UNIVERSIDAD PRIVADA NORBERT WIENER

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Validacin del Mtodo Analtico Microbiolgico: Valoracin de Gentamicina 0.1% en un Producto Terminado

ALUMNO:Luis Vignolo Asencio Asesor:Q.F. CARLA HUANQUI ZAMBRANO

LIMA PER2013

RESUMEN

Los antibiticos son sustancias obtenidas a partir del metabolismo microbiano para matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos, constituyen un bien esencial para el ser humano en la prevencin y cura de infecciones; por eso deben pasar una serie de anlisis que certifiquen su calidad y eficacia. De manera que una de las pruebas ms importantes para estos medicamentos es la determinacin de potencia microbiolgica.La presente investigacin formativa tiene como objetivo principal estandarizar la tcnica analtica y posteriormente validar, es decir, demostrar mediante evidencia documentada, en el Laboratorio de control de calidad de la Empresa Farmacutica, la tcnica analtica microbiolgica para determinar la actividad in vitro (potencia) del antibitico gentamicina en productos farmacuticos terminados que respondan a una formula maestra de preparacin 0.1% de gentamicina. Se describi y desarrollo el proceso de validacin a travs del mtodo difusin en agar y el microorganismo sometido a prueba fue Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. De esta manera, se puede cuantificar su concentracin (valoracin), evidenciando la capacidad de cumplir en forma consistente y repetitiva las especificaciones establecidas, que incluye los requisitos exigidos en la determinacin de parmetros analticos de linealidad del mtodo, especificidad, exactitud y la precisin .Finalmente se determin que si bien la prueba no es complicada, tcnicamente el Laboratoriode Control de Calidad de la empresa se encuentra en condiciones ptimas para poder validar el mtodo analtico.

Palabras claves: Antibitico, gentamicina, Staphylococcus epidermidis, validacin, mtodo analtico microbiolgico, valoracin.

INDICERESUMEN

I. INTRODUCCION II. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIN2.1 Objetivo general2.2 Objetivos Especficos. III.MARCO TERICO3.1 Conceptos de Validacin3.2 Tipos de validacin 3.3 Parmetros a validar en una prueba cualitativa 3.4 Parmetros a validar para la estimacin cuantitativa de microorganismo viables.3.5 Calidad en la industria farmacutica.3.6 Buenas prcticas de Manufactura (BPM).3.7 Aminoglucsidos. 3.8 Potencia microbiolgica de gentamicina. IV. PARTE EXPERIMENTAL 4.1 Metodologa

4.2 Montaje de la Prueba.

4.3 Clculo de potencia.

V.COSTOS VI.DISCUSION VII.CONCLUSIONES VIII.REFERENCIAS BIBLIOGRFICA

I.- INTRODUCCIN

En la actualidad se ha generado una gran aceptacin e inters por los temas relacionados con seguridad y calidad de los productos farmacuticos, teniendo presente que estos son Productos muy importante dentro de la asistencia de la salud.

Es por esto que da a da se recurre a la implementacin de nuevas tecnologas y frmulas farmacuticas con el fin de desarrollar sistemas rigurosos de calidad que proporcionen y aseguren al consumidor un producto de alta calidad que cumpla con las especificaciones.

Adicionalmente, la industria farmacutica peruana debe velar por el total cumplimiento de la normatividad nacional e internacional en casos de exportacin de frmacos, teniendo presente que los procedimientos deben estar validados para su implementacin y cumplimiento de la legislacin, en el caso de la industria farmacutica peruana la normatividad se basa principalmente en DIGEMID, BPM, FDA y USP.La validacin de un proceso toma gran relevancia en el mismo, ya que es la demostracin escrita y experimental con un alto grado de confianza que un transcurso especfico arrojar de forma consistente y permanente productos que poseern las caractersticas de calidad predefinidas.

Para lograr obtener una produccin de frmacos que cumpla con los requerimientos del consumidor se deben evaluar muchos aspectos importantes que intervienen en dicha produccin como lo son la infraestructura, procedimientos, documentacin y procesos como muestreo, fabricacin, anlisis y evaluacin de todos los factores que intervienen en el proceso productivo, asegurando que sean bajo las condiciones que garantizan que los materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de calidad que ha sido juzgado como satisfactorio.

La evaluacin de calidad microbiolgica de materias primas, material de envase y/o un producto farmacutico terminado, juega un papel importante dentro de las caractersticas que le confieren la calidad a un frmaco, ya que la valoracin de los microorganismos presentes reflejara la calidad de los mismos y el proceso de produccin al cual fueron sometidos. Es indispensable conocer las especificaciones microbiolgicas de cada uno de los productos farmacuticos a analizar, ya que el recuento total de microorganismos presentes, o la ausencia o presencia de determinados microorganismos patgenos en el producto pueden conferirle la conformidad o no al producto final, con el objetivo de liberar siempre productos de alta calidad que no atenten contra el paciente y/o pueda presentar carga microbiana que afecte las caractersticas fisicoqumicas del producto.

En la industria farmacutica se requiere de una serie de pruebas que aseguren la calidad de los componentes de un determinado medicamentos, como por ejemplo, los ensayos de estabilidad, que se definen como estudios cuyos resultados sustentan la proposicin de aprobacin, la comprobacin y/o modificacin del periodo de validez o de las condiciones de almacenamiento rotuladas de un producto farmacutico. Otra prueba importante es la determinacin de la potencia o actividad conceptualizada como el contenido de principio activo o frmaco presente en un producto farmacutico o en una unidad de dosificacin.

Ambos parmetros son fundamentales para garantizar a la empresa productora y a los clientes el cumplimiento de ciertas especificaciones para mantener un alto nivel de efectividad y eficiencia en el producto.

De modo que, estos se convierten en dos de los ensayos ms importantes durante el control de calidad de los mismos, pues permiten conocer su rango de accin y las diferentes dosis necesarias, adems de la duracin y permanencia de estas con respecto al tiempo y las condiciones de almacenamiento.

II. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACION

2.1 OBJETIVO GENERAL

Implementar en el Laboratorio de Control de Calidad de una Empresa de la Industria Farmacutica Peruana la prueba para determinar la potencia del antibitico gentamicina en productos farmacuticos terminados.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Establecer y estandarizar el protocolo para llevar a cabo la prueba de potenciao actividad de antibiticos basndose en la metodologa USP y segn los recursos con que cuenta la empresa.

