obtención de proteína a partir de cordyceps militaris y
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Obtención de proteína a partir de Cordyceps
militaris y uso de esta en la elaboración de un
producto alimenticio
P. Usme, A. González, T. Sanjuan
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá Colombia.
Objetivo General
Obtener proteína total de Cordyceps militaris e incorporarla en una matriz láctea.
Objetivos específicos
1. Establecer la proteína total de la biomasa de Cordyceps militaris cultivada en diferentes
condiciones.
2. Evaluar la proteína total de Cordyceps militaris en una matriz láctea.
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Obtención de proteína a partir de Cordyceps
militaris y uso de esta en la elaboración de un
producto alimenticio
P. Usme, A. González, T.Sanjuan
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá Colombia.
Resumen En el mercado existen alimentos con alto contenido proteico, tanto los productos comunes
como los preferidos por personas vegetarianas son desarrollados a base de fuentes proteicas
convencionales y muchas veces costosas. La carne de pollo, la harina de soya y de
pescado, por ejemplo, pueden ser reemplazadas por organismos capaces de producir
proteína celular. El valor nutritivo y la asequibilidad de los hongos en el laboratorio, hace
más llamativo el uso de estos sobre las bacterias y las algas. Cordyceps militaris es rico en
agentes nutracéuticos y sustancias biológicamente activas, por lo que tiene alto potencial
como fuente de proteína. Su biomasa se obtuvo a partir de cultivos en medio líquido, los
cuales posteriormente se separaron y cuantificaron, por el método de Bradford En la
muestra del reactor se tuvo una concentración de 53,61 mg/ml, mientras que la muestra
proveniente de cultivo sólido 40,60 mg/ml. Finalmente, se incorporó las proteínas
purificadas en una matriz láctea y se analizó el comportamiento de estas contrastando con
resultados de un producto sin proteína adicional y con otro estudio de una bebida con
proteína de soya.
Palabras clave: Cordyceps militaris, proteína, cuantificación, caracterización, matriz.
Abstract In the market there are high-protein foods, both common products as preferred by
vegetarians are developed based on conventional protein sources and often costly. Chicken
meat, soybean meal and fish, for example, can be replaced by organisms capable of
producing cellular protein. The nutritional value and affordability of fungi in the laboratory,
makes striking use of these on bacteria and algae. Cordyceps militaris is rich in
nutraceuticals agents and biologically active substances, which has high potential as a
protein source. Biomass was obtained from cultures in liquid medium, which subsequently
were separated and quantified by the Bradford method shown In the reactor a concentration
of 53.61 mg / ml was taken while the sample from solid culture 40.60 mg / ml. Finally, the
purified proteins in a milk matrix and the behavior of these contrasting with results of a
product without additional protein and another study of a drink with soy protein was
analyzed was incorporated.
Keywords: Cordyceps Militaris, protein quantification, characterization, matrix
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1. Introducción
En los últimos años se ha estudiado el potencial que tienen organismos como las
bacterias, levaduras, algas y hongos para la obtención de proteína y así obtener alimentos
con alto contenido proteico. Se prefiere el uso de hongos debido a que crecen en un rango
menor que las algas, tienen capacidad de degradar productos vegetales y son fáciles de
recuperar. Se sabe también que los hongos tienen bajo contenido de ácido nucleico y son
mejor fuente de proteína que las bacterias (Anupama & Ravindrab, 2000). Los hongos
filamentosos tienen buenas propiedades nutricionales, poseen un nivel de proteínas alto,
bajo nivel de grasa, pero alto contenido de calcio, magnesio, zinc y hierro. La proteína
fúngica es extraída de la biomasa cultivada en condiciones fermentativas apropiadas y
controladas que garanticen una adecuada tasa de crecimiento y eviten la producción de
toxinas (Kyanko et al., 2010).
En la medicina tradicional china se utiliza especialmente Cordyceps sp (Dong et al., 2012).
Este es un género de hongos pertenecientes al phylo Ascomycota, parásitos que crece dentro
de hospedero provocando cambios en su comportamiento y finalmente la muerte. Puede
parasitar diferentes órdenes de artrópodos como mariposas, escarabajos, hormigas,
arácnidos y también a otros hongos (Russel & Paterson, 2008). La infección empieza
cuando las esporas del hongo, existentes en el suelo, se adhieren a las larvas o pupas.
Posteriormente ocurre la germinación de éstas y se da inicio a la penetración de la cutícula
o recubrimiento del insecto. Enseguida, se produce micelio y se forma una estructura de
resistencia conocida como esclerocio. Pasados de seis a 20 días, se hacen notorias
estructuras cilíndricas prolongadas que salen del insecto y que en el extremo desarrollan
esporas para continuar con el ciclo de infección (Sanjuan et al., 2001). Finalmente, tanto la
larva como el cuerpo fructífero son recolectados para elaborar productos alimenticios y/o
con fines curativos.
La especie Cordyceps militaris ha sido utilizada por su actividad farmacológica
anticancerígena, antiinflamatoria, inmuno-potencializadora y reguladora (Yuea et al.,
2013). Además, se le ha reconocido la capacidad de producir componentes con actividad
biológica como adenosina, cordicepina y exopolisacáridos, ergosterol, manitol, enzimas –se
conoce de una fibrinolítica (Kim et al., 2006)- y péptidos -como cordymin con actividad
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antifúngica- (Shih et al., 2007). Se ha reportado que los cuerpos fructíferos tienen 29,1% de
carbohidratos, aproximadamente el 59,8% de proteínas y alrededor de 8,8% de materia
grasa del peso seco, mientras que la biomasa del micelio tiene aproximadamente 39,6%
carbohidratos, 39,5% de proteínas y alrededor de 2,2% de materia grasa del peso seco
(Wasser & Chan, 2012).
La proteína total de C. militaris es rica en aminoácidos esenciales como metioninas y
lisina. Comúnmente se obtiene a partir de extractos con agua o alcoholes, se han detectado
proteínas como albúmina y globulina, con las que se tratan personas que tengan hepatitis B
y colesterol alto, por lo que sirve para evitar la ateogénesis. También presenta capacidad de
barrer radicales libres, por lo que es utilizada para evitar el envejecimiento (Hong & Lin,
2004). Así mismo hay reportes de hemaglutinina con actividad anti-viral o de lectina con
actividad mitogénica (Jung et al., 2007). La mayoría de los estudios se han enfocado en el
análisis de esta última, debido a que al ser proteína de origen no inmune, tiene alta
importancia en propiedades biológicas como la aglutinación de eritrocitos, linfocitos y
plaquetas. Además se sabe que interviene en la adhesión en diferentes organismos, por lo
que se considera pieza clave para determinar la patogenicidad (Russel & Paterson, 2008).
