nuestra ciencia

Nmero 8Quito, mayo de 2006

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES1

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Nuestra Ciencia n. 8 (2006)

Contenido2 Editorial.

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Actualidad Cientfica3 6 9 11 15 19 Genes maternos y genes zigticos (Eugenia del Pino). Horror!: se pueden hacer copias del ADN total (Paola E. Leone). Estandarizacin de frecuencias allicas para poblacin mestiza ecuatoriana a partir de estudios por STRs (Csar Paz y Mio). La Enfermedad de Chagas y Trypanosoma cruzi: enemigos silenciosos (Sofa Ocaa M. y Mario J. Grijalva). Buddleja est desapareciendo por culpa de pinus (Tjitte de Vries). Sistemas de defensa de plantas: Hay evidencia de la existencia de un sistema inmune? (Ricardo Oliva). Levadura: cuerpo y alma (Javier Carvajal).

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Curiosidades Cientficas27 31 34 38 La citogentica: un aporte ms al conocimiento de los anfibios ecuatorianos (Miryan Rivera). La hormiga argentina en Quito: Qu pasar con las hormigas de la noble raza quitea? (Juan M. Vieira, Giovanni Onore y Tjitte de Vries). Los bichos acuticos se asfixian en los ros ubicados en la altura? (Dean Jacobsen). Control Biolgico de Insectos Plaga en Palma Africana en el Ecuador (Jean Louis Zeddam, Melany Ruiz Urigen y Ma. Gabriela Zambrano). Avances en el conocimiento de las briofitas ecuatorianas (Susana Len Ynez y S. Robbert Gradstein). Plantas sagradas y ornamentales andinas (Omar Vacas Cruz). Ecuador: cero en conservacin (Nstor A. Acosta Buenao). La Sucesin De Fibonacci (Baldovino Lamirata Carigli).

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Gente que hace historia

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Csar Enrique Jcome: un secretario de calidad (Alberto Rengifo A.).

Noticiencia56 57 El consumo de caf y la salud (Wendy Heredia). La BALSA de los SAPOS leva anclas (Vernica Cano y Miguel Rodrguez).

NUESTRA CIENCIA n. 8 Quito, mayo de 2006 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Dra. Laura Arcos Tern, Decana Dr. Renato Valencia R., Director de la Escuela de Ciencias Biolgicas. Master Wendy Heredia R., Directora de la Escuela de Ciencias Qumicas. Lic. Galo Raza D., Director de la Escuela de Ciencias Fsicas y Matemtica. CONSEJO EDITORIAL Lic. Csar Enrique Jcome, Secretario General de la Facultad. Dr. Luis A. Coloma R., Profesor de la Escuela de Ciencias Biolgicas. Dra. Eugenia del Pino V., Profesora de la Escuela de Ciencias Biolgicas. EDITOR Dr. Alberto Rengifo A., Profesor de la Escuela de Ciencias Biolgicas. COLABORARON EN ESTE NMERO Lic. Nstor Acosta (Laboratorio de Herpetologa) Lic. Vernica Cano (Laboratorio de Herpetologa), M. Sc. Javier Carvajal (Laboratorio de Bioqumica), Dra. Eugenia del Pino (Laboratorio de Biologa del Desarrollo), Dr. Tjitte de Vries (Laboratorio de Zoologa), Dr. S. Robert Gradstein Dr. Mario Grijalva (LIEI, Escuela de Ciencias Biolgicas. Departamento de Ciencias Biomdicas, Universidad de Ohio, USA), Master Wendy Heredia R., (CESAC-PUCE) Dr. Dean Jacobsen (Laboratorio de Ecologa de Ros), Dr. Baldovino Lamirata (Escuela de Ciencias Fsicas), M. Sc. Susana Len (Herbario, QCA), Dra. Paola Leone (Laboratorio de Gentica Molecular y Citogentica Humana), Lic. Sofa Ocaa (Laboratorio de Investigacin en Enfermedades Infecciosas), Lic. Ricardo Oliva (Centro Internacional de la Papa), Dr. Giovanni Onore (Laboratorio de Entomologa), Dr. Csar Paz y Mio (Laboratorio de Gentica Molecular y Citogentica Humana), Dr. Alberto Rengifo (Escuela de Ciencias Biolgicas), Lic. Miryan Rivera (Laboratorio de Citogentica de Anfibios), Lic. Miguel Rodrguez (Laboratorio de Herpetologa), Melany Ruiz (Laboratorio de Entomologa), Lic. Omar Vacas Cruz (Inventario Biolgico Yasun), Juan Manuel Vieira (Laboratorio de Entomologa), Ma. Gabriela Zambrano (Laboratorio de Entomologa), Jean-Louis Zeddam (Laboratorio de Entomologa). ISSN: 1390-1893 Todo bien hecho en Imprenta Hojas y Signos [email protected]

Foto: Tjitte de Vries

EditorialUno de tantos riachuelos que se encuentra a lo largo de la carretera entre Loja y Zamora.

El bien es reconocido cuando es perdido es una de las tantas frases acuadas por la sabidura popular para hacernos reflexionar acerca de valorar lo que poseemos, optimizarlo, guardarlo y protegerlo. Precisamente, en el artculo Ecuador: cero en conservacin, Nstor Acosta subraya esta cruel realidad: somos un pas mendigo, sentado en una mina de oro. En efecto, Acosta seala que Los anfibios (ranas, sapos, salamandras y ceclidos) son un buen ejemplo de la alta biodiversidad del pas. Esta diversidad de anfibios coloca al Ecuador como el tercer pas con mayor diversidad de anfibios despus de Brasil y Colombia, y primero, si se considera su nmero de especies por unidad de superficie (Cfr., infra, pp. 47-48). Qu hace el estado, qu hacen ciertas ONGs para conservar lo que tenemos? La respuesta es nada; por esto, el ttulo de este artculo se justifica plenamente: Ecuador: cero en conservacin. Felizmente, la conciencia crtica que poseen los cientficos que trabajan en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la PUCE, les motiva a investigar con responsabilidad y a decir las verdades sin miedo ni contemplaciones. Cmo es posible que el Ministerio del Ambiente de nuestro pas, no tenga estadsticas oficiales sobre la tala de bosques?, se pregunta Acosta, y anota, profticamente, que si cada ao se deforestan 198 mil hectreas de bosque, en 65 aos, ste pasar a ser historia perdida. Qu hacer? La respuesta es simple y comprometedora: Trabajar intensamente por conocer, divulgar y salvaguardar los recursos naturales del Ecuador (Cfr., infra, p. 50). Justamente, por esto, la misin que se ha impuesto la revista Nuestra Ciencia desde la aparicin de su primer nmero ha sido publicar artculos que participen de esta filosofa de vida. De ah que los trabajos que hoy publicamos abordan, desde su perspectiva particular, tpicos que estn encaminados, de alguna manera a hacernos entender que La nica forma de que el pas [Ecuador] ejerza soberana sobre sus recursos naturales es descubrindolos, catalogndolos, estudindolos y divulgando el conocimiento (Cfr., infra, p. 50). Este octavo nmero de Nuestra Ciencia, que mantiene sus cuatro secciones tradicionales: actualidad cientfica, curiosidades cientficas, gente que hace historia y noticiencia, ha sido posible publicarlo gracias a la comprensin, valoracin y ayuda econmica de las autoridades de la PUCE, al apoyo econmico oportuno de Petrobras Energa Ecuador y a la contribucin generosa del Herbario QCA. Para todos, nuestra eterna gratitud. Sinceramente, espero que cada uno de los artculos que se publican en este nmero se constituya en una luz encendida que ni la ms total oscuridad pueda extinguirla. Alberto Rengifo A. Editor [email protected]

Actualidad Cientfica

GENES MATERNOS Y GENES ZIGTICOSPor Eugenia M. del Pino ([email protected])

se da estaba preocupada respecto de mis clases, cuando lleg mi amigo, el artista que a veces me visita para dialogar sobre los avances de la Ciencia. Esta vez traa un cuaderno de dibujo y me cont que estaba haciendo unos bocetos porque planeaba pintar un cuadro sobre el ADN y sobre la expresin gnica. Me qued sorprendida, por decir lo menos, de que su inters por la Biologa llegara tan lejos para desear pintar un cuadro sobre temticas moleculares profundas. Tuve gran recelo respecto de cules podran ser mis comentarios sobre su trabajo creativo, lo cual aument mi preocupacin. Cuando an estaba inmersa en estos pensamientos, mi amigo dijo: Qu te pasa?, tienes tal vez una preocupacin? Asent con la cabeza. Qu te pasa? volvi a repetir y continu: T sabes que para eso estamos los amigos para escuchar ya sabes que las penas contadas son aliviadas. Con una amplia sonrisa le dije que, en efecto, estaba preocupada, pero que la causa era la marcha de mis clases ya que no estaba segura de que los estudiantes comprendieran la materia con la debida profundidad. Qu alivio! Me alegro de que no te haya pasado nada fue su respuesta y aadi: Por qu no me explicas sobre tus clases? Veamos si es que yo puedo entender estas temticas. Ese fue el inicio de una conversacin muy grata. Vers, trato de explicar a mis

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estudiantes sobre los genes maternos y los genes zigticos. Mi amigo se qued pensando y dijo: genes maternos genes maternos... Yo s que en nuestro genoma la mitad de los genes vienen de la madre y la otra mitad del padre. A esto te refieres? S, tienes razn. En el genoma la mitad de los genes proviene de cada uno de nuestros progenitores, pero no me refiero a este aspecto de la herencia. En la Biologa del Desarrollo se estudian los genes que afectan el desarrollo embrionario temprano. Se ha encontrado en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster genes que se expresan durante la oognesis y que afectan a los oocitos, es decir a los huevos en formacin. T sabes que la unin de los dos gametos, el huevo y el espermatozoide, produce una clula llamada zigoto, de la cual se desarrolla el nuevo ser. Antes de que pueda continuar, mi amigo dijo: Ya entiendo los genes zigticos deben referirse al zigoto. Pero dime Qu se entiende por genes maternos? Qu se entiende por genes zigticos? Le respond que, en efecto, los genes zigticos son la combinacin de los genes de la madre y del padre en el nuevo individuo. Su expresin gnica, es decir, la produccin de molculas de ARN mensajero y de las respectivas protenas no se inicia con la fecundacin.