En el caso de gentamicina indagar o probar la conveniencia de aplicar el mtodo de cilindro-placa o turbidimtrico segn sus requerimientos y los resultados obtenidos en cada caso.

Determinar todos los requerimientos de reactivos y materiales para calcular el costo del ensayo y compararlo con el gasto actual por realizacin de la prueba en laboratorios externos.

Establecer una relacin costo-beneficio para la empresa al evaluar la factibilidad de que la prueba se realice como parte de las actividades de rutina del laboratorio de control de calidad.

III.-MARCO TERICO

3.1 CONCEPTOS DE VALIDACION

VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS ALTERNATIVOS

La validacin de un mtodo microbiolgico es un proceso importante para la implementacin de una tcnica analtica microbiolgica, ya que por medio de la validacin de dicho mtodo se logra establecer de forma experimental que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen con los requisitos para la aplicacin prevista. (USP 36)Para la recuperacin e identificacin microbiana, en anlisis microbiolgicos, son ajustadas a veces a mtodos alternativos a los descritos en la USP por diversas razones, tales como econmicas, de produccin y conveniencia. Por tanto estos mtodos requieren validacin. (USP 36).

En los estudios de validacin de mtodos microbiolgicos alternativos es importante tener en cuenta un importante grado de variabilidad. Cuando se llevan a cabo pruebas microbiolgicas por conteo en placa convencional, el cual es el mtodo a escogido para el presente trabajo; se puede llegar a encontrar resultados con porcentajes de desviacin estndar relativa de 15 a 35 ya que muchos mtodos microbiolgicos convencionales estn sujetos a errores de muestreo, de dilucin, de incubacin y del operador. (USP 36).

La importancia de la validacin de las tcnicas analticas en el anlisis de un producto es gran utilidad e importancia ya que ante todo es parte esencial de las BPMv (Buenas Prcticas de Manufactura Vigentes) ya que es una forma certera y consistente de afirmar cuando un proceso est conforme, es exacto y reproducible.Tambin es un gran aporte a la reduccin de costos y la optimizacin de procesos ya que las tcnicas se desarrollan con eficacia, rapidez y seguridad, disminuyendo el tiempo muerto en equipos.

3.2.- TIPOS DE VALIDACION

A. Validacin Prospectiva

Este tipo de validacin se basa en informacin obtenida antes de implementar los procesos de validacin. Se realiza durante la etapa de desarrollo, mediante un anlisis de riesgos del proceso de produccin, que se divide en pasos individuales, estos se evalan entonces a la luz de la experiencia para determinar si podra concluir a situaciones crticas; se investigan posibles causas y se determina la probabilidad de que suceda y su magnitud, se trazan los

planes de ensayo y se fijan las prioridades; a continuacin se efecta y se evalan los ensayos y se hace una valoracin general; si los resultados son aceptables al final, el procesos es satisfactorio. Los procesos no satisfactorios se deben modificar y mejorar hasta que una nueva validacin demuestre su carcter satisfactorio. Este tipo de validacin es importante para limitar el riesgo de errores que se producen a escala de produccin, por ejemplo, en la preparacin de productos inyectables. (Comisin Europea, 2001).

B. Validacin Concurrente

La informacin requerida en este tipo de validacin se obtiene durante la implementacin delMismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de la variable critica que demuestre que el proceso esta bajo control y el riesgo de datos sobre la marcha de los procesos en estado productivo. (Comisin Europea, 2001).

Para otros autores la validacin concurrente es el establecimiento de evidencia documentada para demostrar que un proceso cumple con su propsito, basados en informacin obtenida durante la implementacin del mismo. Se debe tener en cuenta el monitoreo en proceso de las variables crticas que demuestren que el proceso esta bajo control y el registro de datos sobre la marcha del proceso en estado productivo.

C. Validacin Retrospectiva

Este tipo de validacin se lleva a cabo por medio de la revisin y anlisis de la informacin histrica del proceso. Se deben tomar como mnimo 20 a 30 lotes que cuenten con reportes analticos slidos y confiables, documentacin que muestre condiciones de los procesos y estudios de reclamos de los productos, entre otros. Dentro de este tipo de validacin esNecesario tener en cuenta el control de la materia prima, controles ambientales, controles microbiolgicos, equipos, procedimientos, mtodos analticos y especificaciones; es aplicadapara productos que se encuentran en el mercado y cuyo proceso de manufactura se considera estable, adems cuando por las caractersticas del producto, econmicamente no se justifica hacer una validacin prospectiva. La validacin retrospectiva tambin puede ser til en el establecimiento de las prioridades en un programa de validacin (Comisin Europea, 2001)

D. Revalidacin

Es la repeticin de un procedimiento de validacin o en parte del mismo. Se aplica cuando se presentan cambios de algunos de los componentes crticos de la formulacin, cambio o reemplazo de una pieza critica en un sistema o equipo, cambio

de instalaciones, cambio del tamao del lote de fabricacin y por unidades producidas fuera de especificaciones (Comisin Europea, 2001)

3.3 .-PARAMETROS A VALIDAR EN UNA PRUEBAS CUALITATIVA

Con el fin de evaluar y demostrar la existencia de microorganismos viables en una muestra se deben tener en cuenta los parmetros descritos a continuacin, aunque es importante tener presente que no todas las caractersticas son aplicables a cada procedimiento analticoo a cada material. Ello depende en gran medida del propsito al cual se desea aplicar el procedimiento.

I. Especificidad

La especificidad de un mtodo microbiolgico es la capacidad, para detectar una gama de microorganismos que pueden estar presentes en la muestra. Este problema se enfrenta deManera adecuada a travs de la promocin del crecimiento en los medios para mtodosCualitativos que dependen del crecimiento para demostrar la presencia o ausencia deMicroorganismos. (USP 36)

II. Lmite de Deteccin

El lmite de deteccin es el nmero ms bajo de microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas. (USP 36)

III. Tolerancia

La tolerancia de un mtodo microbiolgico cualitativo es el grado de precisin de los resultados de la prueba obtenidos mediante el anlisis de las mismas muestras bajo diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos, lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia intrnseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados del mtodo microbiolgico. (USP 36).