Adicionalmente, la lectina designada MCL -Lectina purificada de C.militaris-, ha
demostrado que poseen actividad antitumoral (efecto inhibitorio en el crecimiento del
tumor) y actividad anticarcinogénica (efecto inhibitorio en la inducción del cáncer por
carcinógenos y poseer actividad de hemaglutinación en eritrocitos de ratones y ratas pero
no en los eritrocitos humanos (Jung et al., 2007). Jung y colaboradores reportan que la
actividad de hemoaglutinación fue máxima entre pH 6,0 a 9,1 y en temperaturas inferiores a
50 ° C. Adicionalmente, tras realizar espectroscopia CD encontraron que la LMC tiene
una estructura secundaria tiene alrededor de 27% de hélices α, confiriéndoles una
estabilidad relativamente alta debido a los puentes de hidrógeno entre los grupos amino y
carbonilo del esqueleto del polipéptido. Tiene 12% de láminas ß y se estabiliza por puentes
de hidrógeno entre el grupo amida y el grupo carboxilo de un filamento adyacente.
También posee regiones no repetitivas, bucles (32%) y giros (29%) que hacen que la LMC
sea aún más compacta.
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Actualmente, los productos que se encuentran en el mercado, son resultado del
procesamiento del cuerpo fructífero de C.militaris, son procesados para ser vendidos en
forma de hongo seco, obteniendo una apariencia similar a hojuelas de maíz, polvo, cápsulas
o extracto y ser consumido directamente o infusión (Tiens Group , 2010). Sin embargo, el
crecimiento lento y la especificidad del hospedero son dos aspectos que limitan la
producción. Por lo que en los últimos años se ha preferido aislar cepas vivas y cultivarlas
en biorreactores para lograr satisfacer las necesidades de consumo y reducir la presión
sobre los recursos naturales (Russel & Paterson, 2008). Estos resultan menos costosos y se
puede controlar la producción de metabolitos con importancia nutracéutica (Lee et al.,
2012).
Por otro lado, la soya es una fuente de proteína que se utiliza con frecuencia en el mundo.
Se produce tofu, bebidas alimenticias, barras, entre otros, debido a la funcionalidad para
extruidos y texturizados. La proteína aislada de soya contiene 90% de proteína (en base
seca) y no presenta azúcares o fibra dietética. Las proteínas de soya son ampliamente
utilizadas para realizar fórmulas nutricionales para pacientes con diabetes, pues la
incorporación de ésta ayuda a disminuir la respuesta glucémica (Vanegas et al., 2009), por
ejemplo. La caracterización de bebidas lácteas se basa en estudios a escala macroscópica,
microscópica y molecular; estudios sensoriales, reológicos, morfológicos y de tamaño de
partícula, se utilizan para evaluar la interacción de las proteínas en esta matriz. Así mismo
se utiliza para determinar la calidad de los productos antes de ser comercializados según
las exigencias del consumidor (Janhøj et al., 2008). El presente trabajo tiene como fin
obtener proteína total de C. militaris e incorporarla en una matriz láctea analizando algunas
características, para posteriormente comparar los resultados con los reportados en la
literatura acerca de un yogurt con proteínas de leche y soya.
2. Metodología
En este estudio se trabajó con Cordyceps militaris cepa 1175E1 aislada por Tatiana
Sanjuan como parte del Proyecto “Metabolómica de Cordyceps nidus y Cordyceps
takaomontana: un análisis bioprospectivo”. Actualmente esta cepa reposa en el laboratorio
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de Fitopatología y Micología del departamento de Ciencias Biológicas situado en la
Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
2.1 Crecimiento de Cordyceps militaris
2.1.1 Pre- inóculo
Discos de agar de 2-5 mm de la cepa 1175E1 de C. militaris fueron sembrados en cuatro
erlenmeyers de 250ml. Éstos contenían 160ml de medio sintético (g soluto/L de agua
destilada): glucosa, 10,0; peptona, 5,0; extracto de malta, 3,0; extracto de levadura,
3,0; KH2PO4, 1,0; MgS04, 0,5 y pH de 6,0 ajustado con una solución de HCl al 30%. Los
inóculos se pusieron en un shaker a 25°C, 150 rpm a la oscuridad durante 5-7 días .
2.1.2 Fermentación
Luego de observar crecimiento en los erlenmeyers y verificar que no se presentara
contaminación con otros microorganismos, se procedió a hacer el cultivo de fermentación.
Se preparó el medio siguiendo la composición (g de soluto/L de agua destilada): glucosa,
40,0; peptona, 1,0; extracto de levadura, 10,0; cloranfenicol, 10,0 y pH de 6,0. Los inóculos
se homogenizaron en 100 ml del medio descrito y se sirvieron en una relación del 8% (v/v)
según el tratamiento (Lee et al., 2013). Se inoculó el biorreactor NewBrunswick BioFlo
110 para un volumen total de 3 litros de caldo de cultivo y se mantuvo a 100 rpm, a 22°C,
con períodos de luz (14 horas/día) y oscuridad (10 horas/día), con una relación de oxígeno
de 25% (Fot-3L-25). Los otros tres tratamientos se dispusieron en erlenmeyers de 1000 ml;
uno con períodos de luz igual y con una relación de oxígeno de 10% (Fot-1L-10), los otros
dos en oscuridad, uno con relación de oxígeno de 10% (Osc-1L-10) y el otro con 25%
(Osc-1L-25). Estos se incubaron en el Shaker orbital HD 3000CT por 25 días con una
agitación de 100 rpm y 25°C (Ver Anexo 1).
2.2 Cuantificación de proteínas totales
2.2.1 Reactivo de Bradford
Primero se preparó el reactivo de Bradford en el orden indicado: Azul de coomasieG-250
(10 mg), etanol al 95% v/v (5 ml), ácido fosfórico al 85% v/v (10 ml) y agua destilada (100
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ml), se mezcló y se filtró con papel Whatman número 1. Se almacenó en la oscuridad a 4°C
(Bradford, 1976).
2.2.2 Solución concentrada de albumina de suero bovino (BSA)
Para realizar el patrón de albumina se disolvió 10 mg de albumina bovina en 10 ml de agua
destilada, con lo que se obtuvo la disolución madre. Posteriormente se realizó la curva
patrón en un rango de 0 hasta 1000 µg llevando a un volumen total de 1 ml (Bradford,
1976).
2.2.3 Curva de calibración
En una celda de espectrofotómetro, mezcló 100 μl de cada una de las concentraciones
realizadas en el numeral anterior y mezclar con 5 ml de reactivo de Bradford, después de 5
minutos se hizo la lectura del espectrofotómetro UV/VIS a una longitud de onda de 595nm,
ajustando el cero de absorbancia con el blanco. Este procedimiento se realizó por
duplicado.
