayadas. El codón que codifica para la prolina se encuentra en cursiva. Tm* indica la
temperatura de alineamiento en grados Centígrados.
49
una temperatura de -40°C. El micelio liofilizado se trituró hasta obtener un polvo
fino. Se pesaron 20 mg y éstos se utilizaron para la extracción de ADN genómico
con el uso del kit DNA FromPlantTissue (Mini) DNeasyPlant Mini Kit (QIAGEN®)
siguiendo las especificaciones del fabricante.
Para la extracción de ADN genómico de cepas de N. crassa mediante el método
Fenol-Cloroformo, se tomó una asada de conidios de la cepa y se resuspendieron
en 100 µl de Buffer de rompimiento (Tritón X-100 2%, SDS 1%, NaCl 100 mM,
EDTA 1 mM, Tris-HCl pH 8 10 mM) en un tubo de microcentrífuga de 1.7 ml. Se
añadieron 150 mg de perlitas de vidrio (0.45-0.5 mm), se agitó en vórtex durante
30 segundos, luego se incubó a 65°C durante 30 minutos con agitaciones en
vórtex cada 10 minutos durante 30 segundos, se agregaron 100 µl de Phenol-
SEVAG (Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico, 25:24:1), se agitó la muestra por
vórtex durante 5 minutos, se centrifugó a 13,000 rpm durante 5 minutos, se
colectaron 80 µl de sobrenadante y se transfirió a un tubo nuevo de
microcentrífuga de 1.7 ml.
Con la finalidad de observar la presencia del material genómico y su pureza
cualitativa, se tomaron 2 µl del producto, se diluyeron en 8 µl de agua HPLC y se
realizó una electroforesis en gel de agarosa.
c) Amplificación de mwg-1, gas-5 y gfp
Para la amplificación de mwg-1, gas-5 y gfp, se utilizó la técnica de PCR con la
enzima de alta fidelidad TaKaraLA TaqTMPolymerase (5U/µl, TaKara®), el ADN
genómico de la cepa silvestre (FGSC# 988) de N. crassa y con el uso del
termociclador Labnet (Labnet International Inc®).
Para la elaboración de las construcciones genéticas UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de
mwg-1 y gas-5 (gen gfp después del fragmento que codifica para el péptido
señal), se amplificaron los siguientes fragmentos:
50
1.-La región no traducible (UTR) más el marco de lectura abierto (ORF) 5’ de
los genes mwg-1 de 557 pb y gas-5 de 356 pb, con los oligonucleótidos XbaI-
PS/mwg-1-F/P1 (Sentido), gfp-PS/Pro/mwg-1-R/P2 (Antisentido) y XbaI-
PS/gas-5-F/P1 (Sentido), gfp-PS/Pro/gas-5-R/P2 (Antisentido),
respectivamente (Tabla IV y Figura 23).
2.-El marco de lectura abierto (ORF) 3’ de los genes mwg-1 de 1,064 pb y gas-
5 de 1,520 pb, con los oligonucleótidos gfp-ORF/Pro/mwg-1-F/P3 (Sentido),
EcoRI-ORF/mwg-1-R/P4 (Antisentido) y gfp-ORF/Pro/gas-5-F/P3 (Sentido) y
EcoRI-ORF/gas-5-R/P4 (Antisentido), respectivamente (Tabla IV y Figura 23).
Para la amplificación del gen gfp de 717 pb, de la proteína verde fluorescente
(GFP), se utilizó como templado el ADN del vector pMF272 con los
oligonucleótidos gfp-F-P5 (Sentido) y gfp-R-P6 (Antisentido) (oligonucleótidos
estándar para la amplificación de gfp, Tabla IV y Figura 23).
Por otra parte, para la amplificación de los genes mwg-1 de 1,159 pb y gas-5 de
1,552 pb, se usaron los oligonucleótidos sentido XbaI-mwg-1-F/P1 y Xba1-gas-5-
F/P1, y antisentido PacI-mwg-1-R/P2 y PacI-gas-5-R/P2, respectivamente (Figura
24).
Figura 23. Representación esquemática de la amplificación de los fragmentos mediante PCR. En el
inciso A se representan los fragmentos de 557 pb y 1,064 pb del gen mwg-1 (en azul) y en el inciso B
los fragmentos de 356 pb y 1,520 pb del gen gas-5 (en rosa). El gen gfp de 717 pb (en verde) se
encuentra representado en ambos incisos.
51
Posteriormente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa de los productos
de PCR. Los fragmentos amplificados e identificados se cortaron del gel y se
purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN®) siguiendo las
especificaciones del fabricante.
d) Construcciones genéticas de los genes mwg-1 y gas-5
Los fragmentos que corresponden a las regiones UTR mas el ORF-5´ (codifica
para el péptido señal) y los que corresponden a la región ORF-3´ de los genes
mwg-1 y gas-5, se usaron como templados para realizar una fusión de cada
fragmento con el gen gfp mediante PCR. La PCR de fusión implica la hibridación
de regiones de ADN complementarias y su posterior amplificación (Honda y
Selker, 2009). Se usó la enzima de alta fidelidad TaKaraLA TaqTMPolymerase
(5U/µl) y el termociclador Labnet (Labnet International Inc®).
Para mwg-1 se construyeron los brazos UTR/ORF 3´::gfp de 1,255 pb, con los
oligonucleótidos sentido XbaI-PS/mwg-1-F/P1 y antisentido gfp-P6 y, gfp::ORF 5´
de 1,830 pb, con los oligonucleótidos sentido gfp-P5 y antisentido EcoRI-
ORF/mwg-1-R/P4 (Figura 25).
Figura 24. Representación esquemática de la amplificación de los genes mwg-1 y gas-5 mediante
PCR. En el inciso A se representa el gen mwg-1 de 1,159 pb (en morado) y en el inciso B el gen gas-5
de 1,552 pb (en rojo).
52
Para gas-5 se construyeron los brazos UTR/ORF 3´::gfp de 1,071 pb, con los
oligonucleótidos sentido XbaI-PS/gas-5-F/P1 y antisentido gfp-P6 y, gfp::ORF 5´
de 2,235 pb, con los oligonucleótidos sentido gfp-P5 y antisentido EcoRI-
ORF/gas-5-R/P4 (Figura 25).
Finalmente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa de los productos de
PCR. Los fragmentos amplificados e identificados se cortaron del gel y se
purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN®) siguiendo las
especificaciones del fabricante.
Por consiguiente, se realizó otra PCR fusión de los brazos UTR/ORF 3´::gfp y
gfp::ORF 5´ de los genes mwg-1 y gas-5. Para obtener la construcción genética
UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1 de 2,297 pb se usaron los oligonucleótidos
sentido XbaI-PS/mwg-1-F/P1 y antisentido EcoRI-ORF/mwg-1-R/P4 (Figura 26).
Para la construcción genética UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5 de 2,552 pb se
usaron los oligonucleótidos sentido XbaI-PS/gas-5-F/P1 y antisentido ORF/gas-5-
R/P4 (Figura 26).
Figura 25. Representación esquemática de la fusión de los fragmentos de mwg-1 y gas-5 con gfp
mediante PCR. En el inciso A se representa la fusión del fragmento UTR-ORF de mwg-1 (en azul)
con el gen gfp (en verde) de 1,255 pb y la fusión del fragmento ORF de mwg-1 (en azul) con el gen
gfp (en verde)de 1,830 pb. En el inciso B se representa la fusión del fragmento UTR-ORF del gen
gas-5 (en rosa) con el gen gfp (en verde) de 1,071 pb yla fusión del fragmento ORF de gas-5 (en rosa)
con el gen gfp (en verde) de 2,235 pb.
53
Finalmente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa de los productos de
PCR. Los amplicones identificados se cortaron del gel y se purificaron con el kit
QIAquick Gel Extraction (QIAGEN®) siguiendo las especificaciones del fabricante.
e) Construcción de vectores recombinantes
“Construcción de los plásmidos TOPO-mwg-1 y TOPO-gas-5”
Con la finalidad de asegurar una exitosa formación de extremos cohesivos para la
posterior ligación a PMF272, los genes mwg-1 y gas-5 se ligaron al vector TOPO
del kit comercial TA Cloning de Invitrogen® haciendo uso de las colitas poli A que
poseían debido a la fase de extensión final durante su amplificación por PCR. Las
condiciones de ligación se establecieron en base a las especificaciones del kit y
fueron las siguientes: 2 µl de vector TOPO (25 ng/µl), 0.25 µl de ADN (mwg-1
ógas-5) (50 ng/µl), 1 µl de Buffer (10X), 5.75 µl de agua HPLC y 1 µl de T4 ADN
ligasa (4 U/µl), para un volumen final de 10 µl, luego las reacciones fueron
incubadas a 14°C durante 12 horas. Finalmente, los productos de ligación fueron
clonados en E. coli TOP10 y posteriormente extraídos y purificados para la
construcción de los plásmidos pALC01 y pALC02.
Figura 26. Representación esquemática de las construcciones moleculares (CG´s) realizadas
mediante PCR. En el inciso A se representa la CG UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1 (en azul y
verde) de 2,297 pb y en el inciso B se encuentra la CG UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5 (en rosa y
verde) de 2,552 pb.
54
“Construcción de los plásmidos pALC01 y pALC02”
Para la clonación de los genes mwg-1 y gas-5 se utilizó el plásmido PMF272, el
cual contiene el gen que codifica para la proteína GFP además de contar con el
gen de histidina. De tal forma que al existir recombinación genética se corrige la
mutación de la cepa 9717 permitiéndole así sintetizar histidina sin necesidad de
consumirla del medio. De esta manera se puede dirigir la integración de los
vectores conteniendo los genes mwg-1 y gas-5 etiquetados con la secuencia del
gen gfp en el genoma de N. crassa.
Para obtener los vectores recombinantes, los plásmidos TOPO-mwg-1, TOPO-
gas-5 y PMF272 fueron digeridos, para la liberación de los genes mwg-1 y gas-5,
respectivamente; bajo las siguientes condiciones: 0.5 µl de XbaI (20 U/µl,
BioLabs®), 1.0 µl de PacI (10 U/µl, BioLabs®), 2.0 µl de NEBuffer #4 (10X), 2.0 µl
de BSA (10X), 10.0 µl de ADN plasmídico (TOPO-mwg-1 ó TOPO-gas-5
óPMF272), 4.5 µl de agua HPLC para un volumen final de 20 µl, y luego se
incubaron a 37°C durante 3 ½ horas y a la mezcla de reacción que contenía el
vector PMF272, se le añadió 1µl de fosfatasa alcalina (1 U/µl, Promega®) y se
incubó durante 1 hora a 37°C.
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa y una vez que se identificaron los
fragmentos, se cortaron del gel y se purificaron con el kit QIAquick Gel Extraction
(QIAGEN®) siguiendo las especificaciones del fabricante.
