ADAPTACION Y SELECCIÓN MICROBIANA AUTOCTONA EN MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS CON BENZO(A)PIRENO

Miguel Ángel Palomino Gonzales

Docente: Blgo. Fernando Merino Rafael

RESUMEN

Un número creciente de sustancias xenobioticas y compuestos orgánicos naturales son introducidos en el ambiente, que pueden ser toxicas para los seres vivos. Los suelos receptores de desechos tóxicos derivados del petróleo acumulan hidrocarburos policiclicos aromaticos como el benzo(a)pireno. Al establecerse estas moléculas en el suelo, inicialmente las poblaciones microbianas disminuyen, y algunas especies se adaptan sobre todo en las rizosferas de los pastos nativos. El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta de bacterias y hongos aislados en suelos contaminados con petróleo a venzo(a)pireno en medio de cultivo y seleccionar y estabilizar los microorganismos tolerantes. Para ello se realizó el aislamiento, evaluación, adaptación y selección de bacterias y hongos nativos de las rizosferas de los pastos alemán (Echinochloa polystachya) y cabezon (Paspalum virgatum), en Gleysoles (Endoaquents e Hydraquents) influenciados por derrames y fugas de petróleo del campo petrolero localizados en la región occidental del estado de Tabasco. El método utilizado fue el conteo de viables de células vivas sembradas en cajas Petri. Cindo cepas de bacterias (CT11, CT16, CT26, CT36 Y AT4) y tres hongos nativos (Trichoderma spp. Paecilomuces sp. Y Aspergillus sp.) de la rizosfera del pasto cabezon tuvieron altas tasas de crecimiento y de biomasa, lo que indican tolerancia y uso del carbono del benzo(a)pireno en la multiplicación celular. Las bacterias y hongos poseen potencial para la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos poliaromaticos.

INTRODUCCION

El benzo(a)pireno (Bap) es un hidrocarburo aromatico policiclico (HAP) componente del petróleo, con cinco anillos bencénicos y un peso molecular de 252. de 252. El BaP es considerado por la Agencia de Protección Ambiental como uno de los 16 hidrocarburos aromáticos policíclicos más tóxicos, cancerígenos y mutagénicos, que además puede ser transformado a metabolitos como el benzo(a)pireno 7,8 dihidrodiol 9-10, en células de mamíferos y en bacterias, y es más cancerígeno que el BaP

El petróleo crudo contiene 20 mg kg-1 de Bap. Los suelos cercanos a refinerías pueden acumular concentraciones cercanas a 8 mg kg-1 de BaP por la contaminación con. En estudios realizados por PEMEX (1997) en Histosoles y Gleysoles de Tabasco, se encontraron concentraciones hasta de 4.22 mg kg-1 de BaP.

Facultad de Ingenierías y ArquitecturaIngeniería

Ambiental

El BaP origina diversas interacciones con los microorganismos en el suelo. Las bacterias y hongos poseen mecanismos de adaptación fisiológica, probablemente de origen genético, que les permiten usar carbono del BaP en su multiplicación celular. Kästner y Mahro (1996) encontraron que especies de Mycobacterium, Rhodococcus, Gordona y Sphingomonas paucimobilis utilizan moléculas de HaP con cuatro y más anillos bencénicos.

Los microorganismos degradadores del BaP incorporados en sustratos minerales han sido utilizados en estudios de laboratorio. Field et al. (1992) encontraron que el hongo Phanerochaete chrysosporium tuvo un aumento poblacional significativo a partir de la degradación de 10 mg L-1 de BaP. La bacteria S. paucimobilis puede adaptarse a la presencia de BaP y al utilizarlo para multiplicar se lo redujo en 33 %. Kotterman et al. (1998) reportaron el crecimiento del hongo Bjerkandera sp. Cepa BOS55 y la degradación de 20 mg L-1 de BaP en 15 días. También los hongos han crecido en medios de cultivo con 60 mg kg-1 de BaP.

El objetivo del presente estudio fue evaluar en laboratorio la respuesta de bacterias y hongos aislados de pastos en suelos contaminados con petróleo al benzo(a)pireno (BaP) en medio de cultivo, y seleccionar y estabilizar las bacterias y hongos tolerantes al BaP.

MATERIALES Y METODOS

La investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiológía de Suelos del Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, en Montecillo, Estado de México, y comprendió tres etapas: colecta de rizosferas de vegetación de pastos del área de estudio; evaluación mIcrobiológica de las rizosferas; y, selección y estabilización de microorganismos en medios de cultivo enriquecidos con benzo(a)pireno, la cual incluyó tres fases sucesivas para bacterias y dos para hongos.