2.2.4 Cuantificación de proteína de la muestra
La biomasa obtenida en cada uno de los tratamientos se separó del medio filtrando al vacío
con papel Whatman número 1 y se midió la cantidad de biomasa obtenida. En este punto, se
adicionó una muestra más, cuerpos fructíferos o estromas crecidos en medio sólido a base
de arroz (Sanjuan, 2015). Posteriormente se liofilizaron todas las muestras, se midió el peso
seco y se molió el micelio con un mortero.
La extracción de proteína total de C. militaris se realizó según lo descrito por Zhao y
colaboradores (Zhao et al., 2003). Se tomaron muestras del medio líquido filtrado y no
filtrado de cada tratamiento para hacer cuantificación de la proteína extracelular. 2 ml de
cada tratamiento se dispusieron en tubos eppendorf y se centrifugaron (10000 rpm- 15
minutos-4°C). Posteriormente se tomó 100 μl del sobrenadante y se mezcló con 5 ml de
reactivo de Bradford para realizar la lectura en el espectrofotómetro UV/VIS.
Para cuantificar la proteína intracelular, se colocó la biomasa en tubos tipo falcón de 50 ml
más 20ml de agua desionizada. Se trató cada una de las muestras en el sonicador Branson
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250 analógico de punta grande para lisar las células por tres ciclos, 10 segundos bajo la
punta y 20 segundos en hielo. Posteriormente se centrifugaron las muestras (4000 rpm-15
minutos-4°C). Finalmente se tomó una muestra del sobrenadante para hacer la
cuantificación igual que en el caso de las proteínas extracelulares pero haciendo diluciones
1:4.
2.3 Electroforesis
10 μl del sobrenadante del paso anterior para cada uno de los tratamientos mas el marcador
de peso (Biorad #1610318) se dispusieron en tubos eppendorf con 20 μl de buffer de
muestra y se llevaron a denaturar a 90°C por 5 minutos.
Para preparar y visualizar las proteínas extraídas en gel de poliacrilamida se siguió el
protocolo del laboratorio de Biología Molecular de la Universidad de los Andes (Ver
Anexo 2) (Jaramillo, 2008).
2.4 Obtención de proteína
Las muestras sonicadas se centrifugaron (4500 rpm-20 minutos-4°C) y se recuperó el
sobrenadante, cada uno de los tratamientos se mezcló con sulfato de amonio saturado al
60% y se mezcló hasta solubilizar la sal. Se dejaron los tubos a 4°C por una noche. Tras la
precipitación se centrifugó de nuevo cada uno de los tubos (4500 rpm-30 minutos-4°C), y
se recuperó el precipitado. Estos últimos se resuspendieron en 2 ml de agua y se dializaron
con un tapón de CaCl2 a 0.15M por 24 horas a 4°C.
2.5 Incorporación de la proteína en la matriz
En schott se puso 200 ml de leche entera y se mezcló con 0.04 g del sobre del cultivo
láctico concentrado liofilizado para la inoculación de leche directa (CHOOZIT MY 800
LYO 5DCU) adquirido en CIMPA S.A.S. Esta mezcla está compuesta por Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis y Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus. Luego de mezclar por cinco minutos suavemente se adicionó la proteína
purificada. Posteriormente se mantuvo la leche a 44°C por tres horas hasta que se observó
un coágulo. A continuación se agitó suavemente y se enfriaron los frascos hasta alcanzar
una temperatura de 21°C. Se realizó una muestra control, esta contiene únicamente los
organismos fermentadores.
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2.6 Caracterización del producto
Para comparar el comportamiento de las proteínas de los tratamientos se realizaron pruebas
de viscosidad a 4°C, temperatura a la que se recomienda mantener esta bebida fermentada
para reforzar el sabor y dar la viscosidad deseada al yogurt, para esto se utilizó el reómetro
ARG2 con un volumen de 22 ml de muestra. Por otro lado se analizó la distribución de
tamaño de partículas con el equipo denominado Mastersize 3000, se utilizó agua como
dispersante y leche como estándar, las pruebas se realizaron con un obscuración alrededor
del 13% para todas las muestras. Adicionalmente se hizo microscopía para ver si había
algún tipo de aglomeración en las muestras, tomando 0,5 ml de muestra.
3. Resultados y discusión
3.1 Crecimiento pre inóculo
El caldo de cultivo para el pre inóculo se observó oscurecido y turbio pero esto es debido a
la alta tasa de reproducción del hongo. Se muestran tres fotografías en las que se observa el
crecimiento, en los dos primeros días se ve únicamente los discos de agar previamente
crecidos, en los siguientes dos días se evidencia la formación de pequeños pellets y una
nata hacia el borde del medio. Finalmente, luego de 7 días de crecimiento se ve el medio
turbio y que la nata ha crecido más, esto corresponde a la aglomeración de pequeñas hifas
(Ver Anexo 3).
3.2 Crecimiento de los cultivos de Cordyceps militaris
Para todas las muestras se realizó una fermentación por lotes o batch, pues sólo en el
tiempo t0 se inoculó el medio esterilizado con el microorganismo crecido y se llevó a las
condiciones de crecimiento (Crueger & Crueger, 1990). Durante el tiempo de crecimiento
no se adicionó nada, excepto oxígeno (aire) de forma controlada para el reactor; para los
demás tratamientos el porcentaje de oxígeno correspondía únicamente a la relación de
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columna de aire sobre el medio y al flujo ambiental al poner tapones removibles a los
erlenmeyers.
Se prefirió hacer fermentación líquida en vez de la sólida debido a que se puede tener
mayor control de la temperatura, aireación, agitación y pH (Shih et al., 2007), además de
considerarse que ésta es la forma como se está haciendo el cultivo a nivel industrial,
actualmente. En este caso, para la obtención de biomasa y posterior obtención de proteína
total, el pH sólo se tuvo en cuenta al momento de hacer la inoculación para ser ajustado 6,0.
Por su parte la temperatura se mantuvo en el punto que se mencionó para cada tratamiento.
Durante el crecimiento sumergido o fermentación líquida, el hongo puede crecer como
micelio libre o gránulos (pellets). La forma de estos está determinada por factores como el
medio de crecimiento, el tamaño del inóculo, y el medio físico. Otro factor importante es la
agitación, esta puede influir en la tasa de crecimiento o la variación del producto deseado,
hablando de una fermentación industrial, ya que puede romper la pared celular, por
ejemplo (Sinha et al., 2001). En C. militaris los pellets
más grandes se obtienen a una intensidad de agitación baja, alrededor de 50 rpm, mientras
que a 300 rpm las partes pilosas de los pellets son rotos y disminuyen
el tamaño y la circularidad de los pellets (Park et al, 2002).