Nuevamente, me interrumpi: No me digas! No puedo creerlo! Si es que el genoma del zigoto no dirige el desarrollo temprano quin lo hace? Le dije que en diferentes organismos, el genoma del zigoto se activa a diferentes tiempos despus de la fecundacin. Todo el desarrollo embrionario que ocurre con anterioridad, est dirigido por las molculas de ARN mensajero y por las protenas que se acumularon durante la oognesis en el huevo. Los genes que

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Figura 1. Gstrula temprana de la rana dendrobtida Epipedobates anthonyi que muestra la expresin zigtica de la protena Brachyury, como puntos oscuros, que son los ncleos superficiales positivos alrededor del tapn de yema, que es el rea central sin puntos oscuros.

se expresan durante la oognesis son los genes maternos. En tanto que, como te expuse anteriormente, los genes que se expresan en el zigoto son los genes zigticos. La clula huevo es una maravilla de la naturaleza porque tiene la programacin que dirige el desarrollo embrionario temprano y siempre que pienso en la clula huevo y en el proceso de oognesis me lleno de admiracin. Como modelo de estudio de la Gentica del Desarrollo se ha analizado a la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. En este organismo se han encontrado genes que afectan el proceso de la oognesis. Es decir, su actividad resulta en la produccin de vulos normales; mas cuando la actividad de estos genes es alterada por una mutacin, los vulos son anormales y en consecuencia el desarrollo embrionario temprano es tambin anormal. Antes de que yo pueda seguir con mi exposicin, mi amigo exclam: Ah te refieres a los genes maternos! No pude ms que sonrerme, an cuando su comentario inte-

rrumpi el hilo de mis pensamientos, y le manifest: S, veo que ya sabes sobre los genes maternos! Con una expresin de felicidad, replic mi amigo: Qu interesante! Puede ser que de aqu resulten ms ideas para mi lienzo. Yo no quise hablar ms sobre su programada obra de arte, as que continu con mi explicacin: El desarrollo embrionario temprano depende de la clula huevo, es decir de los transcritos, ribosomas y protenas acumulados en el vulo durante el proceso de oognesis. Para ilustrar grficamente esta verdad, basta ver los resultados de la activacin artificial de un huevo de la rana, en ausencia de la fecundacin normal que se da por un espermatozoide. En este caso experimental, el huevo activado inicia sus divisiones, tal como ocurre en el zigoto, despus de la fecundacin. Pero no hubo fecundacin ni la contribucin de los genes del espermatozoide. Al cabo de un tiempo, este desarrollo abortivo se detiene. De esta manera se ilustra que el desarrollo embrionario temprano est guiado por las reservas de informacin que tiene el vulo. Esta informacin est dada por molculas de ARN mensajero sintetizadas durante la oognesis, denominadas transcritos maternos, as como por las protenas acumuladas en el huevo y por aquellas que se sintetizan sobre los transcritos maternos. Mi amigo replic: Qu interesante, prosigue por favor! As que continu con mi explicacin. Las divisiones tempranas en el huevo tanto de la rana como de Drosophila estn alteradas, porque no existe la sntesis de nuevas molculas de ARN mensajero. Es como si el embrin estuviera programado para dividirse y hacer ms clulas. Todos los transcritos, muFoto: Eugenia M. del Pino

chas protenas y toda la maquinaria de sntesis de las protenas corresponde al equipamiento del que viene dotada la clula huevo. La transcripcin de los genes zigticos se inicia cuando el embrin ya es una blstula y se denomina la transicin media de la blstula. En Drosophila tienes el gen Bicoid, el cual es un gen materno que controla el desarrollo anterior de la larva. En su ausencia, la larva carece de partes anteriores y tiene duplicacin de las partes posteriores. Mi amigo manifest: Qu problema, una mosca sin cabeza! Tienes razn le dije pero una mosca as no puede sobrevivir y el embrin muere en etapas tempranas del desarrollo. Del mismo modo, se han aislado otros genes maternos que en cambio afectan el desarrollo posterior de la larva. Mi amigo no dijo nada, pero me miraba con gran inters, as que continu: Todo el desarrollo temprano de Drosophila ocurre guiado por los transcritos maternos. Los genes zigticos (como te expuse) tienen una expresin ms tarda. Antes de que pueda proseguir, mi amigo me dijo: Dame, por favor, el nombre de un gen zigtico y su funcin. Le respond que el primer gen zigtico que se activa en el embrin de Drosophila es el gen hunchback y los transcritos de hunchback son traducidos a la protena hunchback en las regiones anteriores y medias del embrin. En coordinacin con la protena bicoid, traducida sobre los transcritos maternos del gen bicoid, estos dos genes dirigen la primera segmentacin del embrin en grandes bandas que luego darn origen a los segmentos de la larva y del embrin. Mi amigo me interrumpi y me pregunt: Podras sealarme el nombre de un gen materno y un gen zigtico en las ranas? Naturalmente le respond. El descubrimiento de genes mater-

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nos en Drosophila y de sus genes zigticos ha llevado a que se realice una bsqueda de genes homlogos en otros organismos tales como la rana, el pez cebra, el pollo y el ratn, que son otros organismos modelo de la Biologa del Desarrollo. Como sabes, nosotros aqu en el laboratorio de Biologa del Desarrollo de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador trabajamos con modelos alternativos del desarrollo embrionario como son la rana marsupial Gastrotheca riobambae y la pequea rana dendrobtida Colostethus machalilla. En ese instante se escuch la vocalizacin de unas ranas en el laboratorio y mi amigo alz la cabeza y dijo: Claro, las conozco, ahora estn croando tus ranas. Sobre la biologa molecular de estas ranas sabemos mucho menos le dije. Pero puedo decirte que tambin tienen genes maternos y genes zigticos. Recuerdas nuestra conversacin hace ya algn tiempo sobre el gen Brachyury? Cmo me voy a olvidar de Brachyury! Me acuerdo, como si fuera ayer, como mi gato, que suponas tena la mutacin de Brachyury y que por eso naci sin cola, poda perseguirle a un ratn tambin sin cola y que era mutante para Brachyury! (Al terminar esta aseveracin comenz mi amigo a rer de buen grado). Bueno Bueno le dije, fuera de bromas, Brachyury se expresa en el mesodermo prospectivo del embrin de las dos ranas ecuatorianas que estudiamos, como lo hemos demostrado en dos trabajos. Nuevamente, mi amigo interrumpi la conversacin y dijo: Ya s Ya s! Brachyury es un gen zigtico. Claro, has comprendido muy bien la temtica le respond. Pero replic l quiero que me des un ejemplo de un gen materno. Debes preguntarle al res-

pecto al licenciado Oscar Prez, profesor de nuestra Escuela, pues l, desde hace algunos aos, en colaboracin con el Dr. Richard Elinson de la Universidad de Duquesne en Pittsburg, Estados Unidos de Norte Amrica y la de otros miembros de este laboratorio, estudia el gen VegT. En la rana modelo del desarrollo embrionario, Xenopus laevis, el gen VegT tiene transcritos maternos y transcritos zigticos. Es un gen que dirige la formacin de las capas embrionarias del mesodermo y el endodermo y tiene importancia tambin para el desarrollo dorsal del embrin. Qu interesante! exclam mi amigo , y me pidi que continuase. As lo hice y enfatic: El licenciado Prez ha logrado aislar y secuenciar este gen tanto de la rana Gastrotheca riobambae como de la rana Colostethus machalilla y analiza la expresin materna y zigtica de este gen en estos organismos. VegT por sus estudios aparece como un gen altamente conservado. Este gen tiene gran importancia para el desarrollo no solamente en las ranas sino tambin en el pez cebra y en el pollo, pero no ha sido encontrado en los mamferos. Bueno dijo mi amigo est muy claro que los genes maternos significan genes que se expresan durante la oognesis y que su expresin dirige el desarrollo embrionario temprano. Quin lo dira, pero es as! Los genes zigticos, en cambio, se expresan en el embrin con cierta demora. Nunca me habra imaginado que el desarrollo embrionario temprano est dirigido por los transcritos maternos Cada da se aprende algo nuevo!

Figura 2. Gstrula tarda de la rana dendrobtida Epipedobates anthonyi que muestra la expresin zigtica de la protena Brachyury, como puntos oscuros que son los ncleos profundos alrededor del tapn de yema que es el rea central de color claro.

Enseguida, se despidi y quedamos en vernos otro da para ver sus bocetos artsticos... con gran alivio de mi parte. Y me qued pensando sobre sus palabras Para qu estn los amigos, sino para escuchar. Al explicarle estos temas me sent contenta y tuve la certeza de que podra transmitirles mi admiracin por el desarrollo embrionario a mis estudiantes en la prxima clase.

Bentez, M.-S. and del Pino, E. M. (2002). The expression of Brachyury during development of the dendrobatid frog Colostethus machalilla. Dev. Dyn. 225, 592-596. del Pino, E. M., vila, M. E., Prez, O. D., Bentez, M. S., Alarcn, I., Noboa, V., Moya, I. M. 2004 Development of the dendrobatid frog Colostethus machalilla. International Journal of Developmental Biology. 48: 663-670. Gilbert, S. E. 2003 Developmental Biology. Sptima Edicin. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachussetts.

Literatura consultada

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Foto: Eugenia M. del Pino


Horror!:ace algn tiempo, cuando comenc a hacer mis primeras reacciones de PCR (polymerase chain reaction = reaccin en cadena de la polimerasa), recuerdo la preocupacin de uno de los jefes del laboratorio cuando pensaba que esta tcnica de laboratorio inventada a finales de los aos 80 podra permitir que cualquiera copiara el ADN total de su muy protegido banco de ADNs, el cual le haba llevado algo ms de diez aos en recolectar y que lo diferenciaba de otros cientficos de su entorno cercano. La PCR es una tcnica que permite hacer muchas copias de un segmento especfico de ADN, cADN o ARN. Para llevar a cabo la reaccin, se necesita el molde que se debe copiar de ADN o ARN, los cebadores que son secuencias cortas (aproximadamente 20 bases) complementarias a los extremos de la secuencia de nuestro inters y que delimitarn a nuestro fragmento, con lo que tendremos dos cebadores: uno que se unir al extremo 5 (forward) y uno que se unir al extremo 3 (reverse); para la generacin de las nuevas cadenas se necesitar una buena concentracin de dinucletidos (adenina, citosina, guanina y timina), la enzima termoestable que har el trabajo y como toda reaccin contar con un buffer especfico para la enzima y agua hasta completar el volumen deseado. Despus de 13 aos de ese momento de preocupacin, previo a que yo fuera a otro laboratorio a

Se pueden hacer copias del

ADN totalPor Paola E. Leone ([email protected])

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aprender la tcnica en cuestin, se han desarrollado muchas variantes en la PCR como emplear un solo cebador, utilizar diferentes enzimas termoestables o hacer una longPCR para originar fragmentos muy grandes entre otras. Hacer copias del ADN total comenz a inicios de los aos 90 y actualmente se emplea en las situaciones en las que no se cuenta con suficiente cantidad de ADN por tratarse de muestras pequeas, de difcil obtencin o por la necesidad de tener suficiente material gentico para diferentes estudios. La amplificacin del genoma total puede hacerse por mtodos basados en la PCR; sin embargo, existen problemas de reproducibilidad. Consecuentemente, se han desarrollado otras formas de amplificacin que no se basan en la PCR y que pueden generar microgramos a partir de 1-10 copias de ADN. Algunos mtodos requieren como molde por copiar cadenas largas de ADN lo que resulta un problema cuando se parte de ma-

terial archivado o muestras forenses deterioradas. Otra opcin, la base de este artculo, es utilizar RCA (rolling circle amplification) con el fago _29 que permite la amplificacin isotrmica con alta fidelidad sin necesidad de emplear cebadores o cambios de temperatura, caractersticos de la PCR (1). Ese jefe de laboratorio poda prever los grandes avances tcnicos que se haran para facilitar el trabajo diario en un laboratorio. As, en relacin con las enzimas y las tcnicas de ampliacin de ADN, uno de los estudios realizados durante un postdoctorado fue la extraccin y amplificacin de ADN a partir de folculos de ganglio linftico obtenidos mediante microdiseccin por lser. La microdiseccin mediante captura por lser (LCM) es una tcnica que permite el aislamiento de pequeas cantidades de material biolgico para su anlisis individualizado (Fig. 1). Esta metodologa obliga a la amplificacin del ADN antes de llevar a cabo cual-

Figura 1. a. El sistema P.A.L.M. b. La muestra es directamente catapultada dentro de la tapa del eppendorf que contiene buffer de microdiseccin (EDTA, Tris y Tween 20).