Posteriormente, para la determinación de las condiciones de las reacciones de
ligación con mwg-1, gas-5 y PMF272 se hizo uso de la siguiente fórmula:
ng de inserto = (ng de vector x Kb de inserto/Kb de vector) x 3:1
Por consiguiente, se establecieron las siguientes condiciones: 2.0 µl de vector
PMF272 (100 ng/µl), 2.0 µl de inserto (mwg-1 ó gas-5) (25 ng/µl), 1.0 µl Buffer
55
(10X), 1.0 µl de Ligasa T4 (20 U/µl, Biolabs®) y 4.0 µl de agua HPLC para un
volumen final de 10.0 µl. Las reacciones se incubaron a 16°C durante 12 hrs.
(aprox.) y finalmente, los productos de ligación fueron clonados en E. coli TOP10.
“Construcción de los plásmidos pALC03 y pALC04”
Para la ligación de las construcciones genéticas UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de
mwg-1 y UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5 al plásmido PMF272, fue necesario
realizar reacciones de restricción para la formación de los extremos cohesivos en
el caso de los insertos, y para la liberación del gen gfp en el caso del plásmido
PMF272, para así en su lugar ligar el constructo genético y poder dirigir la
integración de la proteína marcada en el genoma de N. crassa, como se explicó
anteriormente. De esta manera, las condiciones de digestión fueron las
siguientes: 1 µl de XbaI (20 U/µl, BioLabs®), 1 µl de EcoRI-HF (20 U/µl,
BioLabs®), 4 µl de NEBuffer # 4 (10X), 4 µl de BSA (10X), 28 µl de constructo
genético (UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1) (64.5 ng/µl) ó 10.20 µl PMF272
(177 ng/µl) ó 23 µl de constructo genético UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5
(44.5 ng/µl) y finalmente las reacciones se ajustaron a un volumen final de 40 µl
con agua HPLC. Las reacciones se incubaron a 37°C durante un período de 3 ½
horas, una vez transcurrido este tiempo, a la mezcla de reacción que contenía el
vector PMF272 digerido con ambas enzimas, se le añadió 1µl de fosfatasa
alcalina (1 U/µl, Promega®) y se incubó durante 1 hora a 37°C.
Luego, se realizó una electroforesis en gel de agarosa de los productos digeridos
y se cortaron y purificaron los fragmentos con el Kit QIAquick Gel Extraction
(QIAGEN®) siguiendo las especificaciones del fabricante.
Posteriormente, para establecer las condiciones de las reacciones de ligación de
las construcciones genéticas y el plásmido PMF272 previamente digeridos, se
siguió la fórmula anteriormente descrita que implica una proporción 3:1
(inserto:vector). Por lo tanto, las condiciones fueron las siguientes: 1 µl de
56
LigasaT4 (400 U/µl, Biolabs®), 1µl de Buffer (10X), 0.8 µl de vector PMF272 (60
ng/µl), 1.2 µl de inserto (UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1) (42 ng/µl) ó 3.67 µl
de inserto (UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de gas-5) (13.6 ng/µl) y se ajustaron con
agua HPLC para tener un volumen final de 10 µl. Las reacciones se incubaron a
16°C durante 12 hrs. aproximadamente y finalmente, el producto de ligación fue
clonado en E. coli TOP10.
f) Clonación en bacterias E. coli TOP10
Los plásmidos construidos (TOPO-mwg-1, TOPO-gas-5, pALC01, pALC02,
pALC03 y pALC04), se clonaron en bacterias E. coli TOP10; para esto, se
tomaron 50 µl de bacterias competentes y se les añadieron 5 µl del vector
recombinante (todo sobre hielo), se mezclaron suavemente y se incubaron en
hielo durante 20-30 minutos. Inmediatamente, se realizó un choque térmico a
42°C durante 2 minutos, rápidamente se pasaron a hielo y se incubaron durante 2
minutos. Se añadieron 900 µl de medio líquido Luria-Bertani (LB) y se incubaron a
37°C durante 1 hora con agitación de 200 rpm. Subsecuentemente se
centrifugaron a 13,200 rpm durante 1 minuto, se removieron 850 µl de
sobrenadante (SN) y la pastilla se resuspendió en los 50 µl restantes de SN. Una
vez resuspendidas las bacterias, se espatularon en placas Petri con medio LB
sólido suplementado con ampicilina (100 µg/ml) (en el caso de las
transformaciones con los vectores TOPO-mwg-1 y TOPO-gas-5, además de la
ampicilina, se añadieron 40 µl de X-Gal (40 mg/ml) al medio) y se incubaron a
37°C durante 12-14 horas. Posteriormente, se seleccionaron diez colonias que
presentaron resistencia a ampicilina (mostraron crecimiento en medio LB con
ampicilina) (en el caso de aquellas cepas transformadas con los vectores TOPO-
mwg-1 y TOPO-gas-5, se seleccionaron las colonias que presentaron coloración
blanca) y con cada colonia, se realizó lo siguiente:
57
1. Bajo condiciones de esterilidad, se tomó cada colonia con un palillo de
madera estéril y se estriaron en una caja Petri con medio LB suplementado
con ampicilina (100 µg/ml), que se incubó a 37°C de 12-14 horas.
2. El resto de colonia que se quedó en cada palillo, se introdujo en tubos para
microcentrífuga de 0.2 ml previamente preparados con la mezcla de
reacción de PCR con el uso de la enzima GoTaq (5 U/µl) y el termociclador
BioRad® (MJ Mini Personal Thermal Cycler). En el caso de las cepas
transformadas con los plásmidos pALC01 y pALC02, se usaron los
oligonucleótidos XbaI-mwg-1-F/P1 (sentido) y PacI-mwg-1-R/P2
(antisentido) para la amplificación del gen mwg-1 de 1,159 pb y los
oligonucleótidos XbaI-gas-5-F/P1 (sentido) y PacI-gas-5-R/P2 (antisentido)
para la amplificación del gen gas-5 de 1,552 pb, respectivamente. Por otra
parte, en el caso de las cepas transformadas con los plásmidos pALC03 y
pALC04, se usaron los oligonucleótidos gfp-ORF/Pro/mwg-1-F/P3 (sentido)
y EcoRI-ORF/mwg-1-R/P4 (antisentido) para la amplificación del marco de
lectura abierto (ORF) 3’ del gen mwg-1 de 1,064 pb y los oligonucleótidos
gfp-ORF/Pro/gas-5-F/P3 (sentido) y EcoRI-ORF/gas-5-R/P4 (antisentido)
para la amplificación del marco de lectura abierto (ORF) 3´ del gen gas-5
de 1,520 pb respectivamente. Luego, se realizó una electroforesis en gel de
agarosa de los productos de PCR.
3. Bajo condiciones de esterilidad, se inocularon tubos (16x100) con 3-5 ml de
medio líquido LB suplementado con ampicilina (100 µg/ml) con aquellas
colonias que presentaron la amplificación de los genes de interés y se
incubaron a 37°C con agitación constante de 200 rpm de 12-14 horas.
“Preservación de células”
A partir de los tubos con las cepas crecidas y previamente seleccionadas como
positivas para la presencia de los vectores recombinantes, se tomaron 700 µl y se
preservaron con 300 µl de glicerol al 50% y se almacenaron a -80°C.
58
g) Purificación y análisis de restricción de vectores recombinantes
“Purificación de vectores recombinantes”
En el caso de la purificación de los vectores recombinantes mediante el método
de miniprep casera, se tomaron 3 ml de suspensión bacteriana, por cada muestra,
positiva para la presencia de los vectores, y se colocaron en tubos de
microcentrífuga de 1.7 ml, posteriormente se centrifugaron a 14,000 rpm durante
un minuto, se decantó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 100 µl de
solución fría P1 (Tris-HCl 50 mM, pH8.0; EDTA 10 mM). Luego, se agregó a cada
muestra 150 µl de solución P2 (almacenada a temperatura ambiente) (NaOH 0.2
M, SDS 1%), se mezclaron por inversión suave (aprox. 7 veces) y se incubaron
durante 5 minutos en hielo. Se realizó otra centrifugación a 14,000 rpm durante 15
minutos y enseguida se rescató el sobrenadante de cada muestra, esto evitando
tocar el precipitado, y se colocaron en tubos de microcentrífuga de 1.7 ml, luego
se les añadió 1 µl de RNAsa (4 µg/µl) y se incubaron a 37°C durante 15 minutos.
Se precipitó el ADN con 2 volúmenes de etanol al 96% frío y se mantuvieron a -
80°C durante 30 minutos, después las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm
durante 15 minutos (a 4°C) se desecharon los sobrenadantes y se lavó de nuevo
el ADN con 500 µl de etanol al 70% frío, se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5
minutos y se desechó el sobrenadante. Finalmente las muestras se secaron con
el uso del concentrador eppendorf concentrator 5301® durante 15 minutos a
60°C, posteriormente cada pastilla se resuspendió en 80 µl de buffer EB (10 mM
Tris-Cl, pH 8.5). Para la observación del ADN plasmídico se realizó una
electroforesis en gel de agarosa.
“Análisis de restricción de vectores recombinantes”
Para el análisis de restricción de los plásmidos construidos, se establecieron
distintas condiciones dependiendo de cada plásmido. Así para TOPO-mwg-1 y
TOPO-gas-5 las condiciones fueron las siguientes: para un volumen total de 20 µl,
59
se adicionaron 3 µl de ADN plasmídico, 2 µl de Buffer H (10X), 0.5 µl de EcoRI (5
U/µl, Invitrogen®) y 14.5 µl de agua HPLC. En el caso de los plásmidos pALC01 y
pALC02 la mezcla de reacción contenía 0.3 µl de NEBuffer #2 (10X), 0.5 µl de
PstI (10 U/µl, BioLabs®) (para pALC01) ó 0.5 µl de EcoRV (10 U/µl, BioLabs®)
(para pALC02), 1.0 µl de ADN plasmídico y 1.2 µl de agua HPLC, para un
volumen final de 3 µl. Finalmente, para el análisis de restricción de los plásmidos
pALC03 y pALC04 se realizaron reacciones de restricción bajo las siguientes
condiciones, 2 µl de NEBuffer #4 (10X), 2 µl de BSA (10X), 1 µl de XbaI (20 U/µl),
1 µl de EcoRI-HF (20 U/µl), 2 µl de plásmido (pALC03 ó pALC04) y se ajustó con
9 µl de agua HPLC a un volumen total de 20 µl.
Todas las reacciones de restricción se incubaron a 37°C durante 3 horas y
finalmente se realizaron diversas electroforesis en gel de agarosa de los
productos de digestión.
h) Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Para cada reacción de PCR se prepararon los siguientes dos tipos de mezcla de
reactivos:
-Con el uso de la enzima GoTaq (Promega ®): 11.05 µl agua HPLC, 3.0 µl Buffer
(5X), 0.25 µl dNTP´s (10 mM), 1.5 µl MgCl2 (25 mM), 1.0 µl oligonucleótido
sentido (10 µM), 1.0 µl oligonucleótido antisentido (10 µM), 2 µl ADN, 0.2 µl
enzima polimerasa (5 U/µl), para un volumen final de 20 µl.