Así, se esperaba que la mayor cantidad de biomasa se obtuviera de la muestra extraída del
tratamiento [Fot-3L-25 (Reactor)] , ya que las condiciones de operación fueron las que se
encontraron reportadas en la literatura para optimizar biomasa (Shih et al., 2007; Lee et al.,
2013). Sin embargo al hacer muestreo periódico –tomar muestras del reactor y sembrar en
el mismo medio, pero sólido (YMPG)- y hacer láminas para detectar algún tipo de
contaminación con otros microorganismos como levaduras, se observó que se tenía gran
cantidad de blastosporas. La formación de estas estructuras puede deberse a que los pellets
más grandes se pudieron haber vuelto más flexibles por el agotamiento de oxígeno
disuelto, dando lugar a la autolisis (Park et al., 2002). Estas estructuras son esporas
asexuales, tienen pared más gruesa que las esporas comunes y forman cadenas de esporas
que posteriormente resultar convirtiéndose en hifas. Se utilizan en formulaciones de
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control biológico pues germinan rápidamente en medio líquido, son altamente infectivos y
poco sensibles al calor (Jaronski & Jackson, 2012).
La Figura 1 corresponde a la morfología de una de las muestras tomadas del reactor luego
de cuatro días de crecimiento. Cabe mencionar que al igual que en las cajas de Petri, en el
reactor se observó el cambio de blastosporas a hifas hacia al final del período de
crecimiento. Para la cuantificación de la biomasa, se tuvo en cuenta el micelio como tal
para este tratamiento, pues al filtrar se retiró todo el contenido de blastosporas que
quedaban en el medio (Ver Anexo 3).
Figura 1. Morfología de C. militaris (1175E1) en caja de Petri. A. B. C. Transición de blastosporas a micelio durante tres meses de crecimiento. D. Blastosporas al microscopio (40x).
En el tratamiento Osc-1L-10, que tenía 10% de oxígeno y oscuridad absoluta, también se
encontraron blastosporas, sin embargo durante el período de crecimiento no se observó la
transición a micelio y sólo se recuperaron estas estructuras. El tratamiento que tenía la
misma relación de oxígeno pero con períodos de luz (Fot-1L-10), se obtuvo la misma
A B C
D
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morfología que en el reactor. Por su parte, el tratamiento que creció a la oscuridad y con
una relación de oxígeno mayor (Osc-1L-25), sólo se produjo micelio, sin estructuras
intermediarias como las blastosporas.
La Tabla 1 resume la biomasa para todas las muestras y la morfología que se encontró. Se
evidencia que con todas las muestras se obtuvo biomasa en el mismo orden de magnitud,
sin embargo sólo dos de las muestras crecidas en la incubadora tienen una cantidad de
biomasa considerable. Los tratamientos Fot-1L-10 y Osc-1L-25 no comparten ningún
parámetro de crecimiento, pues tienen diferente relación de oxígeno y tratamiento de luz.
La muestra con la que se obtuvo menor cantidad de biomasa fue la denominada Osc-1L-10
que creció bajo la menor cantidad de oxígeno y en la oscuridad.
Tabla 1. Biomasa obtenida antes y después de liofilizar y morfología para todos los tratamientos
Con los resultados anteriores se puede inferir que la mejor combinación para obtener
biomasa sería una temperatura de 25°C, crecimiento en la oscuridad y una relación de
oxígeno de 25%.
Por otro lado, es importante mencionar la apariencia que tenía la biomasa recuperada para
cada caso. En la muestra Osc-1L-10 las blastosporas eran totalmente blancas, con una
apariencia similar a la de Fot-1L-10, en el que el micelio no tenía ninguna coloración, se
observa que esta última tiene apariencia más consistente y es una especie de nata gruesa.
La muestra Osc-1L-25 y la del reactor (Fot-3L-25) tienen biomasa mucho más consistente
y estas sí presentan coloración, la del reactor presenta tonos cafés causados por la
oxidación. Adicionalmente, se presenta la muestra denominada Sólido, que corresponde al
crecimiento en medio sólido del que se recuperó el cuerpo fructífero (Figura 2). Se
esperaba que la coloración del micelio ocurriera sólo en las muestras que eran expuestas a
la luz, pues corresponde a la acumulación de carotenoides. La coloración de Osc-1L-25
Muestras Peso Húmedo Peso seco Morfología
Osc-1L-10 20,234 2,761 Blastosporas
Fot-1L-10 15,021 3,349 Blastosporas/Micelio
Osc-1L-25 17,080 4,310 Micelio
Fot-3L-25 21,950 2,870 Blastosporas/Micelio
Sólido 14,84 1,395 Sinemas
Desviación 0,706
Media 3,323
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puede deberse a que el papel aluminio con el que se cubrió el erlenmeyer pudo haberse roto y al
tener un orificio pequeño empieza la acumulación de carotenoides que produce la coloración.
3.3. Cuantificación de proteína
Se realizaron dos curvas de calibración teniendo en cuenta que la concentración de proteína
intra y extra celular resultaron tener magnitud diferente aun haciendo las diluciones. Las
curvas de calibración se muestran en el Anexo 4.
La Tabla 2 muestra las concentraciones de proteína en el medio, es decir la extra celular o
secretada. Se observa que no hay diferencia de magnitud en las muestras filtradas y no
filtradas, ni entre tratamientos.
Tabla 2. Concentración de proteína extracelular
Muestra 1 2 1 2
Fot-3L-25 0,165 0,168 0,245 0,249
Osc-1L-10 0,142 0,147 0,213 0,220
Fot-1L-10 0,178 0,184 0,263 0,271
Osc-1L-25 0,58 0,161 0,235 0,240
1.No filtrado 2. Filtrado
Concentración (mg/ml)Absorbancia
A B C
D E
Figura 2. Biomasa de cada tratamiento antes de liofilizar. A. Sólido B. Fot-3L-25 (Reactor) C. Osc-1L-25 D. Fot-1L-10 E. Osc-1L-10
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El rendimiento, que corresponde a la relación de unidad de proteína por fuente de carbono
(Dextrosa) del medio, para todos los casos fue de alrededor del 1%.
Del mismo modo se realizaron las mediciones de la proteína intra celular luego de sonicar,
que corresponde a las proteínas de membrana y/o enzimas del metabolito primario, se
obtuvo que el tratamiento Reactor (Fot-3L-25) tuvo una concentración 1,5 veces mayor que
el promedio de los tratamientos Fot-1L-10 y Osc-1L-25, y 4 veces mayor que Osc-1L-10.
