obtenciÓn de jarabes fructosados a partir de

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREYDIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURAPROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

TECNOLÓGICODE MONTERREY.

OBTENCIÓN DE JARABES FRUCTOSADOS A PARTIR DEALMIDÓN DE DOS TIPOS DE SORGO (Sorghum bicolor)

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENETER ELGRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON

ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍAPOR

BALTAZAR AGUILASOCHO LEYVA

MONTERREY, NL FEBRERO 2004

AGRADECIMIENTOS

A mis padres Baltazar y Jesús Elaine, por apoyarme en todo momento ypor demostrarme su amor y cariño.

A mis abuelos, Pedro y Camerina, y Enedina, por ser ejemplos a seguir ypor el cariño que siempre me han profesado.

A mis hermanas Elayne y Aime por quererme y hacerme sentir muy bienen todo momento.

A toda mi familia por mantenernos unidos y así sentirme apoyado yquerido por todos.

A mis amigos de Monterrey, Chuy, Beno y Edgardo (menos por mandil) ya mis amigos de Sinaloa, Juanpe, Nelson, Francisco, Chuy, Alfredo yCampeón por ayudarme a salir de la monotonía de la escuela.

A mis amigos de Sinaloa, Juanpe, Nelson, Francisco, Chuy, Alfredo yCampeón por apoyarme.

A Reelena y Miguel, por brindarme su amistad y ayudarme a hacer masplacentera mi estancia en Monterrey.

A mis compañeros de maestría: Alex, Jorge, Helena, Nidia, Osear y Benito,por su colaboración y disposición en los momentos en los que los necesité,además por hacerme agradable y más digerible la maestría.

Al Dr. Mario Álvarez por su tiempo, disposición y su GRAN apoyo en latesis, además de su gran optimismo en los momentos más difíciles de lamaestría.

Al Dr. Sergio Serna por permitirme trabajar con el.

A la Dra. Rebeca Romero y a la rng. Clara Domínguez, por su aporte en elanálisis de los resultados estadísticos.

índice

ÍNDICEPágina

Abreviaturas i

índice de figuras ii

índice de tablas iv

1. INTRODUCCIÓN 1

2. LITERATURA REVISADA 42.1 Almidón 4

2.1.1 Propiedades fisicoquímicas del almidón 52.1.2 Estructura de almidones 62.1.3 Sorgo 72.1.4 Almidón de sorgo 10

2.2 Fuentes de obtención de almidón 112.3 Proceso de obtención de almidón 142.4 Calidad de los almidones 152.5 Producción de jarabes 16

2.5.1 Hidrólisis acida 172.5.2 Hidrólisis enzimática 17

2.5.2.1 Licuefacción 182.5.2.2 Sacarificación 182.5.2.3 Refinación 202.5.2.4 Isomerización 20

2.6 Cinética enzimática 21

3. MATERIALES Y MÉTODOS 233.1 Materia prima 23

3.1.1 Análisis químico 243.1.2 Propiedades físicas 24

3.2 Molienda húmeda de maíz y sorgo 243.2.1 Remojo 253.2.2 Molienda 253.2.3 Separación de fracciones 263.2.4 Secado 263.2.5 Calidad de los almidones 28

3.2.5.1 Color de los almidones 283.3 Conversión enzimática de almidón a jarabes fructosados 29

3.3.1 Licuefacción 303.3.2 Sacarificación 30

Índice

3.3.3 Refinación 313.3.4 Isomerización 32

3.4 Determinación de características de los jarabes 343.4.1 Contenido de glucosa 343.4.2 Grados Brix 353.4.3 Color del jarabe 35

3.5 Modelación 353.5.1 Modelación sacarificación 353.5.2 Modelación en isomerización 36

3.6 Análisis estadístico para los datos experimentales 37

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 384.1 Análisis químico proximal de los granos. 384.2 Análisis de propiedades físicas de los granos 394.3 Rendimiento de fracciones de molienda húmeda 40

4.3.1 Grado de refinación de los almidones 424.3.1.1 Contenido de proteína del almidón 434.3.1.2 Contenido de ceniza del almidón 454.3.1.3 Color de los almidones 45

4.4 Conversión enzimática de almidón a jarabes finctosados 464.4.1 Licuefacción 474.4.2 Sacarificación 484.4.3 Refinación 59

4.4.3.1 Centrifugación 594.4.3.2 Filtrado secuencial a través de columnas de carbón

activado, resina aniónica y resina catiónica 604.4.4 Isomerisación 614.4.5 Concentración 67

4.5 Rendimientos globales 68

5. CONCLUSIONES 70

6. RESUMEN 73

7. BIBLIOGRAFÍA 76

8. ANEXO 81

Abreviaturas

ABREVIATURAS

A.A.C.C American Associaton of Cereal (Asociación Americana deQuímicos de cereales).

A.O.A.C Association of Official Analytical Chemists ( AsociaciónAmericana de Químicos Analíticos)

ELN Extracto Libre de Nitrógeno

% Porciento

gr/cm3 Gramos por centímetro cúbico

mg/ml miligramo por mililitro

°C Grados Centígrados

ITESM Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

cm Centímetros

Kg Kilogramo

Desv. Estandar Desviación estándar

I Litro

hrs Horas

mI Mililitros

min Minutos

rpm Revoluciones por minuto

ml/min Mililitro por minuto

nm Nanometros

Kg/HL Kilogramos por hectolitro

i

índice de figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructuras de glucosas unidas por enlaces glucosídicos a-l,4 y a-l,6 7

Figura 2. Moléculas de almidón con posibles hidrólisis llevadas acabo por las enzimas a-amilasa, B-amilasa, pululanasa yamiloglucosidasa 19

Figura 3. Estructura de glucosa y fructosa 21

Figura 4. Diagrama de flujo del proceso experimental de moliendahúmeda o refinación de almidón 27

Figura 5. Gráfica de color de CIELAB en tres planos (L, a, y b). Elvalor de L* se representa en el eje central. Los ejes a* y b* aparecensobre el plano horizontal 29

Figura 6. Gráfica de color de CIELAB en 2 planos (a y b) 29

Figura 7. Diagrama de flujo para la obtención de jarabes fructosadosa partir de almidón 33

Figura 8. Curvas estándar de correlación absorbancia-concentraciónde glucosa 34

Figura 9. Curva de conversión a glucosa de almidones de maíz, sorgoceroso y sorgo normal previamente licuificados 50

Figura 10. Comparación entre curva obtenida experimentalmente enla sacarificación de almidón de maíz y la curva ajustada porsimulación matemática 51

Figura 11. Comparación entre curva obtenida experimentalmente enla sacarificación de almidón de sorgo ceroso y la curva ajustada porsimulación matemática 51

Figura 12. Comparación entre curva obtenida experimentalmente enla sacarificación de almidón de sorgo normal y la curva ajustada porsimulación matemática 52

ii

índice de figuras

Figura 13. Curvas logísticas ajustadas a cada una de lasconcentraciones de glucosa para maíz, sorgo ARG1 y sorgo 631.ARG 1 significa sorgo ceroso y 631 significa sorgo normal 55

Figura 14. Jarabes después de la sacarificación: los tres primerosfrascos son de sorgo normal, seguidos por tres de maíz y tres desorgo ceroso. La nubosidad observada son dextrinas que no alcanzana ser hidrolizadas a glucosa 59

Figura 15. Jarabes glucosados refinados después de pasar porcentrifugación, carbón activado, resina aniónica y resina catiónica 60

Figura 16. Disminución de la concentración de glucosa con respectoal tiempo durante la reacción de isomerización. Las curvas indicanpromedios para jarabes de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal 62

Figura 17. Comparación entre resultados experimentales de ladisminución de glucosa en la isomerización de maíz y la curvaajustada por modelación matemática 63

Figura 18. Comparación entre resultados experimentales de ladisminución de glucosa en la isomerización de sorgo ceroso y lacurva ajustada por modelación matemática 64

Figura 19. Comparación entre curva obtenida experimentalmente dela disminución de glucosa en la isomerización de sorgo normal y lacurva ajustada por modelación matemática 64

Figura 20. Curvas exponenciales ajustadas a cada una de lasconcentraciones de fructosa para maíz, sorgo ceroso y sorgo normal 66

iii

índice de tablas

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Análisis químico proximal de maíz, sorgo ceroso y sorgonormal 38

Tabla 2. Propiedades físicas de maíz, sorgo normal y sorgo ceroso 40

Tabla 3. Efecto del tipo de grano en los rendimientos de fraccionesde molienda húmeda para maíz, sorgo ceroso y sorgo normal 42

Tabla 4. Efecto del tipo de grano en el contenido de proteína ycenizas en almidones 43

Tabla 5. Color de almidones deshidratados obtenidos a partir demaíz, sorgo ceroso y sorgo normal 46

Tabla 6. Concentración final promedio de glucosa en jarabes,obtenido de los diferentes tipos de almidón, y porcentaje total deconversión de almidón a glucosa 49

Tabla 7. Parámetros cinéticos obtenidos de la modelaciónmatemática a través de la ecuación de Michaelis Menten en lasacarificación de dextrinas de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal 53

Tabla 8. Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento(glucosa) con el modelo Logístico y(t) = a /(1 + bie "ci t) donde a esla concentración máxima, b es la concentración inicial y c es la tasade crecimiento 56

Tabla 9. Concentración final de glucosa obtenida en sacarificación.Valores calculados de manera experimental y a través de lasmodelaciones matemáticas de Michaelis Menten y logístico 57

Tabla 10. Velocidades de conversión en sacarificación obtenidas delas modelaciones de las cinéticas promedio para cada tipo de grano 58

Tabla 11. Color de los jarabes de glucosa obtenidos a partir de losdiferentes tipos de almidones 58

Tabla 12. Concentraciones iniciales de sustrato, finales de productosy conversión para la reacción de isomerización de jarabes glucosadosde maíz, sorgo ceroso y sorgo normal 61

iv

índice de tablas

Tabla 13. Parámetros cinéticos obtenidos de la modelaciónmatemática a través de la ecuación de Michaelis Menten en laisomerización de jarabes glucosados de maíz, sorgo ceroso y sorgonormal 65

Tabla 14. Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento(fructosa) con el modelo Exponencial y(t) = a* ((B*t) donde a es laconcentración inicial al tiempo cero y (3 es la tasa de cambio 66

V

Introducción

1. INTRODUCCIÓN

Del total de granos y tubérculos producidos en el mundo solo el 1.3% esprocesado para la obtención de almidón. El maíz representa la fuente del85% de la producción de almidón esto debido a sus bajos costos deproducción, su alto contenido de este carbohidrato y valor de lossubproductos (germen, gluten y salvado), sin embargo, se a considerado alsorgo (Sorghum bicolor L Moench) granífero como una fuente alternativade almidón debido a que tiene características similares al maíz y por su más

bajo costo comparativo. La producción de sorgo en países industrializadosse ha canalizado principalmente al a producción de alimentos balanceadospara animales.

En México, el cultivo de sorgo no se conocía antes de la primera mitad de

la década de los 50's, pero hoy en día es el segundo cultivo en importanciaen términos de producción total, después del maíz y representa un tercio dela producción total de cereales. En el año 2001 se produjeron 6.5 millonesde toneladas. En tanto que en datos de la FAO (2002), el rendimiento demaíz es del orden de las 20.1 millones de toneladas métricas producidas en6.8 millones de hectáreas. México ocupa el segundo lugar en el continenteamericano en producción de sorgo antecedido solo por los Estados Unidosde América, lo que lo coloca en un papel privilegiado para el uso de estecereal para la elaboración de productos alimenticios.

Existen diferentes alternativas para la obtención de almidón tales como:

trigo, arroz, papa, sorgo, etc. El sorgo ha aumentado su potencial para laobtención de almidón gracias a nuevas variedades e híbridos los cuales

pueden adaptase mejor a este proceso.

1

introducción

En nuestros días los almidones obtenidos de la molienda de maíz sonconvertidos a una gran variedad de productos tales como: almidonesmodificados para la industria de alimentos, textil y del papel, edulcorantespara bebidas, repostería y confitería, etanol para combustible y bebidasalcohólicas para consumo humano y productos fermentados parafarmacéuticos.

El 70% de los almidones producidos son destinados a la producción deedulcorantes los cuales son principalmente jarabes glucosados yfructosados. El consumo de jarabes glucosados y fructosados se haincrementado gracias a factores como: liberación del precio del azúcar,valor nutrimental y mejores características organolépticas.

Los jarabes glucosados y fructosados son obtenidos comercialmente delalmidón de maíz a través de 2 métodos, los cuales están basados, uno en lahidrólisis acida, y el otro por conversión enzimática. Antes de los años 60los hidrolizados eran producidos por el método ácido. Sin embargo, estatecnología tenía varias desventajas tales como producciones pobres de lahidrólisis, formación de azúcares amargos, y un gusto salado en losproductos terminados. La introducción de la hidrólisis enzimática produjotecnología más específica y mas rápida, además de tener menossubproductos indeseables de degradación lo que se traduce en menospurificación y mayores rendimientos.

La obtención de jarabes fructosados consta de los siguientes pasos. Para laproducción de almidón es necesario llevar a cabo el remojo del grano,molienda húmeda, separación de fracciones, purificación del almidón y elsecado. Después de obtener el almidón se procede a:

2

Introducción

Una licuefacción donde se gelatiniza e hidroliza parcialmente el almidónpor la enzima a-amilasa a dextrinas.Una sacarificación, donde las dextrinas son convertidas a glucosa pormedio de un complejo enzimático que consta de amiloglucosidasa, que enocasiones es coadyuvada con p-amilasa y pululanasa.Un refinado donde el jarabe resultante es pasado a través de carbónactivado, resina aniónica y resina catiónica.Una isomerización donde el jarabe glucosado es convertido a jarabefructosado gracias a la acción de la enzima glucosa isomerasa (Wiseman1991).

En el presente trabajo buscamos demostrar que 2 híbridos contrastantes desorgo blanco (uno con endospermo normal y el otro con endospermoceroso) pueden ser una alternativa factible para la producción de almidón,jarabes glucosados y jarabes fructosados, sustituyendo al maíz que es lafuente que tradicionalmente se utiliza.

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Literatura Revisada

2. LITERATURA REVISADA

2.1 Almidón

El almidón es uno de los principales constituyentes de las plantassuperiores, es la forma principal en que los carbohidratos son almacenadosen organelos especiales de reserva, para que sean utilizados en lasdiferentes etapas del ciclo de vida ( Shannon y Garwood, 1984). En formaabundante se encuentran en semillas, raíces y tubérculos. Es el únicopolisacárido que se produce en pequeños paquetes llamados granulos(Whistler y Daniels, 1985), los cuales se desarrollan durante el crecimientoy maduración de la planta en organelos intracelulares llamados plástídos.

Las mutaciones afectan el desarrollo de la semilla, el desarrollo ymorfología del granulo de almidón, así como su composición depolisacárido. De esas mutaciones genéticas, la que tiene importancia para eltrabajo es la del gen ceroso (wx). Este gen ha sido identificado tanto en elmaíz como en sorgo, arroz y cebada. Estos imitantes producen granulos dealmidón en el endospermo y el polen los cuales contienen cerca del 100%de amilopectina (Shannon y Garwood 1984). La apariencia del grano y delos granulos de almidón es similar al de los de sus contrapartes normales,sin embargo, sus propiedades físico-químicas, viscoamilográficas yTeológicas o de comportamiento son muy diferentes. Esta diferencia enpropiedades se debe fundamentalmente al contenido de amilosa.