IV. Robustez

La robustez de un mtodo microbiolgico cualitativo es la medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeas, aunque deliberadas, en los parmetros del mtodo, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal. (USP 36).

3.4.- PARAMETROS A VALIDAR PARA LA ESTIMACIN CUANTITATIVA DE MICROORGANISMOS VIABLES EN UNA MUESTRA

Existen dos tcnicas disponibles y convenientes para datos microbiolgicos. Los datos crudos de los recuentos pueden transformarse en datos normalmente distribuidos, ya sea tomando el valor del Log, para ese recuento o calculando la raz cuadrada del recuento 1. Esta ltima transformacin es especialmente til si los datos contienen recuentos de cero. (USP 36).

I. Exactitud

La exactitud es la proximidad de los resultados de la prueba obtenidos mediante el mtodo de prueba respecto a los obtenidos por el mtodo tradicional. Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de la recuperacin de los microorganismos mediante el mtodo de valoracin. (USP 36, 2013).La exactitud de un procedimiento empleado consiste en la proximidad de los resultados obtenidos al valor real. La exactitud puede determinarse aplicando el procedimiento a las muestras del material a examinarse, cuando han sido preparadas con exactitud cuantitativa.Siempre que sea posible, esas muestras deben contener todos los componentes del material, incluyendo el analito. Deben prepararse tambin muestras en las que el analito haya sido incorporado en cantidades de aproximadamente 10% por encima y por debajo de la gama de valores prevista. Tambin es posible determinar la exactitud comparando los resultados con los obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. (OMS).

II. PrecisinLa precisin de un mtodo microbiolgico cuantitativo es el grado de coincidencia entre los resultados de las pruebas individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a muestreos mltiples de suspensiones de microorganismos de laboratorio a lo largo del intervalo de la prueba. La precisin de un mtodo microbiolgico habitualmente se expresa como la desviacin estndar o la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin). La desviacin estndar relativa esperada en funcin de UFC/ Placa es la siguiente:

III. Especificidad

La especificidad de un mtodo microbiolgico cuantitativo es su capacidad para detectar un panel de microorganismos aptos para demostrar que el mtodo sirve al objetivo propuesto. (USP 36, 2013).

IV. Lmite de Cuantificacin

El lmite de cuantificacin es el nmero ms bajo de microorganismos que pueden contarse con exactitud. (USP 36, 2013).

V. Linealidad

La linealidad de una prueba microbiolgica cuantitativa es su capacidad para generar resultados que sean proporcionales a la concentracin de microorganismos presentes en la muestra dentro de un intervalo dado. (USP 36, 2013)Linealidad para otros autores es considerado tambin como un proceso analtico donde existe la posibilidad de que este produzca resultados que sean directamente proporcionales a la concentracin de analito en la muestra (OMS)

VI. Lmite de Deteccin

El lmite de deteccin es el nmero ms bajo de microorganismos en una muestra que puede detectarse bajo las condiciones experimentales establecidas.

VII. Intervalo

El intervalo operativo de un mtodo microbiolgico cuantitativo. Es el intervalo que existe entre los niveles superiores e inferiores de microorganismos que han demostrado poder determinarse con precisin, exactitud y linealidad.

VIII. Tolerancia

La tolerancia de un mtodo microbiolgico cualitativo es el grado de precisin de los resultados de la prueba obtenidos mediante el anlisis de las mismas muestras bajo diversas condiciones normales de prueba, tales como el empleo de analistas, instrumentos, lotes de reactivos y laboratorios diferentes. Se puede definir tolerancia como la resistencia intrnseca a influencias ejercidas por variables operativas y ambientales sobre los resultados del mtodo microbiolgico.

IX. . Robustez

La robustez de un mtodo microbiolgico cualitativo es la medida de su capacidad para no ser afectado por variaciones pequeas, aunque deliberadas, en los parmetros del mtodo, representa un indicador de su confiabilidad durante uso normal.

3.5.-Calidad en la industria farmacutica

En la industria farmacutica, existen aspectos fundamentales como lo son la infraestructura, procedimientos y procesos, necesarios para garantizar la produccin de frmacos que cumplan con todos los requerimientos del consumidor, estn convocadas dentro del sistema de garanta de calidad, la cual se caracteriza por ser una herramienta administrativa que apoya las diferentes etapas de produccin generando as mismo productos de alta calidad y reconocimiento ante sus clientes.Los conceptos de garanta de la calidad, BPM, y control de la calidad constituyen aspectos de la administracin de la calidad que se relacionan entre s. (WHO)

El desarrollo de la industria farmacutica ha determinado que se realicen los mayores esfuerzos para optimizar los procesos productivos y los sistemas de control con el fin de Garantizar que los productos farmacuticos obtenidos son confiables y cumplen satisfactoriamente los requerimientos farmacolgicos y teraputicos.

Control De Calidad

El control de calidad es una parte de las Buenas Prcticas de Manufactura que agrupa las normas acerca de organizacin, documentacin y procesos como muestreo, fabricacin, anlisis y evaluacin de todos los factores que intervienen en el proceso productivo, asegurando que cada proceso es llevado a cabo bajo las condiciones que garantizan que los materiales y productos son liberados para su uso, venta o suministro con un alto nivel de

calidad que ha sido juzgado como satisfactorio. El control de calidad no est confinado a operaciones de laboratorio, debe estar involucrado en todas las decisiones concernientes a la calidad del producto. (WHO).

Debe existir un departamento de control de calidad independiente del departamento deProduccin, que permita realizar evaluaciones objetivas en pro del mejoramiento continuo.