-Con el uso de la enzima TaKaraLA TaqTMPolymerase (TaKara®): 31.8 µl agua
HPLC, 5.0 µl Buffer (10X), 4.0 µl dNTP´s (2.5 mM), 5.0 µl MgCl2 (25 mM), 1.0 µl
oligonucleótido sentido (10 µM), 1.0 µl oligonucleótido antisentido (10 µM), 2 µl
ADN, 0.2 µl enzima polimerasa (5 U/µl) para un volumen final de 50 µl.
60
Bajo las siguientes condiciones:
Tm* según el oligonucleótido (Tabla IV).
Kb* según el tamaño del fragmento de interés.
Los productos se almacenaron a -20°C hasta su posterior análisis.
i) Electroforesis en gel de agarosa
Para la identificación de los fragmentos de ADN, cada producto se mezcló con
amortiguador de carga Blue/Orange LoadingDye 6X (Promega®) en proporción
6:1 y se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio
(0.1 μg/ml, Invitrogen®) sumergido en buffer TAE1X (40 mM Tris-acetato, 1 mM
EDTA), a 80 volts durante 60 minutos y finalmente, el gel de agarosa se expuso a
luz ultravioleta para su observación y posterior tratamiento. Para identificar las
bandas de interés se utilizó el marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
j) Secuenciación
Los plásmidos recombinantes obtenidos en este estudio (pALC01, pALC02,
pALC03 y pALC04) se prepararon para enviar a secuenciar. Como primer paso y
bajo condiciones de esterilidad, se estriaron asadas de las clonas positivas para
los plásmidos almacenados en glicerol a -80°C, en placas de LB suplementado
con ampicilina (100 µg/ml) y se incubaron a 37°C durante 12-14 horas, una vez
que se observó el crecimiento de colonias se tomó una colonia por plásmido y se
inocularon en tubos (16x100) con 3-5 ml de medio líquido LB suplementado con
61
ampicilina (100 µg/ml). Posteriormente se realizó la extracción de los plásmidos
con el uso del kit comercial QIAGEN ® (QIAprep® spin miniprep) bajo las
especificaciones del fabricante. Una vez obtenidos los vectores, se realizó una
electroforesis en gel de agarosa al 1% para corroborar la presencia y tamaño de
los mismos. Luego se realizó la medición de la concentración del ADN plasmídico
con el uso del nanodrop NanoVue® (GE Healthcare). Para cada plásmido se
prepararon dos mezclas en tubos para microcentrífuga de 0.2 ml, cada tubo
contenía 1 µg (3.3 µl) de ADN plasmídico (≈350 ng/µl) y 6.4 pmoles (0.64 µl) de
oligonucléotido (10 µM). Los oligonucleótidos utilizados fueron PMF272 fwd y
GFP stop fwd (Tabla IV). Finalmente, las muestras se enviaron a SeqXcel® (DNA
Sequencing Services, San Diego, California) para su secuenciación. Una vez
obtenidas las secuencias se analizaron con el uso del programa ApE (A plasmid
Editor by M. Wayne Davis, v2.0.37).
III.6-Obtención de cepas de Neurospora crassa etiquetadas con GFP
a) Linearización de plásmidos para la transformación de N. crassa
Para la linearización de los plásmidos pALC01 y pALC02, se realizaron
reacciones de digestión bajo las siguientes condiciones: para un volumen final de
20µl, se añadieron 3 µl de ADN plasmídico (1 µg/µl) (pALC01 ó pALC02), 2 µl de
NEBuffer #2 (10X), 1 µl de enzima SspI (5 U/µl, BioLabs®) y 14 µl de agua HPLC.
Por otra parte, en el caso de los plásmidos pALC03 y pALC04 las condiciones de
linearización fueron las siguientes: se añadieron 10 µl de plásmido (pALC03 ó
pALC04) (492.5 ng/µl), 2 µl de NEBuffer #2 (10X), 1 µl de enzima SspI (5 U/µl,
BioLabs®) y 7 µl de agua HPLC, para un volumen final de 20 µl. Se incubaron a
37°C durante 3 horas y luego se añadió a la digestión 2 µl de Acetato de sodio (3
M, pH 5.2), posteriormente se añadieron 2 volúmenes (del total) de etanol al
100% frío. La mezcla se mantuvo a -20°C durante 30 minutos, luego se centrifugó
a 13,200 rpm por 15 minutos, al finalizar se retiró el sobrenadante por pipeteo y se
62
añadieron 200 µl de etanol al 70% frío, se centrifugó a 13,200 rpm durante 5
minutos, se retiró el sobrenadante por pipeteo y finalmente, las muestras se
secaron con el uso del concentrador eppendorf concentrator 5301® durante 15
minutos a 60°C (o hasta que se evaporara completamente el etanol) y se
resuspendió la pastilla en 15 µl de buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5). Se corrió
una electroforesis en gel de agarosa con 5 µl de la muestra para corroborar la
presencia de los plásmidos linearizados, y se midió la concentración del ADN
plasmídico con el uso del nanodrop NanoVue® (GE Healthcare). Finalmente, se
realizaron las transformaciones de N. crassa con 10 µl de las soluciones.
b) Transformación de Neurospora crassa
Para realizar la transformación de conidios de N. crassa se utilizó la cepa 9717
(Tabla III) que impide la integración no homóloga, ya que tiene una mutación en el
gen mus 51. Se tomaron las alícuotas de conidios almacenados a -20°C (tubos de
microcentrífuga de 1.7 ml) y se lavaron 3 veces con 1 ml de sorbitol (1 M) frío y
centrifugaciones a 13,000 rpm de 2 minutos. Al finalizar los lavados se
resuspendieron en 1 ml de sorbitol 1 M. Luego, se realizó una dilución 1:1000 con
agua destilada para medir la densidad óptica a 420 nm con el espectrofotómetro
(1 O.D. = 2.86 x 106 conidios/ml) para finalmente ajustar la concentración de
conidios a 2.5 x 109 conidios/ml. Una vez que se tuvo la concentración adecuada
de conidios la suspensión fue transferida a una celda de electroporación de 0.2
mm (fría y estéril) y se añadieron 10 µl de ADN plasmídico (≈1 µg/µl) (pALC01,
pALC02, pALC03 y pALC04); la celda se colocó en el electroporador BioRad®
(Gen Pulser Xcell System modelo 165-2660) usando las siguientes condiciones:
Voltaje 1,500 V, Capacitancia 25 µF, Rango: 10-15 ms, Resistencia: 600 Ω,
Gabeta: 2 mm. Luego, se dio un pulso eléctrico y rápidamente se agregó 1 ml de
sorbitol (1 M) frío, posteriormente la mezcla se transfirió a 5 ml de medio de
recuperación (Sales de Vogel (50X), extracto de levadura al 2%) en tubos
Falcon® de 25 ml y se incubaron a 30°C con 100 rpm de 2 a 4 horas. Una vez
transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugaron a 3,000 rpm durante 5
63
minutos, se retiró el sobrenadante y se resuspendieron en aproximadamente 200
µl del medio sobrante, finalmente los conidios se espatularon en cajas Petri con
medio FGS agar (Sales de Vogel 50X, agar 1%, FGS 10X) y se incubaron a 30°C
hasta la formación de colonias transformantes.
c) Recuperación de transformantes de Neurospora crassa
Las transformantes se resembraron en tubos de borosilicato (12 x 75 mm, Pyrex
®) preparados con medio MMV solidificado de forma oblicua para obtener mayor
superficie de cultivo; luego se incubaron a 30°C hasta obtener micelio maduro que
se expuso a la luz para obtener abundante producción de conidios. Aquellas
cepas que se desarrollaron en medio MMV indican que han recuperado la
capacidad de producir histidina, por lo tanto es indicativo de la integración del
plásmido.
d) Comprobación de la integración de los plásmidos en el genoma de Neurospora crassa
En el caso de la comprobación de la inserción de los plásmidos en N. crassa,
primeramente se realizó la extracción de ADN genómico a partir de las conidios
de cada cepa, mediante el método Fenol-Cloroformo. Se tomaron 5 µl del ADN de
cada cepa y se realizó una electroforesis en gel de agarosa. Después, para cada
cepa transformante indicativa de la integración de los plásmidos mediante la
recuperación de la capacidad de producir histidina, se realizó la PCR con el uso
de la enzima GoTaq (5 U/µl) y el termociclador BioRad® (MJ Mini Personal
Thermal Cycler). Para la amplificación del fragmento de 3.2 Kb que corresponde a
la región 5´ del gen His-3 y a la región 3´ del gen gfp se usaron los
oligonucleótidos pMR10 (sentido) y pMR11 (antisentido). Para la amplificación del
fragmento de 2.1 Kb que corresponde a la región 3´ del gen His-3 y a la región 5´
del promotor ccg-1, se usaron los oligonucleótidos pMR12 (Antisentido) y pMR13
(Sentido). Finalmente, los resultados de PCR se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa.
64
III.7-Microscopía confocal
Para examinar las cepas de N. crassa con expresión de mwg-1::gfp y gas-5::gfp;
se observaron hifas maduras. La preparación de la muestra se realizó tomando
una asada de cada muestra e inoculándolas en cajas Petri con MMV sólido.
Luego se incubaron a 30°C y cuando las hifas formaron una colonia de alrededor
de 5 cm de diámetro se realizó la técnica de bloque invertido (Hickey et al., 2004)
(Figura 27). El corte del bloque de agar se realizó tomando en cuenta la periferia
de la colonia y de forma rectangular y después de un período de recuperación de
15 minutos aproximadamente se procedió al análisis bajo el microscopio.
Se utilizó un microscopio confocal invertido de escaneo con láser LSM-510 META
(Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión 100X de
contraste de fases (N.A. 13) (Plan Neofluar, Carl Zeiss). Para examinar la
expresión de la GFP se utilizó un láser de Argón/1 Abs/Em 488/505-530 nm y un
fotomultiplicador que permitió capturar imágenes tanto de fluorescencia como de
contraste de fases. Para la obtención de imágenes y series de tiempo se utilizó el
software LSM-510 (versión 3.2; Carl Zeiss) y las imágenes fueron examinadas
con el uso del software LSM Image Browser.
Figura 27. Representación esquemática del método de bloque de agar invertido (modificado de
Hickey et al., 2004).