En general los rendimientos para la proteína intracelular son mucho mayores que los
obtenidos para la proteína intracelular.
Tabla 3. Concentración de proteína intracelular
Los valores de proteína obtenidos resultan ser mayores a los reportados para alimentos
ricos en proteína. El yogurt griego, por ejemplo, según la marca, tiene entre 15-30 gramos
por litro de proteína, mientras que proteína de origen vegetal como la soya o el brócoli
tienen 60 y 49 gramos, respectivamente (González et al., 2014). De la misma manera, se
encuentra mayor que reportes de proteína fúngica proveniente de Agaricus bisporus,
Lentinule edodes, Pleurotus ostreatus, Ganoderma lucidum y Volvariella volvácea, con los
que se ha encontrado 23% (Braaksma & Schaap, 1996), 26,3%, 28,6%, 13,3% y 36,5%
(Hung & Nhi, 2012) porcentaje peso a peso, respectivamente.
Al no haber reportes en la literatura de la cantidad de proteína total que puede ser extraída
de C.militaris, se puede presumir que podrían utilizarse métodos más exactos para la
cuantificación de la proteína como el Método de Kjeldahl, muy utilizado en el análisis de
alimentos, y así evitar posibles interferencias con compuestos nitrogenados no proteicos
(FAO, 2016).
Muestra Absorbancia Rendimiento
Fot-3L-25 0,886 268%
Osc-1L-10 0,567 66%
Fot-1L-10 0,717 161%
Osc-1L-25 0,770 195%
Sólido 0,783
Media
Desviación
Concentración (mg/ml)
40,626
16,742
34,513
53,612
13,276
32,204
38,959
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Por otro lado, como se mencionó anteriormente, la agitación además de influir en la
morfología, puede influir en la producción de metabolitos. Se cree que la diferencia notable
entre la cantidad de proteína obtenida en el reactor frente a los demás tratamientos puede
ser el resultado del estrés al que se sometió C.militaris con el tipo de agitador que se utilizó
(Ver Anexo 5).
En varios estudios se menciona que ha resultado mejor hacer fermentaciones con un
impulsor de flujo radial tipo Rushton de seis aspas, en algunos se han hecho modificaciones
poniendo dos impulsores, evitando zonas muertas y que el oxígeno del medio tenga una
mejor distribución. En este caso se utilizó un impulsor de flujo axial tipo Down-pumping
and Up-Pumping, que pudo haber estresado al microorganismo, pues aunque no se utilizó
una intensidad de agitación alta, al tener un área de contacto mayor a la recomendada y
aspas con ángulos contribuyen a la necesidad del hongo por acelerar su crecimiento y
producir metabolitos (Park et al., 2002; Garcia et al., 2013).
Además, debe considerarse que el reactor duró cinco días estático debido a que tuvo una
falla en el motor de agitación, por lo que se pudo haber aumentado la producción de
proteína de C. militaris. La anterior hipótesis se basa en la idea de Shih y colaboradores,
quienes mencionan que la mayor cantidad de metabolitos, como la cordicepina se obtiene
tras hacer cultivo sumergido combinado. Esto corresponde a fermentación en matraces
agitados por 8 días y posteriormente dejar el cultivo estático por 16 días. También
evaluaron la producción de adenosina y exopolisacaridos, pero encontraron que la cantidad
de estos metabolitos no cambia significativamente al hacer cultivo combinado (Shih et al.,
2007).
En otro estudio se encontró que la producción de los mismos metabolitos y micelio en C.
militaris se ve influenciada por la longitud de onda a la que es expuesto durante el
crecimiento. Para cordicepina, es mejor la luz azul que la luz del día y la oscuridad; para la
adenosina, es mejor la luz roja, pero resulta mejor la oscuridad que la luz del día; mientras
que para micelio es mejor la luz roja seguida de la oscuridad y por último, aparece la
opción de la luz del día (Dong et al., 2012).
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Con lo anterior, aunque no se encontraron reportes sobre la optimización de proteína, se
puede inferir que al igual que los otros metabolitos, los factores de crecimiento influyen en
la cantidad que puede producir C.militaris en cultivo líquido. Cabe mencionar que se ha
reportado que en los cuerpos fructiferos –Muestra Sólido- se llega a obtener mayor cantidad
de proteína, pues se obtiene casi el doble con el cultivo sólido (Wasser & Chan, 2012).
Para este caso, se obtuvo que la cantidad de proteína es mayor para el tratamiento del
reactor que para la de sólido.
3.4 Electroforesis
Los primeros pozos tienen un patrón de bandeo similar, comparten la banda definida
alrededor de 101kD, que corresponde a BSA, y tienen una banda más gruesa entre 21 y 6.9
Kd, que corresponde a lisozima y aprotinina, según el marcador de peso. Los pozos en los
que se sembraron las muestras Osc-1L-10 y Fot-1L-10 tienen un patrón de bandeo tenue,
pues estos son los tratamientos con menos cantidad de proteína (Figura 3). Se debe
considerar que con estas diferencias se puede inferir que aunque la proteína es del mismo
organismo, no es igual para todos los tratamientos, pues el hongo crece diferente según las
condiciones del medio.
Se esperaría encontrar una banda bien definida entre los marcadores de peso de 29 y 35.8,
que corresponden a tripsina de soja y anhidrasa carbónica, respectivamente. Pues el único
registro que se tiene de proteína en C. militaris es de lectina (CML), esta proteína tiene un
peso de 31.4kDa (Jung et al., 2007). Sin embargo al haber hecho este gel para detectar un
patrón en las muestras con proteína total, puede inferirse que sí puede haber dicha proteína
en la muestra, pero que se deben hacer procesos de purificación para obtener una banda
presuntiva de esta.
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Figura 3. Gel de electroforesis. MP (Marcador de peso). 1. Fot-3L-25 - 2.Sólido - 3.Osc-1L-25 – 4.Fot-1L-10 – 5. Osc-1L-10 -6. Osc-1L-10 -7,8,9 vacíos.
3.5 Obtención de la proteína
Se decidió purificar las muestras que tenían alta cantidad de proteína: Fot-3L-25, Sólido,
Fot-1L-10 y Osc-1L-25 para poder ser incorporadas posteriormente en la matriz.
Visualmente la cantidad de proteína precipitada fue mayor para la muestra del reactor y
para las demás muestras se tuvo la misma cantidad aproximadamente.
3.6 Proteína en la matriz
Luego de 72 horas de haber dejado reposar el yogurt se realizaron las pruebas en las que se
obtuvieron los resultados que aparecen a continuación.
