Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis microbiológico del suelo

1) Normas prácticas para el muestreo de suelo

2) Técnicas para el cultivo de microorganismos

3) Técnicas de observación al microscopio

4) Métodos de aislamiento y conservación

PRÁCTICO N° 1

Técnicas para el estudio de microorganismos del suelo

1) Diseño de muestreo:

• Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote

• Forma de muestreo: cultivo, sistema de labranza

• Profundidad: 0 – 20 cm

2) Acondicionamiento de las muestras

3) Preparación de las muestras en laboratorio

Normas prácticas para el muestreo de suelo

Cantidad de muestras: topografía y heterogeneidad del lote

15 Submuestras = 1 MuestraLoma

Medialoma

Bajo

Imagen Satelital Mapa de Rendimiento Mapa de Ambientes

Agricultura de Precisión

Elementos de muestreo

Barreno HidráulicoPala Barreno Manual

Forma de muestreo: cultivo y sistema de labranza

Siembra directa Labranza convencional

Rastrojo de maíz Rastrojo de soja Suelo laboreado

Forma de muestreo: profundidad

0 cm.

20 cm.

Acondicionamiento de las submuestras

~200 g.

Preparación de las muestras en laboratorio

Oreado

Tamizado

Embolsado y Rotulado

Conservación

Mínimo 24 hs.

Requerimientos para el cultivo de microorganismos en laboratorio:

1) Condiciones de asepsia: esterilización

2) Medios de cultivos

3) Condiciones ambientales

Técnicas para el cultivo de microorganismos

Condiciones de asepsia: esterilización

• Esterilización: eliminar todos los organismos vivos

• Métodos de esterilización:– Calor: húmedo y seco

– Radiación

– Filtración

– Productos químicos

Calor húmedo: Autoclave

A gas con regulación manual

Eléctrica con regulación automática

Combinación de calor, presión y humedad

Para sustancias acuosas

Temperatura de esterilización: 121°C - 20 minutos

Temperatura de esterilización: 160 °C Tiempo: 2 hs

Calor seco: Horno de esterilización

Para materiales estables al calor (vidrio, metal, porcelana etc.)

Vista exterior

Vista interior

Otros métodos de esterilización

Filtración: soluciones lábiles

•Agua Oxigenada •Alcohol etílico•Hipoclorito•Formol•Bicloruro de mercurio

Radiación UV: superficies, aire y agua

Productos químicos: mesada,manos, tapones, etc.

Filtro

Medios de cultivos

• Definición: mezcla balanceada de requerimientos nutritivos para el crecimiento de microorganismos

• Tipos: – Generales – Selectivos

• Composición química: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, fuente de energía, base mineral y factores de crecimiento

• Características: líquidos o sólidos: agentes solidificantes

Composición de medios de cultivos

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD

Fuente de C y

energíaSucrosa 20 g

Base mineral

Fosfato di potásico 0.05 g

Fosfato monopotásico

0.15 g

Cloruro de calcio 0.01 g

Sulfato de magnesio

0.2 g

Molibdato de sodio 0.002 g

Cloruro férrico 0.01 g

Carbonato de calcio

0.1 g

Agua Agua destilada 1000 ml

pH = 7

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD

Fuente de C y energía

Almidón 12 g

Fuente de N NO3 Na 0.5 g

Base mineral

PO4 HK2 1.0 g

SO4 Mg 7 H2O 0.5 g

Agente solidificante

Agar 15 g

Agua Agua destilada 1000 ml

pH = 7

Medio selectivo: Fijadores de NitrógenoMedio general

Preparación de medios de cultivo

encender colocar recipiente para pesar

tarar

colocar el componente a pesarregistrar la

lectura

Pesar componentes sólidos:

Disolver con agua destilada: hidratar

componentes sólidos agregar agua

disolver

Regular pH: pHmetro

soluciones reguladoras encendido y lavado lectura

lavado del electrodoprotección del electrodo

Preparación de medio sólido

agregar agar

fundir al calor

medio líquido

medio agarizado

Fraccionar y acondicionar para esterilizar

Fraccionamiento demedio líquido

Fraccionamiento demedio sólido

(en caliente)

Acondicionado para esterilizar

Esterilizar en autoclave

Medios en “Pico de flauta”

Visualización de microorganismos: porta objeto enterrado

Suelo en estudio Portaobjeto enterradoRiego

Incubación

Cultivo de microorganismos del suelo en medio líquido

Incubación

Siembra Dilución

Muestreo de suelo

Cantidad de

muestras

Composición

Profundidad

Tamaño del lote

Topografía

Una muestra

n° submuestras

0-20 cm.con

rastrojos

Preparación de muestras en laboratorio

Oreado Tamizado Envasado y Rotulado Conservación en heladera

Guardar en conservadora

Laboratorio

Esterilización

• Autoclave - horno• Radiación• Filtración• Productos químicos

Medio de cultivo Observación Aislamiento

Práctico 2

Composición química

• Base mineral• Fuente de carbono• Fuente de energía• Agua

Preparación de medios

Líquidos

• Pesar drogas• Disolver con agua destilada• Regular pH• Fraccionar

Sólidos

• Pesar drogas• Disolver con agua destilada• Regular pH• Agarizar• Fundir• Fraccionar

Esterilización en autoclave

Siembra de suelo

Incubación

Práctico 1

Actividades

1) Preparación de muestras de suelo en laboratorio:

tamizar, embolsar y rotular.

2) Visualización de microorganismos de suelo:

enterrar un portaobjeto.

3) Cultivo de microorganismos de suelo: colocar una

alícuota de suelo en medios general y selectivo enterrar

un portaobjeto.

4) Visita al Laboratorio de Microbiología Agrícola F.C.A