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quier estudio molecular. La LCM es aplicable a muestras obtenidas a partir de parafina, lo que permite su uso en material archivado. La intencin del laboratorio era obtener ADN de folculos de ganglio linftico para identificar la t(14;18) en individuos con linfomas no Hodgkin (LNH). La translocacin (14;18)(q32;q21) es una alteracin cro-

afecta al gen BCL-2, pero genera un nivel alto de expresin de la protena BCL-2. Con el objetivo de establecer la identificacin de la t(14;18) en individuos con LNH en folculos individualizados por LCM se analizaron 6 muestras de ndulos linfticos incluidos en parafina de 4 pacientes con LNH. Todas las muestras expresaban protena BCL-2 y

muestras se realiz una amplificacin del ADN mediante la utilizacin de la ADN polimerasa del fago _29 (GenomiPhi, Amersham Biosciences) durante 18h a temperatura constante (30C) (3). Una vez obtenido el producto de amplificacin se utiliz PCR para la deteccin de reordenamientos de las regiones MBR y mcr de BCL-2; adems se realiz

Figura 2. Reordenamiento BCL-2/IGH, producto de la t(14;18).

Figura 3. a. Folculo antes de la diseccin. b. Zona diseccionada.

mosmica frecuente en LNH, produce la unin del gen BCL-2 (localizado en 18q21) a la regin de empalme (JH) de la cadena pesada de la inmunoglobulina (H) (localizada en 14q32). Los puntos de rotura en el segmento 18q21 se han agrupado principalmente en dos regiones: MBR (major breakpoint region) y mcr (minor cluster region) (Fig. 2). Esta translocacin no

dos casos presentaban reordenamiento BCL-2/IGH, determinado previamente por PCR en muestra total (ganglio). Tras el aislamiento de los folculos mediante microdiseccin por lser con el sistema P.A.L.M. - (P.A.L.M., Wolfratshausen, Alemania) (Fig. 3), se realiz una digestin con Proteinasa K (2). Para la obtencin de una gran cantidad de ADN en todas las

una PCR control para el locus de -globina, empleando cebadores y condiciones de PCR descritas (4). En todas las muestras se obtuvo ADN procedente de folculos incluidos en parafina con un ta2 mao medio de 0,4 mm (rango de 2 2 0,1 mm 0,6 mm ). La posterior amplificacin mediante el fago _29 permiti la obtencin de una media de 1 000 ng de ADN. En la

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Tabla 1. Reordenamiento de BCL-2/IGH en ADN extrados de muestra total y de muestra parafinadaReordenamiento BCL-2/IGH Caso Muestra Protena BCL-2 + + + + + + ADN extrado de muestra total + + + ADN extrado por LCM* de muestras parafinadas MBR mcr Control + + + + + + + + +

1 2 3 3 4 4

1 2 3 4 5 6

Figura 4. Gel de agarosa 0,8%. 1, 2, 3 y 6 proceden de la extraccin de varios folculos BCL-2+ (mediana: 650 ng de ADN), 4 y 5 proceden de un solo folculo BCL-2 + (mediana: 350 ng de ADN).

Figura 5. Gel de agarosa 2%. En las muestras 2 (caso 2), 3 y 4 (caso 3) se observa el producto amplificado por PCR, que corresponde al reordenamiento BCL2/IGH con punto de corte en MBR.

En 2 de los 4 pacientes analizados se detect la presencia de reordenamiento BCL-2/IGH. Las muestras que amplificaron para la t(14;18) se observan en la figura 5. Los dos pacientes que presentaban reordenamiento en la muestra de microdiseccin eran positivos por PCR en el ganglio, mientras que los dos casos sin amplificacin de BCL-2 en el producto de microdiseccin tampoco mostraban esta alteracin en la muestra total (Tabla 1). Adems, uno de los ADN amplificados se marc mediante la incorporacin de biotina por Nick translation para la posterior realizacin de Hibridacin Genmica Comparada (CGH) a partir de un folculo. El estudio de CGH no detect cambios a nivel genmico y mostr ser un ADN de buena calidad para ser empleado en esta metodologa tambin. Estos resultados sugieren que el empleo del fago _29 puede ser muy til para amplificar el genoma completo (5). Horror! o, tal vez, Eureka! Se pueden hacer copias del ADN total.

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figura 4 se observa la calidad del ADN amplificado de las 6 muestras procedentes de 4 casos de LNH.

Referencias:

1. Wang G., Brennan C., Rook M., Wolfe J.L., Leo C., Chin L., Pan H., Liu W-H., Price B., Makrigiorgos M. (2004) Balanced-PCR

amplification allows unbiased identification of genomic copy changes in minute cell and tissue samples. Nucleic Acids Res. 32(9), e76. Lehmann, U., Glckner, S., Kleeberger, W., Feist, H., von Wasielewski, R., Kreipe, H. (2000) Detection of gene amplification in archival breast cancer specimens by laser-assisted microdissection and quantitative real-time polymerase chain reaction. Am. J. Pathol. 156 (6), 1855-1864. Hawkins, T.L., Detter, J.C., Richardson, P.M. (2002) Whole genome amplification applications and advances. Current Opinion Biotechnol. 13, 65-67. Leone, P.E., Prez, J.C., Morillo, S.A., Paz-y-Mio, C. (2002). Low incidence of follicular lymphoma and t(14;18)(q32;q21) by polymerase chain reaction analysis: observations on Ecuadorian patients. Cancer Genet. Cytogenet. 137, 72-74. Robledo C., Leone P.E., Flores T., Martn P., Lumbreras E., Hernndez J.M., Isidro I.M., Maiso P., Garca J.L. (2003) Extraccin y amplificacin de ADN a partir de folculos de ganglio linftico obtenidos mediante microdiseccin por lser (PO-216). Libro de Resmenes de XLV Reunin Nacional AEHH, p. 146.

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Estandarizaci n de frecuencias al licas para poblaci n mestiza ecuatoriana a partir de estudios por STRsPor Csar Paz y Mio (cpazymino@puce,edu.ec)

as investigaciones sobre diversidad gentica de las poblaciones del mundo tienen un inters mayor en la actualidad. Los estudios comparativos entre poblaciones son numerosos, frente a los estudios intrapoblacionales. Previamente, habamos informado sobre las frecuencias de STRs en la poblacin ecuatoriana (1, 2). En el transcurso de estos aos, otros investigadores han informado sus resultados de STRs en poblacin del Ecuador: existen cuatro estudios ms en relacin con la poblacin mayoritaria del Ecuador: el grupo denominado mestizo. Los resultados difieren en el nmero de individuos de cada muestra, en los STRs utilizados, en los alelos y sus frecuencias. Este hecho nos condujo a buscar una estandarizacin

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de los resultados informados y a tratar de explicar las variaciones. Nuestras muestras de ADNs, coincidencialmente, son las mayores estudiadas para la poblacin mestiza ecuatoriana. Los ADNs se obtuvieron de sangre perifrica de 404 individuos no emparentados del grupo tnico mestizo, se excluy a los negros, indios, blancos, asiticos, cuacasoides y otros. El ADN fue extrado y preparado con kits y con la metodologa modificada de Maniantis (3), que manejamos en el laboratorio. Una vez determinada la pureza y concentracin del ADN, se realizaron PCRs para amplificar 17 marcadores STRs, ubicados en los distintos cromosomas: DED3S1358, HUMTH01, D21S11, D18S51, PENTA E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO,

PENTA D, VWA, D8S1179, TPOX, FGA, F13A1, FES/FPS. Cada resultado fue documentado. Las frecuencias allicas fueron procesadas mediante PowerStatsV12.xls (4) y luego fueron comparadas con las obtenidas en estudios previos realizados tambin para poblacin mestiza ecuatoriana (5, 6, 7, 8). El procedimiento para estandarizacin de los datos fue realizar simples comparaciones entre las frecuencias allicas. Las frecuencias que coinciden en ser las ms altas para el mismo alelo fueron estandarizadas realizando la media aritmtica de sus valores absolutos. Los resultados muestran que en 8 STRs las frecuencias coinciden en ser las ms altas para el mismo alelo (Ver tabla 1). Con los otros 9 STRs no se presenta este tipo de coinciden-

Tabla 1. Comparacin y estandarizacin de 8 STRs para los alelos que muestran coincidencias en sus frecuencias ms altas en cinco estudios realizados en poblacin mestiza ecuatoriana LOCUS D21S11 D18S51 PENTA E D5S818 PENTA D VWA D8S1179 TPOX Alelo 30 14 12 11 10 16 13 11 Paz-y-Mio 0.241 0.244 0.163 0.321 0.216 0.328 0.326 0.212 Gmez 0.325 0.245 0.182 0.480 0.292 0.438 0.339 0.278 Snchez 0.433 0.398 0.271 GonzlezAndrade 0.246 0.249 0.188 0.433 0.233 0.379 0.319 0.273 FernndezRosado 0.236 0.236 0.156 0.470 0.246 0.370 0.320 0.256 Media X 0.262 0.243 0.172 0.427 0.247 0.382 0.326 0.258

- : No hay valor de referencia.

x: promedio

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Tabla 2. Cotejo de los datos de alelos para 9 STRs que no muestran coincidencias en sus frecuencias ms altas en cinco estudios de poblacin mestiza ecuatoriana LOCUS D3S1358 THO1 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO FGA F13A1 FES- : No hay valor de referencia.

Paz y Mio 16(0.216) 6(0.261) 12(0.276) 12(0.352) 12(0.214) 11(0.301) 23(0.226) 5(0.214) 10(0.242)

Gmez 15(0.424) 6(0.372) 11(0.316) 10(0.830) 12(0.381) 23(0.119) -

Snchez 5(0.339) 11(0.296) 12(0.267) 11(0.308) 4(0.224) -

GonzlezAndrade 15(0.457) 6(0.331) 12(0.237) 10(0.278) 12(0.262) 12(0.357) 23(0.116) -

FernndezRosado 15(0.446) 7(0.340) 9(0.213) 10(0.263) 11(0.253) 11(0.333) 24(0.206) -

12-13 (0.174) 12(0.221)

Dentro del parntesis: Frecuencia allica. Fuera del parentesis: Alelo

cia, por lo que no se los puede someter a estandarizacin alguna (Ver tabla 2). Si bien se da por hecho que el 75% de la poblacin ecuatoriana es mestiza, y que son el resultado de un cruce entre espaoles y amerindios (9), la variabilidad de resultados en los estudios realizados para muestras de una misma poblacin, podra atribuirse a una diversidad gentica mayor, a la tradicionalmente descrita para espaoles y amerindios. La poblacin mestiza ecuatoriana debera ser considerada no como dihbrida sino como polihbrida. El origen de este polihibridismo es complejo y se necesitan ms estudios para llegar a conclusiones reales. Los datos histricos estn a favor de un origen mltiple de la poblacin ecuatoriana con asentamientos poblacionales que datan de 11 mil aos a.n.e. Hay evidencias sobre cruces con otras poblaciones provenientes de Asia, Oceana, China y Nrdica (9). El origen de la poblacin mestiza ecuatoriana no puede ser dilucidado bajo una perspectiva netamente histrica ni nicamente molecular, pues se necesita de ambos parmetros para reconstruir la historia de la evolucin humana y

el origen de las poblaciones. Sin embargo, la aplicacin de este estudio, facilitara el anlisis de la poblacin mestiza ecuatoriana si se parte de los datos estandarizados de los STRs que presentan coincidencias en los alelos con frecuencias ms altas, para luego analizar los variables.