65
Capítulo IV
Resultados
IV.1-Análisis Bioinformático
Después de haber realizado la búsqueda de secuencias de N. crassa homólogas
a ScCrh1p/ScCrh2p y Gas1p de S. cerevisiae, se encontraron las secuencias
génicas mwg-1 (Cell Wall Glucanosyltransferase NCU05974.5) y gas-5
(Glycolipid-Anchored Surface protein 5 NCU01162.5), y por consiguiente se
procedió al análisis de sus respectivas secuencias proteicas. Se encontró que la
proteína MWG-1 está conformada de 364 aminoácidos, contiene un péptido señal
y su sitio de corte se encuentra entre los aminoácidos 17(Ala) y 18(Gln). Por otra
parte, en el extremo carboxilo terminal presenta sitios potenciales de unión a
GlucosilFosfatidilInositol (GPI) en los aminoácidos 341(Gly) y 342(Gly). Posee un
dominio GlucosilHidrolasa (GH) de la familia 16 que comprende los aminoácidos
79-189 y 194-220, y dentro de esta región se encuentra el motivo DE(I)D(W)E
(117-122), en donde los aminoácidos 118(Glu), 120(Asp) y 122(Glu) conforman el
sitio activo (Figura 28).
66
En el caso de la proteína GAS-5 se encontró que está conformada de 457
aminoácidos, contiene un péptido señal y su sitio de corte se encuentra entre los
aminoácidos 19(Ala) y 20(Thr). Por otra parte, posee sitios potenciales de unión a
GPI que conforman los aminoácidos 426 (Ser) y 427(Gly). Posee un dominio GH
de la familia 72 que comprende los aminoácidos 80 al 313, y dentro de esta región
se encuentran los motivos SGNEV (163-167) y SEYGC (266-270) en donde los
aminoácidos 166(Glu) y 267(Glu) conforman el sitio activo (Figura 29).
67
IV.2-Conteo de conidios
Los resultados de la cuantificación de los conidios de las cepas de N. crassa se
desglosan en la Tabla V.
IV.3-Caracterización de cepas mutantes
a) Análisis molecular de cepas mutantes de N. crassa
Se obtuvo el ADN genómico de las cepas Δmwg-1 (mat A y a) y Δgas-5 (mat A y
a) (Figura 30).
Figura 30. Las bandas en el gel de electroforesis indican el ADN genómico de las cepas mutantes y la
cepa silvestre control (wt). M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Tabla V. Número de conidios de cepas de N. crassa que se utilizaron en este estudio.
68
Posteriormente, se realizaron reacciones de PCR en donde se utilizaron los
oligonucleótidos para amplificar los genes mwg-1 y gas-5. Las cepas
presuntamente mutantes para mwg-1 presentaron un fragmento de 1,064 pb
indicativo de la presencia del ORF-3´ del gen; esto probablemente se deba a que
la cepa tiene varios núcleos (heterocariótica) y algunos de ellos aún conservan el
gen (Figura 31).
Por otra parte, no se amplificaron los fragmentos de 1,552 pb indicativos del gen
gas-5, lo cual indica que las cepas son mutantes (homocarióticas) (Figura 32). Las
bandas que no pertenecen al tamaño deseado son producto de un alineamiento
inespecífico de los oligonucleótidos en distintas regiones de ADN.
Figura 32. Las bandas en el gel de electroforesis con tamaño de aproximadamente 1.5kb
corresponden a la amplificación del gen gas5, y las bandas con tamaño de aproximadamente 1Kb
corresponden a la amplificación del gen mwg1 como control positivo. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 31. Las bandas en el gel de electroforesis con tamaño de aproximadamente 1kb
corresponden a la amplificación del gen mwg1, y las bandas con tamaño de aproximadamente 500pb
corresponden a la amplificación del gen control Chi2. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb
ADN (3µl) (BioLabs®).
69
b) Obtención de cepas homocariones mutantes sencillas Δmwg-1
Debido a que las cepas mutantes para mwg-1 resultaron ser heterocarióticas, se
realizaron las siguientes cruzas:
Cepa KO1 FGSC# 15710 (mat A) x Cepa silvestre FGSC# 988 (mat a)
Cepa Silvestre FGSC# 9013 (mat A) x Cepa KO2 FGSC# 15710 (mat a)
Se seleccionaron 13 ascosporas homocariones germinadas resistentes a
higromicina, de las cuales sólo tres, y fueron las que se analizaron (Figura 33).
Las reacciones de PCR corroboraron la eliminación del gen mwg-1 en las tres
cepas (Figura 34).
Figura 34. Las bandas en el gel de electroforesis correspondientes a la cepa wt y con tamaño de
aproximadamente 1kb, representan la amplificación del gen mwg1 y del gen control Chi2. Las
bandas de aproximadamente 1kb de las cepas #9, #11 y #12 corresponden al gen control Chi2. M:
Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 33. Las bandas en el gel de electroforesis indican el ADN genómico de los conidios
provenientes de las ascosporas mutantes de mwg1 y la cepa silvestre control. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
70
De nuevo se observaron bandas que no pertenecen al tamaño deseado y que son
producto de un alineamiento inespecífico de los oligonucleótidos en distintas
regiones de ADN.
c) Obtención de cepas doble mutantes Δmwg-1/Δgas-5
Con la finalidad de observar el fenotipo y comportamiento de cepas con doble
mutación, se realizaron las siguientes cruzas:
Cepa Δmwg-1 #11 (mat A) x Cepa Δgas-5 FGSC #12959 (mat a)
Cepa Δgas-5 FGSC #12960 (mat A) x Cepa Δmwg-1 #9 (mat a)
Se seleccionaron 3 ascosporas homocariones germinadas resistentes a
higromicina. Solo una desarrolló micelio y conidios la cual fue analizada (Figura
35). Las reacciones de PCR corroboraron la eliminación de los genes mwg-1
(ORF-3´ 1,064 pb) y gas-5 (ORF-3´1,520 pb) (Figura 36).
Figura 35. La banda en el gel de electroforesis corresponde al ADN genómico de los conidios
provenientes de las ascosporas mutantes Δmwg1/Δgas5. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb
ADN (3µl) (Fermentas®).
71
d) Determinación de la concentración subinhibitoria de congo rojo para la cepa silvestre de N. crassa
Después de que las hifas de la cepa silvestre tuvieron contacto con el filtro que
contenía una concentración de 10 µg/µl de congo rojo (CR), presentaron una
disminución en su crecimiento comparadas con las que tuvieron contacto con el
filtro que contenía una concentración de 5 µg/µl de CR. A diferencia del
crecimiento de las hifas que tuvieron contacto con los filtros de las más altas
concentraciones (15, 20, 25 y 30 µg/µl) de CR que se vieron inhibidas. Se
seleccionó la concentración de10 µg/µl de CR para realizar el resto de los
ensayos (Figura 37).
Figura 37. Esquema en donde se representa el comportamiento de la cepa silvestre bajo distintas
concentraciones de congo rojo (CR).
Figura 36. La banda en el gel de electroforesis correspondiente a la cepa doble mutante
Δmwg1/Δgas5 y con tamaño de aproximadamente 1kb, representa la amplificación del gen control
Chi2. No se presentaron bandas indicativas de la presencia de los genes mwg1 y gas5. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
72
e) Velocidad de crecimiento hifal y morfología microscópica de cepas de N. crassa
Se observó que no hubo diferencias significativas en la velocidad de crecimiento
en ausencia de CR entre las cepas mutantes y la cepa silvestre control (Figura
38). Por otra parte, se observó que existe diferencia significativa en la velocidad
de crecimiento en presencia y en ausencia de CR de las cepas mutantes Δmwg-1
y Δgas-5, siendo menor la velocidad de crecimiento hifal bajo la presencia de CR.
Sin embargo, la cepa doble mutante Δmwg-1/Δgas-5 no mostró diferencia
significativa en la velocidad del crecimiento hifal en presencia y ausencia de CR,
al igual que la cepa silvestre control (Figura 38).
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50
5
10
15
20
25
30
Cre
cim
ien
to h
ifa
l (µ
m/m
in)
CCR (10 µg/µl) ± Std. Error SCR ± Std. Error
(a,b)
(b)
(a,b)
(c)
(a)(a)
(a)
(b,c)
Se observó el crecimiento de las hifas de las cepas mutantes mediante
microscopía de contraste de fases. Una vez que se añadía el CR la morfología de
Figura 38. Crecimiento hifal (µm/min) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en
presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos superíndices indican diferencia
significativa entre los tratamientos (p˂0.05 en donde a˃b˃c). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo
rojo.
73
las hifas cambiaba (videos suplementarios), éstas disminuían su velocidad de
crecimiento, se hinchaban por la parte subapical o apical, se adelgazaban por el
ápice, dejaban de crecer y se lisaban. En las figuras 39 a 42 se esquematizan las
series de tiempo de las cepas wt y mutantes y en las tablas VI al IX se describen
las morfologías y el tipo de lisis que presentaron.
74
Figura 39. Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa silvestre, en presencia y ausencia de
congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices indican el tiempo transcurrido durante el crecimiento
(h:min:seg). Bajo la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la morfología hifal.
Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la escala.
75
Tabla VI. Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la cepa control wt
en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de muestra corresponde a los números de muestras de
las imágenes de las series de tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
76
77
Figura 40. Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de mwg-1, en presencia y
ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices indican el tiempo transcurrido durante el
crecimiento (h:min:seg). Bajo la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la
morfología hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la escala.
78
Tabla VII. Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la cepa mutante
Δmwg-1 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de muestra corresponde a los números de
muestras de las imágenes de las series de tiempo. X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
79
80
Figura 41. Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de gas-5, en presencia y
ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices indican el tiempo transcurrido durante el
crecimiento (h:min:seg). Bajo la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la
morfología hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la escala.
81
Tabla VIII. Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la cepa mutante
Δgas-5 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de muestra corresponde a los números de
muestras de las imágenes de las series de tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
82
83
Figura 42. Series de tiempo de crecimiento hifal de la cepa mutante de mwg-1/gas-5, en presencia y
ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos subíndices indican el tiempo transcurrido durante el
crecimiento (h:min:seg). Bajo la presencia de congo rojo se puede observar un cambio en la
morfología hifal. Las barras ubicadas en la parte inferior de cada imagen indican la escala.
84
Tabla IX. Se describe el tipo de morfología y explosión que presentó cada hifa de la cepa mutante
Δmwg-1/Δgas-5 en presencia de CR (10 µg/µl). Cada número de muestra corresponde a los números
de muestras de las imágenes de las series de tiempo X: indica que se presentó ese tipo de lisis.
85
Por otra parte, al evaluar del tiempo de resistencia de las cepas bajo la presencia
de CR (antes de lisarse), se observó que hubo diferencia significativa entre las
cepas mutantes y la cepa silvestre control (wt), siendo esta última la más
resistente al tratamiento con CR (Figura 43).