Actividades de preparación y materiales utilizados

El material de vidrio fue esterilizado por 5 h en calor seco a 180 °C, en estufa. La esterilización de los medios de cultivo, el agua y las puntillas para la micropipeta se realizó en calor húmedo a 121 °C, en olla de presión de vapor a 1.3 kg cm-2 durante 18 min. En la segunda etapa se utilizó el medio de cultivo selectivo de carbón combinado modificado (CCM1) para bacterias fijadoras de N atmosférico tolerantes a BaP, basado en medio inorgánico más BaP. Este medio constó de dos soluciones: la solución 1 fuede K2HPO4, (0.8 g L-1), NaCl (0.1 g L-1), NaFeEDTA (0.007 g L-1), Na2MoO4•2H2O (0.25 g L-1), agar y agua destilada, con pH ajustado a 7.0; y la solución 2 fue de MgSO4•7H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.06 g L-1), biotina y ácido p-aminobenzoico (10 mg L-1), y se adicionó 30 mg L-1 de BaP. El medio para bacterias asimiladoras de N tolerantes a BaP consistió de las dos soluciones anteriores más NH4Cl (CCM2). El medio para hongos celulíticos, modificado (HCM) para hongos tolerantes a BaP, se formó con nutrimentos inorgánicos más BaP. Este medio consistió de (NH4)2SO4 (0.5 g L-1), KH2PO4 (1.0 g L-1), KCl (0.5 g L-1), MgSO4•7H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.1g L-1), agar, agua destilada y estreptomicina, con adición de 30 mg kg-1 de BaP (v/v) y pH ajustado a 6. En la segunda etapa se utilizaron medios de cultivo sólidos

En la segunda y tercera fases del estudio de las bacterias y segunda de los hongos de la tercera etapa se utilizaron los medios de cultivo líquido CCM1 y HCM, respectivamente.

La solución estándar de BaP se preparó a una concentración de 100 mg L-1 en acetona y se aplicó durante las diferentes fases. Se utilizó BaP (3,4-benzopireno) con un mínimo de 97% de pureza, grado HPLC (Sigma B-1760). Esta molécula tiene una solubilidad en agua de 0.003 mg L , punto de ebullición de 496 C y estado físico sólido cristalino de color amarillo, y es soluble en solventes orgánicos como acetona y hexano.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La tolerancia de los microorganismos rizosféricos al BaP se evidenció en el tamaño de las poblaciones nativas de la rizosfera de los pastos cabezón y alemán en suelos contaminados con petróleo. Las poblaciones de bacterias fijadoras de N, de bacterias asimiladoras de N y de hongos del pasto cabezón fueron 4, 6 y 52 veces mayores en el suelo con contaminación crónica que en el suelo no contaminado; y para el pasto alemán, 4, 19 y 3 veces mayores en el suelo con contaminación reciente que en el suelo sin contaminación (Cuadro 1).

El aumento significativo de las poblaciones microbianas posiblemente está relacionado con el tiempo de exposición y de adaptación de las bacterias y hongos a los HAP presentes en el suelo recientemente contaminado (Gleysol histi-dístrico) y en el suelo afectado por derrames crónicos de petróleo (Gleysol histi-utri-sódico).

Las poblaciones de bacterias fijadoras de N fueron 102 y 103 (Cuadro 1), comparado con poblaciones de 103 y 104 para Bacterium sp. En muestras de suelos aledaños a petroquímicas. El suelo Gleysol histi-eutri-sódico receptor de contaminación crónica con petróleo desde 1963, tuvo la mayor cantidad de microorganismos tolerantes a BaP. Esto es atribuible a que el alto contenido de cal (datos no presentados) y el surcado han propiciado condiciones adecuadas para la aireación y formación de pH neutro (6.7 a 7.3), así como a los contenidos ricos de N (87 a 98 ppm) y de P (11 a 74 ppm), puesto que ellos favorecen el crecimiento de microorganismos en el suelo.

La mayoría de las cepas de bacterias tolerantes a BaP fue aislada de la rizosfera del pasto cabezón (16 colonias) y una cantidad menor (ocho colonias) del pasto alemán. Las 24 cepas aisladas son gram negativas y móviles. Los 16 hongos tolerantes a BaP son nativos de la rizosfera del pasto cabezón, y los géneros más comunes fueron Trichoderma, Penicillium, Aspergillus y Paecilomyces, y solamente dos especies del género Trichoderma fueron aislados de la rizosfera del pasto alemán. La mayor diversidad de hongos encontrados en la rizosfera del pasto cabezón es atribuible al largo periodo de exposición y adaptación (desde 1963) al petróleo crudo.

ANEXOS