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Literatura Revisada

2.1.1 Propiedades fisicoquímicas del almidón

Cambios en la estructura del almidón tales como propiedades de fusión, elgelatinizado o la fragmentación son afectados por varios factores talescomo: la relación agua-almidón, la temperatura, la velocidad decalentamiento, la morfología, la relación amilosa-amilopectina, distribucióny tamaño del granulo, y por la adición de algunas sustancias químicas tales:azúcar, sal, proteínas, lípidos y otras. Viéndose afectados a su vez, elcomportamiento de las propiedades viscoelásticas de los almidones (Kokinet al 1992).

De las propiedades fisicoquímicas de los almidones, la gelatinización y laviscosidad son dos de las más importantes; debido a que en base a ellaspuede determinarse tanto la fuente de almidón como la aplicabilidadindustrial del mismo.

En su forma nativa, los granulos de almidón contienen una cantidadsignificativa de agua (10-12%) y presentan las siguientes características:son insolubles en agua fría, se hinchan en forma reversible con agua atemperaturas por debajo de su temperatura inicial de gelatinización,desvían el plano de luz polarizada mostrando birrefringencia y sonrelativamente inaccesibles al ataque enzimático (Serna-Saldivar y Rooney,1995). La cantidad y distribución del agua dentro del granulo de almidón esimportante con respecto a las propiedades físicas y a las reaccionesquímicas del almidón. Un hinchamiento irreversible de los granulos dealmidón ocurre cuando estos son calentados por arriba de su temperatura degelatinización. Cada granulo sufre este fenómeno de manera diferente,reflejándose así diferencias en la organización molecular dentro del granulo(Kokini et al 1992).

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Literatura Revisada

Watson citado por Rooney et al (1980) menciona que la temperatura degelatinización para los almidones de sorgo con endospemio normal y conendospermo ceroso fluctúa entre 66 y 77 °C. Debido a la importancia deesta propiedad fisicoquímica, para la medición del perfil de viscosidaddurante el calentamiento se han desarrollado diferentes metodologías. Deestas una de las más ampliamente utilizadas es el viscoamilograma.

El uso de almidones ha revolucionado la industria de los alimentosprocesados permitiendo, con base en sus propiedades y composición, laproducción de una gama de alimentos e ingredientes muy amplia y variada.Los almidones de maíz y sorgo no modificados, forman una pasta viscosa,compacta y opaca que se transforma en un gel rígido. Son empleados comoespesantes de salsas, gravies, aderezos, pudines y rellenos para pasteles.Por otro lado, los almidones cerosos, tanto de maíz como de sorgo, sonusados en alimentos donde es deseable una alta capacidad de atrapamientode agua, claridad en la pasta o en el gel y una buena resistencia a laretrogradación, como por ejemplo en sopas preparadas y en alimentoscongelados por la propiedad de no presentar sinéresis.

2.1.2 Estructura de almidones

Los almidones cerosos contienen 100% de amilopectina, mientras que losalmidones normales, tanto de endospermo corneo como harinososcontienen 75% de amilopectina y 25% de anulosa (Palmer, 1992).

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Literatura Revisada

La anulosa consta de cadenas lineales de unidades de glucosa unidas porenlaces glucosídicos a-1,4 y la amilopectina de cadenas ramificadas deglucosa unidas por enlaces a-1,4 y a-1,6.

Figura 1. Estructuras de glucosas unidas por enlaces glucosídicos a-1,4 ya-1,6 (Miralbes, 2003).

2.1.3 Sorgo

Los sorgos constituyen un gran número de plantas incluidas en el génerosorghum de la familia de las gramíneas que tienen diversas aplicaciones yuna característica en común, su resistencia al calor y a la sequía, que hahecho que fueran conocidos y cultivados - principalmente los productoresde grano- desde varios miles de años antes de la era cristiana (Ibar Albina,1984).

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Literatura Revisada

Por su aplicación pueden clasificarse en 4 grandes grupos: sorgos degranífero, sorgos dulces, sorgos escoberos y sorgos forrajeros.

Los sorgos granífero son los más extendidos por el mundo y pertenecen a laespecie Soghum bicolor, de la que existen numerosas variedades e híbridos.Se emplean para explotar a sus cariópsides y hasta cierto punto comoforraje. Los sorgos dulces pertenecen a la variedad Saccharatum delSorghwn vulgare y se caracterizan por contener, en sus tallos, un jugoazucarado, del que una ves extraído por trituración y prensado de lasplantas, se obtiene un zumo, que después de ser concentrado por calor, dalugar a un jarabe, que se consume como edulcorante en los Estados Unidos.Estos sorgos también se ensilan para producir forraje nutritivo y palatablede alto valor. Los sorgos escoberos o de espiga (Sorghum vulgare, variedadtechnicum) se caracterizan por tener inflorescencias (panículas) muyanchas y provistas de ramificaciones largas y flexibles, que se empleanpara la confección de escobas. Finalmente los sorgos forrajeros pertenecena distintas especies, variedades e híbridos del genero Sorghum, algunasvariedades ya citadas (sorgo dulce y sorgo gramífero) y otras másimportantes como pasto del Sudán (Sorghum sudanensé), pasto de Túnez(Sorghum virgatum), sorgo de Alepo, hierba de Johnson (Sorghumhalepensé) y el sorgo negro (Sorghum alimum).

El sorgo granífero (Sorghum bicolor L. Moench) es un cereal cuyacaracterística de resistir a la sequía y adaptarse a ecosistemas secostropicales y subtropicales en todo el mundo lo hacen único y constituyen elalimento básico de millones de personas en los continentes Africano yAsiático (Serna-Saldivar y Rooney, 1995). Como otros cereales es unaincomparable fuente de almidón y proteína, que puede procesarse de muy

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Literatura Revisada

diversas maneras para generar una amplia gama de productosindustrializados (Palmer, 1992).

El sorgo, al igual que otros cereales, es una excelente fuente de almidón yproteína y puede procesarse para obtener almidón, harina, grits y hojuelas(Palmer 1992). El grano de sorgo se considera una cariópside desnuda,aunque algunos tipos africanos retienen sus glumas después de la cosecha.Los granos difieren ampliamente en tamaño o peso (3-80 mg), varían de68.5-76.0 Kg/HL, y densidad (1.15-1.38 g/cm3). Los sorgos comerciales enEstados Unidos son generalmente de 4 mm de longitud, 2 mm de ancho, y2.5 mm de grosor, un peso de grano de 25-35 mg, 72.3-74.8 Kg/HL, ydensidades que varían de 1.28-1.36 g/cm3. Las cariópsides consisten de 3componentes anatómicos distintivos: pericarpio (capa más externa),endospermo (tejido de almacenamiento secundario) y germen (tejido dealmacenamiento primario) (Sema-Saldivar y Rooney, 1995). El pericarpioy la testa del sorgo tienen importantes aplicaciones en el proceso dealimentos debido a su contenido variable de polifenoles y grosor.

El color de los granos varía desde el rojo, negro-púrpura y café a beige,amarillo, blanco o crema. Algunas variedades de sorgo no retienen su testadurante el desarrollo. Sin embargo, cuando esta presente, la testa puedecontener altos niveles de materiales fenólicos.

Los compuestos fenólicos de la testa pigmentada provocan coloresobscuros en los productos integrales o preparados a partir de grano entero.El proceso del sorgo esta muy influenciado por las cantidades decompuestos fenólicos del grano lo cual puede inhibir enzimas, causarastringencia y colores indeseables en los productos terminados (Palmer,1992).

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Literatura Revisada

El endospermo es el tejido presente en mayor cantidad en los granos, estáformado por la capa de aleurona y el tejido almidonóse, este último constade los granulos de almidón, proteínas de reserva (prolaminas y glutelinas) yuna pared celular la cual delinea las células del endospermo. Puede ser detextura suave o harinosa, intermedia donde la parte exterior es comea y lainterior harinosa o de textura dura, córnea o vitrea. Depósitos de proteínaen el endospermo tienden a formar una matriz proteica, en tanto que en elendospermo córneo depósitos similares forman cuerpos proteicos queforman pequeñas identaciones en los granulos de almidón (Palmer, 1992).

2.1.4 Almidón de sorgo

Por sus características el almidón de sorgo se puede usar con los mismosfines industriales y alimenticios que el almidón de maíz ya que es muysimilar en composición y en propiedades viscoamilográficas (Watson,1984).

Del 50 al 75% del grano de sorgo es almidón. El almidón se localiza dentrode los granulos en los cuales las moléculas de anulosa y amilopectina estánunidas por puentes de hidrógeno (Rooney y Pflugfelder, 1986).

Los granulos de almidón del sorgo son de aproximadamente 10micrómetros de diámetro, contienen cerca de 75 % de amilopectina y 25 %de anulosa. Durante la germinación o malteado, los granulos presentes enel endospermo harinoso son hidrolizados más rápidamente que aquellos delendospermo córneo. Esta diferencia en los rangos de hidrólisis reflejadiferencias en la hidratación de los tejidos y en la compactación delalmidón más que diferencias en la composición química de los almidones.

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Literatura Revisada

La hidrólisis más rápida de los almidones de sorgos cerosos en contrastecon los sorgos normales se debe a que los primeros tienen una matrizproteica más débil.

Las ventajas agronómicas del sorgo sobre el maíz son, menor necesidad deagua, por sus largas raíces pues puede aprovechar mejor la humedad delsuelo a mayor profundidad. Al cesar el período de sequía, el sorgo puedeabandonar su estado de vida latente, recobrando su vitalidad normal. Paraproducir una cosecha normal de grano, tiene con el 50% del agua quenecesita el maíz (Ibar Albina, 1984). El sorgo tolera mejor que el maíz lasalinidad del suelo y por su amplia tolerancia al pH del suelo respondemejor a la aplicación de fertilizantes (Ibar Albina, 1984). Finalmente, sibien el sorgo es más resistente a los gusanos perforadores de tallo, estámás expuesto a la acción depredadora de los pájaros (Ibar Albina, 1984).

2.2 Fuentes de obtención de almidón

Uno de los usos más importantes de los cereales es como materia primapara la obtención de almidones. La industria refinadora de estecarbohidrato, también llamada de molienda húmeda, tiene como objetivoprincipal obtener el máximo rendimiento de granulos nativos o sin dañar.La industria refinadora de almidón esta dominada por pocas empresas yutiliza casi exclusivamente el grano de maíz como materia prima Más del90% del almidón comercial refinado a nivel mundial es extraído de maíz.Esto se debe a que el grano contiene una alta proporción de almidón(mayor del 70%) y principalmente al alto valor económico comercial de lossubproductos del proceso: gluten, germen y fibra (Serna-Saldivar, 1996).

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Literatura Revisada

Existen procesos diseñados y adaptados para la extracción de almidón de

otros cereales. El almidón de sorgo posee características similares al delmaíz con la ventaja de que el grano es más barato y esta disponible encantidades adecuadas en algunas regiones del mundo como África, Asia yAmérica donde las condiciones climáticas favorecen su cultivo.

La producción industrial de almidón de sorgo se realiza en algunos paísesafricanos y se practicó por algún tiempo en los Estados Unidos. Sinembargo, se descontinuó su uso en Estados Unidos por que el producto dela molienda húmeda de sorgos rojos o marrones era un almidón de colorrosa indeseable debido a que las variedades e híbridos presentaban una altacantidad de compuestos fenólicos (Serna-Saldivar, 1996). Estoscompuestos fenólicos se encuentran en la testa o cubierta de la semilla delos sorgos rojos o marrones y son considerados como factoresantinutrimentales (Serna-Saldivar, 1996). Además del color rosa per se delalmidón no es permitido en el mercado, es por esta razón, que losalmidones de sorgo deben de ser blanqueados al final del proceso derefinación. Además, la molienda húmeda de sorgo rinde menorescantidades de almidón en comparación con el maíz. Sin embargo, laspropiedades fisicoquímicas de los almidones de sorgo son casi idénticas alas del maíz (Serna-Saldivar, 1996).

Las limitaciones del sorgo como materia prima para la obtención dealmidón son:

Una capa de cera presente en el pericarpio o cubierta del fruto, la cual sedeposita naturalmente sobre la superficie del grano con el objetivo deprevenir la deshidratación de la cariópside. Esta capa de cera representaaproximadamente un 0.3% del total del grano en base seca e interfiere en el

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Literatura Revisada

proceso de refinación. La proporción de germen en el sorgo es menor quela del maíz; por lo tanto, no se obtiene tanto aceite como subproducto.

El grano de sorgo contiene un 65% de endospermo vitreo a comparacióndel maíz que tiene solo 54% (esto depende mucho de la variedad). Estorepercute en la recuperación del almidón debido a la cantidad de proteínaentrecruzada en la matriz proteica en esta región del endospermo, la cualenvuelve a los granulos de almidón (Watson, 1955).

Las cariópsides de sorgo contienen una capa adicional de endospermodenominada endospermo periférico que yace debajo de la capa de aleurona.Esta capa de células contiene mucha proteína altamente entrecruzada y estodificulta la penetración de la solución de remojo involucrada en lamolienda húmeda además de que estas células contaminan al almidón(Wall y Paulis, 1978).

El sorgo de pericarpio grueso contiene de 3 a 4% de almidón en elmesocarpio. El mesocarpio es removido al separar la fibra en la obtencióndel almidón de molienda y consecuentemente se pierde ese almidón. Y porúltimo el tamaño más pequeño de la cariópside de sorgo en comparacióncon el maíz dificulta su molienda.

Los sorgos blancos de endospermo suave (que contienen una menorproporción de endospermo vitreo) son candidatos importantes para laindustria de molienda húmeda ya que contienen menos cantidad decompuestos fenólicos y el producto obtenido de la refinación presenta uncolor blanco. Se prefiere que las cariópsides tengan poca proporción deendospermo vitreo para facilitar el desprendimiento de los granulos delalmidón de la matriz proteica. Sin embargo, las proteínas de la matriz

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Literatura Revisada

proteica del endospermo de sorgo se encuentra más entrecruzadas que lasproteínas de la matriz proteica del endospermo de maíz, obteniéndosemenos rendimientos de almidón de primera (Moheno et al 1999).

Los almidones de arroz (intervalo de gelatinización de 68-77°C), trigo (58-64°C), papa (61°C) y tapioca (59°C), tienen propiedadesviscoamilográficas distintas a la de los almidones de maíz y de sorgo, porlo que ocupan otro lugar específico en el mercado (Hoseney, 1994).

2.3 Proceso de obtención de almidón

El proceso de molienda húmeda del sorgo tiene los mismos principios queel de maíz (Rooney y Serna-Saldivar, 1991, Watson, 1984). El sorgo puedeser usado como materia prima en países donde su precio es más bajo comoes el caso de México. Este procedimiento consiste en un remojo inicial delos granos en una solución de dióxido de azufre con el objetivo desuavizarlos, posteriormente son molidos y el almidón es separado delgluten y otras impurezas por filtración, centrifugación e hidroclones.

