Estudio de la proteína mitocondrial VDAC de Rhipicephalus microplus y su posible función durante la infección con Babesia

1Rodríguez Hernández Elba, 2Mosqueda Gualito Juan Joel, 1Camacho Nuez Minerva*.1Posgrado en Ciencias Genómicas, Universidad Autónoma de la Ciudad de México, México D.F.;

2Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro, Querétaro, México. *mcamachonuez@yahoo.com.mx

ResumenEl vector Rhipicephalus microplus transmite parásitos del géneroBabesia a su hospedero bovino. El estudio de los eventosmoleculares en la interacción garrapata-Babesia permitirádesarrollar nuevos métodos de control de la transmisión delparásito. Mediante herramientas proteómicas identificamos unaproteína intestinal de la garrapata que interacciona con fasessexuales de Babesia bigemina. Esta proteína tiene un alto gradode identidad con el Canal de Aniones Dependiente de Voltaje(VDAC). En este trabajo se describe la caracterización molecularde esta proteína la cual podría estar participando en el proceso deinfección de Babesia al intestino del vector.

ObjetivoCaracterizar la proteína VDAC del intestino de la garrapata queinteracciona con el protozoario Babesia bigemina.

Resultados

ConclusionesLa secuencia parcial del gen vdac de R. microplus fue reportadoen la base de datos de genes (No. de acceso GU994210).

La proteína recombinante fue identificada mediante western blotusando anticuerpos contra tag de histidinas.

El gen vdac disminuye su expresión a las 24 hrs post-repleciónuna con respecto al nivel de expresión a las 48 hrs; y a las 72 hrspost-repleción no se detecta transcrito en ninguna de lascondiciones analizadas.

Agradecemos al CONACYT (No. 7892) y a la UACM (No.7D83023005) por el apoyo financiero otorgado a este proyecto.

Bibliografía1. Snelson J.T. 1975. Animal ectoparasites and disease vector causing major reduction in worldfood supplies. FAO Plant Protection Bulleton, 13: 103-114.2. Purnell R. E. 1981. Babesiosis in various hosts. In “babesiosis”. Ristic, M and Kreir, J .P. Ed.New York U.S.A. Academic Press. 25-32.3. Bock R., Jackson L., De Vos A., Jorgensen W. 2004. Babesiosis of cattle. Parasitol. 129:s247-s269.4. Rodríguez Hernández Elba. 2009. Análisis e identificación de proteínas de las células deintestino de Rhipicephalus microplus que interaccionan específicamente con fases sexualesde Babesia bigemina; agente causal de babesiosis. Tesis de Maestría.

Figura 1. Análisis bioinformático de la proteína VDAC. A) Alineamiento múltiple de losaminoácidos de la proteína VDAC; en asteriscos se muestran los aminoácidos determinantespara entrada de voltaje y en rectángulos se muestran los aminoácidos importantes para laInterface de dimerización. B) Predicción de la estructura terciaria de la proteína VDAC de R.microplus, mediante el programa Swiss Model.

Figura 2. Inducción de la proteína recombinante VDAC. A) Extractos proteicos de E. coliinducidos con IPTG 1 mM, separados en un gel SDS-PAGE al 12%, teñidos con Azul deCoomassie, Carriles: 1 Marcadores de peso molecular (kDa); extractos proteícos de E.coli, Carriles: 2 y 3 pCold-vdac, 4 y 5 pCold vacío, 6 y 7 pCold-ChuA, control de inducción.B) Western blot de un gel espejo con los mismos extractos proteicos que A, lainmunodetección de VDACr usando anticuerpos anti tag-His. Las flechas indican laproteína VDACr de 25 kDa.

Tabla 1. Resultado de la búsqueda en la base de datos MASCOT. La proteína se identificó porespectrometría de masas LC/MS/MS. Los péptidos obtenidos de la secuenciación tuvieron unacobertura de identidad del 33% con la secuencia VDAC de la garrapata Ixodes scapularis.

Introducción Las garrapatas son ectoparásitos que se alimentan de sangre ytransmiten enfermedades tanto a humanos como a animales; entrelas enfermedades que transmiten se encuentran la anaplasmosis y lababesiosis bovina (1), esta última es una enfermedad causada porparásitos intraeritrocíticos del género Babesia, que son transmitidos asu hospedero bovino por garrapatas Rhipicephalus microplus (2). Elciclo biológico de Babesia es complejo e incluye fases asexuales ysexuales en el bovino y en la garrapata, respectivamente (3). Lainvestigación sobre la interacción molecular entre los órganos de lagarrapata y las fases infectantes de Babesia es importante paraimplementar estrategias que ayuden a controlar la transmisión delparásito, y por lo tanto erradicar la enfermedad. Sin embargo; hastael momento no existen muchos reportes del estudio de la interaccióna nivel molecular entre el vector y los patógenos que transmite.Recientemente identificamos una proteína (porina) del intestino de lagarrapata que interacciona con fases sexuales de Babesia (4), la cualpodría ser importante en el proceso de infección de Babesia alintestino del vector.

Proteínaidentificada

Peso molecularteórico (kDa)

Organismo y No. deacceso

Punto isoeléctricoteórico (pl)

Cobertura deidentificación(%)

Canal selectivo deanionesdependiente devoltaje (VDAC)

30.5 Ixodes scapularisgi|241061134

8.70 33%

Figura 3. Expresión del gen vdac a diferentes tiempos en garrapatas infectadas y noinfectadas. La RT-PCR mostró : A) Amplicón del gen vdac usando los oligonucleótidosespecíficos y el cDNA de garrapatas infectadas (I) y no infectadas (NI). Carriles 1 y 2, a las24 hs post-repleción; 3 y 4, a las 48 hrs post-repleción; 5 y 6, a las 72 hrs post-repleción.B) Amplicón de pb del gen de la esterasa , control positivo de carga. C) RT- , ControlNegativo.

A B

A B

1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Esterasa

RT-

24 hrs 48 hrs 72 hrs

I NI I NI I NI

vdacA

B

C1 2 3 4 5 6