Los requerimientos bsicos para el control de calidad son:

a. Instalaciones adecuadas, personal entrenado y procedimientos aprobados. Los documentos deben encontrarse disponibles para cada etapa del proceso de calidad, muestreo, inspeccin y evaluacin de materias primas, materiales de empaque, granel y producto terminado; y donde sea apropiado cuando se realiza monitoreo de condiciones ambientales para los propsitos de las buenas prcticas de manufactura.

b. Los mtodos de ensayo deben ser validados.

c. Los registros deben ser hechos demostrando que todos los muestreos, inspecciones y procedimientos de ensayo requeridos estn siendo llevados a cabo y que cualquier desviacin ha sido totalmente registrada e investigada.

d. Los productos terminados deben ser evaluados para asegurar que contienen la composicin cualitativa y cuantitativa de los componentes descritos en su envase de comercializacin; los componentes deben ser de la pureza requerida, adquiridos de proveedores calificados, en recipientes adecuados y correctamente etiquetados.

e. Los registros deben ser una fiel reproduccin de los hechos, de los resultados de laInspeccin de producto terminado, granel e intermedio contra las especificaciones. LaEvaluacin del producto debe incluir una revisin e inspeccin de la documentacin y unaEvaluacin de las desviaciones de los procedimientos especificados.

f. Los lotes de producto no pueden ser liberados para la venta o suministrados sin antes obtener la certificacin del personal autorizado que est acorde con los requerimientos de comercializacin.

g. Una muestra suficiente de materias primas y productos, deben ser retenidos para permitir la evaluacin futura de estos, si fuera necesario; el producto retenido debe ser guardado en su empaque final.

El departamento de control de calidad como un todo, debe tener otras obligaciones tales como establecer, validar e implementar todos los procedimientos de control de calidad a evaluar, mantener y almacenar los estndares de referencia para sustancias; asegurar el correcto etiquetado de recipientes de materias y productos; asegurar que la estabilidad delos ingredientes activos y los productos estn monitoreados; participar en quejasRelacionadas con la calidad del producto y participar en el monitoreo ambiental. TodasEstas operaciones deben ser llevadas a cabo en concordancia con los procedimientos y registros escritos.

La evaluacin de producto terminado debe abarcar todos los factores relevantes, incluyendo las condiciones de produccin, los resultados de inspeccin en proceso, la documentacin de manufactura incluyendo el empaque, el cumplimiento con la especificacin para el producto terminado y una evaluacin del empaque final. (WHO).De esta forma el control de calidad se puede definir como el sistema que tiene como finalidad lograr una produccin uniforme para colocar en el mercado productos cuyas especificaciones correspondan a lo ofrecido, siendo el elemento que en las plantas industriales favorece el incremento de la eficiencia y productividad.

3.6.- Buenas Prcticas De Manufactura (BPM)

Buenas prcticas de manufactura son una herramienta del aseguramiento de calidadMediante la cual se confirma o asegura que los productos estn consistentementeControlados y producidos con estndares de calidad apropiados para su uso planeado yComo es requerido para su comercializacin.Las BPM son dirigidas primariamente a disminuir riesgos inherentes en cualquier etapa de la produccin farmacutica, que puedan alterar la calidad del producto final. La principalFinalidad es llegar a la prevencin de dos tipos principales de riesgo: Contaminacin cruzada y confusiones causadas por mal etiquetamiento en los contenedores o recipientes. (WHO).

3.7.- AMINOGLUCSIDOS: GENTAMICINA Y NEOMICINA

De manera general, un antibitico se define como cualquier compuesto qumico utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad comn a todos los antibiticos es la toxicidad selectiva, o sea, la toxicidad hacia los organismos invasores y su inocuidad frente a los animales o seres humanos.

Se afirma que la primera observacin de lo que hoy en da se denominara efecto antibitico fue realizada en el siglo XIX por el qumico francs Louis Pasteur, al descubrir que algunas bacterias saprofticas podan destruir grmenes del carbunco (enfermedad tambin conocida como ntrax) (Mascaretti, 2003). Sin embargo, es importante mencionar que desde la antigedad las sociedades se han dedicado a la utilizacin de diversos compuestos (extractos de plantas u hongos) para tratar algunas enfermedades, incluyendo las infecciosas (Martnez et al, 2000).En un principio, el trmino antibitico slo se empleaba para referirse a los compuestos orgnicos producidos por bacterias u hongos que resultaban txicos para otros microorganismos. En la actualidad tambin se emplea para denominar compuestos sintticos o semisintticos que se producen a nivel industrial (Ballest et al, 2006).

Los antibiticos pueden atacar a los grmenes a travs de cualquiera de los siguientes mecanismos: inhibicin de la sntesis de la pared, desorganizacin de la membrana, inhibicin

de la sntesis proteica, interferencia con la sntesis de cidos nucleicos o por analoga con precursores metablicos.

En el recorrido hacia el lugar donde se localiza la infeccin, el antibitico encuentra una serie de obstculos, de manera que la concentracin que finalmente se alcanza en el foco depende de su xito en superarlos. As, un antibitico administrado por va oral debe poseer suficiente estabilidad en el jugo gstrico, debe absorberse en proporcin adecuada en el intestino, no debe ser metabolizado por el hgado en un primer paso, debe fijarse en escasa proporcin a las protenas plasmticas y debe poseer, adems, la necesaria solubilidad para difundir hacia los tejidos.

Es evidente que la prescripcin de un antimicrobiano tiene como finalidad modificar la interaccin agente infeccioso/hospedero en favor de este ltimo. Por lo tanto, la correcta eleccin de un antimicrobiano debe contemplar simultneamente las caractersticas del germen y las caractersticas del hospedero.

Tanto la gentamicina como la neomicina son antibiticos pertenecientes al grupo de los aminoglucsidos (AMG), que pueden resultar indispensables para el tratamiento de algunas infecciones graves causadas por bacterias aerobias gram negativas (USPXXVII, 2013).

Como grupo se caracterizan por:

Pobre absorcin oral

Actividad sobre aerobios gram ().

Oto y nefrotoxicidad

Actividad sobre Mycobacterium tuberculosis

Efecto sinrgico con beta-lactmicos

La estructura qumica comn de este tipo de antibiticos consiste en dos o ms amino azcares unidos por un enlace glucosdico a una hexosa o a un aminociclitol, colocados en posicin central en la mayora de compuestos o en uno de los extremos, como se observa en la figura 1. Son compuestos hidrosolubles y su actividad antibacteriana resulta inhibida en medio cido, en anaerobiosis y en presencia de pus.