En los granos de maíz, los granulos de almidón dentro de las células delendospermo se encuentran incrustados dentro de una matriz proteica. Estamatriz debe ser hidrolizada o modificada antes de que el almidón pueda serliberado, por lo que el dióxido de azufre es indispensable para suliberación. El dióxido de azufre al combinarse con el agua de remojo seconvierte en ácido sulfuroso que desintegra a las proteínas, mediante elrompimiento de los enlaces o puentes disulfuro. De esta manera se liberanlos granulos de almidón y consecuentemente se facilita la completaseparación del almidón y del gluten. Durante el tiempo de remojo, demanera natural hay crecimiento de microorganismos del género

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Literatura Revisada

Lacíobacillus, por lo que se incrementa el contenido de ácido láctico en la

solución de remojo el cual tiene un efecto sinergista con el dióxido de

azufre para la desintegración de las proteínas; este efecto también se puede

lograr si se adiciona el ácido láctico como un reactivo químico a la soluciónde remojo (Moheno et al 1999).

Durante la etapa de remojo, el grano absorbe gradualmente agua hasta

llegar a un contenido de humedad de 45-50%, permitiendo fácilmente laseparación del germen, la fibra, el gluten y el almidón.

2.4 Calidad de los almidones

Los parámetros utilizados para asignarle calidad al almidón son varios,

incluyendo su pureza y sus propiedades viscoamilograficas (que no seencuentre dañado el almidón por calor o hidrólisis enzimática). La pureza

del almidón o su grado de refinación, se mide determinando la presencia de

proteína y cenizas. La cantidad de proteína no debe de pasar de 0.35% en

base seca. La cantidad de proteína presente refleja la separación eficientede la matriz y cuerpos proteicos de los granulos (Serna Saldivar, 1996). La

cantidad de cenizas no debe sobrepasar 0.3% en base seca (Moheno et al

1999). Las cenizas presentes en el almidón indican la presencia decontaminantes inorgánicos originalmente presentes en el pericarpio y

germen.

Las propiedades viscoamilograficas de almidón corresponden a su huella

digital y reflejan si hubo dafío durante el proceso de molienda húmeda. Siun almidón supuestamente nativo no genera un viscoamilograma propio de

su fuente, entonces este almidón se daño mecánicamente, enzimáticamenteo térmicamente durante la extracción y es en términos prácticos inservible

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Literatura Revisada

para las industrias. Las temperaturas de secado de la fracción de almidónademás de la temperatura generada durante la etapa de remojo y demásetapas de la molienda deben ser monitoreadas cuidadosamente para evitarla temprana pre-gelatinización del almidón.

2.5 Producción de jarabes

El almidón es principalmente la base para la elaboración de jarabes oedulcorantes glucosados y fructosados que cada día son más utilizados ydemandados por las industrias alimentarias. Esta transformación se basa enla hidrólisis de las cadenas de anulosa y amilopectina por medio deenzimas o tratamiento ácido con la posterior transformación de la glucosa afructosa por medio de un sistema enzimático llamado glucosa isomerasa(Serna-Saldivar, 1996). Tradicionalmente los jarabes glucosados seobtenían por hidrólisis acida, pero por este método no era posible alcanzaruna concentración de glucosa alta sin que aparecieran saboresdesagradables. La a-amilasa y la glucoamilasa (amiloglucosidasa) son lasenzimas más usadas en la industria de almidón, siendo ademásrelativamente baratas (Wiseman, 1991).

Se considera jarabe glucosado a la solución acuosa concentrada desacáridos con un valor de equivalentes de dextrosa de 20 o mayor(Pomeranz, 1985), obtenido por hidrólisis de almidón comestible. Losequivalentes de dextrosa son un indicador de el total de azúcares reductorescalculados como D-glucosa en base seca, esta inversamente relacionadocon el grado de polimerización (Lloyd y Nelson, 1984).

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Literatura Revisada

2.5.1 Hidrólisis acida

La hidrólisis acida rompe los enlaces a-1,4 y a-1,6 al azar, debido a que elácido no tiene especificidad. La hidrólisis propicia otras reaccionesindeseables como lo es la generación de metilfurfural que cambianegativamente el color y sabor del jarabe (Lloyd y Nelson, 1984). Esta selleva a cabo en una suspensión de 35-40% de almidón en una solucióndébil de ácido clorhídrico (0. 02-0.2 N) calentando a 150 °C en un reactorpresurizado por 15 a 20 minutos hasta alcanzar los grados de dextrosadeseados (Serna-Saldivar, 1996).

2.5.2 Hidrólisis enzimática

La hidrólisis enzimática del almidón es más específica que la hidrólisisacida para la producción de jarabes glucosados, minimiza la aparición desabores y colores desagradables, así como la formación de productosindeseables de degradación. Requiere el uso secuencia! de las enzimas a-amilasa y amiloglucosidasa para obtener el jarabe glucosado y de la enzimaglucosa isomeraza para convertir el jarabe glucosado en jarabe fructosado.El almidón debe solubilizarce antes de llevar a cabo su hidrólisis esto selogra calentando la pasta de almidón hasta que los granulos gelatinizen ysolubilizen (Wiseman, 1991).

Para obtener jarabes fructosados es necesario llevar a cabo los siguientespasos: licuefacción, sacarificación, refinado e isomerización.

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Literatura Revisada

2.5.2.1 Licuefacción

Actualmente la industria utiliza preferentemente a la a-amilasatermoestable derivada de Bacillus licheniformis puesto que puede catalizarla reacción hasta temperaturas de 105°C. De esta manera se puede lograr lalicuefacción del almidón en cortos periodos de tiempo hasta alcanzar 10 a15 equivalentes de dextrosa. Después de la gelatinización la a-amilasacontinua la acción durante algunas horas a 95 °C hidrolizando enlaces a-1,4 al azar en la anulosa y la amilopectina, dando productos de bajo pesomolecular, solubles y menos viscosos, cuya ruptura esta limitada por lapresencia de los enlaces glucosídicos a-1,6 en los puntos de ramificaciónde la molécula del almidón nativo (Wiseman, 1991).

El proceso industrial consiste en tratar una suspensión de 30 a 40% dealmidón en agua agregando 5 ppm calcio con a-amilasa a un pH de 6 y unatemperatura de 80 a 110 °C por 90 minutos (Wiseman, 1991). El almidónes gelatinizado y depolimerizado a un fluido de fácil manejo. Una variantedel proceso es calentar hasta 120-180 °C para gelatinizar y después agregara-amilasa bajando la temperatura a 90-105 °C durante 1 a 3 horas hastaalcanzar 15-20 equivalentes de dextrosa (Lloyd y Nelson, 1984).

2.5.2.2 Sacarificación

La amiloglucosidasa cataliza la etapa de hidrólisis de los enlaces a-1,4 delalmidón y los oligosacáridos, liberando extremos de glucosa a partir delextremo no reductor de la cadena. Los enlaces a-1,6 también se hidrolizanpero más lentamente hasta producir jarabes con casi 100% de glucosa. Elalmidón licuificado con 28-30 de sólidos, se ajusta a un pH de 4 - 4.5 y secalienta a 60°C, se agrega la suficiente amiloglucosidasa para alcanzar el

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Literatura Revisada

nivel deseado de glucosa en 24-96 horas (Wiseman, 1991). Debido a labaja velocidad de hidrólisis de enlaces a-1,6 se ha propuesto el usocombinado de amiloglucosidasa y la enzima desramificante pululunasa oisoamilasa, logrando aumentos en el contenido de glucosa a pesar de llevara cabo la reacción a un pH 5.5-6, en el que la amiloglucosidasa es menosactiva (Wiseman, 1991). También es utilizada P-amilasa para producirunidades de maltosas.

Figura 2. Moléculas de almidón con posibles hidrólisis llevadas a cabo porlas enzimas a-amilasa, P-amilasa, pululanasa y amiloglucosidasa (Miralbes2003).

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Literatura Revisada

2.5.2.3 Refinación

Los jarabes resultantes de la conversión acida, ácida-enzimática oenzimática son refinados y clarificados con el objetivo de remover cenizas,pigmentos, proteína soluble, grasa insoluble y almidón resistente al ataqueenzimático. Esto es logrado mediante procesos de centrifugación integradosa un sistema de paso através de filtros con carbón activado y resinasiónicas (Serna-Saldivar, 1996). Para la clarificación se remueven trazas degrasa, proteína y dextrinas por centrifugación, posteriormente a este paso seutilizan columnas con carbón activado y resinas de intercambio iónico pararemover impurezas tales como pigmentos, precursores de color y materialproteico (Hebeda, 1987).

2.5.2.4 Isomerización

Si se convierte glucosa en fructosa, el producto aumenta su dulzura y enconsecuencia su valor. Una forma de llevar a cabo esto es la isomerizaciónalcalina, aunque esta técnica produce un color excesivo y demasiadossubproductos. La glucosa isomeraza es una enzima que isomeriza laglucosa a concentraciones elevadas, dando lugar a jarabes de maíz ricos enfructosa, este procedimiento es el que más enzima inmovilizada consumemundialmente y su producción de jarabes alcanza varios millones detoneladas por año. Esta enzima es apta para utilizarse en formainmovilizada puesto que es intracelular, es estable a temperaturas elevadas,suficientes para frenar la contaminación microbiana, y porque todos losreactantes son moléculas pequeñas de forma que plantean pocos problemasde difusión. Para activar la enzima es necesario añadir trazas de magnesio,en forma de sulfato. Los iones magnesio sufren la competencia de los ionescalcio, por lo que su concentración debe ser de aproximadamente 20 veces

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Literatura Revisada

mayor que la de calcio. La mayoría de los jarabes ricos en fructosamanufacturados en la actualidad, se fabrican utilizando preparaciones de laempresa Novozyme de células enteras de Bacillus coagulans (Wiseman,1991).

La glucosa isomerasa asociada con las células de Bacillus coagulans sesepara por centrifugación del medio de cultivo, se entrecruza conglutaraldehído, se rompe en pequeñas partículas y se seca para mejorar laresistencia mecánica de los granulos. La enzima inmovilizada se emplea enreactores en columna a una temperatura de 60°C para producir jarabes quecontienen aproximadamente 42-43% en peso de fructosa y una intensidadde color bajo (Wiseman, 1991).

Hj_j Isomerización

OH

OH

ot- Glucosa

Figura 3. Estructura de glucosa y fructosa (Miralbes 2003)

2.6 Cinética enzimática

Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque se aumente laconcentración de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, es deciraparece un efecto de saturación. La saturación se debe a que todos los

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Literatura Revisada

centros activos están ocupados. La velocidad depende de la cantidad de

enzima con sustrato suficiente.Dos de los parámetros más importantes dentro de las cinéticas de enzimasson la velocidad máxima (Vmax) y la constante de afinidad (Km) (Bailey,1986).

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse conrelativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislara la enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas depH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentracionessaturantes de sustrato (cuando todos los centros activos de las enzimas

están ocupados por el sustrato). En estas condiciones, la velocidad dereacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puededeterminarse bien, midiendo la aparición de los productos o la desaparicióndel sustrato. La constante de afinidad (Km) es a la concentración desustrato a la que la velocidad es 1/2 Vmax. Es una medida de la afinidad dela enzima por el sustrato. El valor de Km da idea de la afinidad del enzimapor el sustrato: a menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y amayor Km, menor afinidad (Wiseman, 1991).

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Materiales y Métodos

3. MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se llevó a cabo en dos partes. La primera tuvo como objetivo la

obtención de almidón refinado a partir de sorgo ceroso, sorgo normal y

maíz amarillo. La segunda consistió en la conversión de almidones a

jarabes glucosados y fructosados. Para llevar a cabo la segunda parte fue

necesario diseñar procesos enzimáticos para licuificar el almidón a

dextrinas, convertir las dextrinas a glucosa (sacarificación), refinar los

jarabes fructosados e isomerisar parcialmente la glucosa en fructosa.

3.1 Materia prima

Se utilizaron 2 tipos de sorgo, uno con el endospermo ceroso y otro con el

endospermo normal. El sorgo ceroso (ARG1) y el sorgo (ATX631) normal

fueron proporcionados por el programa de fitomejoramiento de la

Universidad de Texas A&M. El maíz amarillo utilizado se obtuvo de la

compañía local Agrolnsa a través del departamento de Tecnología de

Alimentos del ITESM. El maíz obtenido y seleccionado fue el típico

sembrado en el cinturón de maíz de los Estados Unidos.

Para la limpieza del grano, fue primeramente necesario remover materia de

bajo peso. Esto se hizo dejando caer el grano desde una altura de 1 metro

en oposición a una corriente de aire. Posteriormente el material se paso por

un tamiz con orificios de 0.5 cm. Una vez tamizado los granos, se

eliminaron manualmente los granos dañados, quebrados y cualquier otra

partícula ajena al maíz y/o sorgos. Los granos limpios se empacaron en

bolsas de polietileno en lotes de 1 Kg. y se almacenaron en refrigeración a

4°C (Fisher Scientific Isotemp, Conway, AR U.S.A) hasta el momento que

se inicio el proceso de molienda húmeda.

23


3.1.1 Análisis químicos

El análisis próxima! de los granos y almidones se llevó a cabo de acuerdo a

los métodos aprobados por la A.A.C.C (1986) y la A.O.A.C (1990). La

humedad se determinó mediante el método gravimétrico 44-16 de la

A.A.C.C. La proteína se determinó a través del método MicroKjehdahl

960.52 de la A.O.A.C. Las cenizas se determinaron por el método 08-03 de

la A.A.C.C. La cantidad de grasa o extracto etéreo y la cantidad de fibra

cruda se determinaron por los métodos 32-20 y 32-10 de la A.A.C.C.,

respectivamente. Las determinaciones se hicieron por triplicado.

3.1.2 Propiedades físicas

Se sometieron a un análisis que incluyó pruebas de medición de peso de

1000 granos, peso hectolítrico y textura de endospermo. El peso

hectolítrico se determinó en el Winchester Bushel Meter de acuerdo a

métodos oficiales de E.U.A. La textura del endospermo se determinó

subjetivamente después de diseccionar 10 cariópsides y observar la

proporción de endospermo vitreo y endospermo harinoso o suave. El peso

de 1000 granos se llevó a cabo pesando 100 granos seleccionados

aleatoriamente en una balanza OHAUS Analytica Plus y el peso resultante

se multiplicó por 10.

3.2 Molienda húmeda de maíz y sorgo

La molienda húmeda a nivel laboratorio se baso en la técnica implementada

por Moheno Pérez (1994).

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3.2.1 Remojo

Se pesaron 500 gr de grano limpio de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal enbase a 14 % de humedad. Los granos se colocaron en frascos de vidrio contapadera, siendo sometidos a remojo en 1L de solución de bisulfito de sodio(ctl) y ácido láctico (DEQ S.A. de C.V.). La solución de remojo se preparódisolviendo 1.48 gr. de bisulfito de sodio y 4.7 mi de ácido láctico al 85%en 1L de agua destilada, la solución fue previamente calentada a 50°C enuna incubadora (Fisher-Scientific, Pittsburg, PA U.S.A), hasta que alcanzóesta temperatura se adicionaron los granos y se colocaron en incubación a50°C (Fisher-Scientific) por48hrs.

3.2.2 Molienda

Posterior al remojo el grano se separó en 2 porciones másicas equivalentesy se licuó a la máxima velocidad en una licuadora. Se tamizaron en unamalla 40 las 2 porciones por separado. Cada fracción que fue retenida enla malla fue lavada con 150 mi de agua destilada; el agua para el lavado fuebombeada a un flujo de 100 ml/seg (Bomba peristáltica Masterflex ColéPalmer). Las 2 fracciones retenidas en la malla se juntaron y se lavaroncon 200ml de agua destilada al mismo flujo en la malla 40.