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50
10
20
30
40
50
60
Tie
mp
o d
e r
esis
ten
cia
(S
eg
un
do
s)
Media Media±Std.Error
(a)
(b)
(b)
(b)
f) Medición de biomasa de cepas de N. crassa por peso seco
En cuanto a la producción de biomasa se observó que en ausencia de CR, las
cepas no presentaron diferencia significativa, a excepción de la cepa mutante
Δmwg-1 que mostró mayor producción de biomasa. Sin embargo, al ser sometidas
al tratamiento de CR se observó que las cepas mutantes produjeron menor
biomasa y presentaron diferencia significativa con respecto a la cepa silvestre
(Figura 44).
Figura 43. Tiempo de resistencia a congo rojo (segundos) de las cepas mutantes y su control la cepa
silvestre, en presencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos superíndices indican diferencia
significativa entre el comportamiento de las cepas (p˂0.05 en donde a˃b).
86
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Peso S
eco (
mg)
(a)
CCR (10 µg/µl) ± Std. Error SCR ± Std. Error
(b,c)
(c)
(d)
(e)
(e) (e)
(b)
g) Cuantificación de ramificaciones de cepas de N. crassa
En la cuantificación de las ramificaciones se observó que existe diferencia
significativa entre las cepas mutantes y la cepa silvestre, la cual produjo el mayor
número de ramificaciones. Sin embargo, la cepa mutante de Δmwg-1 fue la única
que presentó diferencia significativa con respecto a la mutante Δgas-5 y a la doble
mutante Δmwg-1/Δgas-5 (Figura 45).
Figura 44. Peso seco (mg) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en presencia y
ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos superíndices indican diferencia significativa entre
los tratamientos (p˂0.05 en donde a˃b˃c˃d˃e). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
87
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50
1
2
3
4
5
6
Ra
mific
acio
ne
s/m
m
Media Media±Std.Error
(a)
(b)
(c)
(b)
h) Medición de hifas aéreas y producción de conidios
Los resultados de la medición de las hifas aéreas indican que existe diferencia
significativa entre las mutantes y la cepa silvestre, la cual presentó un mayor
desarrollo. Por otra parte, se presentó el mismo patrón de desarrollo bajo la
presencia de CR, en donde existió diferencia significativa entre las cepas
mutantes y la cepa silvestre. Finalmente, también se presentó diferencia
significativa entre los tratamientos de las cepas mutantes (en presencia y en
ausencia de CR) (Figura 46).
Figura 45. Ramificaciones/mm de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre. Los distintos
superíndices indican diferencia significativa entre las cepas (p˂0.05 en donde a˃b˃c).
88
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
Hifa
s A
ere
as (
cm
)
SCR ± Std. Error
CCR (10 µg/µl) ± Std. Error
(a)
(a,b) (b)
(d)
(c)(c) (c)
(a,b)
En cuanto a la cuantificación de conidios se observó que en ausencia CR existe
diferencia significativa entre las cepas mutantes y la cepa silvestre, la cual
presentó la mayor producción de conidios. En el caso de la cepa silvestre se
observó que no hubo diferencia significativa en presencia de CR, con respecto a
la producción de conidios en ausencia de CR. Por otra parte, las cepas mutantes
presentaron diferencia significativa en presencia de CR, sin embargo, la cepa
mutante Δgas-5 presentó la menor producción de conidios con respecto a la cepa
silvestre y a las mutantes Δmwg-1 y Δmwg-1/Δgas-5 (Figura 47).
Figura 46. Hifas aéreas (cm) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en presencia y
ausencia de CR (10 µg/µl). Los distintos superíndices indican diferencia significativa entre los
tratamientos (p˂0.05 en donde a˃b˃c˃d). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo rojo.
89
WT Δmwg-1 Δgas-5 Δmwg-1/Δgas-50
1E7
2E7
3E7
4E7
5E7
6E7
7E7
8E7
9E7
Conid
iació
n (
conid
ios/m
l)
SCR ± Std. Error
CCR (10 µg/µl) ± Std. Error
(a)
(b)(b)
(b)(b)
(c)
(a)(a)
IV.4-Técnicas de biología molecular
a) Extracción de ADN genómico de Neurospora crassa
Después de haber obtenido el micelio de la cepa silvestre FGSC# 988 liofilizado y
triturado, se realizó una extracción de ADN genómico, para así proceder con la
amplificación de las secuencias génicas de interés en este estudio. Se realizó una
electroforesis para poder visualizar el material genómico y su pureza cualitativa
(Figura 48).
Figura 48. La banda en el gel de electroforesis corresponde al ADN genómico de los conidios
provenientes de la cepa silvestre. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (BioLabs®).
Figura 47. Conidiación (conidios/ml) de las cepas mutantes y su control la cepa silvestre, en
presencia y ausencia de congo rojo (10 µg/µl). Los distintos superíndices indican diferencia
significativa entre los tratamientos (p˂0.05 en donde a˃b˃c). CCR: con congo rojo, SCR: sin congo
rojo.
90
b) Amplificación de los fragmentos de los genes mwg-1, gas-5 y gfp
A partir del ADN genómico de la cepa silvestre de N. crassa se amplificaron los
fragmentos UTR/ORF 5´ (región no traducible UTR más el marco de lectura
abierto 5´) de 557 pb y 356 pb y los fragmentos ORF 3´ (marco de lectura abierto
3´) de 1,064 pb y 1,520 pb de los genes mwg-1 y gas-5, respectivamente. Para la
amplificación del gen gfp de 717 pb se usó como templado el ADN plasmídico
PMF272. Esto con la finalidad de obtener las construcciones genéticas UTR/ORF
5´::gfp::ORF 3´ de ambos genes, en donde el gen de la GFP se encuentra
después del fragmento que codifica para el péptido señal (Figura 49).
Por otra parte, para llevar a cabo el etiquetamiento de los genes mwg-1 y gas-5
con el gen gfp después del extremo 3´ río abajo de las secuencias génicas, se
amplificaron los genes completos de 1,159 pb y 1,552 pb, respectivamente
(Figura 50).
Figura 50. Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a los genes mwg1 y gas5. M:
Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 49. Las bandas en los geles de electroforesis corresponden a los fragmentos de los genes
mwg1 y gas5, y al gen gfp. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (BioLabs®)
(Fermentas®).
91
c) Construcciones genéticas de mwg-1 y gas-5
Para la obtención de los brazos (fusiones con el gen gfp), UTR/ORF 3´::gfp de
1,255 pb y gfp::ORF 5´ de 1,830 pb del gen mwg-1 y de los brazos UTR/ORF
3´::gfp de 1,071 pb y gfp::ORF 5´ de 2,235 pb del gen gas-5, se usaron como
templados los fragmentos anteriormente amplificados y purificados. Los productos
de PCR se observaron mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%
(Figura 51) y una vez identificadas las bandas se cortaron y purificaron.
Finalmente se hizo una PCR de fusión de los brazos anteriormente purificados,
para obtener las construcciones genéticas UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de mwg-1
(2,297 pb) y gas-5 (2,550 pb), que se identificaron mediante electroforesis en gel
de agarosa al 1% para su identificación (Figura 52) y se purificaron.
Figura 52. Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a las construcciones genéticas de los
genes mwg1 y gas5. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 51. Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a la fusión de los fragmentos de los
genes mwg1 y gas5 con el gen gfp. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl)
(Fermentas®).
92
d) Construcción, clonación y análisis de restricción de vectores recombinantes
“Plásmidos TOPO-mwg-1 y TOPO-gas-5”
Los genes mwg-1 de 1,159 pb y gas-5 de 1,552 pb se ligaron al vector TOPO y
los vectores resultantes fueron propagados en E. coli TOP10. Se obtuvieron 8
colonias blancas en el caso de las transformantes de TOPO-mwg-1 y 8 colonias
blancas en el caso de las transformantes de TOPO-gas-5. Esto indica una
interrupción, por los genes de interés (mwg-1 y gas-5), del marco de lectura del
gen lacZ, con lo cual el operón se volvió incapaz de sintetizar la enzima β-
galactosidasa funcional. Esta enzima hidroliza el compuesto X-Gal a galactosa y
5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol, el cual es oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-
índigo, que emite un color azul. Además, el plásmido contiene un gen que aporta
resistencia a ampicilina, lo que hizo que solo se desarrollaran aquellas colonias
que tenían los plásmidos, resultando positivas para la presencia de los genes de
interés. Posteriormente, las colonias blancas positivas fueron tratadas para la
extracción y purificación de los plásmidos. Finalmente, se realizó un análisis de
restricción para asegurar la presencia de los insertos de interés (Figura 53). Se
seleccionaron los plásmidos 2 y 7 de la construcción TOPO-mwg1, y los
plásmidos 3 y 8 de la construcción TOPO-gas5.
Figura 53. Los patrones de restricción en el gel de electroforesis corresponden a las plásmidos
TOPO-mwg1 y TOPO-gas5. Las figuras rojas indican los plásmidos seleccionados para la
construcción de los plásmidos pALC01 y pALC02, respectivamente. Controles: 1, plásmido
PMF272, 2, plásmido PMF272 digerido con EcoRI, 3, plásmido PMF272 extraído y digerido con
EcoRI, 4, plásmido 2-6. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
93
“Plásmidos pALC01 y pALC02”
Para la construcción de los vectores pALC01 y pALC02 se realizó una reacción de
digestión de los plásmidos TOPO-mwg-1.1-2 y TOPO-mwg-1.1-7 y TOPO-gas-
5.2-3 y TOPO-gas-5.2-8 para liberar los genes mwg-1 y gas-5 respectivamente, y
del plásmido PMF272 para linearizarlo. Luego se corrió una electroforesis de los
productos de las reacciones; y se cortaron y purificaron las bandas restantes
pertenecientes a los genes y al plásmido PMF272 (Figura 54). Finalmente se
realizó la reacción de ligación para obtener los plásmidos recombinantes (Figura
55), en donde la etiqueta gfp se encuentra en el extremo 3´ río abajo de los genes
mwg-1 y gas-5.
Figura 54. Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las plásmidos TOPO-
mwg1 (1-2 y 1-7), los cuales liberaron el fragmento de 1,159 pb que corresponden al gen mwg1 y
TOPO-gas5 (2-3 y 2-8), los cuales liberaron el fragmento de 1,552 pb que corresponden al gen gas5.
M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
94
Posteriormente, los plásmidos fueron clonados en E. coli TOP10, y se
seleccionaron 10 colonias positivas por transformación. Se realizó PCR de colonia
con la finalidad de comprobar la presencia de los plásmidos, en el caso de las
cepas transformadas con pALC01.1-2 se obtuvieron 6 colonias positivas; en el
caso de las transformadas con pALC01.1-7 se obtuvieron 7 positivas y finalmente
en el caso de las transformadas con pALC02.2-8 se obtuvieron 9 positivas (Figura
56).
Figura 55. La imagen A esquematiza el plásmido pALC01, el gen mwg1 se encuentra en color rojo.
La imagen B esquematiza el plásmido pALC02, donde el gen gas5 se encuentra en color morado. La
etiqueta con el gen gfp se encuentra en color verde y en el extremo 3´ en ambos genes.