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Referencias

1. Paz y Mio, C. 2001 Resultados Preliminares de la frecuencia de STRs en la poblacin ecuatoriana. Nuestra Ciencia, n. 3:20-22. 2. Paz y Mio, C. 2005 Caracterizacin de secuencias de ADN repetidas en tandem (STRs) en poblacin mestiza ecuatoriana. Nuestra Ciencia, n. 7:12-14. 3. Gmez M, Peaherrera M, Aguirre-Tello V, Vela-Cavinato M, Giovambattista G. Allelle Frequencies of 15 STR loci in the Quito city Population, Ecuador (J. Forensic Sci-enviado a consideracin). 4. Snchez D., Gonzlez-Andrade F., Martnez Jarreta B. Population Genetics of 12 STR Loci in a Simple of Mestizos from Ecuador (South America). J Forensic Sci 2003; 48(2):453-454. 5. Gonzlez-Andrade F., Snchez D., Martnez-Jarreta B. Genetic Profi-

7.

8.

9.

le of the Ecuadorian Mestizo population (Ecuador-South America) by using the Power Flex 16 System Kit. Forensic Sci 2003; 135: 64-66. Fernndez-Rosado F., MartnezEspn E., Rodrguez T., Entrala C., Alvarez J.C., Lorente J.A., Budowle B., Villanueva E. Population Data of Ecuador for Fifteen STR Loci (POWERPLEXTM16). J Forensic Sci 2002; 48(1): 1-3 Paz-y-Mio C. Genetic Services in Ecuador. Community Genet 2004; 7:137-141. Cavalli-Sforza, L.L., Menozzi, P., Piazza, A. The History and Geography of Human Genes. Princeton University Press. PrincetonUSA. 1994. Salazar, E. El Hombre temprano en la regin del Ilal, Sierra del Ecuador. Universidad de Cuenca, Cuenca, 1979.

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Enemigos silenciososPor Sofa Ocaa M. y Mario J. Grijalva ([email protected]) ([email protected])

La Enfermedad de Chagas y Trypanosoma cruzi:

a Enfermedad de Chagas, conocida tambin como tripanosomiasis americana, es una de las enfermedades parasitarias ms importantes de Latinoamrica. Esta enfermedad es causada por el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi (Fig. 1a), y es transmitida, principalmente, por las heces de insectos de la subfamilia Triatominae; estos vectores son conocidos en el Ecuador como chinchorros o chinches caballo (Fig. 1b). La segunda ruta ms comn de transmisin es medianteFotos: Esteban Baus

L

mente, durante la fase crnica, se produce un dao paulatino en el corazn y en el sistema digestivo. Debido a estas caractersticas, la mayora de los afectados con la Enfermedad de Chagas no reciben un diagnstico oportuno. Al no contar con un diagnstico, no se aplica el tratamiento mdico y por lo tanto la enfermedad avanza hasta su estado crnico. Chagas es una enfermedad conocida por los investigadores, ignorada por mucho tiempo por las autoridades de salud y completamente desconocida por las poblaciones afectadas. Pero, qu hace

resultado de complejas interacciones entre parsitos, insectos vectores y mamferos reservorios, en los que se incluye el hombre. La transmisin del parsito se ve favorecida por la influencia de varios determinantes como la distribucin de las poblaciones humanas, la colonizacin de reas de bosque, deforestacin, cambios medioambientales (ligados al desarrollo de actividades econmicas), condiciones de las viviendas, y de otros patrones sociales y culturales (Abad-Franch y Aguilar, 2003). El no conocer cul es el rol epidemiolgico y ecolgico de todos los actores (parsito, insecto vector y reservorios) nos impide desarrollar las herramientas necesarias para prevenir la transmisin de la Enfermedad de Chagas en las provincias del Ecuador, en las cuales se presenta como endmica. Se calcula que en el pas existe una prevalencia del 1.37% (164 000 personas aproximadamente) y al menos 3 millones de personas viven en riesgo de contraer esta enfermedad, siendo la cardiomiopata chagsica la forma crnica dominante en el pas (Aguilar et al., 2001; Abad-Franch et al., 2001). Esto convierte a Chagas en un problema de salud pblica tan importante como la malaria o el dengue. Sin embargo, hasta el momento no est considerada dentro de las enfermedades prioritarias en las polticas estatales. Por estas razones, el Laboratorio de Investigacin en Enferme-

Qu pasa en el Ecuador?

Figura 1 a) Trypanosoma cruzi (tripomastigote), parsito causante de la Enfermedad de Chagas. b) Panstrongylus howardi uno de los principales vectores transmisores de la enfermedad de Chagas en Ecuador.

las transfusiones de sangre (Grijalva et al., 1995). sta es una enfermedad silenciosa, ya que sus sntomas no se expresan sino despus de 5 a 20 aos de producida la infeccin. Durante la infeccin aguda, se presentan sntomas como el malestar general y la fiebre que fcilmente se podran confundir con otras enfermedades comunes. Luego viene una fase indeterminada en la que no se presentan sntomas y, final-

que esta enfermedad sea tan compleja? La respuesta no es sencilla. Se considera que su impacto social y econmico supera los efectos combinados de otras enfermedades parasitarias como la malaria, leishmaniasis y esquitosomiasis (Dias y Schofield, 1999). Uno de los principales problemas es la falta de conocimiento sobre los factores biolgicos relacionados con esta enfermedad y esto se debe, bsicamente, a que su transmisin es el

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dades Infecciosas (LIEI) de la PUCE ha realizado, durante los ltimos 6 aos, investigaciones para buscar las respuestas a importantes interrogantes relacionadas con la enfermedad de Chagas, tales como: cul es el porcentaje de la poblacin afectada en las provincias endmicas para esta enfermedad?, cules son las especies de vectores que estn involucrados en la transmisin activa de la enfermedad?, qu especies de mamferos pueden ser importantes como bodegas del parsito y por ende de la enfermedad?, qu cepas del parsito circulan en el pas?

riesgo que influyen en la persistencia de la infeccin y se encontr que las condiciones socio-econmicas (tipo de construccin de viviendas, educacin, entre otros) son factores que estn relacionadas con la incidencia de la enfermedad (Fig. 2). Tambin se hall que especies de vectores antes considerados secundarios estn jugando un rol importante en la transmisin activa. Adems, reportamos que especies de mamferos sinantrpicos, como las ratas, son reservorios importantes del parsito y que deben ser tomados en cuenta en los programas de control de la enferFoto: Archivo LIEI

tado de las poblaciones en lo que respecta a su relacin con las especies de los hospederos en donde se los encontr (vectores, mamferos), el hbitat en donde fueron colectados, la ubicacin geogrfica y las relaciones genticas entre los aislados obtenidos.

Los ciclos de transmisin de la Enfermedad de Chagas: su complejidad e influencia

Figura 2. Construccin tpica de vivienda en reas endmicas en las que se desarrolla la Enfermedad de Chagas. Los materiales con la que es construida favorecen el establecimiento de los vectores y son consideradas como factores de riesgo en la transmisin de la enfermedad (Provincia de Loja).

Muchas de estas preguntas han sido respondidas, al menos parcialmente. Por ejemplo, se encontr que el 3.8% de un total de 4 800 personas examinadas de 30 comunidades rurales en Manab (Grijalva, datos no publicados), el 3.9 % de un total de 1 136 muestras analizadas en 5 comunidades rurales de Loja (Grijalva et al., 2004) y el 2.9% en la Amazonia (Grijalva et al., 2003) son seropositivos para la presencia de anticuerpos anti-T. cruzi, lo que representa un indicativo de la infeccin. Se analiz, tambin, los factores de

medad por la alta incidencia de infestacin con tripanosomas que presentan. Sin embargo, quedaban otros aspectos que deban ser abordados, como por ejemplo resolver la duda de qu pasa con las poblaciones del parsito y qu relacin tienen con los ciclos de transmisin activa en Ecuador? Genticamente, qu tan similares o distintos son los parsitos aislados de diferentes provincias del pas? Si bien estas preguntas requieren un estudio a largo plazo, nos planteamos como meta inmediata el establecer, a un nivel general, el es-

El ciclo silvestre de la Enfermedad de Chagas involucra la interaccin entre vectores silvestres y los reservorios dentro de los ecotopos naturales. En este caso se produce un balance ecolgico entre el parsito, el vector y el reservorio debido a que la co-evolucin ha hecho que los parsitos no produzcan dao a los vectores y reservorios. En cambio, el ciclo domstico es el resultado del contacto entre los vectores y los humanos, y est influenciado por una serie de modificaciones ecolgicas en el ambiente, en este caso el parasitismo causa la enfermedad en las personas y las interacciones entre los ciclos domstico y silvestre son el producto de factores que dependen bsicamente del comportamiento humano (Dias, 1992). Un claro ejemplo es la intervencin humana en reas de bosque, en este caso los vectores que usualmente se alimentaban de la sangre de mamferos silvestres tienen a disposicin una nueva fuente de alimento: los humanos y los animales domsticos. En este momento se produce un vnculo entre los ciclos de transmisin domstica y silvestre a travs de los vectores que pone en riesgo de infeccin a la poblacin (Fig. 3). Las interacciones entre reservorios y vectores tambin juegan un papel importante en los ciclos de transmisin. En el ciclo domstico, los humanos y los animales domsticos son las principales bodegas de los parsitos y el riesgo se incrementa con la presencia de

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mamferos sinantrpicos como las raposas y ratas que se encuentran infectadas y que frecuentemente invaden las reas domsticas y peridomsticas, aumentando la posibilidad de infeccin con T. cruzi. Las aves no son consideradas como reservorios debido a que no son susceptibles a la infeccin por T. cruzi; sin embargo, juegan un rol importante en la ecologa de la Enfermedad de Chagas debido a que son una de las principales fuentes de alimento de la mayora de especies de triatominos (Dias, 1992).