Los aminoglucsidos son activos frente a aerobios gram negativos como Pseudomonas aureginosa, E. coli, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterobacter sp, Serratia sp y Citrobacter sp. Son inactivos frente a todos los aerobios gram positivos con excepcin de los estafilococos. Se utilizan en clnica en combinacin con betalactmicos precisamente para potenciar su actividad anti estafiloccica. Por otra parte, todos los estreptococos son resistentes a los aminoglucsidos en concentraciones clnicas, pero la asociacin con beta-lactmicos hace que se vuelvan sensibles. Los anaerobios estrictos y facultativos en condiciones de anaerobiosis son resistentes a los aminoglucsidos.

Estos antibiticos no se metabolizan y su eliminacin es fundamentalmente renal. Todos los aminoglucsidos pueden producir toxicidad vestibular, coclear y renal El primer antibitico de este grupo, la estreptomicina, fue obtenido en 1944 de una cepa de Streptomyces griseus aislada del suelo. Unos aos despus, en 1949, fue aislada a partir de Streptomyces fradiae la neomicina, que slo se utiliza en forma tpica dada su elevada oto y nefrotoxicidad. De manera que, la kanamicina descubierta por Umezawa en Japn en 1957 se convirti en el aminoglucsidos de eleccin hasta el descubrimiento de la gentamicina.

La neomicina est compuesta de Neomicina A, B (la ms usada) y C. Es hidrosoluble y ms activa a pH alcalino (Camacho y Arias, 2002). Es uno de los antibiticos tpicos ms utilizados, est presente en mltiples productos para el tratamiento de lesiones cutneas, oftalmolgicas y otorrinolaringolgicas (Gernimo et al, 2002).

Por otro lado, la gentamicina aislada en 1963 de una cepa de Micromonospora purpurea es eficaz contra numerosas bacterias gram negativas, incluyendo la Pseudomonas aeruginosa. Es un antibitico empleado para tratar infecciones oculares, cutneas, pulmonares, gstricas, urinarias y en sangre.

El mecanismo de accin de este grupo de antibiticos ha sido ampliamente estudiado, sin embargo an no se conoce en todos sus detalles. Todos los aminoglucsidos comparten el mismo mecanismo de accin secuencial, que incluye transporte al interior celular y unin a los ribosomas, donde tradicionalmente se ha considerado que ejercen su accin. Estos interactan unindose de forma irreversible con algunas de las protenas ribosmicas de la subunidad 30S de los ribosomas bacterianos, as como con la molcula 16S de ARN-ribosmico. Las consecuencias de esta unin dependen del estado funcional del ribosoma. Si forma parte de un complejo de iniciacin impiden que progrese a lo largo de la molcula de ARN mensajero y la sntesis proteica es bloqueada completamente. Si forma parte de un complejo de elongacin causan errores en la lectura del ARN mensajero y se producen protenas anmalas que hacen inviable la replicacin bacteriana.

Los AMG se unen por adsorcin a los sitios de unin de cationes Mg2+ de los lipopolisacridos de la superficie bacteriana. Esta unin de tipo inico se produce muy rpidamente, es reversible, y puede ser inhibida por la presencia de cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+) en el medio. Posteriormente los AMG adsorbidos penetran hasta la membrana, en los organismos gram negativos a travs de canales tipo porina de la membrana externa hacia el espacio periplsmico, y en los gram positivos, como en el caso de los estafilococos, a travs de los espacios acuosos del peptidoglicano de la pared celular. Diversos estudios realizados sobre cepas de Pseudomonas aeruginosa aportan datos que sugieren que los AMG destruyen directamente la membrana externa de la envoltura celular de los gram negativos debido a que desplazan de su unin a los cationes necesarios para mantener la estabilidad de los constituyentes de dicha membrana. La desestabilizacin subsecuente se traduce en la formacin de vesculas que, al desprenderse, ocasionan la prdida de componentes de la membrana (protenas, lipopolisacridos, fosfatos), y en la formacin de canales o agujeros, que permiten el libre paso de stos u otros antibiticos hasta la membrana citoplasmtica, as como la salida de componentes citoplasmticos.

Una vez que los AMG alcanzan el espacio periplsmico quedan unidos al exterior de la membrana celular de nuevo por adsorcin. Una pequea cantidad del frmaco adsorbido penetra al interior celular mediante un mecanismo de entrada denominado fase I dependiente de energa. Esta primera fase de captacin ocurre en medio aerobio tanto en clulas sensibles como resistentes, y es un proceso lento, pero la intensidad con la que se produce es favorecida por elevadas concentraciones del AMG en el medio y por el gradiente de protones transmembrana, que favorece la electroforesis de las molculas de AMG a travs de los canales acuosos. As pues, la concentracin intracelular inicial del frmaco es escasa, por lo

que se une preferentemente a los ribosomas de los complejos de elongacin, que son mucho ms numerosos que los que forman los complejos de iniciacin. Hay complejos de elongacin asociados a la membrana celular que producen protenas para reparar y mantener indemne dicha membrana. La accin intracelular inicial de los AMG es la sntesis anmala de protenas, algunas de las cuales son incorporadas a la membrana celular, donde se crean canales proteicos que facilitan la entrada de ms antibitico, establecindose as un proceso auto cataltico de aumento de entrada, lectura anmala y formacin de canales .

Esta segunda fase de captacin es denominada fase II dependiente de energa, sucedeAlgunos minutos despus de la primera fase slo en clulas sensibles a los AMG, y su intensidad tambin es directamente proporcional a la concentracin del AMG en elMedio.Segn lo expuesto, la alteracin de la membrana citoplasmtica no sera debida a la accin directa de los AMG, sino como consecuencia de su efecto sobre los ribosomas; en cambio, la desintegracin de la membrana externa s sera consecuencia directa del paso de dichas molculas. En la actualidad, mediante una tcnica especial de microfotografa se han observado los efectos de la gentamicina sobre cepas vivas de P. aeruginosa. Se ha confirmado la formacin de vesculas y de indentaciones, pero las microfotografas han mostrado que tambin ocurre elongacin bacteriana (fenmeno del que no se tena constancia) y que la envoltura celular se puede separar en bloque del cuerpo principal de la clula, con prdida del contenido citoplasmtico.Muy probablemente este mecanismo de accin, la desintegracin de la membrana externa, sea el que ms aporte a la muerte celular a travs de la alteracin del metabolismo y la respiracin celulares por prdida de sustancias citoplasmticas.

