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Módulo 20 El laboratorio clínico (Bioquímica y biología molecular) en el proceso de la investigación.

Significado de los resultados del laboratorio y procedimientos instrumentales para su obtención.

Módulo 20:

El laboratorio clínico (Bioquímica y biología molecular) en el proceso de la investigación. Significado de los resultados del laboratorio y

procedimientos instrumentales para su obtención.

Autor: J.A. Gómez Gerique, C. dela Piedra, F. Clemente

Indice

20. EL LABORATORIO CLINICO (BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR) EN EL PROCESO DE LA INVESTIGACION. SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS DEL LABORATORIO Y PROCEDIMIENTOS INSTRUMENTALES PARA SU OBTENCIÓN.......................................................¡Error! Marcador no definido. Indice........................................................................................................................................................¡Error! Marcador no definido. Objetivos...................................................................................................................................................3

20.1. Introducción. ................................................................................................................................4 20.2. La variabilidad de los resultados obtenidos por el laboratorio ... ¡Error! Marcador no definido. 20.3. Variabilidad preanalítica.............................................................................................................. 8 20.4. Variabilidad analítica................................................................................................................... 8

20.4.1. Variabilidad analítica. Error total de un sistema analítico..............................................13 20.5. Variabilidad postanalítica. Selección e interpretación de un resultado. Valor Clínico. Establecimiento y uso de valores de referencia. ............................................................................... 21 20.6. Procedimientos utilizados habitualmente (técnicas analíticas).................................................30

20.6.1. Espectrofotometría ....................................................................................................... 30 20.6.2. Nefelometría y turbidimetría......................................................................................... 34 20.6.3. Fluorescencia................................................................................................................36

20.6.3.1. Concepto de emisión de fluorescencia..........................................................37 20.6.3.2. Espectrofluorímetros.....................................................................................40 20.6.3.3. Fluorescencia de proteínas...........................................................................42

20.6.4. Luminometría................................................................................................................43 20.6.5. Espectrofotometría de emisión atómica........................................................................47 20.6.6. Espectrometría de masas.............................................................................................50 20.6.7. Centrifugación...............................................................................................................54 20.6.8. Cromatografía...............................................................................................................61

20.6.8.1. Concepto de cromatografía...........................................................................61 20.6.8.2. Cromatografía en papel.................................................................................65 20.6.8.3. Cromatografía en capa fina...........................................................................66 20.6.8.4. Cromatografía en columna............................................................................67

20.6.8.4.1. Cromatografía convencional......................................................67 20.6.8.4.2. Cromatografía líquida de alta resolución..................................73 20.6.8.4.3. Cromatografía de gases...........................................................79

20.6.9.Electroforesis.................................................................................................................81 20.6.9.1. Concepto de electroforesis: electroforesis libre y de zona............................81 20.6.9.2. Electroforesis de zona. Equipo electroforético..............................................82

20.3.9..2.1. Soportes no restrictivos.............................................................88

© J.A. Gómez Gerique, C. dela Piedra, F. Clemente 1

marta

Cuadro de texto

marta

Cuadro de texto

marta

Cuadro de texto

marta

Cuadro de texto



20.3.9..2.2 Soportes restrictivos: gel de poliacrilamida (PAGE).................93 20.3.9..2.3. PAGE-SDS...............................................................................97

20.6.9.3. Factores que afectan a la electroforesis.......................................................97 20.6.9.4. Inmunoelectroforesis (IEF)............................................................................98 20.6.9.5. Electroenfoque.............................................................................................101 20.6.9.6. Electroforesis capilar...................................................................................101

20.7. Técnicas enzimáticas..............................................................................................................103 20.8. Técnicas inmunoquímicas.......................................................................................................107 20.8.1. Inmunoensayo por inmunodifusión radial....................................................................107 20.8.2. Inmunoelectroforesis...................................................................................................107

20.8.3. Técnicas turbidimétricas y nefelométricas..................................................................107 20.8.4. Ensayos inmunoquímicos con compuestos marcados...............................................107 20.8.4.1. Tipos de ensayos: competitivo y no competitivos; homogéneos y

heterogéneos.............................................................................................................108 20.8.4.1.1. Ensayos competitivos y no competitivos .............................108 20.8.4.4.2. Ensayos inmunoquímicos homogéneos y heterogéneos.....111

20.8.4.2. Ejemplos de ensayos inmunoquímicos con compuestos marcados...........111 20.8.4.2.1. Inmunoensayos con compuestos radiactivos: RIA e IRMA ................................................................................................................112 20.8.4.2.2.Inmunoensayos no isotópicos: Enzimoinmunoanálisis, Fluoroinmunoensayo..............................................................................113

20.9. Biología molecular...................................................................................................................114 20.9.1. Técnicas de extracción de ácidos nucleicos...............................................................116 20.9.2. Southern blot...............................................................................................................117 20.9.3. Northern blot................................................................................................................118 20.9.4. PCR.............................................................................................................................119 20.9.5. RT-PCR.......................................................................................................................121 20.9.6. Ensayos de protección de nucleasas..........................................................................122 20.9.7. Secuenciación.............................................................................................................122 20.9.8. Estudios de restricción................................................................................................123 20.9.9. DNA Arrays.................................................................................................................124 20.9.10. Terapia génica...........................................................................................................125

Bibliografía...........................................................................................................................................127




Objetivos

Al finalizar este módulo el alumno deberá:

1) Conocer las fuentes de variación de los resultados analíticos.