Buscando en el genoma

Existen varias fuentes para obtener informacin biolgica, sin embargo el ADN es una de las fuentes ms importantes y de la que se pueden obtener datos tan especficos como variados. Por esta

ms de obtener la informacin biolgica conocimos la realidad social en la que vive la gente de estas comunidades. Esa experiencia nos permiti entender a un nivel ms que profesional, humano, las razones y el porqu todos estos estudios y sacrificios valen la pena. Con la ayuda de voluntarios, especialmente jvenes, se realiz la captura de los mamferos. Personal del Programa Nacional de Chagas del Servicio Nacional de Erradicacin de la Malaria (SNEM) colabor en las bsquedas activas de los vectores en cada una de las viviendas de la comunidad. Una vez colectados, los animales fueron procesados y se obtuvo ADN de las muestras de sangre de los mamferos y las muestras de heces de los vectores. Con este material, se realiz la amplificacin de ciertas

Figura 3. Interaccin entre el ciclo de transmisin domstico y silvestre del parsito T. cruzi. 1-4 transmisin silvestre entre triatominos y mamferos silvestres. 5-6 transmisin domiciliar/peridomiciliar entre triatominos, humanos y mamferos domsticos (Zeledn, 1974). El punto de enlace entre ambos ciclos constituyen, principalmente, los vectores que colonizan las viviendas, pero tambin puede estar influenciado por la presencia de mamferos silvestres en zonas de asentamientos humanos.

razn decidimos utilizar al genoma como fuente de informacin para conocer lo que est pasando con el parsito. Como primer paso debamos obtener los parsitos, para esto realizamos largas salidas de campo a distintas comunidades de las provincias de Manab, Loja, Guayas y a la Amazonia; en estos sitios, ade-

regiones del genoma mediante la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Para este estudio escogimos tres marcadores moleculares: el espacio intergnico del mini-exn (NTS-ME), el minicrculo del kinetoplasto (kADN) y microsatlites polimrficos. El NTS-ME es una secuencia que nos permite identificar el li-

naje al que pertenece un aislado de T. cruzi y relaciona cada linaje con una forma de transmisin (el linaje TC I se relaciona con el ciclo de transmisin silvestre y el linaje TC II con el ciclo de transmisin domiciliar). La relacin entre los ciclos de transmisin y ciertos aspectos ecolgicos y sociales es importante y debe ser analizado para tener un enfoque global de la influencia de los parsitos en la epidemiologa de la enfermedad. Con los antecedentes sobre la influencia de los ciclos de transmisin, comparamos la informacin molecular y la relacionamos con las caractersticas de los ciclos de transmisin en el Ecuador. Los resultados que encontramos fueron muy interesantes. Se vio que en nuestro pas los ciclos de transmisin no estn claramente separados, es decir, encontramos infeccin con el linaje silvestre (TC I) en animales considerados dentro del ciclo domstico como las ratas. Tambin encontramos un alto porcentaje de infecciones mixtas con TC I y TC II. Esto indica que se est produciendo una conexin entre ambos ciclos lo que puede tener consecuencias epidemiolgicas importantes. Por ejemplo, esto puede estar influenciando en los sntomas que presenta la enfermedad en su fase crnica. Esto tambin indica que las acciones de control deben contemplar, adems de un control de los vectores, una vigilancia para detectar nuevos brotes. Si se elimina la transmisin domiciliaria en un rea, la misma puede ser re-invadida por vectores que introduzcan nuevamente el parsito al infectar a nuevas especies de reservorios o vectores relacionadas con los asentamientos humanos. Ahora, nos gustara saber, por ejemplo, cmo influye este escenario ecolgico en la sintomatologa y en la respuesta a los tratamientos aplicados? Esta es una pregunta, de las tantas, para la que an no tenemos la respuesta; por esto, seguimos investigando.

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Si encontramos diferencias en cuanto a la relacin de los parsitos con sus hospederos, qu diferencias existen entre los diferentes aislados de parsitos? Para responder esta pregunta analizamos las muestras con tres microsatlites polimrficos, y encontramos un indicio interesante. Los anlisis estadsticos mostraron que los aislados de las provincias de Orellana y Loja se encuentran genticamente ms relacionados que las muestras de provenientes de Manab. Este resultado llam la atencin debido a que Orellana y Loja se encuentran geogrficamente distantes y separadas por la cordillera de los Andes. Una posible explicacin a este resultado es que desde los aos 60 se ha dado un movimiento migratorio significativo hacia la regin amaznica, desde diferentes zonas del pas, incluyendo reas consideradas endmicas para la Enfermedad de Chagas; y posiblemente personas infectadas llevaron el parsito hacia zonas de la Amazonia (Grijalva et al., 2003). Otro de los problemas asociados a este parsito es la confusin en el diagnstico. Esto se produce principalmente por la presencia de otra especie de trypanosoma que tambin es importante, esta especie es Trypanosoma rangeli. La importancia de este parsito, a pesar de no ser patgeno para el hombre, radica en que comparte con T. cruzi su distribucin geogrfica y especies de hospederos (reservorios y vectores). Ms an, existen muchas similitudes moleculares que hacen que estas infecciones no puedan ser diferenciadas mediante pruebas serolgicas para diagnstico. En este caso el anlisis del kADN nos permiti confirmar la presencia de T. rangeli en las mismas reas de distribucin de T. cruzi y compartiendo especies de vectores. Esta informacin es valiosa y debe ser considerada por los centros mdicos de diagnstico

para que se realicen pruebas de confirmacin utilizando, de preferencia, anlisis moleculares. Estos resultados nos indican que la situacin epidemiolgica de Chagas en el Ecuador est influenciada tanto por factores sociales como por factores biolgicos y por tanto debe ser abordada de forma global, con un enfoque ecolgico y molecular de todos los componentes (parsito, vector y resevorio) sin olvidar que tenemos la responsabilidad moral de sumar esfuerzos para mejorar el nivel de salud y vida de las poblaciones afectadas por esta enfermedad. De ah que el objetivo a largo plazo del LIEI es buscar e investigar toda la informacin biolgica necesaria para plantear, mejorar y establecer programas de control integrales que lleven a la erradicacin de la enfermedad de Chagas en Ecuador.

Conclusin

Abad-Franch, F., Aguilar, H.M. 2003. Control de la Enfermedad de Chagas en el Ecuador. Organizacin Panamericana de la Salud - Ministerio de Salud Pblica del Ecuador, 146 pp. Abad-Franch, F., Paucar, A., Carpio, C., Cuba-Cuba, C.A., Aguilar, H.M., Miles, M.A. 2001. Biogeography of Triatominae (Hemiptera: Reduviidae) in Ecuador: Implications for the design of control strategies. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 96: 611620. Aguilar, H.M., Abad-Franch, F., Guevara, A.G., Racines, V.J., Briones, L.B., Reyes, L.V. 2001. Gua operacional para el control de la enfermedad de Chagas en el Ecuador. FASBASE, MSP. Quito, Ecuador. Dias, J.C.P., Schofield, C.J. 1999. The Evolution of Chagas Disease (American Trypanosomiasis) Control after 90 Years since Carlos Chagas Discovery. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 94:

Literatura citada

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BUDDLEJAEST DESAPARECIENDO POR CULPA DE

PINUSLas plantaciones de pino y el calentamiento global cambian el pramo.Por Tjitte de Vries ([email protected])

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reinta aos (19762006) de estudios de la dinmica de la vegetacin del pramo arbustivo del Cotopaxi nos indican el efecto causado por los bosques de pino sobre los rboles nativos y las plantas herbceas; mientras que alteraciones adicionales, en reas no intervenidas por el hombre, nos hacen sospechar una reorganizacin ecolgica causada por el calentamiento global. El paisaje andino ecuatoriano cambi con la introduccin del eucalipto y el pino; en efecto, la entrada del Parque Nacional Cotopaxi sorprende al presentar el ambiente del hemisferio norte con el bosque de Pinus radiata, una especie originaria de los Estados Unidos. Pero slo ha cambiado el paisaje? Qu pas con las plantas herbceas situadas en la sombra del bosque? En 1976 iniciamos un estudio de la vegetacin en el pramo a 3350 msnm, en un rea que fue usada entre 1967-1971 para el cultivo de Piretro (Chrysanthemum cinerariifolium); en ese ao (1976) se sembraron pinos en el sitio de nuestro estudio. Los vestigios del arado se notan claramente en la figura 1. Este mismo cuadrante contaba en 1979 con 25 plantas vasculares, cuatro especies fueron abundantes (Caryophyllaceae, Poaceae (2 especies) y Rumex acetosella), con seis plantitas de pino entre 0.53-1.43 m de altura (L. Avils, 4 Septiembre 1979; Tabla 1). En 1982, quisimos saber cmo se recupera la vegetacin paramea en esta rea intervenida; por esto, instalamos tres cuadrantes adicionales en reas cercanas, no intervenidas, dominadas por rboles de Quishuar (Buddleja incana), Pumamaqui (Oreopanax sp.), Sacha capul (Vallea stipularis) y Rapanea sp., todos rboles nativos (Balslev y de Vries, 1982). El contraste es grande: cuadrante 1, el intervenido, tena 19 especies de plantas vasculares (ade-

T

Figura 1. El cuadrante 1 en 1976 con pinos recin sembrados, vestigios de arado visibles.

Tabla 1. Cambios y disminucin de especies en el cuadrante 1rboles y arbustos: Baccharis latifolia Baccharis sp. Berberis sp. Margyricarpus setosus (pinnatus) Myrica parvifolia Pernettya prostrata Pinus radiata Vaccinium floribundum Hierbas gramincolas: Aegopodon cenchroides Anthoxanthum odoratum Calamagrostis intermedia Cortaderia ntida Festuca sp. Stipa sp. Poaceae sp. 1 sp. 2 sp. 3 sp. 4 sp. 5 sp. 6 Otras hierbas: Asteraceae sp. 1 sp. 2 Bidens humilis Bidens sp. Caryophyllaceae Cerastium sp. Chrysanthemum cinerariifolium Eryngium humile Geranium chilloensis Geranium sp. Gnaphalium sp. Hydrocotile bonplandii Hypericum cf. indecorum Hypericum sp. Hypochoeris sp. Lachemilla sp. Lupinus sp. Plantago sp. Rumex acetosella Senecio chionogeton Vernica sp. No identificado Total de plantas vasculares 1979 X X X X 1982 X X X X X X X X X X X X Aos 1990 X X 1991 X X X X X 2005

X X

X

X X

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

X X X X X X X X X X X

X X X X X X X 19

X X

X

X X X X X 12 X X 14

X X

X X X X X

Musgos, lquenes y hongos terrestres: Anacolia laevisphaera Boletus sp. Cladonia sp. 1 sp. 2 Dictionemia pavonia Lycoperdon sp. Polytrichium juniperinum Stereocaulon cf. myriocarpum Thuidium peruvianum Liquen sp. Musgos epifticos: Evernastrum sp.

X X 25 X X X X X X X X X X

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En los aos 1976, 1990, 1991 y 2005 no se analizaron los musgos, lquenes y hongos

ms, 10 especies de musgos, lquenes y hongos terrestres y una especie de musgo epiftico); el no inter-

venido, el cuadrante 2, cont con 64 especies de plantas vasculares (y 8 especies de musgos, lquenes y

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Figura 2 a. El cuadrante 1 en 2005, despus de la tala del bosque de pino; el pino ms grueso talado tena 60 cm de dimetro (en la esquina izquierda, arriba).