El material que pasó la malla 40 durante todos los tamizados anteriores, setamizó a través de la malla 100 para obtener la suspensión de almidón-gluten. Después el primer tamizado se lavó el material retenido en la malla100 con 300 mi de agua destilada tal como se realizó en el primer lavado, yse unió esta fracción de lavado a la primera suspensión almidón-gluten. Elmaterial que no paso la malla se unió al retenido por la malla 40 y se secó a50 °C (Fisher-Scientific) por 24 hrs para obtener fibra. La diferencia de

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proceso entre maíz y sorgos en la molienda radicó en que para el sorgo seutilizó el doble de volumen de agua en cada tamizado.

3.2.3 Separación de fracciones

La suspensión de almidón y gluten obtenida se bombeó con un flujo delOOml/seg (Bomba peristáltica Masterflex Cole-Palmer) a través de uncanal de sedimentación para lograr separar el gluten del almidón. Paralograr la separación efectiva del almidón, el canal de sedimentación de 3mde largo se niveló y posicionó en un ángulo de 0.7 °. El almidón deprimera con mayor densidad que el gluten se sedimentó en los primeros270cm del canal y se recuperó. En los restantes 30cm se sedimentó elalmidón de segunda, y lo que salió de el canal de sedimentación fue unasolución de gluten. Para evitar pérdidas de sólidos y lograr obteneralmidones más refinados la solución que salió del canal durante losprimeros 5 min se recirculó. Después de que el total de la suspensiónalmidón-gluten fue bombeada a través de la canal se lavó el sedimentó conagua (3.5 L para sorgos y con 4.5 L para maíz). Cuando se terminó ellavado, el almidón se dejó por media hora a temperatura ambiente en lacanal para deshidratarlo parcialmente. La suspensión de gluten se dejósedimentar por 1 día para poder eliminar la mayoría de agua sobrenadantepor decantación.

3.2.4 Secado

Se secaron todas las fracciones (fibra, almidón de primera, almidón desegunda y gluten) en una estufa de aire forzado (Fisher-Scientific) a 50° Cdurante 24 hrs. Posteriormente se dejaron enfriar por 1 hr a temperaturaambiente, se pesaron en una balanza (Precisión Plus Ohaus) y se colocaron

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en bolsas de polietileno. El almidón deshidratado se refrigeró en bolsas de

polietileno a 4°C hasta su utilización y análisis.

FIBRA

SECADO 50°C

FIBRA SECA

SUSPENSIÓN DE GLUTEN

SEDIMENTACIÓNDECANTACIÓN

SECADO 50° C

GLUTEN

GRANO DE CEREALLIMPIO

500gr/14 % humedad.

FRASCO DE REMOJO

REMOJO50 °C/48 hrs.

SOLUCIÓN DEREMOJO

0.02% SO? y 0.5%ÁCIDO LÁCTICO

MOLIENDA2 min/alta velocidad

TAMIZADO Y LAVADOMalla 40 500ml/maíz y

IL/sorgoMalla 100 300ml/maíz y

600ml/soreo

SUSPENSIÓN DEALMIDÓN-GLUTEN

CANAL DE SEDIMENTACIÓN3m. de largo /0.7° de inclinación

AGUAPARALAVADO

3.5L para sorgo y 4.5Lpara maíz

ALMIDÓN DE PRIMERA270cm de la canal

ALMIDÓN DE SEGUNDA(almidón-gluten)

Últimos 30 cm. de la canal

SECADO 50° CSECADO 50° C

ALMIDÓN DE PRIMERAALMIDÓN DE SEGUNDA

Figura 4. Diagrama de flujo del proceso experimental de molienda húmedao refinación de almidón.

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3.2.5 Calidad de los almidones

El contenido de proteínas y cenizas de los almidones se tomó como basepara determinar la calidad de los mismos. La cuantifícación la proteína sedeterminó a través del método MicroKjehdahl 960.52 de la A.O.A.C.(1990). El factor de conversión de nitrógeno a proteína fue de 6.25. Lascenizas fueron cuantificadas por el método gravimétrico 08-03 de laA. A.C.C. (1986), donde las muestras fueron incineradas a 550 °C.

3.2.5.1 Color de los almidones

Para la determinación del color de los almidones se utilizó un colorímetro(Minolta CR-300) basado en el sistema de color CIÉ (Comisióninternaíionale de I'Eclairagé) con la expresión numérica de CIÉ (L*, a*,b*). Se calculó el valor de la diferencia total de color AE mediante lasiguiente ecuación (L2 + a2 + b2)1/2.

Cuando un color se expresa en CIELAB, la L define la claridad, "a" denotael valor rojo/verde y "b" el valor amarillo/azul. Las figuras 4 y 5 muestranlas gráficas de color para L, a y b. El eje "a" corre de izquierda a derecha.Una medición de color en la dirección +a muestra un desplazamiento haciael rojo. En el eje "b" un movimiento hacia +b representa un cambio hacia elamarillo. El centro del eje L muestra L=0 (negro o absorción total) en elfondo. En el centro de este plano es neutral o gris.

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Figura 5. Gráfica de color de CIELAB en tres planos (L, a, y b). El valor deL* se representa en el eje central. Los ejes a* y b* aparecen sobre el planohorizontal (X-Rite 2000).

Figura 6. Gráfica de color de CIELAB en 2 planos (a y b) (X-Rite 2000).

3.3 Conversión enzimática de almidón a jarabes fructosados

El proceso de conversión enzimática constó de cuatro partesfundamentales: 1) Licuefacción; 2) Sacarificación; 3) Refinación e 4)Isomerización. Para estos cuatro procesos se utilizó el almidón de primeraextraído del sorgo ceroso, sorgo normal y maíz.

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3.3.1 Licuefacción

El objetivo de la licuefacción fue convertir la suspensión de almidón a unasolución de dextrinas solubles. Se prepararon 500 mi de una suspensión al30 % en peso de almidón-agua en un vaso de precipitado de 1000 mi, seagregaron 5 ppm de calcio como CaO y se ajustó el pH a 5.4 con ácidoclorhídrico 0.1N. La suspensión obtenida se calentó a 70°C en baño maríacon agitación manual. Una vez que la suspensión alcanzó esta temperaturase agregó 0.23 mi de enzima a - amilasa (Termamyl Supra, Novozymes).La suspensión se llevo hasta 85° C y se dejó a esta temperatura por 2.5horas teniendo una agitación manual cada 10 min, el matraz fue cubiertocon papel aluminio para minimizar pérdidas de agua. Durante esta etapaocurrió simultáneamente la gelatinización y dextrinización del almidón.Terminado este proceso, se dejó enfriar el licuificado a temperaturaambiente hasta que fuera posible manipularse con las manos. El licuificadose tapó y se refrigeró a 4° C hasta ser utilizado.

3.3.2 Sacarificación

El volumen de licuificado se ajustó a 500 mi compensando el agua quepodía haber perdido en la licuefacción. El pH de la solución se ajustó a 4.3con ácido clorhídrico 0.1N y se calentó a 60°C en baño maría con agitaciónmanual cada 10 min. Al alcanzar los 60° C se agregaron 6 mi de uncomplejo enzimático de glucoamilasas, pululanasas y p-amilasas(Dextrozyme E, Novozyme). Esta mezcla se mantuvo así por 16 horas y setomaron muestras a las 0.5, Ihra y posteriormente cada hora hasta llegar alas 16 horas de biocatálisis. La concentración de glucosa fue cuantificadade acuerdo a la técnica de glucosa oxidasa (Villaseñor, 1997).

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3.3.3 Refinación

Se centrifugaron los jarabes resultantes a 4,000 rpm por 7 min. (centrífugaIEC centra MP4R), y los sedimentos fueron separados y descartados pordecantación.

Los jarabes después de ser centrifugados fueron pasados por gravedad através de una columna de 2.6 cm de ancho y 20 cm de largo empacada con13 cm de carbón activado en granulos de 2-3mm de diámetro (Activen G-61, PAÍS). Se filtraron los jarabes al vacío con papel filtro (Whatmannúmero 1), antes de ser pasados a través de las resinas.

Después de la filtración en carbón activado, se paso el jarabe centrifugadoprimeramente a través de una columna con resina aniónica (Diaion WA30,Supelco), la columna tenía las mismas proporciones que la del carbónactivado y fue empacada de la misma forma.

Posteriormente el jarabe semirefinado se hizo pasar a través de una resinacatiónica (Amberlite 200C, Fluka) empacada en una columna de lasmismas proporciones que las anteriores.

La activación de ambas resinas se llevó a cabo de la misma forma, como seindica a continuación. La resina se virtió en un vaso de precipitado de 500mi al cual se agregó suficiente agua destilada hasta pasar el nivel de laresina en aproximadamente 2 cm aproximadamente. Los contenidos seagitaron suavemente y se dejó reposar por 15 min. Se decantó el exceso deagua y se reemplazó por agua destilada fresca, se agitó nuevamente y sedejó reposar por 5 a 10 min. La segunda agua de lavado fue decantada yposteriormente se agregó buffer de fosfatos (DEQ S.A de C.V) con un pH

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de 6.5 asegurando que los fenólicos, en el caso de la resina aniónica, y el

calcio en el caso de la resina catiónica, estuvieran ionizados y pudieran serseparados.

3.3.4 Isomerización

La isomerización se llevó a cabo con glucosa isomeraza inmovilizada

(Sweetzyme IT, Novozyme). Se empacaron 22.3 gramos de la enzima enuna columna y se hizo fluir agua a través de la chaqueta de la columna a64.5°C para mantener la temperatura adecuada. Se colocaron lOOml dejarabe glucosado (previamente ajustado el pH a 7.5 y adicionado 20 ppm de

sulfato de magnesio (Analítica S.A de C.V)) en un vaso de precipitado el

cual a su vez se colocó en una plancha hasta que alcanzó la temperatura de

60 °C , después de alcanzada esta temperatura se bombeo el jarabe

glucosado a la columna a una razón de 1.5 ml/min, al concluir estaoperación, se midió el volumen de jarabe que salió de la columna y esta se

sustrajo a los 100 mi para conocer cantidad de jarabe que se retuvo en la

columna y tuberías. Medido el volumen se aforó a 200 mi el jarabe

fructosado.

El jarabe glucosado fue bombeado (Masterflex Microprocesor Pump) por150 min con recirculación y se tomaron muestras a los 10, 20, 40, 60, 90,

120 y 150 min para medir la cantidad de fructosa producida. Para este

propósito se utilizó el método de la glucosa oxidasa utilizado en la

sacarificación, la cantidad de fructosa se midió indirectamentecuantifícando la concentración de glucosa residual en el jarabe.

Después de obtenidos los jarabes fructosados se concentraron en un

rotavapor (Buchí) a 70°C hasta alcanzar los 70 ° Brix.

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ALMIDÓN DE PRIMERA

SUSPENSIÓN30% en peso almidón agua

LICUEFACCIÓNpH. 5.4/5ppm Ca/85°C/16 hrs

SACARIFICACIÓNpH. 4.3/60 °C/ 2.5 hrs

REFINACIÓNCentrifugación/carbón activado/resina

aniónica/resina catiónica

GLUCOSA ISOMERASAINMOVILIZADA

pH. 7.5/20ppm Mg/ 60°C

JARABE FRUCTOSADO

CONCENTRACIÓNrotavapor 70 °C

JARABE FRUCTOSADO70% sólidos

a-amilasatermorresistente

COMPLEJO ENZIMÁTICOAmiloglucosidasa,

pululanasa y p-amilasa

Figura 7. Diagrama de flujo para la obtención de jarabes rructosados apartir de almidón.

33


3.4 Determinación de características de los jarabes

3.4.1 Contenido de glucosa

Para la determinación de glucosa se utilizó el método de la glucosa oxidasa(Pipco, 2001), con el hit de ensayo de glucosa proporcionado por Sigma(número de producto GAGO-20). El método espectrofotométrico fuemontado en un instrumento Beckman DU 50, midiendo la absorbencia auna longitud de onda de 540 nm.

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R2=0.99

-̂ — •'_• i

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D 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA mg/ml

CURVA 1

CURVA 2r*i IR\/A •*

Figura 8. Curvas estándares de correlación absorbancia-concentración deglucosa.

Se obtuvo una curva estándar para correlacionar concentración de glucosacon absorbancia durante la sacarificación y la isomerización. Todas lascorrelaciones estuvieron por arriba de 0.99 y la ecuación promedioobtenida de las tres curvas fue:

= Y-0.108415.0896 Ecuación 1

donde:x = concentración de glucosay = absorbancia

34


3.4.2 Grados Brix

Los grados Brix de las muestras se midieron a temperatura ambiente con un

refractómetro manual (Sagar Brix refractometer, Sper Scientific) con una

escala de O a 80 unidades.

3.2.1.5 Color del jarabe

Para la determinación del color de los jarabes se utilizó la metodología

utilizada para almidones en el apartado 3.2.6.

3.5 Modelación

Se llevaron a cabo dos modelaciones matemáticas para encontrar los

parámetros cinéticos de cada una de las corridas promedio de sacarificación

e isomerización. Para la sacarificación se utilizaron la modelación de

Michaelis Menten y la modelación Logística, y para isomerización se

utilizó la modelación de Michaelis Menten y la modelación exponencial.

La metodología para la modelación Logística y la modelación exponencial

se muestran en el anexo I.

La metodología utilizada para la modelación de Michaelis Menten fue la

siguiente:

3.5.1 Modelación en sacarificación

Para encontrar la curva de simulación se utilizó la ecuación de Michaelis

V SMenten v = —-^— en función al diferencial de producto dp/dt = VmaxK.+S F F

35


(s)/Km + s (ecuación 2). Con esta ecuación se obtuvo el cambio de laconcentración de producto en el intervalo de tiempo de 1 min variando laKm y la concentración inicial de sustrato, este cambio en el producto se fuesumando en una columna para obtener la concentración final de producto,además el cambio en la concentración de producto se multiplicó por -1 paraobtener la disminución de sustrato también en el intervalo de tiempo de 1min, la cantidad de sustrato se fue restando en una columna para conocerla concentración final de sustrato.

Para encontrar la diferencias entre la curva simulada y la obtenidaexperimentalmente, se restaron los valores experimentales a los valores dela simulación en los puntos de medición (30 min, 60min y asísucesivamente hasta las 960 min) y se elevaron al cuadrado, al final sesumaron los cuadrados. Se busco el mínimo valor en la suma de cuadradosvariando Km y la concentración inicial de sustrato. Para encontrar elmínimo se utilizó la función solver del paquete estadístico de Excel.

Se determinó y se fijó la Vmax a partir de los primeros puntos de las curvasen donde tuvieran una correlación mayor a 0.95.

3.5.2 Modelación en isomerización

Se llevo a cabo de la misma manera que en sacarificación, solo que en estecaso se obtuvo ds/dt = -(Vmax (s)/Km + s) (ecuación 3) en el intervalo detiempo de O a 2.5 hrs.

36


3.6 Análisis estadístico para los datos experimentales.

Se llevó a cabo utilizando el paquete estadístico JMP^ versión 5.0 (SAS

Institute INC. Cary, NC U.S.A). Se llevó a cabo análisis de varianza

(ANOVA) y separación de medias a través de la prueba LSD (p< 0.05).

37

Resultados v Discusión

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este capítulo se presentan y discuten los resultados del procesoexperimental que se siguió. El lector recordará que en este estudio seanalizaron tres tipos de granos, maíz y dos tipos de sorgo con propiedadescontrastantes en su composición de almidón. Es propósito central de estasección, comparar rendimientos, calidades y en resumen factibilidad deutilización de sorgo de endospermo normal o ceroso como alternativa aluso de maíz para obtener jarabes dextrinizados, glucosados y fructosados.