2) Conocer los principales procedimientos e instrumentación que utilizamos en el laboratorio,

incluyendo su valor y sus limitaciones.




1. Introducción

En este capítulo del programa de metodología de la investigación, haremos una revisión de lo que el

laboratorio puede aportar dentro de la generación de conocimiento.

Función del laboratorio

Realizar análisis cualitativos y cuantitativos de diversos medios

Entre los que destacan los diversos fluidos corporales, que permiten obtener una información útil para el diagnostico y monitorización de los diversos procesos biológicos.

Todo ello requiere comprender:

con un buen grado de fiabilidad la base de los métodos analíticos que utilizamos,

la instrumentación que nos ayuda,

las principales influencias que pueden intervenir en la obtención de los resultados que vamos

a utilizar posteriormente.




Dentro de este bloque, nos centraremos fundamentalmente en el laboratorio clínico, ya que la

experiencia acumulada en este campo puede servirnos ampliamente para comprender los puntos

conflictivos de este tema.

2. Variabilidad de los resultados obtenidos por el laboratorio

Como punto de partida, podría ser interesante analizar una historia clínica y la relevancia que tienen

los datos de laboratorio dentro de la misma:

Figura 20.1. Historia clínica a




Figura 20.2. Historia clínica b

Figura 20.3. Datos de Laboratorio

Con los resultados obtenidos se plantea un análisis del riesgo cardiovascular del paciente y la

aplicación de alguna de las recomendaciones actualmente existentes. Si seguimos las

recomendaciones del ATPIII, este paciente tendría:

un riesgo cardiovascular del 16% en los próximos 10 años

su concentración “deseable” de cLDL debería ser inferior a 160 mg/dl.

Con esta finalidad se instauran una serie de intervenciones sucesivas asumiendo que cada nueva

intervención se inicia porque la anterior no ha sido suficientemente efectiva.




Tabla 20.1. Evolución

Basal Dieta

2 meses Bezafibrato

2 meses Fluvastatina

2 meses s Colesterol mg/dl

275

285

250

225

s Triglicérido mg/dl

160

150

120

175

s,cHDL mg/dl

46

41

43

40

s,cLDL mg/dl

197

175

183

150

Se inicia con un periodo de dieta, seguido por la administración de bezafibrato y sustituyendo

posteriormente este fármaco por fluvastatina, con lo que en apariencia se consigue el objetivo

predefinido (cLDL inferior a 160 mg/dl).

Esta historia, sencilla y que describe un proceso relativamente frecuente, nos puede servir para

plantearnos algunas preguntas:

¿Cuál es la fiabilidad de los resultados analíticos?, sobre todo si tenemos en cuenta que la

toma de decisiones depende en muchas ocasiones de puntos corte muy concretos;

¿Cuándo podemos considerar que existe una “respuesta” a una intervención concreta?,

O si se prefiere, ¿cuándo podemos decir que dos resultados consecutivos son diferentes?

Para analizar estas preguntas sería conveniente realizar una revisión de las diferentes fases de que

consta el proceso analítico.




Fases del proceso analítico

Cada una de ellas con sus fuentes de variación específicas.

Tabla 20.2. Fases del proceso analítico

Variabilidad Preanalítica

Recogida de muestras y procesamiento. Fuentes de variación biológica.

Variabilidad Analítica

Error total de un sistema analítico.

Variabilidad Postanalítica

Selección e interpretación de resultados. Valor clínico.

Establecimiento y uso de valores de referencia.

Fase preanalítica Fase analítica propiamente dicha

Fase post analítica

3. Variabilidad Preanalítica

Consideramos como fase preanalítica a todo el conjunto de circunstancias que

rodean al proceso previo al de la realización del procedimiento analítico.




En

o de la variabilidad biológica controlable, los principales factores que intervienen a corto plazo

son

movilización,

mientos,

la ingesta de alimentos.

eamos más información con respecto a la postura y al grado de inmovilización en la siguiente tabla:

el caso del análisis clínico, podemos distinguir dos fuentes principales de variación preanalítica.

Fuentes principales de variación preanalítica

La variación biológica

La correspondiente a condiciones médicas.