Figura 2b. Grfico de cobertura de especies vegetales del cuadrante 1.

hongos terrestres y 10 especies de musgos y lquenes epifticos). El gran total: 30 versus 82 especies; en ambos sitios en 10 x 10 m. En 1982, en el cuadrante 1, las gramneas Aegopogon cenchroides y Anthoxanthum oderatum y Rumex acetosella (las tres consideradas malas hierbas, por crecer en tierras alteradas) eran las ms afectadas entre las especies dominantes, con el arbusto enano Margyricarpus setosus, disperso en todo el cuadrante y el musgo Polytrichium juniperinum con una cobertura de sobre el 25 %. El ms grande de los seis pinos lleg hasta 6 metros. En 1990 y 1991, las plantas vasculares disminuyeron a 12 y 14 especies, respectivamente (Bliemslieder, 1992; Tabla 1). Rumex y musgos y lquenes se mantienen, como tambin gramneas y Pernettya prostrata y Margyricarpus. En 2005 (22 de octubre) poco ha cambiado, las especies mencionadas anteriormente estn presentes, mantenindose durante todos estos treinta aos; se presentan dos especies no vistas antes: Eryngium humile y Senecio chionogeton. Ciertos cambios tienen relacin con el desarrollo del bosque de pino que fue talado en 2004 (despus de 24 aos que fue plan-

tado). El rbol de pino ms grueso, encontrado cortado en el cuadrante, tena 60 cm de dimetro al nivel del piso (Fig. 2a y 2b) En el cuadrante 2, en un rea no intervenida en 1982, el nmero de especies de plantas vasculares tambin disminuy: de las 61 especies en 1982 a 42 en 1990; 34 en 1991 y 20 en 2005. Despus de 1991, en este cuadrante fueron plantados pinos; en 2005, encontramos 13 rboles con alturas entre 1.70-3.30 m, que, sin duda, alteran ms esta rea no intervenida previamente.

El rbol de Buddleja incana creci hasta 6 m (en 1982 tena 3 m) y arbustos como Berberis sp., Brachyotum ledifolium, Gynoxys buxifolia, Hypericum laricifolium, Monnina crassifolia, Pernettya prostrata, Rubus sp., Vallea stipularis y Muehlenbeckia tamnifolia (una trepadora) se mantienen; todas son plantas tpicas para el pramo arbustivo (Fig. 4 y 5). Las que se van... son especies de orqudeas terrestres (Fig. 3). Estas plantas asoman y florecen muy peridicamente. Sus bulbos quedan bajo tierra, pero en los lFotos: Tjitte de Vries

Figura 3. Las que se van... . Altensteinia virescens y Rubus glabratus.

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Figura: C. Altamirano, A. Bastidas, R. Bentez y A. Carvajal

Actualidad CientficaFigura: M. V. Surez y S. Ribadeneira

Figura 5. Grfico de cobertura de especies vegetales del cuadrante 4.

timos aos no han asomado. Ser por el calentamiento global? Sern las orqudeas del pramo como los jambatos, una seal de extincin? Tambin, entre los arbustos desaparecieron especies : Baccharis spp., Coriaria ruscifolia, Myrica parvifolia y Salpichroa difusa (una trepadora). Durante una generacin (24 aos, 1976-2004) de Pinus radiata, el suelo queda con musgos, lquenes, gramneas, Rumex, Bidens humilis, Lachemilla, Lupinus, todas

especies de reas abiertas. La prdida de las especies parameras ser el equivalente de las ganancias de ACOSA S.A. en xxx metros cbicos de madera de pino? Nos preguntamos: la siguiente generacin (ciclo de cosecha) durar menos que 24 aos? Ser el crecimiento de los rboles de pino ms rpido por el aumento de la concentracin del dixido de carbono? El ao 2030 nos dar las respuestas. Es llamativo que en el rea no intervenida, tambin haya disminucin de especies, en las diferentes formas de vida, entre arbustos y plantas herbceas (42-34 especies en 1990-91 y 20 en 2005). Esta desaparicin no es una extincin global. Tenemos que instalar ms cuadrantes permanentes para averiguar cun local puede ser esta desaparicin; pero el cuadrante 3 en reas no intervenidas demuestra la misma tendencia de prdida: en 1982 con 68 especies; en 1991 con 44 y en 2005 con 21 especies de plantas vasculares. Algo pasa en el pramo! El Quishuar (Buddleja incana) est desapareciendo debido al desarrollo del pino(Pinus radiata), y lo peor es que esta situacin est patrocinada por el hombre y su economa. El pramo pierde especies (no solamente el Jambato;Fotos: Tjitte de Vries

Pounds et al., 2006). Ser por el calentamiento global causado por el hombre, quien al quemar combustible fsil y talar los bosques, aumenta la cantidad de dixido de carbono? El estudio ha demostrado el efecto negativo del pino sobre la vegetacin del pramo; lo que todava no est claro es si se inici tambin una reorganizacin ecolgica por causa del calentamiento global.

Balslev, H. y Tj. de Vries, 1982. Diversidad de la vegetacin en cuatro cuadrantes en el pramo Arbustivo del Cotopaxi, Ecuador. Publicaciones Museo Ecuatoriano de Ciencias Naturales. n. 3, Ao 3: 20-32. Bliemslieder, M., 1992. Cambios en la diversidad de la vegetacin en parcelas permanente luego de un periodo de ocho y nueve aos en el pramo arbustivo del Parque Nacional Cotopaxi, Ecuador. Disertacin, Licenciatura en Ciencias de Educacin , especializacin Biologa, PUCE, Quito. De Vries, Tj., 2005. Cuntos aos viven los frailejones del pramo de El Angel? 25 aos de anlisis de la dinmica poblacional de Espeletia pycnophylla. Nuestra Ciencia n. 7: 48-50. De Vries, Tj. y J. Jaramillo, 2004. Dinmica de la vegetacin del pramo de la Virgen del Antisana se secarn los pramos? Nuestra Ciencia n. 6: 33-35. Pounds, J.A., M.R. Bustamante, L.A. Coloma, J.A. Consuegra, M.P.L. Fogden, P.N. Foster, E. La Marca, K.L. Masters, A. Merino-Viteri, R Puschendort, S. Ron, G.A.Snchez-Azofeifa C.J. Still y B.E. Young, 2006. Widespread amphibian extincions from epidemic disease driven by global warming. Nature 439:161-167.

LITERATURA CONSULTADA

Figura 4.

El cuadrante 2 en1982, en una quebrada con Buddleja incana.

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SISTEMAS DE DEFENSA DE PLANTAS:HAY EVIDENCIA DE LA EXISTENCIA DE UN SISTEMA INMUNE?Por Ricardo Oliva [email protected]

Introduccinas plantas tienen numerosos enemigos incluyendo bacterias, hongos, oomycetes, virus, insectos y nemtodos. Por tal motivo, no es extrao que posean un sistema de defensa tan diversificado y dinmico como el que ocurre en animales. A pesar de que plantas y animales tienen un ancestro evolutivamente muy distante y su complejidad biolgica no es equiparable, comparten caractersticas generales que hacen factible preguntar si poseen un sistema inmune. En ambos grupos, los mecanismos de defensa se han especializado en distinguir lo propio de lo extrao, desencadenando una serie de respuestas fisiolgicas y bioqumicas con la finalidad de aislar o eliminar esos elementos extraos. En sentido amplio, un sistema inmune debe tener tres caractersticas: 1) reconocer y reaccionar ante la presencia de elementos extraos, 2) generar una seal que perdure a modo de memoria y 3) distribuir esta seal a todo el organismo. La inmunidad en animales se adquiere por la respuesta innata, la cual reconoce elementos universales en los patgenos, y la respuesta adaptativa que evoluciona y aprende al reconocer antgenos novedosos. A pesar que la complejidad en la organizacin e interaccin celular de plantas es muy primitiva en comparacin a la de animales, hay evidencia para pensar que ambos sistemas, innato y adaptativo, se encuentran representados.

L

Hoja de pepino dulce (Solanum muricatum) infectada por el oomycete Phytophthora infestans.

Podemos llegar a pensar que las plantas adquirieron un sistema que les permite reconocer un elemento extrao, producir una seal de alerta que es transportada a otros tejidos y finalmente reaccionar de forma global ante el ataque de un patgeno? Qu ocurre si esta seal permanece en la planta actuando como una memoria y protege a la planta de futuros ataques? Varios de los procesos que vamos a resumir han sido estudiados en plantas modelo o plantas con inters comercial. El objetivo es saber qu nivel de complejidad poseen los sistemas de defensa vegetales para ser considerados como un sistema inmune.

Mecanismos de defensa externos: tricomas, pelos, toxinasLa epidermis y cutcula de las plantas son sin lugar a duda la primera lnea de defensa en contra de posibles patgenos. Adicionalmente, algunas especies o grupos han desarrollado estructuras exteriores como espinas y tricomas que optimizan la funcin defensiva. Se han aislado alrededor de 12 000 compuestos procedentes de organismos vegetales. Una buena parte de estos poseen actividad anti-microbiana. Estas sustancias, que son sintetizadas durante el crecimiento y desarrollo, impiden el crecimiento o presentan alta

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Foto: Gabriela Chacn, Centro Internacionaol de la Papa (CIP, Quito)


toxicidad ante agentes microbianos. Saponinas, taninos, isoflavonoides, derivados fenlicos, etc., constituyen una batera de compuestos de defensa con distinto origen metablico. Las saponinas son productos del metabolismo secundario y se encuentran en la mayora de plantas. Se ha demostrado que las saponinas se unen a los esteroles contenidos en la membrana de los hongos. Esta unin causa la prdida de la integridad de la membrana y por consiguiente previene una posible colonizacin. Evidencias de la importancia de las saponinas en los sistemas de cultivo se han obtenido del estudio de la especie Avena strigosa, utilizada comnmente como avena forrajera. Los mutantes de esta especie que poseen deficiencia para producir saponinas tambin presentan mayor susceptibilidad al ataque de hongos patgenos. Todos estos mecanismos constituyen la defensa pasiva, la cual funciona durante todo el ciclo de vida de la planta. Por otro lado, existen sustancias cuya sntesis de novo es inducida como respuesta a un ataque. Las fitoalexinas han sido ampliamente estudiadas en los sistemas planta-patgeno y se resalta su importancia en la resistencia general de muchas especies a una infinidad de agentes. Se ha demostrado la produccin de fitoalexinas en clulas de perejil que han sido artificialmente inoculadas con varias especies de oomycetes del gnero Phytophthora. De igual forma, la capacidad de algunos hongos para detoxificar las fitoalexinas es una caracterstica importante en su virulencia. Por ejemplo, las cepas ms agresivas del hongo Nectria haematococca que atacan a garbanzo y arveja son aquellas que pueden sobrevivir en presencia de las fitoalexinas producidas por dichas plantas.