3.8.- POTENCIA MICROBIOLGICA DE GENTAMICINA Y NEOMICINA

La actividad o potencia de estos y cualquier otro antibitico, puede ser demostradaMediante el efecto inhibitorio del crecimiento de un organismo sensible a la sustancia en cuestin. Una reduccin en la actividad antimicrobiana puede revelar cambios sutiles que no son demostrados por mtodos qumicos (USP 36).

En los anlisis de potencia, se compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biolgico con el efecto producido por una preparacin estndar en las mismas condiciones y para la cual ya se ha determinado exactamente su actividad, obteniendo as un valor de potencia relativo al del estndar de referencia (BP, 2013). Si se prueban las muestras en diferentes concentraciones se puede determinar una concentracin inhibitoria mnima del antibitico hacia ese microorganismo.

Existen dos mtodos que se emplean en este anlisis, el de cilindro-placa o ensayo en placa y el turbidimtrico o ensayo en tubo. El primero depende de la difusin del antibitico en el agar que funciona como medio de cultivo para el patgeno de prueba. Dicha difusin ocurre a partir de un cilindro impregnado del antibitico, el cual es colocado sobre la superficie del agar, formando as una zona circular de inhibicin de crecimiento del microorganismo alrededor del cilindro que contiene la solucin de antibitico. El mtodo turbidimtrico depende de la inhibicin del crecimiento de un cultivo microbiano en una solucin uniforme del antibitico en un medio lquido favorable para su rpido crecimiento en ausencia del antibitico (USP 36).

La evaluacin y la interpretacin de los resultados en esta tcnica se realizan por la medicin de los halos de inhibicin del crecimiento del organismo de prueba o mediante las concentraciones capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias en el medio lquido para el mtodo turbidimtrico (USP, 2013).As, con la aplicacin de un adecuado anlisis estadstico es posible determinar ms all de si un microorganismo es sensible o resistente a determinado antibitico y junto con las pruebas de estabilidad de los mismos se logran determinar valores definidos que permitan un buen posicionamiento del producto en el mercado.

MICROORGANISMO DE PRUEBA: Staphylococcus epidermidis

El gnero Staphylococcus, perteneciente a la familia Micrococcaceae corresponde a microorganismos que estn presentes en la mucosa y en la piel de los seres humanos y de otros mamferos y aves. Comprende en la actualidad a 35 especies y 17 subespecies. Las especies que se asocian con ms frecuencia a las enfermedades en seres humanos son Staphylococcus aureus (el miembro ms virulento y conocido del gnero), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophticus, Staphylococcus capitis y Staphylococcus haemolyticus (Montiel, 1997).

Se caracterizan por ser cocos gram positivos de un dimetro entre 0,7 y 1,2 m y quetienen tendencia a formar grupos dado que la divisin celular no conduce a la separacin completa de las clulas hijas. No son formadoras de esporas y viven bien en los medios ordinarios, sobre todo slidos.

Parte de las caractersticas de sus factores de virulencia es que poseen en su estructura los cidos teicoicos y lipoteicoico y los peptidoglicano. Los cidos le sirven para adherirse a superficies corporales junto con las especies de estafilococo que tienen cpsula, y en conjunto

los cidos teicoicos y el pptidoglicano tienen la caracterstica de activar el sistema inmune del complemento. Adems sirven de evasores de la fagocitosis.

Los estafilococos plasmocoagulasa-negativos (ECN) constituyen una parte esencial de la flora comensal cutnea y mucosa del ser humano. Son los clsicos oportunistas que slo poseen un escaso potencial patgeno en las personas inmunocompetentes.

El Staphylococcus epidermidis es responsable del 70 80 % de las infecciones por ECN (Lode y Stahlmann, 2004). Este tipo de microorganismos tambin son grmenes multirresistentes, y muchas veces requieren altas dosis de antibitico por va intravenosa; Cerca del 90% producen beta lactamasas, mientras que 60% al 80% son resistentes a la meticilina.

Sin embargo, se ha determinado su sensibilidad ante los antibiticos que se pretenden probar en este trabajo, neomicina y gentamicina. Y como se mencion antes, los AMG, por lo general resultan efectivos contra los estafilococos y an ms en presencia de betalactmicos.

Adems S. epidermidis ha sido avalado y estandarizado como microorganismo de prueba para este anlisis por las organizaciones encargadas de dictar las pautas para el control y aseguramiento de la calidad de los frmacos (USP 36).

S. epidermidis fue considerado por mucho tiempo como un germen contaminante de cultivos. Sin embargo, ahora se le reconoce como un patgeno importante. Es la causa ms frecuente de infecciones en cuerpos extraos implantados (catteres intravasculares, catter de la dilisis peritoneal ambulatoria continuada (DPAC), derivaciones ventrculo-peritoneales, endoprtesis, prtesis valvulares cardiacas y prtesis articulares, marcapasos, etc.). Las cepas que provocan infecciones asociadas a cuerpos extraos, suelen proceder de la flora endgena del paciente. Sin embargo, tambin se producen infecciones nosocomiales exgenas (Jurado et al, 2002). En cuanto a la patogenicidad, se sabe que las cepas de S. epidermidis poseen la capacidad de adherirse a polmeros y de generar biopelculas que surgen de la multiplicacin y formacin de una capa mucosa (glucoclix) del patgeno.

Este proceso se ve reforzado en presencia de protenas de la matriz (por ejemplo: fibringeno, fibronectina) que cubren los cuerpos extraos en el organismo. Las biopelculas son focos infecciosos a partir de los cuales las bacterias entran en el torrente circulatorio y pueden causar una sepsis.

IV.- PARTE EXPERIMENTAL

4.1 METODOLOGIA-

A partir de la metodologa oficial de la USP 36 (anexo 1) se realizara algunas modificaciones tratando de no alterar los resultados finales y de simplificar el procedimiento hasta donde fuera posible, de manera que se pudiera trabajar adecuadamente con los recursos con que se cuente en el momento. Este ensayo se llevara a cabo en el rea de Microbiologa del Laboratorio de Control de Calidad de una empresa farmacutica peruana.