La morfología de la superficie se analizó en un microscopio óptico, en la Figura 4 se
evidencia la formación de agregados en forma de gránulos, pero debido a la poca
resolución del microscopio no se puede hacer una diferenciación clara de dichos agregados
según la muestra. Al tener el mismo volumen sobre la lámina, se puede decir que la muestra
proveniente del reactor es menos densa que las demás, incluyendo al control, pues se
observa menor cantidad de gránulos.
210 kD
125
101
56.2
35.8
29
21
6.9
MP 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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Con una microscopía SEM, se podría hacer la diferenciación de los aglomerados en las
muestras. Es decir, identificar si los gránulos son simétricos y porosos, o si por el contrario
tienen un comportamiento similar a una red, característica de los productos con proteína de
soya (Giraldo et al., 2014).
En cuanto al tamaño de partícula, se observa en la Figura 5 que las muestras tienen un
tamaño similar. Comparando con la muestra control, el reactor tiene un diámetro mayor,
mientras que Fot-1L-10 tiene el mismo tamaño y las otras dos muestras tienen un tamaño
menor. Giraldo y colaboradores mencionan en su estudio, que el tamaño de partícula puede
deberse al pH final de las muestras. Es decir que si se tiene un pH cercano al punto
isoeléctrico de las proteínas, se da un aumento en el tamaño de las partículas en la matriz.
(Giraldo et al., 2014).
Lo anterior, indicaría que sólo en la muestra Fot-3L-25 se llegó a valores cercanos del
punto isoeléctrico, sin embargo al no saber cuáles eran las proteínas específicas de las
muestras, no se tuvo en cuenta el pH como factor decisivo para concluir acerca del tamaño
de partícula. Al realizar las mediciones del pH, todas las muestras reportaron valores
alrededor de 4,6.
Comparando con el estudio mencionado (Giraldo et al., 2014)., se evidencia un
comportamiento diferente al de la soya, pues el yogurt con 100% proteína de soya tiene un
tamaño de partícula mayor al yogurt con leche normal y en este caso, la mayoría de las
muestras tiene un tamaño menor que el control. Sin embargo la muestra Fot-3L-25 tendría
mayor relevancia, pues es la que tiene una cantidad superior de proteína, lo que se reflejaría
en su importancia a nivel comercial.
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Figura 4. Microscopia 40X. Escala de 10 um A. Control B. Osc-1L-25 C. Fot-1L-10 D. Fot-3L-25 E. Sólido
BA
C D
E
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Figura 5. Tamaño de partícula en las muestras
Adicionalmente, se muestra la distribución del diámetro volumétrico en las muestras
(Figura 6), se observa que la agrupación de partículas pequeñas y medianas de las muestras
y el control son muy parecidas, las pequeñas tienen un diámetro de 0,03µm y las medianas
de 0,2 µm. Por su lado, la distribución de las partículas más grandes si se diferencian entre
sí. La muestra Fot-1L-10 tiene un valor promedio más cercano al control, mientras que las
demás pruebas están por debajo de éste. Lo anterior podría influenciar en la textura y
estabilidad del producto terminado (Dickinson, 2001).
Figura 6. Distribución del diámetro volumétrico en las muestras
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Finalmente con la caracterización reológica, se encontró una viscosidad aparente diferente
para cada muestra. Los mayores valores se obtuvieron con el tratamiento Fot-1L-10 ,
seguido de Sólido; estos dos tienen una viscosidad mayor que el control. Por su parte, las
muestras de Osc-1L-25 y Fot-3L-25 tuvieron una viscosidad menor que el tratamiento,
siendo esta ultima la de menor viscosidad (Figura 7). Todas las muestras de yogurt
presentaron un comportamiento seudoplástico, pero se omitió evaluar la propiedad de
tixotropía en cada una de los productos fermentados.
Figura 7. Viscosidad de las muestras
Se esperaba un comportamiento similar al reportado por Giraldo et al., en el que a mayor
cantidad de proteína de soya se tiene mayor viscosidad. Pero en este caso se obtuvo un
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comportamiento inverso, pues la muestra Fot-3L-25, que tenía más proteína de C.militaris
tuvo la menor viscosidad y la muestra Fot-1L-10 con menor cantidad de proteína tuvo la
mayor viscosidad.
Cabe mencionar que estos resultados pueden deberse a que al proceso de la preparación del
yogurt le hizo falta tiempo o llegar a la temperatura adecuada, pues se sabe que la leche
tiene dos proteínas: una es la caseína (recubierta por fosfoparacaseinato) y la lactoglobulina
que es inestable, ésta se rompe por acción de la temperatura formando una capa que protege
a la caseína contribuyendo a una mejor capacidad de retención de agua e incremento de
viscosidad. Así que se tendrían que evaluar estos dos parámetros para poder obtener la
viscosidad deseada y tener una mejor apariencia del producto (McKenzie, 2012).
4. Conclusiones
El cultivo Cordyceps militaris en medios artificiales debe ser estandarizado y controlado,
pues las condiciones de crecimiento como temperatura, luz y requerimientos nutricionales
influyen en el componente de interés que se desea obtener.
Aunque hay reportes en la literatura, en los que se afirma que en el cultivo sólido se obtiene
la mayor cantidad de proteína, en este caso, se tuvo en una fermentación líquida en un
biorreactor. Se cree que las condiciones de estrés a las que se sometió C.militaris
permitieron que la actividad metabólica incrementara y así obtener la mayor concentración
de proteína.
Es necesario utilizar métodos más rigurosos para la purificación de la proteína como
realizar cromatografía de afinidad, por ejemplo. Adicionalmente, se puede caracterizar la
proteína por medio de secuenciación o espectrometría de masas. Posteriormente se podría
diseñar un producto alimenticio para personas con requerimientos nutricionales específicos
y contribuir al limitado estudio de las proteínas de importancia comercial de este
microorganismo.
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La incorporación de nuevos ingredientes en la formulación del yogurt, cambia la estructura
original de éste tanto física como químicamente, por lo que es importante conocer sus
efectos. Los productos obtenidos en este estudio, resultaron tener una viscosidad aparente
similar a un yogurt convencional y tener buena consistencia. Ninguno presentó sinéresis
después de las 72 horas de elaboración. Con lo anterior, se puede concluir que al presentar
estas características, podría ser un buen prototipo para realizar un producto que tenga
además de un alto contenido proteico, una textura homogénea al tener un comportamiento
correcto con las proteínas de la leche.
5. Referencias
Anupama, P., & Ravindrab. (2000). Value-added food: Single cell protein. Biotechnology
Advances, 18, 459-479.
Biorad #1610318. (s.f.). Prestained SDS-PAGE Standards, broad range, 500 µl #1610318.