95
Por otra parte, se realizaron extracciones de ADN plasmídico de aquellas clonas
positivas para la realización de los respectivos análisis de restricción, con la
finalidad de confirmar la presencia de los genes de interés, así como la correcta
construcción de los vectores. Los plásmidos pALC02.2-8.1, pALC02.2-8.3,
pALC02.2-8.4 y pALC02.2-8.6 mostraron el correcto patrón de restricción, el cual
consiste en dos fragmentos de 7,853 pb y 2,152 pb (Figura 57). Por otra parte,
sólo los plásmidos, pALC01.1-7.2, pALC01.1-7.3 y pALC01.1-7.4 mostraron el
correcto patrón de restricción, el cual consiste en tres fragmentos de 2,154 pb,
6,050 pb y 1,407pb (Figura 57).
Figura 56. Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 1kb corresponden a la
amplificación del gen mwg1 y las de 1.5 kb a la amplificación del gen gas5. Las figuras rojas indican
los plásmidos seleccionados para el análisis de restricción. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb
ADN (3µl) (Fermentas®).
96
“Plásmido pALC03 y pALC04”
Para la construcción de los vectores pALC03 y pALC04 (Figura 58) se realizaron
reacciones de digestión de los constructos genéticos UTR/ORF 5´::gfp::ORF 3´ de
mwg-1 y gas-5, con la finalidad de digerir los sitios de restricción y hacerlos
cohesivos, así como se realizó la digestión del plásmido PMF272 para la
liberación del gen gfp y para la obtención de los sitios de restricción cohesivos
(Figura 59).
Figura 57. Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las plásmidos pALC01
y pALC02 extraídos de las colonias positivas seleccionadas por PCR. Las figuras rojas indican los
plásmidos seleccionados para la transformación de N. crassa. M: Marcador molecular Lambda (ʎ)
1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
97
Posteriormente, se realizaron reacciones de ligación y se clonaron los vectores en
cepas E. coli TOP10. Se seleccionaron 10 colonias positivas para cada
Figura 59. Las bandas en el gel de electroforesis corresponden a las construcciones genéticas de
mwg1 (2.2 Kb) y gas5 (2.5 Kb) digeridas con EcoRI y XbaI. La C indica el control PMF272 sin
digestión y la P indica el plásmido PMF272 digerido con EcoRI y XbaI. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 58. La imagen A esquematiza el plásmido pALC03, el gen mwg1 se encuentra en color azul.
La imagen B esquematiza el plásmido pALC04, donde el gen gas5 se encuentra en color rosa. La
etiqueta con el gen gfp se encuentra en ambos genes de color verde y después de la secuencia que
codifica el péptido señal.
98
transformación con pALC03 y pALC04 para la realización de PCR de colonia para
la comprobación de la presencia de los constructos genéticos de interés. En el
caso de las transformantes con pALC03 se obtuvo solo una colonia positiva, por
otra parte, en el caso de las transformantes con pALC04 se obtuvieron 9 colonias
positivas (Figura 60).
De este modo, se seleccionaron las clonas positivas y se realizó la extracción del
ADN plasmídico. Finalmente, se realizaron los análisis de restricción de los
plásmidos para comprobar la presencia de los constructos genéticos, así como la
correcta construcción de los vectores. Todos los plásmidos obtenidos presentaron
el patrón de restricción deseado, en donde el plásmido pALC03.4 liberó un
fragmento de 2,297 pb perteneciente al constructo genético PSgfp::mwg-1 y los
plásmidos pALC04.1, pALC04.2, pALC04.4, pALC04.5, pALC04.7 y pALC04.8
liberaron el fragmento de 2,552 pb perteneciente al constructo genético
PSgfp::gas-5 (Figura 61).
Figura 60. La banda en el gel de electroforesis de aproximadamente 1kb corresponde a la
amplificación del gen mwg1 y las bandas de 1.5 kb a la amplificación del gen gas5. Las figuras rojas
indican los plásmidos seleccionados para el análisis de restricción. M: Marcador molecular Lambda
(ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
99
e) Secuenciación
Los plásmidos pALC03.4 y pALC04.2 se enviaron a SeqXcel® (DNA Sequencing
Services, San Diego, California) para confirmar la fusión de los constructos
genéticos PSgfp::mwg-1 y PSgfp::gas-5 al plásmido PMF272, así como para
confirmar la secuencia en fase de los genes y la correcta secuencia de los sitios
de restricción. Una vez obtenidas las secuencias se analizaron con el uso del
programa ApE (A plasmid Editor by M. WayneDavis, v2.0.37). La secuencia
obtenida del plásmido pALC03.4 con el uso del oligonucleótido PMF272 fwd
pertenece al extremo UTR/ORF-5´::gfp del constructo genético de mwg-1. Se
observó que hubo cuatro mutaciones puntuales por eliminación de nucleótidos,
una se presentó antes de que comenzara el marco de lectura abierto del gen
mwg-1 y las otras tres se presentaron en la secuencia del gen gfp; sin embargo,
se observaron en la parte final de la secuencia obtenida, donde la señal en el
cromatograma no era muy buena ya que no estaban bien separados los picos de
los nucleótidos (Figura 62) y por lo tanto lo más seguro es que no sean
mutaciones reales.
Figura 61. Los patrones de restricción en el gel de electroforesis pertenecen a las plásmidos
extraídos de las colonias positivas para la presencia de pALC03 y pALC04 El plásmido pALC03.4
liberó la construcción genética PSgfp::mwg-1 de 2.2 kb. Los plásmidos pALC04 liberaron la
construcción genética PSgfp::gas-5 de 2.5 kb. El control P indica el plásmido PMF272. Las figuras
rojas indican los plásmidos seleccionados para la transformación de N. crassa. M: Marcador
molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
100
Figura 62. Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia in silico del
plásmido pALC03.4 y la secuencia UTR/ORF-5´::gfp del constructo genético de mwg-1. El recuadro
azul indica el sitio de restricción de XbaI. Los recuadros verdes indican los codones de inicio. El
primero pertence al gen mwg-1 y el segundo el gen gfp.
101
Por otra parte, la secuencia obtenida del plásmido pALC04.2 con el uso del
oligonucleótido PMF272 fwd pertenece al extremo UTR/ORF-5´::gfp del
constructo genético de gas-5, se presentaron nueve mutaciones puntuales por
eliminación en la secuencia que pertenece al gen gfp (Figura 63), pero al igual
que en el caso anterior corresponden a zonas de la final de la secuencia obtenida
en donde no se obtiene muy buena señal.
102
Finalmente, en la secuencia obtenida del plásmido pALC04.2 con el uso del
oligonucleótido GFP stop fwd que pertenece al extremo ORF-3´ del constructo
genético de gas-5, se pudo observar que existen algunos cambios de nucleótidos
que resultan en sustituciones de aminoácidos. En el nucleótido 35 se identificó
una mutación de Guanina (G) por Adenina (A), lo que produjo un cambio en el
codón y por lo tanto un cambio del aminoácido glicina (aminoácido hidrófobo o
apolar) por ácido glutámico (aminoácido ácido, es decir, con carga negativa). En
el nucleótido 180 se identificó una mutación de Timina (T) por Citosina (C), lo que
también produjo un cambio del aminoácido serina (hidrófilo o polar) por prolina
(hidrófobo o apolar). Finalmente en el nucleótido 478 se identificó una mutación
en donde se cambió una Timina (T) por Citosina (C), lo que produjo un cambio
conservado del aminoácido leucina (hidrófobo) por prolina (hidrófobo) (Figura 64).
Figura 63. Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia in silico del
plásmido pALC04.2 y la secuencia UTR/ORF-5´::gfp del constructo genético de gas-5. El recuadro
azul indica el sitio de restricción de XbaI. Los recuadros verdes indican los codones de inicio. El
primero pertence al gen gas-5 y el segundo el gen gfp.
103
Figura 64. Representación esquemática del alineamiento realizado con la secuencia in silico del
plásmido pALC04.2 y la secuencia ORF 3´ del constructo genético de gas-5. El recuadro verde
indica la secuencia del gen gfp. La flecha roja indica el inicio de la secuencia del gen gas-5. Los
recuadros rojos al igual que el símbolo # indican los lugares de mutación de la secuencia.
104
IV.5-Obtención de cepas de Neurospora crassa etiquetadas con GFP
a) Linearización de plásmidos y transformación de N. crassa
Para obtención de cepas de N. crassa con las proteínas de interés etiquetadas
primero se llevó a cabo la linearización de los plásmidos pALC01.2-8.3,
pALC02.1-7.2, pALC03.4 y pALC04.2 (Figura 65) y luego se realizó la
transformación de conidios de N. crassa.
Se obtuvieron 24 colonias transformadas con el plásmido pALC01.2-8.3, 30
colonias transformadas con el plásmido pALC02.1-7.2, 49 colonias transformadas
con el plásmido pALC03.4 y 46 colonias transformadas con el plásmido
pALC04.2. Las colonias obtenidas fueron de tamaño reducido y de color blanco,
cada una de estas se resembró en tubos de borosilicato con MMV y se incubaron
hasta su crecimiento. Finalmente, los conidios de cada cepa se observaron bajo el
microscopio invertido zeiss con el uso de la lámpara de UV, el filtro ph3 y con el
filtro óptico para fluorescencia FITC, también se sembraron en cajas petri con
MMV para la observación de hifas maduras bajo el microscopio confocal invertido
de escaneo con láser LSM-510 META (Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) con el
uso del láser de Argón/1 Abs/Em 488/505-530 nm, esto con la finalidad de hacer
Figura 65. Las bandas 01.1-7.2L, 02.2-8.3L, 03.4L y 04.2L en el gel de electroforesis corresponden a
los plásmidos linerizados. La P indica el plásmido control PMF272. M: Marcador molecular
Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
105
una selección de aquellas que presentaban fluorescencia, sin embargo, ninguna
cepa emitió fluorescencia.
b) Comprobación de la integración de los plásmidos en el genoma de N. crassa
Para comprobar la integración de mwg-1::gfp, gas-5::gfp, PSgfp::mwg-1 y
PSgfp::gas-5 dentro del genoma de N. crassa se seleccionaron 5 cepas de cada
transformación, las cepas se seleccionaron en base a su abundante producción
de conidios. Posteriormente, se realizó la extracción de ADN genómico de cada
cepa, siguiendo las especificaciones del método Fenol-Cloroformo y finalmente se
realizaron reacciones de PCR con el uso de los oligonucleótidos MRp10, MRp11,
MRp12 y MRp13.
