Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo

Técnicas mas utilizadas

Abundancia de microorganismos

• Biomasa total

• Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos, nitrificadores, amonificadores, etc.)

Actividad microbiana

• Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2)

• Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)

PRÁCTICO N° 3Análisis de fertilidad de los suelos

Recuento de células totales Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento")

Método por turbidez (Fotómetro)

Técnicas para determinar abundancia de microorganismos

Recuento de células viables

En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC)

Rango entre 30 – 300 colonias

En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos

Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía

Recuento de células viables: grupos funcionales

Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales

1) Suspensión y dilución de suelo

2) Siembra en medios selectivos

3) Determinación del crecimiento (lectura)

4) Cálculo de abundancia

Análisis de grupos funcionales

X g suelo

Recuento en medio sólido (Cajas Petri)

Recuento en medio líquido (NMP)

10° Agitar 3 minutos

9 ml H2Odestiladapor tubo

1 ml1 ml 1 ml1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1 10-310-2 10-610-5 10-810-710-4

Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores

X ml H2O destilada

+

1- Suspensión

2- Diluciones decimales

3- Siembra de cada grupo funcional

4- Incubación y crecimiento

5- Lectura y cálculosLECTURA

ESTUFA

Material de trabajo

Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada Tapar y agitar durante tres minutos

Suspensión de suelo

Suspensión de suelo

Extraer una pipeta estéril

Flamear un porta-pipeta

Preparación de las diluciones

Extraer 1ml de la suspensión de suelo

Poner el ml en el tubo 10-1

Mezclar y extraer 1 ml

Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos

Preparación de las diluciones

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Siembra en medios específicos: Amonificadores

Diluciones: -8, -7, -6

Siembrar en medio con asparagina

Incubación 28-30°C, 7días

Siembra en medios selectivos: Celulolíticos

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Sembrar en medio líquido con papel de filtro

Incubación 28-30°C, 15 días

Diluciones: -5,-4,-3

Dilución: -3

Siembra en medios selectivos: Fijadores

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Sembrar en medio sólido sin N

Incubación 28-30°C, 5 días

Siembra en medios selectivos: Nitrificadores

1 2 3 4 5 6 7 8

0

Dilución: -3,-2,-1

Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio

Incubación 28-30°C, 21 días

Siembra de grupos funcionales

Batería de grupos funcionales

•suspensión de suelo

•gradilla de diluciones

•gradilla de nitrificadores

•gradilla de celulolíticos

•gradilla de amonificadores

•caja de fijadores de N

Estufa de incubación

Síntesis del análisis de grupos funcionales

Recuento en medio sólido (Cajas Petri)

Recuento en medio líquido (NMP)

10° Agitar 3 minutos

9 ml H2Odestiladapor tubo

1 ml 1 ml 1 ml1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

10-1 10-310-2 10-610-5 10-810-710-4

Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores

X g suelo

X ml H2O destilada

+

LECTURA

ESTUFA

Agregar reactivo NesslerEl color ocre detecta presencia de amonio

Lectura: Amonificadores (ejemplo)

+ + + + + - - - +

Número característico 3 2 1

Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número Mas Probable (NMP) = 15

6 6 6 7 7 7 8 8 8

Lectura: Celulolíticos (ejemplo)

Observar alteración del papel

Número característico 3 2 1

+ + + + + - - + -

Número Mas Probable (NMP) = 15

Tipos de alteración del papel

3 3 3 4 4 4 5 5 5

Lectura: Fijadores (ejemplo)

Contar colonias (entre 30-300)

Número de colonias (UFC) = 120

(-3)

Lectura: Nitrificadores (ejemplo)

Agregar SO4H2 más difenilanidaEl color azul detecta presencia de nitrato

Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady

Número característico 3 2 1

Número Mas Probable (NMP) = 15

+ + + + - + - - + 1 1 1 2 2 2 3 3 3

Tabla de Mc. Grady

Nº Característico NMP Nº Característico NMP Nº Característico NMP

000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5

001 0.3 112 1.5 223 4.2

002 0.6 113 1.9 230 2.9

003 0.9 120 1.1 231 3.6

010 0.3 121 1.5 232 4.4

011 0.61 122 2.0 233 5.3

012 0.92 123 2.4 300 2.3

013 1.2 130 1.6 301 3.9

020 0.62 131 2.0 302 6.4

021 0.93 132 2.4 303 9.5

022 1.2 133 2.9 310 4.3

023 1.6 200 0.91 311 7.5

030 0.94 201 1.4 312 12

031 1.3 202 2.0 313 16

032 1.6 203 2.6 320 9.3

033 1.9 210 1.5 321 15

100 0.36 211 2.0 322 21

101 0.72 212 2.7 323 29

102 1.1 213 3.4 330 24

103 1.5 220 2.1 331 46

110 0.73 221 2.8 332 110

Cálculos

Tubos (NMP)

Nº de microorganismos por g de suelo

Nº de colonias (caja de Petri)

X1 en 10 ml de la dilución 10°

X2 en X ml de la solución 10° (volumen de la suspensión)

X2 en X g de suelo de la suspensión

N en 1 ml sembrado en la caja o tubo

X en 10 ml del tubo de la dilución usada (la más concentrada en el NMP)

X en 1 g de suelo

Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra

Actividades

1. Lectura de amonificadores: reacción de nessler y

manejo de la tabla de Mc.Grady

2. Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en

caja de Petri

3. Calculo: resolver problemas de abundancia de

microorganismos

Crecimiento bacteriano

N = N0 2n

Log N = log N0 + n log 2

n = log N – log N0

log 2

g = t / n

Cálculos de tiempos de generaciónCrecimiento exponencial

Nt = N0 2n

Representación semilogaritmica

Representación aritmética

N = número final de células

N0 =número inicial de células

n = número de generaciones

g = tiempo de generación

t = horas o minutos de crecimiento exponencial

Curva de crecimiento

Fase

de

latencia

Fase exponencial (logarítmica)

Fase estacionaria

Fase de muerte

Tiempo

Loga

ritm

o de

l núm

ero

de c

élul

as

Productos microbiológicos de carácter industrial

Producto Microorganismo productor

Antibióticos

Penicilina

Tetraciclina

Penicillium chrysogenum

Streptomyces griseus

Bebidas alcohólicas

Vinos

Cervezas

Saccharomyces ellipsoideus

S. cerevisiae y S. caribergensis

Enzimas

Amilasa bacteriana

Pectinasas

Bacillus subtilis

Aspergillus wentii, A aureus

Ácidos orgánicos

Ácido láctico

Ácido acético (vinagre)

Lactobacillus delbruckii

Gluconobacter suboxidans

Bioinsecticida

Proteína paraesporal Bacillus thuriginensis

Fertilizantes biológicos Bradyrhizobium japonicum

Azospirillum spp

Cultivo continuo