Controlable o a

largo plazo.

Dentr

:

la postura,

el grado de in

el ejercicio,

los ritmos circadianos,

el grado de ceguera,

la realización de desplaza

V




Tabla 20.3. Variabilidad Preanalítica. Recogida de muestras y procesamiento. Fuentes de

Factore ioló

variación biológica.

s Fis gicos que afectan la composición de los líquidos orgánicos.

a mayor parte de los cambios de volumen se

n

ovilización (al cuarto día el hematocrito

más prolongados tiene lugar la retención hídrica:

proteínas y albúmina descienden en aprox. 3-5 g/l.

Variables BIOLÓGICAS controlables.

Postura: El volumen sanguíneo de un individuo de pié es usualmente de 600-700 ml

menos que cuando está estirado (aprox. 10%). L

debe fundamentalmente al agua plasmática. Por ese motivo, las moléculas no difusibles

modifican considerablemente su concentración.

Hospitalización e inmovilización: Los volúmenes de plasma y LEC (Líquido

extracelular) disminuyen a los pocos días de inm

puede aumentar un 10%). Con tiempos

En la siguiente tabla podemos ver una aproximación cuantitativa a los cambios que se producen con

respecto al ejercicio y a l

Tabla 20.4. Variables BIOLÓGICAS controlables (II)

Ejercicio. Depende de la intensidad del mismo.

% Aumento % Descenso

a variación cardiaca:

Constituyente Constituyente Fosfatasa ácida Albú ina 11 m 4 ALT 41 Hie ro 11 rAST 31 Potasio 8 Fosfatasa alcalina 3 Lipidos Totales 12 Creatinina 17 Fosforo 12

Variación Circadiana. El resultado depende de la hora de extracción (múltiples factores).

Con ejercicio Intenso




Constituyente Media Variación Total

(%) Variación

Analítica (%) Hierro (ug/dl) 116 37 3.4 ALT (U/l) 6 56 17 Urea (mg/dl) 14 22.5 2.5 Albúmina (g/dl) 4.5 5.5 3.9

En la siguiente tabla podemos observar algunos de los cambios poco conocidos relacionados con la

ingesta de alimentos la postura y al grado de inmovilización:

Variaciones entre 8:00 y

14:00 h.

Tabla 20.5. Variables BIOLÓGICAS controlables (III)

Ceguera. Si bien no es un factor estrictamente controlable, la ceguera puede influir por su

efecto sobre los ritmos circadianos.

Viaje. El viaje a través de diferentes zonas horarias puede modificar los ritmos circadianos. El

cambio de 10 h, puede precisar de hasta 5 dias para recuperar la situación “fisiológica”.

Ingesta reciente de alimentos.

Constituyente Antes de comer 2h tras una comida de 700

Kcal.

Albúmina (g/dl) 4.5 4.6

Colesterol (mg/dl) 220 220

Glucosa (mg/dl) 71 82

Fosforo (mg/dl) 3.1 3.6

Potasio (mmol/l) 3.8 4.0

Ingesta reciente de bebidas (en especial cafeína). Tabaco (nicotina). Ingesta de alcohol (en cantidad

moderada poco efecto). Fármacos.




Dentro de las condiciones médicas, hay que considerar todos aquellos factores que pueden influir de

forma no específica en los resultados que vamos a obtener, como los que se exponen en la siguiente

tabla.

Tabla 20.6. Variabilidad debida a condiciones médicas.

Fiebre.

Cambios hormonales. Balance negativo de nitrógeno. Reactantes de fase aguda.

Lípidos descienden inicialmente, luego aumentan marcadamente. Hierro y Zinc

descienden (acúmulo en hígado). Creatinina y ácido úrico aumentan.

Shock y Traumatismo.

Múltiples cambios. Hasta 5 veces aumento de cortisol, con todas sus consecuencias.

Disminución función renal. Cambios dependientes de la destrucción tisular.

Transfusión.

Por otra parte, existen otros componentes de la variabilidad biológica, menos controlables y que

ejercen su efecto a largo plazo dependiendo de las condiciones del individuo, como los que vemos en

la siguiente tabla.

Tabla 20.7. Influencias sobre la Variación Biológica a largo plazo.

Edad, Sexo y Raza

Efecto de factores ambientales.

Altura. Calor (exposición aguda). Localización geográfica.

Cambios cíclicos a largo plazo.

Ciclo menstrual

Hábitos corporales.

Dieta. (vegetarianos, malnutrición, ayuno)




Todo este conjunto de factores hacen que los resultados que obtengamos tengan un grado de dependencia de la condición que

estamos estudiando, que puede ser variable en función del peso específico de los mismos. Lo cual nos obliga a intentar

estandarizar al máximo posible las condiciones de la fase preanalítica con el

fin de minimizar su variabilidad.