En el caso de la transformación con el plásmido pALC01.1-7.2, las cepas
seleccionadas fueron TpALC01.1-7.2.10, TpALC01.1-7.2.16, TpALC01.1-7.2.18,
TpALC01.1-7.2.19, TpALC01.1-7.2.21, y en el caso de la transformación con el
plásmido pALC02.2-8.3, las cepas seleccionadas fueron TpALC02.2-8.3.20,
TpALC02.2-8.3.24, TpALC02.2-8.3.28, TpALC02.2-8.3.35, TpALC02.2-8.3.51. Los
resultados (Figura 66) muestran fragmentos de 2,100 pb amplificados con los
oligonucleótidos MRp12 y MRp13 que corresponden a las regiones flanqueantes
río arriba de los vectores de clonación (His-3/ccg-1).
Figura 66. Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 2.1kb corresponden a la
amplificación de la región His-3
/ccg-1 de las transformantes TpALC01.1-7.2 y TpALC02.2-8.3. C+
indica el control positivo. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
106
En el caso de la transformación con el plásmido pALC03.4, se seleccionaron las
cepas TpALC03.4.11, TpALC03.4.26, TpALC03.4.28, TpALC03.4.30 y
TpALC03.4.32, y en el caso de la transformación con el plásmido pALC04.2, se
seleccionaron las cepas TpALC04.2.3, TpALC04.2.6, TpALC04.2.7,
TpALC04.2.10 y TpALC04.2.12. Los resultados (Figura 67) muestran los
fragmentos de 4,200 pb amplificados con los oligonucleótidos MRp10 y MRp11
que corresponden a las regiones flanqueantes río abajo de los vectores de
clonación (gfp::mwg-1/His-3 y gfp::gas-5/His-3).
Por otra parte, se observaron (Figura 68) los fragmentos de 2,100 pb amplificados
con los oligonucleótidos MRp12 y MRp13 que corresponden a las regiones
flanqueantes río arriba de los vectores de clonación (His-3/ccg-1).
Figura 68. Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 2.1kb corresponden a la
amplificación de la región His-3
/ccg-1 de las transformantes TpALC03.4 y TpALC04.2. C+ indica el
control positivo. M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
Figura 67. Las bandas en el gel de electroforesis de aproximadamente 4.2kb corresponden a las
amplificaciones de las regiones gfp::mwg-1/His-3
y gfp::gas-5/His-3
de las transformantes TpALC03.4
y TpALC04.2, respectivamente. C+ indica el control positivo. Las flechas rojas señalan las bandas.
M: Marcador molecular Lambda (ʎ) 1Kb ADN (3µl) (Fermentas®).
107
Capítulo V
Discusión
La pared celular de los hongos es una estructura dinámica que funciona en un
importante número de procesos. Existen pocos estudios enfocados a esclarecer el
papel que desempeñan los diversos componentes encargados de la formación de
la pared celular de los hongos filamentosos. Es por eso que este trabajo se
enfoca en determinar el papel de proteínas con dominio glucosilhidrolasa
encargadas de formar enlaces entre los polímeros que conforman la pared celular
permitiendo la rigidización de la misma.
Hasta el momento se conoce que todos los miembros de las familias Gas y Crh
tienen secuencias bien conservadas entre especies de Saccharomyces, Candida
y Aspergillus, además de poseer una actividad enzimática conservada. Existen
ciertas características estructurales que son comunes entre estas proteínas, tales
como: (1) una región en el extremo amino terminal que codifica para el péptido
señal de secreción, (2) un dominio que tiene una región rica en Ser-Thr y un sitio
de unión a GPI en el extremo carboxilo terminal, necesarios para el anclaje de la
proteína a la membrana plasmática y finalmente, presentan (3) un dominio
catalítico responsable de su actividad enzimática específica en la biogénesis de la
pared celular (Arroyo et al., 2007; Caro et al., 1997).
Las proteínas Crh1 (de 507 aminoácidos) y Crh2 (de 467 aminoácidos) de S.
cerevisiae tienen un motivo DE(I/L)DXE que es homólogo al grupo catalítico de
las endo-β-1,3-1,4-glucanasas de procariotas y al de las xiloglucano
endotransglucosidasas de plantas. En bacterias se ha reportado que el primer
108
glutamato en este grupo actúa como nucleófilo catalítico y el segundo podría ser
un residuo general ácido-base involucrado en el mecanismo catalítico de
desplazamiento (Rodríguez-Peña et al., 2000). Este motivo catalítico forma parte
de un dominio que pertenece a la familia 16 de glucosilhidrolasas (GH) de
acuerdo a la base de datos CAZy (Carbohydrate-Active Enzyme por sus siglas en
ingles) (Cabib et al., 2008; Rodríguez-Peña et al., 2000). En el extremo carboxilo
terminal presentan sitios de unión a dominio GPI; Crh1 comprende los
aminoácidos 422(Asn) y 423(Gly) y Crh2 los aminoácidos 385(Asp) y 386(Ala), de
acuerdo al servidor de predicción de sitios de unión a GPI (The GPI Fungal
Prediction server), además de áreas ricas en Ser-Thr (Cabib et al., 2008;
Rodríguez-Peña et al., 2000).
En este trabajo se identificó que el gen mwg-1 es homólogo a los genes CRH1 y
CRH2 de S. cerevisiae. La secuencia aminoacídica predicha de MWG-1 de N.
crassa presentó (1) una secuencia que codifica un péptido señal,(2) sitios de
unión a dominio GPI y (3) un dominio GH de la familia 16. Lo que indica que
cumple con las características estructurales de las proteínas que pertenecen a la
familia Crh (Arroyo et al., 2007; Caro et al., 1997). Finalmente, no se observó una
región rica en Ser-Thr; sin embargo, aunque esta región es encontrada a menudo
en proteínas con sitio de union a GPI, su presencia no es un requisito absoluto
para que las proteínas puedan ser ancladas a la membrana plasmática (Caro et
al., 1997).
En el extremo amino terminal se encuentra un dominio hidrofóbico que
comprende un péptido señal (De Groot et al., 2003), y su sitio de corte se ubica
entre los aminoácidos 17(Ala) y 18(Gln). Por otra parte, en el extremo carboxilo
terminal también se encuentra un dominio hidrofóbico (De Groot et al., 2003) que
posee sitios de unión a GPI y que conforman los aminoácidos 341(Gly) y
342(Gly). Al igual que ScCrh1p/ScCrh2p, la proteína MWG-1 conserva la
presencia de aminoácidos hidrófobos potenciales para el sitio de unión a GPI.
Finalmente, el dominio GH de MWG-1 también pertenece a la familia 16 y dentro
109
de esta región se encuentra el motivo DE(I)D(W)E (117-122) que es homólogo al
presente en ScCrh1p y ScCrh2p, los aminoácidos 118(Glu), 120(Asp) y 122(Glu)
conforman el sitio activo, lo cual concuerda con lo establecido anteriormente
(Cabib et al., 2008; Rodríguez-Peña et al., 2000). Las observaciones que se
presentaron en los análisis bioinformáticos indican que existe la posibilidad de que
la proteína MWG-1 en N. crassa esté involucrada en procesos similares a los de
Crh1p y Crh2p en S. cerevisiae.
La proteína Gas1p de S. cerevisiae (de 559 aminoácidos) contiene una secuencia
péptido señal en el extremo amino terminal (aminoácidos 1 al 22). Presenta un
dominio que pertenece a la familia GH 72 de acuerdo a la base de datos CAZy, y
posee dos motivos (A/S)GNE(V/I) y SE(Y/F)GC en donde los aminoácidos
catalíticos son 161(Glu) y 262(Glu). De igual manera se ha propuesto que estos
residuos tienen la función de actuar como un nucleófilo catalítico y el segundo
como un residuo ácido-base. En el extremo carboxilo terminal presenta una región
rica en serina (de 485 al 525) seguida de un sitio de unión a GPI en el aminoácido
528(Asn). Finalmente, posee un domino altamente hidrofóbico en el extremo
carboxilo terminal, que abarca los aminoácidos 528 al 559 (Carotti et al., 2004;
Popolo et al., 1993; Ragni et al., 2007; Vai et al., 1991).
En este trabajo se identificó que el gen gas-5 es homólogo al gen GAS-1 de S.
cerevisiae. Al igual que MWG-1, la secuencia aminoacídica predicha de GAS-5
presentó (1) una secuencia que codifica un péptido señal, (2) sitios de unión a
GPI y (3) un dominio GH de la familia 72. La secuencia que codifica un péptido
señal se localiza en el extremo amino terminal y es altamente hidrofóbica (De
Groot et al., 2003; Popolo et al., 1993; Ragni et al., 2007), y su sitio de corte se
encuentra entre los aminoácidos 19(Ala) y 20(Thr). En el extremo carboxilo
terminal presenta una secuencia hidrofóbica que posee sitios de unión a dominio
GPI que conforman los aminoácidos 426(Ser) y 427(Gly). En S. cerevisiae se ha
mostrado que los sitios de unión a GPI más comunes son los aminoácidos Asn,
un aminoácido hidrófilo y Gly, un aminoácido hidrófobo (Caro et al., 1997; De
110
Groot et al., 2003). En GAS-5 uno de los sitios potenciales de unión a GPI fue la
serina, sin embargo, tiene propiedades hidrofílicas al igual que la asparagina, por
lo tanto se puede concluir que en este caso ambos aminoácidos presentan la
misma función. Por otra parte, presenta un dominio GH de la familia 72
(aminoácidos 80 al 313), que tiene dos motivos SGNEV (163-167) y SEYGC (266-
270) en donde los aminoácidos que conforman el sitio activo son 166(Glu) y
267(Glu) (Popolo et al., 1993; Ragni et al., 2007). Las comparaciones entre
ScGas1p y GAS-5 indican que existe la posibilidad de que esté de igual manera
involucrada en procesos de entrecruzamiento de polímeros de glucanos de la
pared celular.
Por otra parte, en este trabajo se realizaron ensayos con cepas mutantes de los
genes mwg-1 y gas-5 de N. crassa. En MMV sólido las cepas mutantes no
presentaron diferencia significativa en la velocidad de crecimiento con respecto a
la cepa silvestre. Las cepas mutantes Δmwg-1 y Δgas-5 presentaron diferencia
significativa con respecto a la cepa silvestre en producción de biomasa y de hifas
aéreas. Las cepas mutantes presentaron menor formación de ramificaciones con
respecto a la cepa silvestre y en producción de conidios las cepas mutantes
presentaron mayor cantidad que la cepa silvestre. Sin embargo, como se indica
por diversos autores (Bailey et al., 1996; Bernard et al., 2002; Damveld et al.,
2005b; Romano et al., 2006), en la mayoría de los casos los resultados de una
mutación producen un fenotipo no discernible del producido por la cepa silvestre o
en cambios sutiles, como la velocidad de germinación alterada, una reducción en
la adhesión o cambios en la susceptibilidad a agentes estresores de la pared
celular. Esto puede deberse a varios motivos como: (a) redundancia génica, es
decir que existan familias de genes que tengan la misma función, (b) a una
interacción limitada del producto génico con los determinantes específicos
externos y (c) que se exprese bajo condiciones estrictamente definidas (Osherov
y Yarden, 2010).