Recuperado el 27 de Abril de 2016, de http://www.bio-rad.com/en-
mx/sku/1610318-prestained-sds-page-standards-broad-range-500-ul
Braaksma, A., & Schaap, D. (1996). Protein analysis of the common mushroom Agaricus
bisporus. Postharvest Biology and Technology, 7, 119-127.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem ,
248-254.
Crueger, W., & Crueger, A. (1990). Biotechonology: A texbook of Industrial Microbiology .
Sunderland : Sinauer Associates .
Dickinson, E. (2001). Milk protein interfacial layers and the relationship to emulsion
stability and rheology. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 20, 197-210.
Dong, J. Z., Liu, M. R., Lei.C, Zheng, M. R., & Wang, Y. (2012). Effects of Selenium and
Light Wavelengths on Liquid culture of Cordyceps militaris Link . Appl Biochem
Biotechnol, 2030–2036.
Página 24 de 36
Durand, A. (2003). Biorreactor designs for solid-state fermentación . Biochemical
Engineerinf Journal, 13, 113-125.
FAO. (2016). Biochemical and chemical methods. Recuperado el 1 de Mayo de 2016, de
http://www.fao.org/docrep/v7180e/V7180E0h.htm
Garcia, C., Gonzales, M., Medrano, H., & Solis, A. (2013). Estudio de las condiciones de
mezclado en fermentador para la producción de blastosporas de Beauveria bassiana.
Revista Colombiana de Biotecnología, 15, 47-54.
Giraldo, A., Diaz, A., Gonzáles, G., Pacheco, S., Klotz, B., Álvares, O., y otros. (2014).
Estudio de la Interacción de Proteínas de Leche y Soya durante la preparación de
Yogurt. Tesis Uniandes, Medellín.
González, R., Pérez, J., & Urbina, N. (2014). Efecto de la Microencapsulación sobre las
Propiedades Reológicas y Fisicoquímicas del Yogurt Blando. Información
tecnologíca , 45-56.
Hong, Y., & Lin, B. (2004). Evaluation of the anti-inflammation screening model of
macrophages cell line by the proinflammatory mediators secretions. Journal of
Nutritional Science, 29, 159–167.
Hung, P., & Nhi, N. (2012). Nutritional composition and antioxidant capacity of several
edible mushrooms growm in the Southerm Vietnam. International Food Research
Journal, 19(2), 611-615.
Janhøj, T., Frøst, M., & Ipsen, R. (2008). Sensory and rheological characterization of
acidified milk drinks. Food Hydrocolloids, 798–806.
Jaramillo, C. (2008). Guía de laboratorio Biología Molecular. Bogotá: Universidad de los
Andes.
(2012). Mass production of entomopathogenic hypocreales. En S. Jaronski, & M. Jackson,
Manual of techniques in invertebrate pathology (págs. 225-284). Oxford, N.Y.:
Academic Press. .
Jung, E., Kim, K., Bae, C., Kim, J. K., & Kim, H. (2007). A mushroom lectin from
ascomycete Cordyceps militaris. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General
Subjects, 833–838.
Kim, J., Sapkota, K., Park, S., Choi, B., Kim, s., Nguyen, T., y otros. (2006). A fibrinolytic
enzyme from the medicinal mushroom Cordyceps militaris. Microbiol, 622-631.
Kyanko, V., Cane, R., de la Osa, O., Ludemann, V., Pose, G., & Wagne, J. (2010).
Filamentous fungy as unconventional protein ingredients with good hydraation
Página 25 de 36
properties. International conference on food innovation, Universidad politecnica de
Valencia .
Kyanko, V., Cane, R., de la Osa, O., Ludemann, V., Pose, G., & Wagne, J. (2010).
Filamentous fungy as unconventional protein ingredients with good hydratation
properties. International conference on food innovation, Universidad politecnica de
Valencia.
Lee, B., Lee, M., Kim, Y., & Lee, K. (2013). Cultural characteristics of Cordyceps militaris
strain „Yedang 3‟ on various media and nutritional conditions. Journal of
Mushroom Science and Production , 124-130.
Lee, K.-H., Morris, S., Yang, X., Huang, R., Zhou, T., Shi, Q., y otros. (2012). Recent
progress of research on medicinal mushrooms, foods, and other herbal products
used in traditional Chinese medicine . Traditional and complementary Medicine,
84-95.
McKenzie, H. (2012). Milk Proteins V1: Chemistry and molecular biology. Elsevier.
Park, J., Kim, Y., Kim, S., Hwang, H., Cho, Y., Lee, Y., y otros. (2002). Effect of agitation
intensity on the exo-biopolymer production and mycelial morphology in Cordyceps
militaris. Applied Microbiology, 34, 433-438.
Russel, R., & Paterson, M. (2008). Cordyceps – A traditional Chinese medicine and another
fungal therapeutic biofactory? Phytochemistry, 69, 1469-1495.
Sanjuan, T. (2015). PHYLOGENETIC STUDY OF THE INTERACTION Cordyceps sensu
lato - INSECTA IN THE NORTHWEST AMAZON, AN ECOLOGICAL,
MOLECULAR AND MORPHOLOGICAL ANALYSIS. Medellin : [ Disertación
Doctoral] Universidad de Antioquia 225 p.
Sanjuan, T., Henao, L., & Amat, G. (2001). Distribución espacial de Cordyceps spp.
(Ascomycotina: Clavicipitaceae) y su impacto sobre las hormigas en selvas del
piedemonte amazónico de Colombia. Revista de Biología Tropical, 49(3-4), 945-
955.
Shih, I., Tsai, K., & Hsieh, C. (2007). Effects of culture conditions on the mycelial growth
and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris.
Biochemical Engineering Journal , 193-201.
Sinha, J., Bae, J., Park, J., Kim, K., Song, C., & Yum, J. (2001). Changes in morphology of
Paecilomyces japonica an their effect on broth reology during production of exo-
biopolymers. Applied Microbiology and Biotechnology , 56, 88-92.
Página 26 de 36
Tiens Group . (2010). Tiens Group . Recuperado el 20 de Febrero de 2016, de
http://co.tiens.com/detalles/7
Vanegas, L., Restrepo, D., & López, J. (2009). Caracterización de las bebidas con proteína
de soya. Revista Facultad Nacional de Agronomía, 5165-5175.
Wasser, P., & Chan, S. (2012). Patente nº WO2014055035 A1. Hungría.
Yuea, K., Ye, M., Zhou, Z., Sun, W., & Lin, X. (2013). The genus Cordyceps: a chemical
and pharmacological review. Jounal of Pharmacy and Pharmacolgy, 65, 474-493.
Zhao, C., Sun, H., Tong, X., & Qi, Y. (2003). An antitumour lectin from the edible
mushroom Agrocybe aegerita. Biochemical Society , 321-327.