4.1 Análisis químico proximal de los granos.

Los resultados del análisis químico proximal para cada uno de los granosestudiados se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Análisis químico proximal de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Humedad

Proteína

Cenizas

Grasa

Fibracruda*ELN

MaízPorcentajepromedio

13.28

7.25

1.08

3.71

1.66

73.02

Desviaciónestándar

0.21

0.10

0.19

0.05

0.12

0.45

Sorgo cerosoPorcentajepromedio

12.71

10.88

1.14

1.15

0.51

73.61


0.06

0.13

0.02

0.62

0.03

0.61

Sorgo normalPorcentajepromedio

13.63

10.72

1.7

1.14

1.08

71.73


0.02

0.04

0.24

0.88

0.43

1.12

ELN = Extracto libre de nitrógenoCada valor es el promedio de 3 observaciones. Los valores están expresados en base húmeda.

38


La composición química de los granos de sorgo ceroso, sorgo normal ymaíz utilizados en la investigación concuerda con la reportada en literatura(Rooney y Serna Saldivar 1991, Moheno Pérez et al, 1999, Serna-Saldivaret al., 2003). La composición química de estos cereales es muy similarentre sí, excepto en cantidad de proteína, la cual fue superior en los sorgos.El extracto libre de nitrógeno, fracción donde se encuentra todo el almidón,fue muy similar entre los granos estudiados. Esto implica que los tres tiposde grano tienen (en principio) el mismo potencial como materias primaspara la obtención de almidón y jarabes1.

4.2 Análisis de propiedades físicas de los granos

Con el propósito de validar la calidad de los granos utilizados, sedeterminaron sus propiedades físicas (en específico peso de 1000 granos,peso hectolítrico2 y textura del endospermo). Los resultados de dichasevaluaciones se reportan en la Tabla 2. Estos resultados indican que ambostipos de sorgo se encuentran dentro de las especificaciones para granos dealta calidad (Rooney y Serna Saldivar, 1991, Osorio Morales et al., 2000,Villaseflor Medina, 1997). Los parámetros para el maíz también seencuentran dentro de los esperados para un maíz suave dentado (Rooney ySerna Saldivar, 1991).

1 Posteriormente se discutirá la validez de esta aseveración, al comparar rendimientos experimentales2 La relevancia de estos parámetros físicos como factores de calidad del grano se refiere en la sección deLiteratura revisada.

39


Tabla 2. Propiedades físicas de maíz, sorgo normal y sorgo ceroso.

Peso 1000granos

Pesohectolítrico

kg/HL

Textura deendospermo"

Promedio

359.66

74.68

Suave

Desv.estándar

0.28

0.86

Promedio

30.66

79.53

Intermedio

Desv.estándar

0.58

0.10

Promedio

26.33

78.78

Intermedio

Desv.estándar

0.57

0.55

' Determinado subjetivamente observando granos disectados

4.3 Rendimiento de fracciones de molienda húmeda

En la Tabla 3 se reportan rendimientos de almidón y diferentessubproductos para los tres tipos de granos analizados. En lo que respecta aextracción de gluten y almidón de segunda, no existió una diferenciasignificativa (p>0.05) entre los distintos granos estudiados. El maíz rindióentre 5 y 6 % más almidón que los sorgos. Durante la etapa de lavado de lafibra en la molienda húmeda se observaron diferencias de comportamientoentre el maíz y los dos sorgos. Por ejemplo, fue necesario utilizar el doblede agua para extraer el almidón residual de la fibra para el caso de ambossorgos. Mientras que para el caso del lavado de maíz, el agua de salida yano presentaba un aspecto lechoso, lo que si ocurrió para ambos tipos desorgo (indicativo de presencia residual de almidón). Obsérvese el renglónreferente a contenido de fibra de la tabla 3. Para ambos sorgos, el valor defibra determinado es mayor que para el caso del maíz. Se puede inferir

40


entonces, que aún después de lavar con el doble de volumen de agua, en lafracción de fibra de los sorgos aún se retuvo almidón residual.

Las diferencias observadas en rendimientos de almidón a favor del maízconcuerdan con los resultados de Moheno et al., (1999). Los mismosautores reportan rendimientos de almidón para el sorgo ceroso y el sorgonormal un poco menores a los obtenidos en este estudio. Esta diferencia sesustenta en lo reportado en literatura (Rooney y Serna Saldivar, 1991). Lossorgos presentan mayor dificultad en la extracción del almidón, pues seencuentra mayormente asociado a la matriz proteica o gluten. SegúnWatson et al., (1955) esto se debe según a la presencia de endospermoperiférico y a que los granulos de almidón están más fuertemente cubiertospor la matriz proteica, lo que hace más difícil la separación de almidón ygluten. La matriz y cuerpos proteicos del sorgo tienen una mayor cantidadde puentes de disulfuro que las proteínas del endospermo del maíz y porconsiguiente son más difíciles de hidrolizar (Wall y Paulis, 1978).

Al comparar ahora rendimientos para ambos sorgos. Se esperaría unporcentaje mayor de almidón de sorgo ceroso en comparación con loencontrado en sorgo normal, ya que el sorgo ceroso no contieneendospermo periférico o capa de subaleurona y además posee una matrizproteica más débil. Se ha reportado (Rooney y Pflugfelder, 1986) que laestructura y morfolología del sorgo ceroso es mas parecida a la del granode maíz y por lo tanto debería comportarse de manera similar a este encuanto a rendimientos de extracción de almidón. No obstante, losrendimientos de almidón para sorgo ceroso fueron menores que los desorgo normal y maíz (sin embargo, la diferencia entre ambos sorgos en esterubro no es significativa (p>0.05)).

41


Tabla 3. Efecto del tipo de grano en los rendimientos de fracciones demolienda húmeda para maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Almidón

Almidónde

segundaFibra

Gluten

Maíz

Base seca%

66.71a1

2.79a

15.22b

10.86a

Desv.estándar

1.01

0.44

0.56

1.41

Sorgo ceroso

Base seca%

60.27b

3.61a

21.99a

12.93a

Desv.estándar

1.36

0.42

2.17

2.16

Sorgo normal

Base seca%

61.05b

2.82a

23.00a

11.07a

Desv.estándar

1.84

0.53

0.88

1.28

Letras diferentes entre columnas indican que los valores son significativamentediferentes (LSD test, pX).05)

4.3.1 Grado de refinación de los almidones

Los parámetros de calidad para cuantificar el grado de refinación de losalmidones utilizados fueron los contenidos de proteína, cenizas y color (verTabla 4).

42


Tabla 4. Efecto del tipo de grano en el contenido de proteína y cenizas enalmidones.

Maíz

Maíz

Maíz

Promedio

Sorgo ceroso

Sorgo ceroso

Sorgo ceroso

Promedio

Sorgo normal

Sorgo normal

Sorgo normal

Promedio

Humedad%

5.42

4.65

8.86

6J1

3.29

5.73

6.3

5.10

4.7

4.17

7.73

5.53

Desv.estándar

0.51

0.16

0.27

0.68

0.02

0.50

0.13

1.22

1.44

Proteína%

0.43

0.50

0.65

0.53I)1

0.59

0.54

0.81

0.65ab

0.73

0.83

0.76

0.78a

Desv.estándar

0.01

0.04

0.14

0.03

0.01

0.08

0.01

0.07

0.07

Cenizas%

0.03

0.03

0.08

O.OSb

0.08

0.11

0.12

0.10a

0.04

0.07

0.06

0.07ab

Desv.estándar

0.01

0.01

0.01

0.06

0.01

0.06

0.08

0.06

0.047

'Letras diferentes entre promedios indican que los valores son significativamente diferentes (LSD test,p<0.05)Cada valor es el promedio de tres observaciones.

4.3.1.1 Contenido de proteína del almidón

El gluten es separado del almidón de molienda debido a su más bajadensidad (1.1 g/cm3) en comparación con la del almidón (1.5 gr/cm3), loque permite la separación por sedimentación o centrifugación. Sin embargo

el almidón puede contener proteína cuando el proceso de separación es

deficiente (Watson, 1984). El contenido residual de proteína en el almidón

43


es entonces un indicador de eficiencia del proceso de separación proteína-almidón, y por tanto un parámetro de calidad del producto.

Watson (1984) y May (1987) reportan que el contenido de proteína enalmidones producidos industrialmente, bajo condiciones convencionales deoperación debe ser inferior a 0.3% para ser considerados de primeracalidad.

Los resultados de contenido de proteína en los almidones de primerapresentados en la Tabla 4 están por encima de los documentados porWatson (1984) y Serna Saldivar et al., (2003), pero están por debajo deaquellos observados por Moheno et al., (1999) y similares a Villasefior(1997) en estudios similares al aquí presentado. Por lo tanto los almidonesextraídos en este estudio pueden considerarse como de calidad aceptable.

En general el contenido promedio de proteína en almidones de maíz seencuentra por debajo de los dos sorgos. Esto es debido a que además de queper se el sorgo presenta mayor cantidad de proteína, también contieneendospermo periférico y proteínas entrecruzadas que se quedan ligadas alos granulos de almidón que conforman (Watson, 1984). La textura suavedel endospermo del maíz (evaluada subjetivamente por inspección visual,Serna-Saldivar, comunicación personal) favoreció que los granulos dealmidón se separaran más fácilmente y con menor residuo de proteína(Tabla 4).

El promedio de proteína del almidón de sorgo ceroso fue menor al de sorgonormal y esto se puede considerar lógico puesto que el sorgo ceroso poseeuna matriz proteica más débil que los sorgos normales lo que hace másfácil de separar.

44


4.3.1.2 Contenido de ceniza del almidón

El contenido de cenizas en los almidones como criterio de calidad ha sidopoco referenciado en la literatura, Watson (1984) reporta que los almidonesde maíz o sorgo contienen aproximadamente 0.1%, mientras que Kulkarniet al., (1987) reporta valores más altos para almidones obtenidoscomercialmente en la India. Estos autores reportan valores promedio de0.3% a 0.4%.

Los valores de contenido de ceniza reportados en la Tabla 4 oscilan entre0.03 y 0.12%, lo que los sitúan dentro de los rangos citados en bibliografíay los obtenidos por Serna Saldivar et al., (2003), Villaseftor (1997) y pordebajo de los resultados obtenidos por Moheno et al, (1999).

El mayor contenido de cenizas se observó en el sorgo ceroso, seguido porel sorgo normal y por último el maíz. El análisis estadístico de esteindicador de calidad solo percibe como significativa la diferencia entresorgo ceroso y maíz (prueba LSD, p<0.05).

4.3.1.3 Color de los almidones

En general, el almidón de maíz sin modificar es un polvo blanco con unatonalidad pálida amarilla y el sorgo rosa pálido. En el caso particular delsorgo, esta coloración rosada se deriva de la presencia de compuestosfenólicos presentes en el pericarpio (Watson, 1984). Sin embargo, para queun almidón se considere de alta calidad, su color debe ser lo más cercano alblanco (Watson, 1984), si esto no sucediera se puede llevar a cabo un

45


proceso de blanqueado con peróxido de hidrógeno, permanganato de

potasio, hipoclorito de sodio y clorito de sodio (May, 1987).

Tabla 5. Color de almidones deshidratados obtenidos a partir de maíz,sorgo ceroso y sorgo normal

Maíz 1ra

M3ÍZ2"*Maíz 3ra

Sorgo ceroso 1ra

Sorgo ceroso 2a*Sorgo ceroso 3ra

Sorgo normal 1ra

Sorgo normal 2a*Sorgo normal 3ra

L*95.8595.6095.6595.7095.8895.4796.1495.6095.52

a*-1.47-1.43-1.53-0.32-0.38-0.41-0.35-0.33-0.41

b*5.375.165.472.182.322.141.781.651.63

AE+

96.0195.7695.8095.7295.9095.4996.1595.6195.53

*L deñne la claridad +L blanco y -L negro, y a y b denotan +a rojo, -a verde, +b amarillo y -b azul(ver materiales y métodos figuras 5 y 6).+ AE (valor de diferencia total de color) se obtiene de la siguiente ecuación AE = (L2 + a2 + b2)

Se puede observar en los resultados mostrados en la tabla 7 que losalmidones tienen un color similar al blanco y se encuentran dentro del

parámetro de calidad. Cabe mencionar que los valores de L y E casituvieron los valores máximos posibles (100). Valores de 100 de L y E

indican el mayor valor de blancura posible. Este resultado es relevante,

pues indica que el proceso de extracción de almidón fue efectivo entérminos de remoción de pigmentación, evitándose entonces la necesidad

de una etapa de "blanqueo" químico posterior que implicaría un costo

adicional de proceso.

4.4 Conversión enzimática de almidón a jarabes fructosados

En esta subsección se presentan y discuten los resultados correspondientesa las etapas de transformación de almidón a jarabes fructosados. En esta

secuencia se incluyen procesos de: (a) licuefacción enzimática (utilizando

a-amilasa termoresistente); (b) sacarificación utilizando un complejo

46


enzimático consituido por tres enzimas (amiloglucosidasa, pululanasa y b-amilasa); (c) refinación que consiste en una centrifugación y posterioresetapas secuenciales de filtrado en carbón activado, una resina amónica yuna resina catiónica3, y (d) isomerización utilizando un sistema de glucosa-isomerasa.

4.4.1 Licuefacción

Durante esta etapa, el almidón se hidroliza parcialmente en dextrinas. Elproducto es una mezcla de dextrinas lineales y ramificadas con unadistribución de pesos moleculares dependiente de factores tales como laestructura del almidón, tiempo y condiciones de reacción. En principio, esposible seguir la evolución de esta reacción midiendo la cantidad deextremos reductores expuestos por la hidrólisis (expresados comoequivalentes de dextrosa). Es importante hidrolizar el almidón por eltiempo suficiente ya que la eficiencia del siguiente paso (sacarificación)depende mucho del grado de hidrólisis obtenido durante la licuefacción (serecomiendan 20 equivalentes de dextrosa) (Wiseman, 1991). Entre másequivalentes de dextrosa se tenga más disponible estará el sustrato (para elcomplejo enzimático constituido por amiloglucosidasa, pululanasa y P-amilasa. En este estudio no se realizaron determinaciones de eficiencia deesta etapa, pero se seleccionaron condiciones de proceso que asegurasenuna alta conversión de almidón a dextrinas: pH=5.4, temperatura=85 °C, yconcentración de iones Ca+2=5 ppm (de acuerdo a especificacionesrecomendadas por el proveedor de la enzima). Se especificó un tiempo deproceso de 2.5 horas (superior a la recomendación del proveedor).

3 Las especificaciones de las enzimas y resinas utilizadas se presentan en la sección de material ymétodos.

47


4.4.2 Sacarificación

En general, la sacarificación contempla el uso de la enzima

amiloglucosidasa, algunas veces complementada con pululanasa y P-amilasa para obtener el jarabe glucosado con un alto valor de conversión

(Wiseman, 1991). En reportes previos, se documenta el uso deamiloglucosidasa en un reactor de recirculación acoplado a membrana,

obteniéndose rendimientos altos en el proceso de conversión de jarabes

dextrinizados a jarabes glucosados (Villaseñor, 1997). En este estudio, se

aborda la etapa de sacarificación con variaciones sustantivas. Se utiliza un

complejo enzimático que incluye una amiloglucosidasa, una pululanasa, y

una (3-amilasa con el propósito de mejorar el desempeño global del proceso

bio-catalítico. Se incorporan herramientas estadísticas para validar la

existencia de diferencias significativas en el comportamiento de la curva deconversión de los tres jarabes estudiados. Se proponen tres diferentesmodelos de ajuste a los datos experimentales (un modelo de Michaelis-

Menten, un modelo Gompertziano y un modelo logístico). Se evalúa la

calidad de ajuste de cada modelo a los datos experimentales, y se discute lasignificancia física de los valores identificados para cada modelo.