111
Por otra parte, mediante ensayos de susceptibilidad a agentes estresores, se ha
observado que en S. cerevisiae el incremento en la susceptibilidad al CR es
indicativo de los defectos en la pared celular (Ram y Klis, 2006). También se ha
observado en otras levaduras como Candida albicans (Popolo y Vai, 1998) y
Yarrowia lipolytica (Ruíz-Herrera et al., 2003), en hongos filamentosos como A.
niger (Damveld et al., 2005a,c), A. nidulans (Shaw y Momany, 2002), A. awamori
(Oka et al., 2005), y en el hongo basidiomiceto Cryptococcus neoformans (Gerik
et al., 2005; Ram y Klis, 2006).
De esta manera, las pruebas de susceptibilidad a agentes estresantes son
comúnmente utilizadas para identificar cepas mutantes de pared celular (Ram y
Klis, 2006). Uno de los agentes más utilizados para realizar dichas pruebas es el
CR. Este componente contiene dos grupos ácido-sulfónico y lleva a cabo su
actividad antifúngica cuando está solubilizado, esto es bajo condiciones
ligeramente ácidas, básicas o neutrales, es decir, cuando sus grupos ácido-
sulfónico están cargados negativamente (Ram y Klis, 2006). Por esta razón, en
los ensayos basados en la sensibilidad a CR el pH no debe estar por debajo de
5.5 y es importante destacar que debido a sus cargas negativas no puede pasar a
través de la membrana plasmática (Ram y Klis, 2006). Se cree que se une a las
cadenas nacientes de quitina, lo que inhibe la formación de microfibrillas de
quitina (Bartnicki-García et al., 1994; Herth, 1980) y el entrecruzamiento de quitina
a β-(1,3)-glucano y β-(1,6)-glucano realizado por enzimas. Por lo tanto, la pared
celular se hace débil (Ram y Klis, 2006) y en cepas mutantes de componentes de
la pared celular la susceptibilidad a este agente se ve incrementada.
Para determinar la susceptibilidad de la cepa al agente estresor, se deben de
realizar ensayos en donde se manipule el tamaño del inóculo y la concentración
del agente, la cual varía entre diferentes hongos y también depende del fondo
genético dentro de las mismas especies. La concentración seleccionada debe ser
subletal para la cepa silvestre. La concentración de CR usada es de 100 µg/ml
para S. cerevisiae (De Groot et al., 2001; García et al., 2004; Lussier et al., 1997),
112
1 µg/µl para A. niger (Damveld et al., 2005b) y 5 µg/µl para C. neoformans (Gerik
et al., 2005; Ram y Klis, 2006). En este trabajo se determinó la concentración
subinhibitoria de N. crassa la cual fue de 10 µg/µl, que se utilizó en los ensayos
de susceptibilidad a CR, y que tuvo efectos sobre el crecimiento y desarrollo de
las cepas mutantes de N. crassa. La velocidad de crecimiento de las cepas
mutantes Δmwg-1 y Δgas-5 disminuyó en comparación con la cepa silvestre; sin
embargo, la cepa doble mutante Δmwg-1/Δgas-5 no presentó diferencia bajo la
presencia de CR. El fenotipo de todas las cepas mutantes se afectó por la
presencia de CR ya que produjeron menor biomasa, menor cantidad de hifas
aéreas y menor producción de conidios que la cepa silvestre, esto posiblemente
se deba a que las proteínas MWG-1 y GAS-5 tienen un papel importante en el
entrecruzamiento de polisacáridos de la pared celular, con lo cual las cepas
mutantes de estas proteínas no producen una pared celular capaz de llevar a
cabo eficientemente todos los procesos biológicos del hongo.
Se conoce que el debilitamiento de la pared celular ocasionado por CR activa la
respuesta de estrés de la pared celular. Esta respuesta incluye la activación de
diversos genes que codifican proteínas involucradas en el refuerzo de la pared
celular (Boorsma et al., 2004; García et al., 2004; Lagorce et al., 2003; Ram y Klis,
2006). En el ascomiceto P. brasiliensis se conoce que bajo diversas condiciones
de estrés de la pared celular se incrementa la síntesis de los componentes de la
pared celular, como β-1,3-D-glucano y quitina (Tomazett et al., 2011). Por otra
parte, en estudios realizados in vitro, se ha observado que el CR inhibe a las
enzimas β-glucano sintasas (Nodet et al., 1990; Roncero y Durán, 1985) y quitina
sintetasas (Bartnicki-García et al., 1994; Roncero y Durán, 1985). Sin embargo, se
ha reportado que el CR no inhibe a la enzima quitina sintetasa en N. crassa
(Selitrennikoff, 1985).
Ya que el CR se une a quitina, este agente estresor contrarresta directamente la
respuesta de estrés de pared celular (Ram y Klis, 2006). Por lo tanto, a pesar de
113
la excesiva producción de polisacáridos, la presencia de CR no permite que se
forme una estructura rígida capaz de contener la presión interna de turgencia
(Nodet et al., 1990). Se cree que, por consecuencia, evita los entrecruzamientos
entre polisacáridos, fenómeno que ocurre en puntas de hifas normales y
proporciona rigidez a la pared celular (Wessels, 1986), lo que incrementa el
debilitamiento de las estructuras de la pared celular y a pesar de su espesor ésta
puede ser deformada (Nodet et al., 1990). Dicho debilitamiento de la pared celular
se observó en las cepas analizadas en este trabajo mediante microscopía, donde
se contempló el comportamiento de las cepas mutantes y el control (la cepa
silvestre) en presencia de CR. Las hifas presentaban aberraciónes morfológicas,
es decir, se hinchaban o se adelgazaban de la parte apical, subapical o distal y
posteriormente se lisaban, en algunos casos por la parte distal (wt y mwg-1) y en
otros casos por la parte apical y subapical (cepas mutantes gas-5, mwg-1/gas-5,
mwg-1) (Figuras 39 a 42 y Tablas VI a IX). Así como se ha observado en los
hongos filamentosos A. niger y Geotrichum lactis en donde las hifas se lisan por el
ápice como resultado del efecto de debilitamiento de la pared celular y debido a la
presión interna de turgencia (Damveld et al., 2005a,c; Pancaldi et al., 1984; Ram y
Klis, 2006; Roncero y Durán, 1985). Por otra parte, se observó que en las cepas
mutantes el tiempo de resistencia a la presencia de este colorante fue menor al de
la cepa silvestre (hubo diferencia significativa), debido probablemente a una
reducción de la fuerza de resistencia de la pared celular, lo cual indica que las
proteínas MWG-1 y GAS-5 posiblemente tienen un papel importante en el
entrecruzamiento de polisacáridos.
Para realizar estudios de localización y dinámica de proteínas, es muy utilizada la
técnica de etiquetamiento con la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa
Aequorea victoria. El etiquetamiento de proteínas con la proteína GFP tiene
ciertas ventajas como permitir el análisis de proteínas en células vivas, presenta
un fondo con bajo ruido, alta resolución, colocalización robusta de dos colores, y
evita la fijación de artefactos (Michaelson y Philips, 2006). En este trabajo se
114
etiquetaron las proteínas MWG-1 y GAS-5 de N. crassa con la proteína GFP y las
pruebas mediante PCR y análisis de restricción indicaron que el procedimiento y
las secuencias eran las correctas. Sin embargo, los resultados de la
secuenciación mostraron algunos cambios y eliminaciones de nucleótidos. El
extremo ORF-3´ del CG de gas-5 en pALC04.2 fue el único que presentó diversas
mutaciones puntuales por sustitución de tipo transición y transversión, lo que
produjo cambios de aminoácidos que presentaron diferentes propiedades
químicas a las esperadas (Luque y Herráez, 2006). El primer cambio de
aminoácido se presentó en el extremo amino terminal, en el dominio hidrofóbico
del péptido señal antes del sitio de corte, se cambió un aminoácido hidrófobo por
uno con carga negativa. El segundo cambio de aminoácido se presentó en el
dominio GH 72, uno hidrófilo por un hidrófobo; sin embargo, el aminoácido no
formaba parte de los motivos catalíticos. Finalmente el tercer cambio de
aminoácido se presentó en el carboxilo terminal en el dominio hidrofóbico; sin
embargo, las características químicas no cambiaron además de que no interfería
con el sitio de unión a GPI. Por lo tanto, existe la posibilidad de que los resultados
negativos en microscopía se deban a que el cambio de los aminoácidos y sus
propiedades químicas afectara la funcionalidad y plegamiento de la proteína y por
lo tanto, su correcta localización.
Por otra parte, a pesar de que el extremo ORF-5´ del CG de mwg-1 no presentó
mutaciones que afectaran el marco abierto de lectura del gen, no se observó
fluoresencia. Diversos autores han mencionado que existen ciertas desventajas al
estudiar proteínas etiquetadas con GFP cuando son sobre expresadas en relación
a las proteínas endógenas. Además han mencionado que la etiqueta de GFP,
puede, en principio afectar la función de la proteína (Michaelson y Philips, 2006).
Rolli et al. (2009) realizó trabajos de etiquetamiento de la proteínas Gas1p de S.
cerevisiae con mRFP y realizó la transfromación en la cepa parental. La señal se
detectó en estructuras perinucleares, además del patrón que presentó mRFP-
Gas1p en la cepa mutante Δgas1, lo que sugirió una retención parcial en el
115
retículo endoplásmico, probablemente debido a una competencia en el
plegamiento entre la proteína etiquetada (mRFP-Gas1p) y la endógena (Gas1p)
(Rolli et al., 2009). Finalmente, tomando en consideración que diversos autores
han mencionado que uno de los puntos mas importantes con respecto a las
proteínas fluorescentes como marcadores, es que la estructura conformacional de
la proteína es esencial en el desarrollo y mantenimiento de la señal de
fluorescencia (Kremers et al., 2011), se puede pensar que otra posible causa de
los resultados negativos es que las proteínas de interés (MWG-1 y GAS-5) de
este trabajo y la proteína GFP fueron incompatibles, es decir, que debido a un
impedimento estérico no se realizó el correcto plegamiento ya sea el de la
proteína de interés o de la etiqueta (GFP) o de ambas.
116
Capítulo VI
Conclusiones
Las proteínas MWG-1 y GAS-5 de Neurospora crassa son homólogas a
Crh1p/Crh2p y Gas1p de Saccharomyces cerevisiae.
Las proteínas MWG-1 y GAS-5 de N. crassa tienen el motivo característico de las
proteínas glucosilhidrolasa para llevar a cabo la actividad glucanosiltransferasa.
Las cepas mutantes Δmwg-1, Δgas-5 y Δmwg-1/Δgas-5 son hipersensibles al CR.
Las proteínas GAS-5 y MWG-1 posiblemente tiene un papel importante en la
rigidización de la pared celular de N. crassa.
117
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