Respuesta mediada por genes de resistencia (R)Las plantas tienen la capacidad de reconocer patgenos de forma especfica. Para esto han desarrollado un sistema que identifica molculas llamadas elicitinas. Las elicitinas son molculas secretadas por el patgeno que desencadenan una respuesta por parte de la planta. La resistencia especfica est definida por la presencia de genes mayores de resistencia (R) los cuales estn conservados entre las distintas especies de plantas. Estos genes R codifican receptores especficos en la membrana o citoplasma de la clula vegetal cuya funcin es reconocer elicitinas producidas por genes de avirulencia (Avr) en el patgeno. En el modelo del gen-porgen (Flor, 1971), a cada gen R le corresponde un gen de avirulencia Avr. Cuando la elicitina del patgeno es reconocida positivamente por el receptor en la planta, se inicia una cascada de sealizacin celular que termina en lo que se ha llamado respuesta de hipersensibilidad (RH). En plantas, la respuesta de hipersensibilidad es un mecanismo para producir muerte celular localizada. Este suicidio celular ocurre como medida para impedir el avance del patgeno (Fig. 1). Los genes R que se encuentran presentes en las distintas especies

de plantas comparten dominios estructurales en todo el reino vegetal. La mayora de protenas codificadas por los genes R poseen dominios con repeticiones ricas en leucina (Leucine Reach Repeats) y sitios de unin a nucletido (Nucleotide Binding). Conjuntamente se conocen como protenas con dominios NB-LRR. Fuera del reino vegetal, otras molculas receptoras tambin comparten estos dominios estructurales, lo que sugiere un nivel mayor de conservacin en las estrategias de reconocimiento (Fig. 2). Muchos receptores R de plantas son parecidos a los receptores Toll de Drosophila, los cuales cumplen papeles importantes en la respuesta innata y durante el desarrollo. En mamferos, los receptores para interleucina-1 (TLR), que son componentes importantes del sistema inmune animal, comparten homologa con los receptores R del sistema de defensa de plantas (Dangl, et. al., 2001) La RH en plantas es un mecanismo anlogo a la muerte celular programada que ocurre en clulas animales. Este mecanismo se denomina apoptosis, y al igual que la RH en plantas, ocurre en respuesta a una seal que proviene del exterior de la clula. Una vez que los receptores han sido activados, las clulas necesitan enviar rdenes de muerte celular al interior del ncleo. En plantas, este proceso se encuentra mediado por un grupo

Figura 1. Esquema de la colonizacin por parte de un patgeno y la respuesta de la planta mediada por genes R.: A. El patgeno penetra el tejido y causa infeccin en una planta susceptible. B y C. Las clulas de la planta han reaccionado ante el ataque mediante la respuesta de hipersensibilidad. Como consecuencia de la presencia de genes R se desencadena una respuesta que termina en la muerte celular y la eliminacin del patgeno (Tomado de Kamoun, 2003).

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Figura 2. Comparacin de las protenas R de plantas con otras protenas involucradas en la inmunidad innata en animales. Toll en Drosophila y TLR en mamferos son activados por ligandos extracelulares y comparten un dominio citoplasmtico TIR. Una vez activados, todos reclutan protenas con dominios de que se han llamado de muerte celular. Estas protenas llevan la seal de suicidio al ncleo (tomado de Dangl J. & Jones J.D.G. 2001).

de protenas llamadas MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinase). A pesar que la apoptosis en animal es un proceso muy complejo que regula varios aspectos biolgicos, tambin emplea parte de la ruta de las MAPKs (por ejemplo, protenas ERK1, ERK2, JNK, etc) para auto eliminarse. La respuesta de hipersensibilidad est acompaada de otras respuestas fisiolgicas y bioqumicas. El endurecimiento de la pared celular, la produccin de radicales libres a partir del oxgeno (O-, HOy H2O2), la peroxidacin de lpidos, entre otros, son mecanismos que ocurren paralelamente a la RH y ayudan a eliminar al agresor. Despus del ataque microbiano, la planta tambin necesita informar a otros tejidos para que activen sistemas de defensa. El cido saliclico es uno de los mensajeros ms importantes producidos a este nivel. Una de sus funciones es viajar a otros tejidos donde induce una respuesta global. Este evento se conoce como resistencia sistmica adquirida y

proporciona a la planta con una estrategia de defensa global en caso de ataques mltiples.

La respuesta innata

Se ha generado mucha evidencia que asegura que varios principios del sistema inmune innato de mamferos e insectos funcionan igual a los sistemas de defensa en plantas. Adicionalmente a la respuesta especfica mediada por genes R, las plantas han desarrollado la capacidad de reconocer elicitinas mucho ms generales en los patgenos. Este tipo de molculas elicitoras que forman parte integral de las membranas de microorganismos incluyen oligosacridos, lpidos, polipptidos y glicoproteinas. Los lipopolisacridos (LPS), por ejemplo, son componentes integrales de bacterias Gram negativas. Estos compuestos activan la sntesis de molculas anti-microbianas en Drosophila de la misma manera que lo hacen con productos inmunoregulatorios y molculas citotxicas en huma-

nos. Una de las molculas claves inducidas por LPSs bacterianos en humanos es el xido ntrico (ON). Esta molcula gaseosa funciona como segundo mensajero e inhibe la replicacin viral. A pesar de esto, su participacin en la respuesta innata de plantas no ha sido clarificada en su totalidad. Recientemente se ha estudiado la interaccin entre la planta modelo Arabidopsis thaliana y la bacteria Pseudomona syringae, en la cual los LPSs bacterianos estimulan la formacin de ON en la planta, y ste a su vez induce la activacin de varios genes de defensa (Zeidler, D. et al. 2004). La enzima responsable de producir ON en tomate, la oxido ntrico sintasa (iNOS), utiliza los mismos cofactores que la enzima anloga en mamferos. Ambos hechos sugieren que la inmunidad innata es un mecanismo ancestral de defensa contra patgenos. Otro componente importante de la membrana bacteriana de Pseudomonas es la flagelina. La flagelina es un pptido secretado por bacterias entricas que interacta con receptores TLR humanos y activa la respuesta innata. La flagelina de Pseudomonas es otro ejemplo de molculas bacterianas que activan la respuesta innata en plantas. En el tomate, la flagelina es reconocida por receptores especficos los cuales inician una cascada de mensajes celulares que culminan en la expresin de genes de defensa de forma local y sistmica.

Silenciamiento del ARN y la defensa contra virus

Otro sistema de defensa que ha sido descubierto recientemente es el que acta a nivel del aparato de transcripcin celular. Se basa en la degradacin del ARN mensajero (ARNm) de forma especfica. El sistema de silenciamiento de la expresin gnica basado en ARN (ARN de interferencia) es un me-

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Foto: Gabriela Chacn y Francisco Jarrn (CIP, Quito)

nismo se encuentren conservados evolutivamente, sugiere que el iARN forma parte de un mecanismo ancestral para la defensa contra ataques virales.

Sistema inmune o sistema de defensa?

En sentido horario: Jcama o Yacn (Polimnia sonchifolia), Oca (Oxalis tuberosa), Papa silvestre (Solanum colombianum). y Pasiflora silvestre (Pasiflora sp.).

canismo que se ha descrito en numerosos grupos de organismos incluyendo ciliados, hongos, plantas y animales. El sistema utiliza un paquete de molculas celulares (polimerasas, helicasas, RNAasas etc) como maquinaria de degradacin. La defensa se activa ante la presencia de ARNs de doble cadena (dsARN), los cuales son cortados en ARN pequeos o siRNA (small interfering RNAs) de 21 a 25 nucletidos cada uno. Estas pequeas molculas actan como guas, y se unen a cualquier ARNm que tenga la misma secuencia. Como consecuencia de esta unin el ARNm es degradado por la maquinaria celular. Qu relacin existe entre este sistema de degradacin y la respuesta de las plantas a los virus? Los virus son entes biolgicos formados de ADN o ARN, los cuales emplean las clulas de sus hospederos para replicarse. Durante este proceso, el material gentico viral se introduce en la clula y es procesado por la maquinaria celular para conseguir mltiples copias de

su genoma. Finalmente, el material gentico viral es encapsulado y se libera al medio extracelular. Un evento comn a la mayora de virus que atacan plantas es la formacin de dsARN en uno o varios pasos del proceso de replicacin. Los dsARN generados son reconocidos y activan la maquinaria de degradacin. De esta forma se elimina el ARNm del virus interfiriendo con la replicacin dentro de la clula. El sistema tiene la capacidad de recordar eventos de infeccin viral. Una vez que la planta ha detectado un patgeno y ha producido siRNA en contra de ste patgeno, el sistema contribuye a la defensa de posibles ataques futuros. Por otro lado, la seal de silenciamiento es producida localmente pero se distribuye en otros tejidos a travs de los haces vasculares para que la respuesta sea global. De esta forma la planta no slo reconoce y reacciona ante el ataque, sino que lo hace de forma sistmica y duradera. El hecho de que la maquinaria de degradacin y el meca-

Se sabe que varios elementos que se asocian a las respuestas de defensa de plantas comparten homologa con los mecanismos identificados en animales. Tambin se conoce que a escala molecular, varios de los actores que modulan la respuesta se encuentran representados en plantas y animales. La conservacin de genes cuyos productos cumplen funciones de defensa y la utilizacin de las mismas rutas celulares para transportar los mensajes de defensa hacen pensar en estrategias universales. A pesar de que la naturaleza de la respuesta de defensa entre plantas y animales, depende de la complejidad del organismo en cuestin, es claro que las plantas han desarrollado estrategias mucho ms complejas y sofisticadas que un sistema de defensa convencional.

Dangl J. & Jones J.D.G. 2001. Plant pathogens and integrated defence response to infection. Nature 411, 826-833. Flor, H. H. 1971. Current status of gen-for-gen concept. Ann. Rev. Phytopathology 9, 275-296. Kamoun, S. 2003. Molecular genetics of pathogenic oomycetes. Eukaryotic Cell 2,191199. Vance V. & Vaucheret H. 2001. RNA silencing in plants-defense and counterefense. Science 292, 22772280. Zeidler, D. et al., 2004. Innate immunity in Arabidopsis thaliana: lipopolysaccharides activate nitric oxide synthase (NOS) and induce defense genes. PNAS 44, 1581115816.