Finalmente, se comparan valores de rendimiento, conversión, y velocidad

de reacción, para cada uno de los jarabes estudiados.

La Tabla 6 muestra resultados promedio de concentración final de glucosa,concentración de sólidos disueltos (expresada como grados Brix) y

porcentajes de conversión para cada uno de los jarabes glucosados

obtenidos.

Se utilizaron 150 gr de almidón (con una concentración de 300 mg/ml) de

cada uno de los cereales convirtiéndose a glucosa (en promedio) 132.09gr

48


de almidón de maíz, 132.51gr de almidón de sorgo ceroso y 125.49 dealmidón de sorgo normal (los porcentajes de conversión se muestran en laTabla 6).

Tabla 6. Concentración final promedio de glucosa en jarabes, obtenido delos diferentes tipos de almidón, y porcentaje total de conversión de almidóna glucosa.

Maíz

Sorgo ceroso

Sorgonormal

°Brix

27.16

28.33

27

Almidónmg/ml300

300

300

Glucosa mg/ml

264.18a1

265.02a

251.85a

Porcentaje deconversión

88.06

88.34

83.66

Letras diferentes entre concentraciones de glucosa indican que los valores son significativamentediferentes (LSD test, p<0.05)

De acuerdo con Lloyd y Nelson (1984), las dextrinas lineales sonconvertidas rápidamente a glucosa cuando se someten a una hidrólisis conamiloglucosidasa y las ramificadas son menos susceptibles al ataqueenzimático debido a que la amiloglucosidasa corta más lentamente a losenlaces glucosídicos a-1,6. Esto implicaría que el sorgo ceroso tardaría mástiempo en alcanzar máxima conversión ya que más del 95% de almidónestá conformado por moléculas de amilopectina y de cadenas ramificadascon enlaces glucosídicos a-1,6. Debido a la baja velocidad de hidrólisis deenlaces a-1,6 por la enzima amiloglucosidasa, Hebeda (1987) propuso eluso combinado de esta, con la enzima desramificante pululanasa paraincrementar la velocidad reconversión a glucosa. De hecho, el complejoenzimático que se utilizó en este trabajo incluye una pululanasa,Adicionalmente, la enzima p-amilasa hace también un trabajo sinérgico ycomplementario, ayudando en la hidrólisis rompiendo enlaces a-1,4 cadados monómeros de glucosa.

49


En la Figura 9 se muestran las curvas promedio de evolución de laconcentración de glucosa (producto) con respecto al tiempo, para cada unode los jarabes obtenidos de los diferentes tipos de grano en estudio. Elresultado del trabajo combinado de las tres enzimas del complejo utilizado,se ve reflejado en una aparente igualdad4 en el valor de las velocidadesiniciales de conversión para los diferentes tipos de jarabe.

Figura 9. Curva de conversión a glucosa de almidones de maíz, sorgoceroso y sorgo normal previamente licuificados.

En la Figura 9 también se observa aparentemente una conversión finalmayor para el caso de los jarabes dextrinizados de sorgo ceroso y maíz.Para validar la significancia de equivalencias o diferencias de velocidades yconversiones, se sometieron los datos experimentales a distintosprocedimientos de ajuste.

Las Figuras 10, 11 y 12, muestran el ajuste de los datos experimentales decurvas de conversión a un modelo Michaelis Menten (M-M)5 para jarabesglucosados provenientes de maíz, sorgo normal y sorgo cerosorespectivamente. El modelo clásico M-M consta de dos parámetros de

Posteriormente se presentará validación estadística de esta aseveración.5 Los detalles de implementación del ajuste se describen en la sección de Materiales y Métodos.

50

C 3OO -i 1

£ 25° /^^V-aJt-, .̂ S?»-*-̂ ^̂ -1 I - » - M A [ Z IHJ 200 ~é^^^^^^- —•5 S 15Q - JL —i»—SORGO CEROSO

W -inn - ¿S £¿ SORGO NORMAL5 5O -I I I

y o -I 1 1 1 1g O 5 1O 15

TIEMPO (hr)


ajuste (Km y vmax). Sin embargo, en el ajuste se incluyó como parámetroadicional la concentración inicial de sustrato. De estos tres parámetros, elvalor de vmax se fijó en base al análisis de pendientes de las curvas deconversión (figuras 10, 11, y 12).

- Curva experimental- Simulación

50OTIEMPO (min)

10OO

Figura 10. Comparación entre curva obtenida experimentalmente en lasacarificación de almidón de maíz y la curva ajustada por simulaciónmatemática El mínimo valor de la sumatoria de cuadrados para el ajustefue de 3366.73 (ver materiales y métodos).

CO

NC

EN

IRA

aON

DE

GLU

CO

SA

^nn

-00 J * * ~I 150 X -^-Curva lau ^»£ _^ -•— Simi

inf) f1UU ^^en y50

0 200 400 600 800 1000TIEMPO (min)

a experimentaljlación

Figura 11. Comparación entre curva obtenida experimentalmente en lasacarificación de almidón de sorgo ceroso y la curva ajustada porsimulación matemática. El mínimo valor de la sumatoria de cuadradospara el ajuste fue de 3860.15 (ver materiales y métodos).

51


Í!:fini

s8

3OO

25O -

2OO

O 150

1OQ

5Ot>0

O -(

A ¡* *

M *^ — • — SimulaciónJJ

' \3 500 1000

TIEMPO (min)

Figura 12. Comparación entre curva obtenida experimentalmente en lasacarificación de almidón de sorgo normal y la curva ajustada porsimulación matemática. El mínimo valor de la sumatoria de cuadradospara el ajuste fue de 3540.33 (ver materiales y métodos).

Se aclara que en general, el valor de Vmax no es equivalente al valor develocidad inicial, pero para el caso de los experimentos aquí reportados talconsideración es válida. El comportamiento lineal de las curvas deconversión se extiende al menos por periodos de tiempo de 180 minutos(coeficiente de correlación fXiSS en todos los casos). Esto implica que, eneste tiempo la velocidad de reacción es independiente de la concentraciónde sustrato. Durante este tiempo, la concentración de sustrato varíasignificativamente6. Amplias variaciones de concentración de sustrato conun valor de velocidad invariable solo son posibles en condiciones cercanasa Vmax, de manera que es justificable suponer el valor característico de laregión lineal como equivalente a Vmax. Los valores de los dos parámetrosrestantes del modelo, se obtuvieron por ajuste utilizando la función"solver" de la hoja de cálculo de Excel (Microsoft R). La tabla 7 resume los

6 En el periodo de comportamiento lineal de la velocidad de reacción, ocurre entre al menos el 50% deconversión de sustrato.

52


valores de los parámetros cinéticos obtenidos por esta estrategia. Losvalores de Km (en todos los casos bajos con relación a la concentracióninicial de sustrato) implicarían una alta afinidad de la enzima por elsustrato. Esto es consistente con el hecho de que las curvas de conversiónmuestren comportamientos lineales prolongados. Si el valor de Km es muypequeño relativo a s, entonces Km + [S] es aproximadamente igual a [S], yambos factores se criminan, obteniendo una igualdad entre v y Vmax(prueba de consistencia con nuestra suposición para selección de vmax).

v =

Tabla 7. Parámetros cinéticos obtenidos de la modelación matemática através de la ecuación de Michaelis Menten en la sacarificación de dextrinasde maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Maíz

Sorgo ceroso

Sorgo normal

Vmax

mg/min

0.68

0.85

0.74

Km

mg/ml

20.09

0.23

0.35

Sustrato inicial (s)

mg/ml

154.74

176.28

152.37

Los parámetros cinéticos se calcularon por ajuste al modelo de Michaelis Mentenv = Vmax [s]/(Km + [s]).

El valor de Vmax fue superior en sorgo ceroso comparado con maíz ysorgo normal. Esto nos indica que fue mayor la velocidad de conversión desustrato a producto en sorgo ceroso. Esto podría representar una ventajacompetitiva de un proceso industrial basado en sorgo ceroso que implicaríareactores más compactos o tiempos de residencia más cortos (en un reactor

53


continuo). El valor de Km fue menor en el sorgo ceroso debido a que elcomplejo enzimático contenía la enzima pululanasa que rompe los enlacesa-1,6, estos enlaces se encuentran en mayor cantidad en el sorgo ceroso porlo cual el complejo es mas afín al sustrato, en este caso el almidón de sorgoceroso.

Adicionalmente, se llevó a cabo un segundo procedimiento de modelación,esta vez basado en argumentos estadísticos. Los datos experimentales seajustaron a un modelo logístico7:

ay = ̂ —7

En este modelo, a es la población máxima o carga máxima del sistemaecológico (concentración máxima de glucosa en el contexto de esteestudio), b es la población inicial (concentración inicial de glucosa) y c esuna tasa de crecimiento (parámetro análogo a una velocidad de reacción).

El desarrollo de este segundo procedimiento de ajuste y de la validaciónestadística correspondiente se presenta en el anexo I8. La figura 13 ilustra lacalidad de ajuste del modelo logístico a los datos experimentales.

1 El modelo logístico es ampliamente utilizado en el área de ecología y dinámica de poblaciones.8 Este desarrollo fue realizado por la Dra. Rebeca Romero Alvarez, profesora del Departamento deMatemáticas del ITESM, campus Monterrey.

54


Glucosamg/ml

300

250

200

150-

100

50

-O— Maiz-A- Sorg-*•- Sorgo631

O 2 4 6 8 10 12 14 16Tiempo (horas)

Figura 13. Curvas logísticas ajustadas a cada una de las concentraciones deglucosa para maíz, sorgo ARGl y sorgo 631. ARG 1 significa sorgo cerosoy 631 significa sorgo normal.

55


Tabla 8.Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento (glucosa)con el modelo Logístico y(t) = a /(I + b¡ e " C1 l ) donde a es laconcentración máxima, b es la concentración inicial y c es la tasa decrecimiento. (Contribución de la Dra. Rebeca Romero Alvarez,Departamento de Matemáticas del ITESM, Campus Monterrey).

Tratamiento

Maíz

Sorgo ceroso

Sorgonormal

Parámetros

abc

abc

a

bc

236.21.903020.6711

244.5222.822971.02416

222.786

2.044730.824175

Desviación

estándar delparámetroestimado

4.69390.3292840.109435

4.230090.5663270.160117

4.40971

0.4014120.147164

Correlación entreparámetros

ab

-0.0092

-0.0282

-0.009

ac

-0.44

-0.329

-0.383

be

0.655

0.726

0.676

Los resultados de la aplicación de esta prueba a los parámetros estimadosindican que la concentración final de glucosa del sorgo ceroso es mayorque la concentración final de glucosa del maíz, la concentración final deglucosa del maíz es mayor que la concentración final de glucosa del sorgonormal y la concentración de glucosa del sorgo ceroso es mayor que laconcentración de glucosa en el sorgo normal.

Se llevo a cabo también un análisis estadístico donde se compararon losúltimos 13 puntos promedio de las 3 diferentes corridas, estos puntos setomaron en cuenta dado que gracias a las gráficas se observaba unaestabilización en la concentración de glucosa. Los resultados obtenidosindicaron que existía diferencia significativa (LSD, p<0.05) entre las

56


concentraciones de jarabe glucosado provenientes de sorgo ceroso y sorgonormal, no así entre maíz y sorgo ceroso, y maíz y sorgo normal.

De acuerdo a los datos de concentraciones finales promedio obtenidosexperimentalmente para cada uno de los jarabes glucosados (ver Tabla 6)no existe diferencia significativa (LSD, p < 0.05) entre estos. Sin embargo,las concentraciones finales derivadas del ajuste de los datos experimentalesa los modelos de Michaelis-Menten (ver tabla 7), de curva logística (vertabla 8) y del estadístico de los 13 puntos promedio finales cuentan unahistoria diferente. El análisis estadístico realizado (ver anexo I) sobre elajuste logístico no arroja diferencia significativa para velocidades deconversión (parámetro c) pero sí para las concentraciones finales deproducto (parámetro a).

Las tablas 10 y 11 presentan una comparación de conversionesexperimentales, conversiones derivadas del ajuste al modelo de MichaelisMenten, y conversiones derivadas del ajuste al modelo logístico. El lectorpodrá constatar la similitud de los resultados obtenidos por ambos modelosde ajuste.

Tabla 9. Concentración final de glucosa obtenida en sacarificación. Valorescalculados de manera experimental y a través de las modelacionesmatemáticas de Michaelis Menten y logístico.

Michaelis Menten

Logístico

Datos Experimentales

Maíz

234.62

236.20

264.18

Sorgo ceroso

240.85

244.52

265.02

Sorgo normal

219.22

222.78

251.85

57


Tabla 10. Velocidades de conversión en sacarificación obtenidas de lasmodelaciones de las cinéticas promedio para cada tipo de grano.

Michaelis Menten

Logístico

Maíz

0.68

0.67

Sorgo ceroso

0.85

1.02

Sorgo normal

0.74

0.82

4.4.2.1 Color de los jarabes glucosados

Tabla 11. Color de los jarabes de glucosa obtenidos a partir de losdiferentes tipos de almidones.

Maíz 1ra

Maíz 2a*Maíz 3ra

Sorgo ceroso 1ra

Sorgo ceroso 2a*Sorgo ceroso 3ra

Sorgo normal 1ra

Sorgo normal 2a"Sorgo normal 3ra

L36.9140.1241.5634.6436.4735.9237.9441.0440.23

a-1.00-1.41-1.741.470.51-0.24-0.59-1.42-1.25

b3.171.160.778.126.073.943.461.110.19

AE+

37.0640.1641.6035.6036.9736.1338.1041.0740.24

*L define la claridad L= 100 blanco y L= O negro, y a y b denotan +a rojo, -a verde, +b amarillo y -b azul (ver materiales y métodos figuras 5 y 6).+ AE se obtiene de la siguiente ecuación AE = (L2 + a2 + b2)

La medida de el color de los jarabes de glucosa se llevó a cabo de la mismaforma que la medida de color de almidones, en esta ocasión se puedeobservar que los resultados mostrados en la tabla 7 no son homogéneos yesto fue debido a que existía una cantidad determinada de dextrinas ensuspensión como se puede observar en la figura 10 lo que hacia que elcolor de cada uno de los jarabes fuera heterogéneo.

58


Figura 14. Jarabes después de la sacarificación: los tres primeros frascosson de sorgo normal, seguidos por tres de maíz y tres de sorgo ceroso. Lanubosidad observada son dextrinas que no alcanzaron a ser hidrolizadas aglucosa

4.4.3 Refinación

El refinado se realiza para la remoción de contaminantes insolubles ysolubles tales como cenizas, pigmentos y proteínas hidrosolublessolubilizadas durante el procesamiento. Para la clarificación se remueventrazas de grasa, proteína y dextrinas por centrifugación, después de llevar acabo este paso con carbón activado y resinas de intercambio iónicoimpurezas tales como pigmentos, precursores de color y material proteico(Hereda, 1987).