El procedimiento ser desarrollada con tcnica asptica en todo momento y se controlara muy bien la temperatura especialmente, para el cultivo del microorganismo de prueba, para la preparacin del inculo y el periodo de incubacin.La mayora de los pasos de dicho mtodo se efectuaran en la cmara de flujo laminar que ser previamente asperjada con alcohol de 70 y 96.La manipulacin durante el ensayo siempre se har utilizando guantes de ltex estriles y rociados frecuentemente con alcohol.Las obras oficiales o guas de validacin (USP, BP, EP, AEFI) establecen ciertos criterios de aceptacin o especificaciones, para asegurar la confiabilidad de sus resultados.

Material biolgico.-

Se empleara la cepa estandarizada de Staphylococcus epidermidis ATTC (American Type Culture Collection) 12228. Cantidad: 01 vial liofilizado, unidades formadoras de colonias (UFC) no cuantificables, con certificado de calidad del proveedor .

Material de Laboratorio.-

a) Frmacos y placebo:

Producto terminado X Crema tpica drmica, que posee las siguientes caractersticas que el fabricante declara :Composicin: Cada 100 g de crema contiene: Ingredientes farmacuticos activos (IFAs):Clotrimazol 1.000gGentamicina (como sulfato) 0.100gDexametasona (como acetato) 0.040g Excipientes c.s.p Presentacin: Tubo colapsible x 10g. Cantidad:50 tubos

Gentamicina Sulfato (Estndar Secundario de Referencia). Producto terminado X Crema tpica (Placebo).

b) Reactivos:

Agar antibitico N11 Trypticase Soja Agar (TSA) Trypticase Soja Broth (TSB) Hidrxido de sodio 1N cido Clorhdrico 1N. Fosfato dibasico de sodio. Solucin Amortiguadora N3 (pH=8.0) Fosfato Monobsico de Potasio. Hidrxido de potasio 10N. cido Fosfrico 18N. Cloruro de Sodio. Solucin salina estril 0.9%. Cloroformo S.R, agua purificada.

4.2.- MONTAJE DE LA PRUEBA

Preparacin del microorganismo de prueba (Staphylococcus epidermidis)

Se reconstituir la cepa de S. epidermidis (ATCC 12228) a partir de un tubo con la cepa liofilizada. Se tomara un vial con la cepa reconstituida, se ray en una placa Petri con Agar Nutritivo o Agar Tripticasa Soya y de igual forma en un tubo en cua como control de crecimiento y para mantener el cultivo en refrigeracin. Se incubara durante 24 horas antes de la preparacin del inculo para el ensayo.

Preparacin de Solucin Salina Estril al 0.9%

Se disolvi 0,9 g de NaCl en 100 ml de agua destilada. Se dispensara en tubos de ensayo colocando aproximadamente 10 ml por tubo. Se autoclavar durante 15 min a 121 C.

Preparacin Solucin buffer No 3 estril, 0.1 M, pH 8.0

Se pesara 16.73 g de fosfato de potasio dibsico y 0.523 g de fosfato de potasio monobsico. Se colocar ambos reactivos en un baln aforado de 1000 ml.

Se disolver en agua destilada y se llev hasta la marca de aforo. Se trasvasara la solucin buffer a una botella y se ajust el pH a 8.0 0.1, segn se necesit, con H3PO4 18 N o KOH 10 N antes de autoclavar. Se esterilizara en autoclave a 121 oC por 15 minutos.

Preparacin de Agar 11 para Antibitico

Peptona.6.0 g Casena pancretica digerida.......4.0 g Extracto de levadura.....3.0 g Extracto de carne..1.5 gDextrosa....1.0 g Agar....15.0 gAgua...1000.0 ml

pH despus de esterilizacin 8.3 0.1 Se disolver 27 g (como lo indica el fabricante) de Medio N 1 para Antibitico (pH 6.5 0.1) en 1000 ml de agua destilada. Se ajustara el pH a 8.3 0.1 con KOH 10 N antes de autoclavar. Se esterilizara en autoclave a 121 oC durante 15 minutos.

Preparacin de Agar 11 para Antibitico inoculado

Despus de las 24 horas de incubacin para el crecimiento del microorganismo de prueba, se tomara un tubo con solucin salina al 0,9% estril y se colocaron dos o ms asadas del cultivo de S. epidermidis. Se agitara en el Vortex para homogenizar completamente la suspensin. Luego se determin el porcentaje de transmitancia de la suspensin del microorganismo a una longitud de onda de 580 m (utilizando solucin salina como blanco).

Preparacin de las placas de Petri

Se utilizaran placas Petri de vidrio con un dimetro de 100 mm y aproximadamente 20 mm de altura. Inicialmente se colocara en cada placa con una pipeta estril 21 ml del Agar 11 para Antibitico sin inocular y se dej solidificar colocando las placas sobre la superficie nivelada. Una vez solidificada la capa base de medio, se agregara 4 ml de Agar 11 para Antibitico inoculado con S. epidermidis. Cuando esa segunda capa de agar solidifique, se colocara sobre el medio y con la ayuda de una pinza estril 6 cilindros de acero inoxidable por placa, los cuales tendrn un dimetro interno de 6 mm y 5 mm de altura. Dichos cilindros se

Ubicaran aproximadamente a 1 cm del borde de la placa y lo ms equidistantes posible.

PRUEBA CON GENTAMICINA SULFATO:

. Para preparar la solucin madre, se pesara 0,05 g del patrn estndar de Gentamicina Sulfato y se colocara en un baln aforado de 50 ml, y se pasara a disolver en solucin buffer No 3 estril y se llev hasta la marca de aforo con este diluyente para obtener una concentracin final de 1 mg/ml. Para preparar las soluciones estndar primero se diluir la solucin madre hasta 0,5 mg/ml, luego se realizara las diluciones necesarias con buffer No 3 estril para obtener las siguientes concentraciones: 0.10 g/ml (SE1): se tomara10 ul en baln de 50 ml. 0.15 g/ml (SE2): se tomara 15 ul en baln de 50 ml. 0.20 g/ml (SE3): se tomara 20 ul en baln de 50 ml. 0.25 g/ml (SE4): se tomara 25 ul en baln de 50 ml. 0.30 g/ml (SE5): se tomara 30 ul en baln de 50 ml.