6. Anexos Anexo 1
Especificaciones de los tratamientos
*Para ver especificaciones del medio consultar la referencias (Sanjuan, 2015)
Muestra Relación Oxígeno % Temperatura (°C) Periodo de luz
(horas día)
Osc-1L-10 (Shaker) 10 25 0
Fot-1L-10 (Grande) 10 25 14
Osc-1L-25 (1175) 25 25 0
Fot-3L-25 (Reactor) 25 22 14
Sólido* 25 27 24
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Anexo 2
SDS PAGE- Electroforesis de proteínas
Preparación del gel de separación
Se debe tener en cuenta que para separar proteínas de 60 a 200 kDa se usa un gel del 5%,
para proteínas de 16 a 70 kDa use uno de 10% y uno de 15% para separar proteínas de 12 a
45 kDa.
a) Preparar una solución de persulfato de amonio (fresca diariamente) (0.1 g en 1 ml de
H2O).
b) Mida 1 cm por debajo de los peines en el montaje, hasta este punto llenará así es que
márquelo.
c) En un beaker de 50 ml mezcle 0.7 ml de solución de acrilamida; 1,25 ml de solución pH
8.8; 3 ml de H2O; Adicione 50 μl de Persulfato de Amonio y 20μl de TEMED. Agite
gentilmente para mezclar y use de inmediato.
d) Al haber alcanzado el nivel máximo marcado, cubra la solución rápidamente con agua
desionizada. Hágalo con cuidado para que las dos soluciones no se mezclen. Una vez
polimerizado (+/- 30-45 minutos) remueva el agua volteando todo el montaje.
Preparación del gel de stacking
a) En un beaker de 50 ml mezclar 0.7ml de mezcla de acrilamida; 1.25 ml de solución pH
6.8; 3 ml de H2O. Adicionar 50 μl de Persulfato de amonio y 20 μL TEMED. Agitar bien
para mezclar. Usar inmediatamente y dejar polimerizar.
Corrido de extractos de proteína
a) Realice el montaje de la cámara de electroforesis, llene la cámara interna con buffer de
electroforesis 1X hasta que cubra los pozos y el resto en la cámara externa. Asegúrese de
que la cámara externa está aislada de la interna, para eso lea cuidadosamente las
instrucciones de ensamblaje.
b) Siembre 8 µL de cada una de las muestras, anote el orden de siembra en los pozos del
gel.
c) Cierre la cámara de electroforesis y conecte a la fuente de poder. Programe el corrido de
electroforesis a 150 V por 90 minutos.
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Fijado
a) En una botella de vidrio con tapa y en campana de extracción prepare 100 ml de la
solución de fijado, agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de metanol (40 ml)
10% de ácido acético (10 ml) 40% de agua des ionizada (dH2O; 50 ml).
b) Una vez terminada la electroforesis, vierta la solución de fijado en las cubetas de tinción
suministradas con el kit.
c) A paso seguido, apague y desconecte la cámara de electroforesis vertical de la fuente de
poder. Retire el montaje de los vidrios y a continuación, los vidrios, teniendo siempre
presente el pozo número uno de sembrado. Con la ayuda de las espátulas verdes de plástico
previamente humedecidas con la solución de fijado, separe cuidadosamente los dos vidrios,
procurando que el gel quede en el vidrio más delgado. Separe y descarte el gel de stacking,
y haga un pequeño corte en la esquina superior del gel de separación en el lugar
correspondiente del primer carril de sembrado.
d) Deposite el gel en la cubeta con la solución de fijado, y guarde la cubeta en una bolsa
Ziplock a 4ºC hasta por 15 días para la tinción, de lo contrario deje el gel en esta solución
por 30 min.
Tinción azúl de Coomasie
a) En una botella de vidrio con tapa y en campana de extracción prepare 100 ml de la
solución de tinción, agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de Metanol (v/v;
15 ml) 10% de ácido acético (v/v; 3 ml) 40% de agua des ionizada (v/v; 12 ml) Coomasie
0.05% (w/v; 0.015g) .
b) Deje en agitación continua de aprox. 60 rpm a 37ºC por 45 min.
Destinción
a) Prepare con el mismo cuidado del paso anterior 100 ml de solución de destinción
agregando en orden estricto los siguientes reactivos: 50% de metanol (v/v; 50 ml) 10% de
ácido acético (v/v; 10 ml) ácido acético 40% de dH2O (v/v; 40 ml).
b) Descarte la solución de tinción en un recipiente de vidrio con tapa, con cuidado de no
botar el gel. A continuación haga un enjuague con Agua desionizada.
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c) A continuación, agregue 30 ml de la solución de destinción. Deje el gel en agitación
constante de aprox. 50 rpm a 37º C por 10 minutos. Revise periódicamente su gel hasta
obtener la intensidad de bandas deseada. Si al cabo de los primeros minutos aún encuentra
un elevado background (es decir, coloración azul de fondo que compite con las bandas),
reemplace la solución de destinción por una nueva.
d) Cuando obtenga el bandeado esperado, el gel que está listo para ser fotografiado o
secado en papel celofán en frío.
Anexo 3
Registro fotográfico: Crecimiento
Figura Anexo 1. Equipos utilizados para el crecimiento A. Shaker B. Reactor
A C
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Figura Anexo 2. Transición del medio: A Primeros dos días de inoculación. B Aparición de nata y pellets pequeños. C Turbidez del medio y nata más grande por la aglomeración de hifas.
A B C
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Figura Anexo 3. A Crecimiento en reactor en los que se observa sólo blastosporas B. Medio con blastosporas y micelio hacia el final del tiempo de crecimiento.
A B
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A B
C
Figura Anexo 4. A. Montaje de filtración B. Blastosporas retenidas C. Medio antes y después de filtrar (Tratamiento en Shaker)
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A
B
Figura Anexo 5. A. Sonicador y parámetros utilizados. B. Muestras luego de sonicar
B
A
Figura Anexo 6. A. Pre tratamiento de bolsa de diálisis con Cloruro de calcio. B. Muestras luego de la precipitación con sulfato de amonio.
BA
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Registro fotográfico: Producto
Figura Anexo 7. Producto terminado
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Anexo 4
Curvas de calibración
y = 0,7182x - 0,0109 R² = 0,9895
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ab
sorb
anci
a (5
95
nm
)
Concentración (mg/ml)
y = 0,0079x + 0,4622 R² = 0,9548
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0 10 20 30 40 50 60
Ab
sorb
anci
a (5
95
nm
)
Concentración (mg/ml)
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Anexo 5
Tipo de agitador
Figura Anexo 6. Agitador utilizado: Impulsor flujo axial, tipo Down-pumping and Up-pumping.