La refinación se llevo a cabo en 4 pasos, una centrifugación y tres filtrados,carbón activado, resina aniónica débil y resina catiónica fuerte.

4.4.3.1 Centrifugación

Esta se llevo a cabo para separar las dextrinas que no fueron convertidas aglucosa, el sorgo ceroso fue el que mejor separación mostró y esto fuedebido a que este tipo de sorgo probablemente contuvo mayor cantidad de

59


dextrinas ramificadas de mayor peso molecular las cuales precipitarondurante la centrifugación.

4.4.3.2 Filtrado secuencia! a través de columnas de carbón activado, resina

aniónica y resina catiónica

El filtrado con carbón activado se llevó a cabo para remover impurezas,

material proteico y pigmentos. La resina aniónica se utilizó principalmentepara remover fenólicos y la resina catiónica para remover calcio que es un

inhibidor de la glucosa isomerasa.

Figura 15. Jarabes glucosados refinados después de pasar porcentrifugación, carbón activado, resina aniónica y resina catiónica.

Se puede observar en la figura 11 la disminución de insolubles los cuales

podían ser percibidos en la figura 10. Esto indica que la remoción de

insolubles fue satisfactoria, además de que existió una disminución en la

intensidad de color de los jarabes.

Después de pasar por la el refinado disminuyó la concentración de glucosa

en un 17.35% en maíz, 16.82% en sorgo ceroso y 17.55% de sorgo normal,

terminando con una concentración de 218.33mg/ml en maíz, 220.44, en

sorgo ceroso y 207.64 mg/ml en sorgo normal. Esto debido al jarabe que

quedó embebido en los diferentes lechos empacados de refinación.

60

Resultados y Discusión

4.4.4 Isomerización

La literatura refiere configuraciones de reactores diversas para isomerisar

glucosa a fructosa. Industríalmente el proceso se lleva a cabo en reactorescontinuos de lecho empacado (ver por ejemplo Hebeda, 1987, Wiseman,

1991). En este estudio se utilizó un reactor híbrido (combinación de tanqueagitado y columna empacada con recirculación9). La columna se empacó

con la enzima glucosa isomerasa inmovilizada (Sweetzyme IT,Novozyme). El reactor se operó vertiendo jarabe glucosado en un tanque

agitado (vaso de precipitado) al tiempo inicial, y circulando este a travésdel reactor empacado a una velocidad de flujo volumétrico de 1.5 ml/min

(para un tiempo aproximado de residencia de 33 minutos por paso). La

corriente de salida de la columna era recirculada al tanque. Estaconfiguración permite explotar las ventajas de una alta concentración deenzima (en la columna) y es plenamente escalable.

Tabla 12. Concentraciones iniciales de sustrato, finales de productos yconversión para la reacción de isomerisación de jarabes glucosados demaíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Concentracióninicial de glucosa

mg/mlGlucosa despuésde isomerización

mg/mlFructosa7 mg/ml

Conversión%

°Brix

Maíz218.33

108.45

109.88

50.32a

28

Sorgo ceroso220.44

109.34

111.1

50.39a

28

Sorgo normal207.64

113.05

94.59

45.55a

27

'Letras diferentes entre porcentajes de conversión indican que los valores son significativamente diferentes (LSD test, p<0.05)Se partió de una concentración inicial de almidón de 300 mg/ml.TSe cuantificó sustrato (glucosa) y la concentración de fructosa fue calculada por diferencia a partir de la concentración inicial deglucosa.

' Consultar detalles de la configuración del reactor en la sección de materiales y métodos.

61

Resultados y Discusión

En la Tabla 12 se presentan las concentraciones de fructosa producida apartir de jarabes glucosados de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal. Estasconcentraciones corresponden a 50.32%, 50.39% y 45.55% de conversión.Hebeda (1987) reporta similares conversiones. Estos valores deconcentración cumplen con el requisito industrial de conversión de almenos 42% a fructosa (42 HFCS).

Los resultados de concentración de sólidos, expresados como °Brix paracada jarabe producto también se muestra en la Tabla 9. La cantidad degrados Brix del maíz, sorgo ceroso y sorgo normal fue muy similar.

Oüi

260

2OO

150

100

O

-MAÍZSORGO CEROSO

-SORGO NORMAL

O 50 100

TIEMPO (min)15O

Figura 16. Disminución de la concentración de glucosa con respecto altiempo durante la reacción de isomerización. Las curvas indicanpromedios para jarabes de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

En la Figura 16 se observa aparentemente una conversión final mayor parael caso de los jarabes glucosados de sorgo ceroso y maíz. Para validar lasignificancia de equivalencias o diferencias de velocidades y conversiones,

62


se sometieron los datos experimentales a dos procedimientos de ajuste

diferentes (ajuste a modelo M-M y a modelo exponencial).

Las Figuras 17, 18 y 19, muestran el ajuste de los datos experimentales de

curvas de conversión a un modelo Michaelis Menten (M-M)10 para jarabesfructosados provenientes de maíz, sorgo normal y sorgo ceroso

respectivamente. El procedimiento de ajuste es análogo al utilizadopreviamente para los datos correspondientes a la etapa de sacarificación.

-Cuna experimental- Simulación

50 100

TIEMPO (min)150

Figura 17. Comparación entre resultados experimentales de ladisminución de glucosa en la isomerización de maíz y la curva ajustadapor modelación matemática. El mínimo valor de la sumatoria decuadrados para el ajuste fue de 818.8 (ver materiales y métodos).

' Los detalles de implementación del ajuste se describen en la sección de Materiales y Métodos.

63


• Curva ejqperimentalSirrulación

50 100

TlEMPO(m¡n)

150

Figura 18. Comparación entre resultados experimentales de ladisminución de glucosa en la isomerización de sorgo ceroso y la curvaajustada por modelación matemática. El mínimo valor de la sumatoria decuadrados para el ajuste fue de 156.6 (ver materiales y métodos).

Curva experimentalSimulación

50 100TIEMPO (rnin)

150

Figura 19. Comparación entre curva obtenida experimentalmente de ladisminución de glucosa en la isomerización de sorgo normal y la curvaajustada por modelación matemática. El mínimo valor de la sumatoria decuadrados para el ajuste fue de 92.87823 (ver materiales y métodos).

El lector podrá observar un comportamiento lineal en la disminución desustrato con respecto al tiempo durante la isomerización glucosa-fructosa.Las pendientes ds/dt (velocidades de reacción) de cada uno de los

64


experimentos de isomerización se presentan en la tabla 13. Elcomportamiento lineal observado en las figuras 17, 18 y 19 denotan unacinética de orden O porque existió un impedimento de transferencia demasa debido al bajo flujo impuesto.

Tabla 13. Parámetros cinéticos obtenidos de la modelación matemática através de la ecuación de Michaelis Menten en la isomerización de jarabesglucosados de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Maíz

Sorgo ceroso

Sorgo normal

Vmaxmg/min

1.40

1.38

1.13

Kmmg/ml

99.7

136.80

173.69

Sustrato inicial (s)mg/ml

194.53

210.33

191.07

Los parámetros cinéticos se calcularon por ajuste al modeloV = Vmax [s]/(Km +[s]).

de Michaelis Menten

El jarabe glucosado que mayor Vmax presentó fue el maíz, mientras que laenzima mostró mayor afinidad por el jarabe glucosado de sorgo ceroso(Km menor). Dada la sospecha de que el comportamiento de conversionesestá dominado por impedimentos de transferencia de masa, los valores deVmax y Km deben ser tomados con cautela pues físicamente nonecesariamente implican parámetros meramente cinéticos.

Se llevó a cabo un segundo procedimiento de modelación, esta vez basadoen argumentos estadísticos. Los datos experimentales se ajustaron a unmodelo exponencial11:

y = a * exp(/? * i}

En este modelo, a es la concentración inicial de sustrato, B es la velocidadde conversión a producto.

1' El modelo exponencial es ampliamente utilizado en el área de ecología, dinámica de poblaciones, yprocesos químicos de primer orden.

65


Fructosamg/ml

-O— Maíz-*-- Sorgo Ceroso-x- - Sorgo Norma l

20 40 60 80 100 120 140 160

Tiempo (horas)

Figura 20. Curvas exponenciales ajustadas a cada una de lasconcentraciones de fructosa para maíz, sorgo ceroso y sorgo normal.

Tabla 14. Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento(fructosa) con el modelo Exponencial y(t) = a* (P*t) donde a es laconcentración inicial al tiempo cero y (3 es la tasa de cambio.Tratamiento

Maíz

Sorgo Ceroso

Sorgo normal

Parámetros

a

P

a

P

a

P

208.021-0.0054

217.058-0.0050

198.298

-0.0038


4.903110.00042

4.860260.00039

4.74252

0.00038


a p

-0.677

-0.683

-0.701

Los resultados de la aplicación de esta prueba a los parámetros estimadosindican que en la isomerización, la velocidad de conversión de glucosa a

66


fructosa del sorgo ceroso fue igual que la velocidad de conversión deglucosa a fructosa del maíz, la velocidad de conversión de glucosa afructosa del maíz fue mayor que la velocidad de conversión de glucosa afructosa del sorgo normal, la velocidad de conversión de glucosa a fructosadel sorgo ceroso fue mayor que la velocidad de conversión de glucosa afructosa del sorgo normal, la concentración inicial de glucosa en el jarabeobtenido de sorgo ceroso fue igual que la concentración inicial de glucosaen el jarabe obtenido de maíz, la concentración inicial de glucosa en eljarabe obtenido de maíz fue igual que la concentración inicial de glucosa enel jarabe obtenido de sorgo normal la concentración inicial de glucosa en eljarabe obtenido de sorgo ceroso fue mayor que la concentración inicial deglucosa en el jarabe obtenido de sorgo normal.

A pesar que a simple vista el porcentaje de conversión parece ser máselevado para el sorgo ceroso y el maíz comparado con el sorgo normal. Elanálisis de significancia estadística por la prueba LSD (p<0.05) sobre losdatos experimentales de porcentajes de conversión no arroja diferenciassignificativas entre los distintos jarabes. Sin embargo, las velocidades deconversión y las concentraciones iniciales derivadas del ajuste de los datosexperimentales a partir de la curva exponencial (ver tabla 14) si muestranuna diferencia significativa entre las velocidades de maíz y sorgo ceroso(estas dos iguales estadísticamente) contra sorgo normal (ver anexo I).

4.4.5 Concentración

Se llevo a cabo una concentración del jarabe fructosado en rotavapor hastallegar a 70 °Brix. Esto se hace comercialmente para producir un jarabe conbajo Aw y así evitar el ataque de microorganismos.

67


4.5 Rendimientos globales

De los resultados aquí reportados, es posible calcular los siguientesrendimientos globales a partir de los datos experimentales y de modelación:

Partiendo de una base arbitraria de cálculo de lOOgr de cereal y de los datosexperimentales pueden obtenerse:

(a) 69.34ml de jarabe fructosado de maíz al 50.32% de fructosa con unaconcentración de 70°Brix.

(b) 63.25ml de jarabe fructosado de sorgo ceroso al 50.39% de fructosacon una concentración de 70°Brix.

(c) 60.36ml de jarabe fructosado de sorgo ceroso al 45.55% de fructosacon una concentración de 70°Brix.

Partiendo de una base arbitraria de cálculo de lOOgr de cereal y de los datosobtenidos de la modelación logística pueden obtenerse:

(a) 66.07 mi de jarabe fructosado de maíz al 50.32% de fructosa con unaconcentración de 70°Brix.

(b) 62.28 mi de jarabe fructosado de sorgo ceroso al 50.39% de fructosacon una concentración de 70°Brix.

(c) 57.74 mi de jarabe fructosado de sorgo ceroso al 45.55% de fructosacon una concentración de 70°Brix.

68


Estos resultados integran los efectos de todas las eficiencias parciales de lasetapas intermedias, constituyendo un indicador global de eficiencia delproceso. Si bien un proceso basado en maíz como materia prima reportaríaventajas globales en rendimiento, cuando se excluye del análisis la etapa deextracción de almidón, y solamente tomamos en cuenta la producción dejarabes dextrinizados, glucosados y fructosados a partir de una baseequivalente de almidón, se observan rendimientos y calidades similarespara los tres tipos de grano.

69

Conclusiones

5. CONCLUSIONES

El maíz, sorgo ceroso y sorgo normal, fueron similares en el contenido deELN o almidón. Los sorgos utilizados tuvieron un mayor peso hectolítricoy una textura de endospermo más dura que la del maíz.

El maíz tuvo 5% más de rendimiento de almidón de primera que los sorgos.El rendimiento de almidón del sorgo ceroso y normal fueron similares(p>0.05).

El grado de refinación de acuerdo al contenido de proteína en todos losalmidones estuvo por encima del parámetro para considerarlo de primeracalidad (0.3%), aunque los resultados pueden considerarse como de calidadaceptable. El contenido de cenizas en los almidones si cumplió con elestándar de primera calidad al estar por debajo de 0.3%.

El color de los almidones no fue afectado por el tipo de grano, muyprobablemente debido a la utilización de sorgos blancos que son bajos enpigmentos fenólicos.

Partiendo de 300mg/ml de suspensión de almidón, el contenido final deglucosa en el jarabe no presentó diferencia significativa (p>0.05) entresorgo ceroso, sorgo normal y maíz (265.02 mg/ml, 251.85mg/ml y 264.18mg/ml respectivamente). La comparación de los últimos 13 puntospromedio de las 3 diferentes corridas presentó diferencia significativa(p>0.05) entre sorgo ceroso y sorgo normal, no así entre maíz y sorgoceroso, y maíz y sorgo normal. El porcentaje de conversión de almidón demaíz, sorgo ceroso y sorgo normal a glucosa fue de 88.06, 88.34 y 83.66,respectivamente. De acuerdo a la modelación logística si existió diferencia

70

Conclusiones

significativa entre los valores de concentración final donde sorgo ceroso >maíz > sorgo normal.

El porcentaje de conversión de glucosa a fructosa partiendo de 218.33mg/ml, 220.44 mg/ml, 207.64 mg/ml de jarabe glucosado fue de 50.32para maíz, 50.39 para sorgo ceroso y 45.55 para sorgo normal. Estoequivale a una conversión de 109.88 mg/ml para maíz, 111.1 mg/ml parasorgo ceroso y 94.54 mg/ml para sorgo normal. De acuerdo a lamodelación de la formula de Michaelis Menten el porcentaje de conversiónpara maíz, sorgo ceroso y sorgo normal fue de 51.21, 51.60 y 40.95respectivamente.

Partiendo de lOOgr de grano se obtuvieron: 69.34ml, 63.25ml y 60.36mlde jarabe fructosado ajustado a 70°Brix de maíz, sorgo ceroso y sorgonormal, respectivamente.

Los parámetros cinéticos en la sacarificación calculados por la modelaciónmatemática a partir de Michaelis Menten fueron los siguientes:Para Km el valor de maíz fue de 20.09 mg/ml, de sorgo ceroso 0.23 mg/mly para sorgo normal 0.35 mg/ml. En lo que respecta a Vmax, el maíz seobtuvo un valor de 0.68, el sorgo ceroso 0.85 y el sorgo normal 0.74.

En la isomerización la Vmax de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal fueronde 1.40 mg/min, 1.38 mg/min y 1.13mg/min, respectivamente. Losvalores de Km obtenidos en la isomerización para maíz sorgo ceroso ysorgo normal fueron de 131.21, 114.45 y 173. 69 respectivamente.