Preparacin de la muestra (M):

Producto terminado X Crema tpica: 0.10 g de Gentamicina sulfato por cada 100 g de vehculo.

Se pesara 1 g de crema que es equivalente a 1 mg de gentamicina sulfato. Se colocara en un baln aforado de 100 ml y se agregara la mitad del volumen de buffer No.3 y se agitara vigorosamente durante 10 min para extraer el antibitico. Trascurrido este tiempo se llev el volumen hasta la marca de aforo para tener una concentracin final de 10 g/ml. . A partir de la preparacin anterior se realizara otra dilucin de la muestra, tomando una alcuota de 1 ml en un baln de 50 ml y se llevara hasta la marca de aforo nuevamente con buffer No. 3. De esta manera se lograra una concentracin de 0,2g/ml, que corresponde a la dilucin de prueba para la muestra.

Procedimiento para el ensayo por el mtodo Cilindro-Placa

Para la curva de estandarizacin se utilizaran 3 placas Petri por cada solucin estndar SE1, SE2, SE4 y SE5, lo cual equivale a un total de 12 placas preparadas.

En cada serie de tres placas se llenaran de forma alterna tres cilindros con la solucin estndar respectiva SE1, SE2, SE4 o SE5 y tres cilindros con la solucin estndar media SE3, para obtener un total de 9 zonas de inhibicin para cada solucin estndar SE1, SE2, SE4 y SE5 y 36 zonas de inhibicin para la solucin estndar media SE3. . Durante la prueba las placas se identificaran muy bien con cada uno de los estndares segn corresponda y adems se sealaran los cilindros que contenan el estndar de concentracin media para poder hacer la lectura adecuada de cada uno de los halos.

Para el ensayo con la muestra, se utilizaron igualmente 3 placas Petri preparadas por cada muestra. En cada serie se llenaron alternamente tres cilindros con la muestra respectiva M y tres cilindros con la solucin estndar media SE3, para obtener as un total de 9 zonas de inhibicin para cada muestra y 9 zonas de inhibicin para la solucin estndar media SE3. Las placas se incubaron durante 16-18 horas a 36.0-37.5 oC. Despus del tiempo de incubacin se retiraran los cilindros del agar y se midieron los dimetros de las zonas de inhibicin utilizando una regla milimtrica y tomando en cuenta el promedio de tres mediciones para un mismo halo de inhibicin. Es importante destacar que la USP recomienda estandarizar la prueba para la obtencin de halos con dimetros entre 14 y 16 mm.

Esquema del Diseo de anlisis para la preparacin de la curva estndar con las soluciones de antibitico

Esquema del diseo del anlisis para la preparacin de muestras

4.3.-CLCULO DE POTENCIA

Para calcular la potencia a partir de los datos obtenidos de la medicin de halos se proceder a interpolar con la curva de estandarizacin. Con ayuda del programa Excel de Microsoft se trazara la curva usando los promedios de todas las mediciones y una transformacin logartmica de las concentraciones con respecto a la medicin de los halos de inhibicin. Adems se aplicara el mtodo de lnea recta mediante el procedimiento de mnimos cuadrados y se hizo una prueba de linealidad para comprobar la relacin entre las concentraciones y los valores obtenidos.

Finalmente el porcentaje o valor de las unidades internacionales de potencia seCalculara haciendo una comparacin por regla de tres con el patrn de referencia utilizado para el antibitico, del cual s se conoce con certeza la potencia.

V.- COSTOS.-

En el siguiente cuadro se hace el costo de los materiales y reactivos necesarios para la preparacin del anlisis. Los valores se presentan en Dlares y soles.

PRODUCTOPRESENTACIONPRECIO(DOLARES)PRECIO(SOLES)

Cepa Staphylococcus epidermidis (ATCC 1228)Tubo liofilizado82.72231.618

Placa Petri de vidrio20 unids5.8116.268

Medio Antibitico N11500g116.00324.8

Hidrxido de potasio500g26.4274.00

cido clorhdrico2.5L30.2584.70

Fosfato de potasio dibasico1 Kg53.65150.22

Fosfato potasio monobsico1Kg52.25146.30

Cloruro de sodio1 Kg18.0350.50

Vernier1x (30 mm)117.46328.89

Penicilindros132 unids806.032256.88

Otros200560

INVERSION INICIAL1508.624224.176

Se debe tomar en cuenta que existen algunos materiales que constituyen nicamente una inversin inicial para la prueba, pues luego de su compra tendrn una vida til de varios aos, a su vez ah material que ya el laboratorio de microbiologa tiene y se ha colocado el precio solo como una referencia de su costo.

VI DISCUSION.-

Para la determinacin de la potencia microbiolgica de Gentamicina en un producto terminado X se utilizara el mtodo de Difusin en Agar, empleando la cepa S. epidermidis ATCC 12228, pues presenta una conocida sensibilidad antes los AMG, los cuales presentan una respuesta efectiva contra aerobios Gram positivos.

En la preparacin tanto de los estndares como de las muestras se utilizara Buffer N3 a un pH=8.0, pues son ms activos a pH alcalino que en medios cidos, de manera que, esto permiti potenciar aun mas su accin ante los microorganismos (Gernimo et al,2002).

Se utilizara un medio de Cultivo con pH =7.9, lo que brindara mejores condiciones para la difusin del antibitico a travs del agar, por lo que se obtuvo un buen crecimiento en el Medio Antibitico N11, Por otra parte, el crecimiento previo a la preparacin del inoculo, se llevara a cabo en un medio con pH=7.3, ya sea el caldo CASO y el TSA, recomendados por la USP.

VII CONCLUSIONES.-

Se estandarizara y validara, es decir mostrando mediante evidencia documentada, en el laboratorio de control de calidad de la Empresa farmacutica peruana X ; el mtodo analtico microbiolgico para determinar la actividad in vitro (potencia) del antibitico Gentamicina en productos farmacuticos terminados que respondan a una sola formula maestra de preparacin 0.1%, a travs del mtodo difusin en agar y, de esta manera se cuantificara su concentracin (valoracin), evidenciando la capacidad de proporcionar resultados confiables que cumplan en forma consistente, repetitiva y se encuentren dentro de los parmetros y especificaciones establecidas en las normas tcnicas de las guas oficiales vigentes.

VIII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.-

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