Literatura Consultada

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LEVADURA: CUERPO Y ALMAfinales del siglo XIX, los hermanos Buchner se encontraban en su laboratorio en Alemania trabajando en la obtencin del citoplasma de levaduras cerveceras (Saccharomyces cerevisiae). Ellos haban prensado las levaduras de tal manera que lograron reventarlas y obtener el contenido lquido interno o citoplasma, libre de pared y membrana celular. En aquellos tiempos, la manera comn de preservar los extractos, evitando las infecciones bacterianas, era por medio de la utilizacin de soluciones de glucosa concentradas que, por su alta presin osmtica, impedan el crecimiento de microorganismos que arruinaran los extractos celulares obtenidos. As lo entendieron los cientficos alemanes, quienes desconocan por completo el alcance que tendra su experimento. Entonces guardaron sus extractos en soluciones ricas en glucosa con la idea de realizar posteriores estudios de los mismos. Grande fue la sorpresa que se llevaron al ver que las soluciones, al cabo de unos das, haban comenzado a fermentar, produciendo etanol y gas carbnico a partir de la glucosa; lo que normalmente ocurre cuando las levaduras vivas se encuentran en un medio lquido con glucosa en disolucin. Pensaron que seguramente algunas levaduras escaparon vivas del prensado y que ellas seran las responsables de la fermentacin, por lo que volvieron a obtener los extractos; pero esta vez comprobaron de manera minuciosa que no escape de

Por Javier Carvajal ([email protected])

A

la prensa una sola clula de levadura viva. La sorpresa se repiti cuando vieron que los extractos celulares volvieron a fermentar la glucosa y lo haran tantas veces cuantas se reprodujera el experimento. Entonces, y por primera vez en la historia, se poda decir que las funciones que realizan los seres vivos tienen relacin con la qumica, ya que, an estando muertos, como en el caso de levaduras prensadas, sus contenidos celulares mantienen las funciones. Era como pensar que el alma de las clulas se preservaba a pesar de que haba sido separada de su cuerpo. Ahora es conocido que lo que tienen los extractos celulares de levadura no es ni ms ni menos que toda la maquinaria enzimtica que, independientemente de la clula, puede realizar las mismas funciones que cuando se encuentra dentro de las levaduras vivas. Obviamente, con limitaciones, ya que las enzimas tienen un tiempo de vida y si no sigue habiendo sntesis de las mismas en nuevas levaduras, simplemente las funciones terminan. Este descubrimiento marca el inicio de la bioqumica; es decir, la qumica de los seres vivos. En aquel entonces los eventos de la vida no eran relacionados con las reacciones explicadas por la qumica, que era entendida exclusivamente desde el punto de vista inorgnico; era un verdadero misterio sin solucin el cmo los organismos vivos llevaban a cabo sus funciones. Las implicaciones biotecnolgicas que a partir de este descubri-

miento han venido teniendo lugar en la corta historia de la bioqumica como ciencia, son muy profundas y se las puede apreciar en el da a da: enzimas celulares son empleadas con diversos fines en los mbitos cientfico, industrial, mdico y domstico. Adems, se han encontrado importantes aplicaciones para los compuestos que conforman las paredes celulares de hongos como las levaduras cerveceras que en la actualidad cumplen con funciones enormemente tiles, siendo empleados como compuestos antitumorales, inmunoestimulantes, probiticos, espesantes de alimentos y uno de sus usos ms importantes, como atrapadores de micotoxinas, molculas altamente peligrosas para animales de granja y seres humanos. Algunas de esas aplicaciones son tema de estudio en nuestro laboratorio, en estrecha colaboracin con el laboratorio de Gentica de Levaduras del Centro Andaluz de Biologa del Desarrollo, en Sevilla.

Las levaduras son hongos, por tanto poseen una pared celular compuesta bsicamente por polisacridos como los glucanos y la quitina. Esta estructura es rica en manoprotenas, que se encuentran ancladas al interior de la pared celular, dejando expuestas hacia el exterior de la clula las cadenas de mananos que se extienden a lo largo y ancho de la superficie de la levadura en forma de ramificaciones (Figuras 1a y 1b). Estas ramificaciones tienen funcin de reconocimiento entre levaduras, permitiendo que se peguen

La pared celular de levadura

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unas con otras, a manera de velcro, en determinados momentos del crecimiento poblacional o como respuesta a factores del medio donde crecen.

Figura 1a. Portada de la revista Science de marzo de 2001 ilustra las manoprotenas con sus cadenas ramificadas de mananosCadenas ramificadas de mananos Manoprotenas -Glucanos -Glucanos y Quitina Manoprotenas Membrana plstica

lugar de los suyos propios, esto implicara que las protenas se glicosilaran con patrones pertenecientes a nuestra especie, lo que, a su vez, permitira fabricar medicamentos que no causen rechazo en humanos, usando a las levaduras como reactores biolgicos. Las enzimas que regulan los patrones de glicosilacin se conocen como manosil transferasas (Fig. 2) y su actividad est dirigida hacia la generacin de diferentes enlaces entre dos molculas de azcares de 6 carbonos como la manosa. Al generarse estos enlaces las cadenas van creciendo hasta llegar a contarse entre 20 y 200 manosas adheridas a la protena glicosilada. La abundancia, longitud y patrn de ramificacin de estas cadenas son clave para la biotecnologa ya que eso determina el uso diferencial que se puede dar a estos remarcables componentes de la pared celular en distintas aplicaciones importantes para el ser humano.

revela algunos de los secretos de la vida desde la perspectiva molecular. Como arriba se dijo, la levadura tiene un alma que est constituida por las enzimas, protenas que a su vez son el producto de la traduccin del cdigo gentico propio de la levadura. Las enzimas de glicosilacin se encuentran ubicadas en el aparato de Golgi, donde se modifican las protenas post-traduccionalmente; esto es, posteriormente a su sntesis; de manera que de forma secuencial stas van adquiriendo molculas de manosa con variados tipos de enlaces. Las modificaciones post traduccionales permiten el correcto funcionamiento de las protenas. La expresin de las glicosiltransferasas y de las glicoprotenas en s es el resultado de dos factores fundamentales: el primero, como se dijo antes, el cdigo gentico que es inherente a cada especie. Por otra parte, el ambiente donde crece, se reproduce y muere el organismo o la po-

Figura 1b. Capas de la pared celular de levadura

Esto demuestra que la pared celular, lejos de ser esttica, es en realidad una estructura bastante dinmica cuya arquitectura es capaz de cambiar de acuerdo a las condiciones externas del medio, edad de la levadura, niveles de alcohol del medio, disponibilidad de nutrientes, entre otros factores. Los cambios de esta estructura estn regulados a nivel gentico, lo que significa que es posible manipular la expresin gnica, de manera que se pueden conseguir mutantes en los genes que expresan las enzimas encargadas de la glicosilacin y, de esta manera, modificar la arquitectura de la pared celular. La manipulacin gentica al nivel de los genes que expresan las enzimas de la glicosilacin es muy importante en la actualidad, pues si la levadura expresa genes humanos en

Figura 2. Distintos patrones de glicosilacin en humanos, levadura cervecera S. cerevisiae y otra especie de levadura, P. pastoris. Ntese los diferentes patrones de glicosilacin en cada especie.

En levaduras, el cuerpo es el reflejo del alma

Esta frase adaptada no es ms que una manera de explicar cmo la gentica de la levadura define la estructura de su pared celular. Por otro lado, la manipulacin gentica permite la modificacin de la arquitectura de la pared de la levadura y nos

blacin provoca la activacin o silenciamiento de genes de glicosiltransferasas, lo que repercute en la arquitectura de la pared celular. Conseguir un cuerpo a medida ya no es un tema de exclusividad de la ciruga plstica. La ciruga gentica hablando del cuerpo o pared de las levaduras da la posibilidad de contar con un catlogo que presenta

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distintas posibilidades en lo referente al patrn de glicosilacin de protenas (Fig. 3a ); esto es, cmo se enlazan y ramifican las cadenas de manosa (Fig. 3b), lo que efectivamente tiene aplicaciones, ya que, por citar un ejemplo, estas cadenas de manosa son adsorbentes de micotoxinas y prestan proteccin a las clulas contra los temidos radicales libres que producen daos en el ADN de las clulas y son causantes del envejecimiento y muerte celular.

los cereales del mundo estn contaminados por hongos filamentosos, especialmente de los gneros Fussaruim, Aspergillus y Penicillum que crecen sobre los cereales y que bajo ciertas condiciones de estrs, como cambios de temperatura y de humedad producen metabolitos secundarios conocidos como micotoxinas. Las micotoxinas son molculas pequeas con una variedad de estructuras qumicas, que causan disfunciones celulares que pueden lle-

Figura 3a. Protena glicosilada. Ntense los sitios con ramificacin. 3b. Una glicosiltransferasa, enzima que se encuentra en el aparato de Golgi y se encarga de realizar enlaces entre manosas. La manipulacin gentica a nivel de expresin de estas enzimas es un campo de inters en nuestros estudios.

Si usted piensa que la respuesta es tan simple como que son todos alimentos, pues s, eso es verdad, pero son alimentos que de una u otra manera tienen que ver con los cereales. En la alimentacin animal se emplea una amplia variedad de mezclas que apuntan a la mejor produccin con menor costo. En estas dietas los cereales son imprescindibles como fuente de energa y fibra, por lo que las gallinas ponedoras y las vacas lecheras son fuertes consumidoras de cereales. Igualmente, en la produccin de hojuelas de maz y de cerveza las materias primas por excelencia son los cereales. Segn la Food and Agricultural Organization of the USA, el 25% de

Qu pueden tener en comn un huevo de gallina, un vaso de leche, las hojuelas de maz y un jarro de cerveza?

gar a ser altamente peligrosas para animales de granja y para los consumidores finales de sus productos: los seres humanos. Las micotoxinas son termoestables, lo que las hace difciles de destruir incluso a altas temperaturas; por otro lado, resisten muy bien a la congelacin y son molculas muy estables en el tiempo, lo que las hace peligrosas desde todo punto de vista. Ya que las micotoxinas son molculas tan difciles de evitar en los cereales, es necesario un grupo de estrategias que tienda a controlar la ocurrencia de hongos filamentosos desde el campo hasta el momento del procesamiento del alimento. El caso de la cerveza ilustra muy bien lo dicho. La cebada en el campo es cosechada mecnicamente. Este hecho provoca que algunos granos sean cortados, expo-

niendo el interior de almidn, sustrato para que los hongos crezcan. La medida lgica es evitar al mximo la presencia de granos rotos, por lo que son seleccionados mecnicamente. Lo siguiente es el almacenaje de los granos. En este punto, existen formas ms y menos seguras de hacerlo. Por ejemplo, la peor forma de almacenar granos es a la intemperie, donde estn expuestos no solo a la contaminacin fngica, sino a las variables condiciones ambientales que causan el estrs, que hace que el hongo active el metabolismo secundario que produce micotoxinas. La forma de solucionar esto es usando silos ventilados y controlando temperatura y humedad. El transporte de los granos por tierra o por mar es otro punto crtico en el que el cereal puede contaminarse, por lo que es necesario que se pongan las mismas medidas de seguridad antes mencionadas. Al llegar a la planta cervecera, el grano es almacenado en silos que deben guardar las condiciones de baja humedad, ventilacin y temperaturas controladas para evitar crecimiento de hongos. Es tambin comn el uso de sustancias antifngicas e insecticidas. Sin embargo, an con todas las medidas de cuidado y la tecnologa que existe en este sentido, los hongos son capaces de crecer sobre los cereales y contaminarlos con micotoxinas, por lo que contaminan a su vez los alimentos de consumo humano como la leche, huevos, hojuelas de maz y cerveza, entre muchos otros que dependen como fuente directa o indirecta de los cereales. Entonces, qu hacer para luchar contra estos enemigos invisibles?

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Actualidad Cientfica La pared celular de levadura cervecera: una red para la pesca de micotoxinasLas micotoxinas pueden ser atrapadas por los compuestos de los que se habl al inicio de este artculo. Existen interacciones de carcter electrosttico e hidrofbico entre las molculas de micotoxinas y los mananos de pared celular. Es conocido desde hace muchos aos por los japoneses que beber infusiones de ciertos hongos comestibles produce beneficios para la salud, pues cura ciertas disfunciones del cuerpo; incluso, reduce o elimina tumores cancerosos. Ahora sabemos que esto se explica por la ingesta de paredes celulares de hongos cuya composicin fue descrita de forma general al principio de este artculo. La misma solucin se est haciendo ms y ms popular en relacin al uso de mananos y beta-glucanos en alimentos balanceados. Estos compuestos no solo que atrapan micotoxinas de los alimentos, sino que mejoran el nivel de absorcin de nutrientes en el intestino

nuestra ciencia

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