Este estudio demuestra claramente que es factible producir jarabesdextrinizados, glucosados y fructosados, a partir de sorgo ceroso (más que

71

Conclusiones

sorgo normal). Sin embargo, el maíz tuvo un rendimiento deaproximadamente 6% más de almidón que los dos tipos de sorgo. Una vezobtenidos los almidones, el rendimiento y calidad de los jarabes fueronmuy similares. Se sugiere idear métodos para incrementar los rendimientosde almidón de sorgo si se desea que rinda semejantemente al jarabe demaíz.

72

Resumen

6. RESUMEN

El presente trabajo consistió en obtener jarabes fructosados de dos

diferentes variedades de sorgo, comparado con el maíz. Para alcanzar ese

objetivo, primeramente se obtuvo almidón a través de un procesoexperimental de molienda húmeda y posteriormente se convirtió el almidónen tres pasos secuenciales biocatalíticos en jarabes fructosados.

Para la obtención del jarabe fructosado primeramente se procedió a una

licuefacción con a-amilasa termorresistente donde al mismo tiempo segelatinizó el almidón y se hidrolizó a dextrinas. Posteriormente el jarabe

dextrinizado se sacarificó con un complejo de amiloglucosidasa, p-amilasay pululanasa. Terminada la sacarificación se procedió a refinar el jarabeglucosado por medio de centrifugación, y el paso a través de columnas

secuenciales de carbón activado, resina amónica y resina catiónica.Finalmente los jarabes refinados y clarificados se sometieron a una

isomerización, con un sistema inmovilizado de glucosa isomerasa.

Se llevaron a cabo dos modelaciones matemáticas para obtener los

parámetros cinéticos así como las concentraciones finales de glucosa y las

concentraciones iniciales de fructosa de las corridas promedio desacarificación e isomerización.

Los rendimientos obtenidos de almidón fueron 66.7%, 60.3% y 61.0% para

el maíz, sorgo ceroso y sorgo normal, respectivamente y en jarabesglucosados de maíz, sorgo ceroso y sorgo normal, obtenidos partiendo de300mg/ml de suspensión de almidón fueron de 265.02 mg/ml,

251.85mg/ml y 264.18 mg/ml de acuerdo al análisis experimental. De

acuerdo a las modelaciones matemáticas fueron de 236.20, 244.52 y

73

Resumen

222.78, respectivamente. En la refinación diminuyó la concentración deglucosa en un 17.35% en maíz, 16.82% en sorgo ceroso y 17.55% de sorgonormal. El porcentaje de conversión de glucosa a fructosa obtenido en laisomerización fue de 50.32 para maíz, 50.39 para sorgo ceroso y 45.55para sorgo normal.

Los valores de Km en la sacarificación para el en maíz, sorgo ceroso ysorgo normal fueron de 20.09, 0.23, y 0.35 respectivamente. En lo querespecta a Vmax para sacarificación obtenida de la modelación deMichaelis Menten y de la modelación logística, el maíz tuvo un valor de0.68 y 0.67, el sorgo ceroso 0.85 y 1.02 y el sorgo normal 0.74 y 0.82respectivamente.

Los valores de Km en la isomerización para el maíz, sorgo ceroso y sorgonormal fueron de 131.21, 114. 45 y 173. 69 respectivamente. En lo querespecta a Vmax para isomerización el maíz tuvo un valor de 1.40, el sorgoceroso 1.38 y el sorgo normal 1.13.

Los rendimientos de jarabes fructosados ajustados a 70° Brix basados enlOOgr de grano y a datos experimentales fueron de: 69.34, 63.25, 60.36 mipara el maíz, sorgo ceroso y sorgo normal, respectivamente.

Los rendimientos de jarabes fructosados ajustados a 70° Brix basados enlOOgr de grano y a modelación logística fueron de: 66.07, 62.28, 57.74 parael maíz, sorgo ceroso y sorgo normal, respectivamente.

Este estudio demuestra que es factible producir jarabes fructosados a partirde sorgo normal y ceroso. Para incrementar los rendimientos de jarabefructosados de sorgo es importante mejorar la efectividad del proceso de

74

Resumen

molienda húmeda para aumentar los rendimientos de almidón a un nivelsimilar al obtenido de maíz.

75

Bibliografía

7. BIBLIOGRAFÍA

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80

Anexo

ANEXO

81

AnexoComparación de modelos no-lineales para las concentraciones de glucosay fructosa.

Metodología Estadística

Se presenta la metodología estadística para el caso de la concentración de glucosa y posteriormente seindican los resultados para la concentración de fructosa.

GLUCOSAEl problema estadístico consiste en determinar si las tres muestras de concentraciones de glucosa soniguales.El problema se encuentra dentro del contexto siguiente: el de analizar datos con modelos no-linealesque requiere no sólo de diferentes pruebas estadísticas sino de la comparación de un mismo modelodentro de situaciones experimentales diferentes. Para realizar este tipo de análisis se requiere pasar porlas siguientes etapas.

a) Elegir un modelob) Estimar los parámetrosc) Validar el modelod) Comparar varias "realizaciones o versiones" del modelo

En un primer paso se realiza el ajuste individual del modelo para cada tratamiento y después se ajustandiferentes versiones del mismo modelo dejando uno o dos parámetros comunes a los datos de los trestratamientos. En el segundo paso se comparan las realizaciones de los modelos para decidir cuál es elque mejor describe el comportamiento de la concentración de glucosa de los tres tratamientosdiferentes.

Aunque se puede realizar el ajuste de un polinomio, un modelo no-lineal es preferible. Este tipo demodelos tiene parámetros que tienen un significado en el contexto del problema como la tasa decrecimiento, la concentración inicial y la concentración máxima.

DatosSe trabajó con parejas de datos (t¡, y,) para i = 1,2,...., n donde cada y¡ es la concentración de glucosaen el tiempo t¡ . Existen tres repeticiones de medición para cada tratamiento en el mismo tiempo t¡para la glucosa. En el caso de la fructosa las y¡ son la media de las observaciones repetidas.

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Elección del Modelo

Para explicar el crecimiento de la concentración de glucosa se probaron dos modelos el de Gompertz yel de la Logística, ver por ejemplo Seber y Wild (1989). La elección se hizo después de hacer unaobervación del comportamiento gráfico de los datos que muestran un crecimiento a partir de un valor

inicial y una asíntota horizontal para los valores grandes de tiempo. De acuerdo con el comportamientomencionado se eligió el modelo de la Logística. Las características y calidad del ajuste son casi lasmismas en ambos ajustes y las sumas de cuadrados de los errores son muy parecidas.

El modelo de la Logística es:

ay h error(l + 2»*exp(-c*0)

el significado de los parámetros es:a - concentración máximab - concentración inicialc - tasa de crecimiento

El criterio de estimación empleado para realizar los ajustes fue el de cuadrados mínimos. Y en cuantoal software empleado fue SPLUS versión 6.1 ver por ejemplo Crawley (2002)

Se realizaron también ajustes de modelos compuestos, es decir, ajustes de modelos que compartenalgunos parámetros en común. El criterio de Akaike (AIC) (Lebreton et al, 1992) fue empleado comouna herramienta para la selección de modelos. Y también la prueba F basada en el cociente deverosimilitud donde la hipótesis que se prueba es Ho: Modelo con parámetros comunes, ver porejemploRatkowskyD.A (1983: 135)

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Resultados Glucosa

Tratamiento

Maíz

Sorgo ARG

Sorgo 631

DesviaciónParámetros estándar del

parámetroestimado

abc

abc

abc

236.21.903020.6711

244.5222.822971.02416

222.7862.04473

0.824175

4.69390.3292840.109435

4.230090.5663270.160117

4.409710.4014120.147164


ab ac be

-0.0092 -0.44 0.655

-0.0282 -0.329 0.726

-0.009 -0.383 0.676

Tabla 1 .Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento (glucosa) con el modelo Logísticoy(t) = a /(1 + b¡ e"c" ) donde a es la concentración máxima, b es la concentración inicialy c es la tasa de crecimiento. ARG significa sorgo ceroso y 631 significa sorgo normal.

Se procedió entonces a realizar pruebas para ver:Si un solo modelo era suficiente para explicar el crecimiento de la concentración de glucosa.Si se requerían tres modelos, uno para cada tratamientoSi algún modelo compuesto era necesario (cada uno de los modelos compuestos compartía unoo dos parámetros)

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Diciembre 2003


Los resultados de los modelos compuestos se encuentran en la Tabla 2 con los valores de cada una delas herramientas para elegir el mejor modelo, el criterio de Akaike y el valor p de la prueba F.

Modelo

a /(1 + b¡ €a¡ /(1 + b ea( /(1 + b¡ ea /(1 + b ea /(1 + b¡ ea¡ /(1 + b ea /(1 + b eai /(1 + bi e

i '0* ')-C i t )

l " c t )- d t )- C . J

• c t )• c t ),-c.t )

Descripción

a comúnb comúnc comúna y b comunesa y c comunesb y c comunesa, b y c comunesa, b y c individuales

AIC Prueba Fvalor p

177.975169.223169.483177.218182.652165.967179.374171.000

0.02770.37030.33400.05280.02230.58700.0491

Tabla 2. Resultados de los ajustes compuestos con el modelo Logístico y(t) = a /(I + b¡ e"C 1 ' ) donde a es laconcentración máxima, b es la concentración inicial y c es la tasa de crecimiento.Los modelos compuestos presentan el valor del criterio de Akaike (AIC) así como el valor p de la prueba F

Así que de acuerdo con ambos criterios de selección, el más bajo criterio de Akaike y el valor p másalto, se sugiere el uso del modelo que comparte los parámetros b y c comunes.

Así el modelo seleccionado es:

, . x 233.421yímctiz) h error(1 + 2.2382 * exp(-0.847092 * /))

,D^ 245.602y(soreoARG) h error (1)(1 +2.2382 *exp(-0.847092*0)

223.229y(soreo631) = + error(1 +2.2382 *exp(-0.847092*/))

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Se continúa con el análisis ahora con la comparación 2 a 2 de los parámetros a¡ del modelo elegido. Seutiliza una prueba t (ver por ejemplo Kleinbaum & Kupper 1978:101) con el objeto de verificar lasdiferencias entre las concentraciones máximas de cada tratamiento.

t =

si Ho 01 = 02

y las regiones críticas son:

t >t^_a para Ha.d\>$2?</!_„ paraHa:Q\<&2\t\> tapara

2

tHo: a¡ = 3j

valor p conclusiónHo: a¡ < 3j

valor p conclusiónSorgo ARG vs Maíz

Máiz vs Sorgo 631Sorgo ARG vs Sorgo 631

2.1530 0.0328 rechazoRegión de

1.8101 0.0722 incertidumbre3.9628 0.0001 rechazo

0.0164 rechazo

0.03610.0001

rechazorechazo

Tabla 3. Comparación 2 a 2 del parámetro a del modelo elegido (1). ARG significa sorgo ceroso y 631 significasorgo normal.

Los resultados de la aplicación de esta prueba a los parámetros estimados indican que:a) el parámetro a de sorgo ARG e mayor que el parámetro a del maíz.b) el parámetro a de maíz es mayor que el parámetro a de sorgo 631c) el parámetro a de sorgo ARG es mayor que el parámetro a de sorgo 631


Diciembre 2003


FRUCTOSA

DatosSe trabajó con parejas de datos (t¡, y¡) para iobservaciones repetidas en el tiempo t¡.

= 1, 2, ...., n donde cada y¡ es la media de las

Elección del ModeloPara explicar el crecimiento de la concentración de fructosa se ajustó el modelo exponencial, ver porejemplo Seber & Wild (1989).

El modelo Exponencial es:

y - a * exp(/7 * t) + error

el significado de los parámetros es:a - concentración inicial al tiempo ceroP - tasa de cambio

Resultados Fructosa

Tratamiento

Maíz

Sorgo Ceroso

Sorgo normal

Parámetros

aP

aP

aP

208.021-0.00541606

217.058-0.0049885

198.298-0.00382651

Desviación Correlaciónestándar entre

parámetrosa p

4.903110.000421762

4.860260.000389065

4.742520.000383922

-0.677

-0.683

-0.701

Tabla 4. Resultados de los tres ajustes a los datos cada tratamiento (fructosa) con el modelo Exponencial

y(t) = a* (P*t) donde a es la concentración inicial al tiempo cero y p es la tasa de cambio.

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Diciembre 2003


Modelo

aep i t

a¡ep t

a¡epit

a e p t

Descripción

a común

p común

a y p comunesa y p individuales

AIC Prueba FP

33.575

34.224

36.86530.000

valor

0.0424

0.0338

0.0225

Tabla 5. Resultados de los ajustes compuestos con el modelo Exponencial y(t) = a* (P*t) donde a es laconcentración inicial al tiempo cero y p es la tasa de cambio.Los modelos compuestos presentan el valor del criterio de Akaike (AIC) así como el valor p de la prueba F

Así que de acuerdo con el más bajo criterio de Akaike se sugiere el uso de tres conjuntos deparámetros.Así los modelos seleccionados son:

y(maíz) = 208.021 * exp(-0.005416 * /) + error

y(sorgo ceroso} = 217.058 * exp(-0.004988 * /) + error (2)

y(sorgo normal) = 198.298 * exp(-0.003826 * t) + error

Se continúa ahora con la comparación 2 a 2 de los parámetros a¡ del modelo elegido. Se utiliza unaprueba t (ver por ejemplo Kleinbaum & Kupper 1978:101) con el objeto de verificar cuáles son losparámetros diferentes entre los tratamientos

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gDiciembre 2003


a

Sorgo ceroso vs MaízMaíz vs Sorgo normalSorgo ceroso vs Sorgo normal

t1.30901.42542.7626

Ho:valor p0.20700.17120.0128

a¡ = ttjconclusiónno rechazono rechazo

rechazo

Ho:valor p0.10350.08560.0064

a¡ < ctjconclusiónno rechazono rechazo

rechazo

P

Sorgo ceroso vs MaízMaíz vs Sorgo normalSorgo ceroso vs Sorgo normal

t0.74512.78712.1259

Ho:valor p0.46580.01220.0476

Pi = Pjconclusiónno rechazo

rechazorechazo

Ho:valor p0.23290.00610.0238

Pi * PJconclusiónno rechazo

rechazorechazo

Tabla 3. Comparación 2 a 2 de los parámetros a y P del modelo elegido (2)

Los resultados de la aplicación de esta prueba a los parámetros estimados indican que:a) el parámetro a del sorgo ceroso es mayor que el parámetro a del sorgo normal.b) el parámetro P del maíz es mayor que el parámetro P del sorgo normalc) el parámetro P del sorgo ceroso es mayor que el parámetro P del sorgo normal

d) el parámetro a de sorgo ceroso es igual que el parámetro a del maíz.e) el parámetro Ct del maíz es igual que el parámetro a del sorgo normalf) el parámetro P del sorgo ceroso es igual que el parámetro p del maíz

Comentarios sobre la comparación

El haber comparado los parámetros en forma separada (2 a 2) aumenta la correlación que pueden tenerlos parámetros estimados. En efecto los parámetros a y P tienen correlaciones superiores a -0.6 Estaspruebas resultan, de un cierto modo simplistas aparte de correlacionadas.


Diciembre 2003


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Participaron en la elaboración de este análisis, del Departamento de Matemáticas:Rebeca Romero Álvarez y Clara P. Domínguez Islas

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obtenciÓn de jarabes fructosados a partir de

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