Por otra parte, la mayoría de estos factores debería controlarse, en el grado en que sea posible,

cuando se realiza cualquier tipo de investigación en humanos para evitar los sesgos que pueden

producirse por distribuciones desiguales de estos componentes de la variabilidad.

4. Variabilidad analítica

Dentro de la fase analítica, tenemos que diferenciar distintas partes sometidas a influencias

claramente distintas.



Significado de los resultados del laboratorio y procedimientos instrumentales para su


obtención.

Empieza en el momento en que se realiza la toma de muestra para el análisis biológico.

Continua con los procedimientos

utilizados para la manipulación de la

muestra y su conservación

dirección.

Finaliza por el proceso analítico en

sí mismo.

Partes de la fase analítica

Por lo que respecta a la toma de muestras, en la siguiente tabla tenemos algunas de las principales

cuestiones que debemos tener en cuenta con respecto a la extracción de sangre. Esto puede influir de

forma significativa en la calidad de la muestra que vamos a analizar posteriormente y, en

consecuencia, en los resultados finales.

Tabla 20.8. Toma de Especimenes.

Sangre.

Punción Venosa

Oclusión. (Torniquete)

Recogida con tubo de vacío

Recogida con jeringa

Punción capilar

Punción Arterial

Anticoagulantes y conservantes

Influencia del lugar de punción Problemas con líneas intravenosas.

Hemólisis



Dentro de estas cuestiones caben destacar las relacionadas con:

el tipo de presión utilizada (tubos de vacío o jeringa, esta última con un grado de presión

negativa variable),

el tipo de muestra que se obtiene (no es lo mismo sangre venosa, capilar o arterial, por lo

menos para el análisis de determinados constituyentes),

el uso de distintos anticoagulantes que pueden influir en la distribución de agua entre

eritrocitos y plasma, y en consecuencia modificar la concentración efectiva de diversos

constituyentes. Sin olvidar las interferencias que posteriormente puede originar su presencia,

así como la debida a las modificaciones de su matriz básica como son las derivadas de la

hemólisis.

Una vez obtenida la muestra, es necesario realizar diversos procedimientos con el fin de obtener una

matriz adecuada para su posterior análisis.

El tipo de muestra más habitual es la de suero o plasma, lo cual implica el uso de

técnicas de centrifugación para su

separación de los elementos celulares.

Tabla 20.9. Preparación de la muestra.

Coagulación de la sangre en los tubos de extracción.

Centrifugación.

Transferencia del suero a tubos secundarios.





obtención.

Proceso manual. Desventajas.

Retrasos en preparación de Especimenes.

Tendencia a la AUTOMATIZACIÓN.

Errores de manipulación.

Uso de Analizadores en Sangre Total.

En este punto hay que recordar que:

el punto de extracción (lugar físico donde se obtiene la muestra) y el lugar donde se procesa

inicialmente, donde se almacena y donde se analiza

pueden ser coincidentes o no. Si no son coincidentes, hay que tener un especial

cuidado en los sistemas de transporte de muestras y en el tiempo y temperatura en

que ese transporte se realiza.

Con respecto a estos detalles no existen unas normas universales, sobre todo porque la estabilidad

de los distintos componentes que pueden analizarse pueden tener estabilidades distintas. Esto obliga

a:

establecer unas condiciones particulares para cada tipo de análisis que piense realizarse.



conocer cuales son las circunstancias en que se ha realizado el traslado y conservación

inicial.

Algo parecido podríamos comentar acerca de la conservación de muestras hasta el momento de

realizarse el análisis.

No siempre el proceso analítico tiene lugar

inmediatamente después de obtenida la muestra. Esto hace que tengamos que

considerar también como una variable más que puede influir en los resultados finales

a:

los sistemas de conservación utilizados,

el tiempo transcurrido entre la obtención de la muestra y el análisis.

El primer punto a tener en cuenta, es el de que a menos que lo que se pretenda analizar sea sangre

total, la separación del suero o plasma de los elementos celulares debe ser realizada cuanto antes

y siempre en función de cuales sean las determinaciones que vayamos a realizar. Hay procedimientos

que requieren técnicas de separación muy precoces, mientras que en otros casos la separación

puede realizarse en el plazo de 2-3 horas tras la extracción.

Dentro de los sistemas de conservación es importante:

la temperatura a que se realiza la conservación (idealmente, en la mayoría de los casos es

recomendable que sea de – 80º C).

los recipientes en los que se realiza.

el volumen contenido en los mismos: si los tubos en los que se realiza la conservación son

relativamente grandes en relación a su contenido, la interfase aire-muestra puede ser




elevada. Esto puede dar lugar a importantes modificaciones de la concentración de muchos

constituyentes de la muestra, tanto en:

conservación a corto plazo (mientras se espera a la realización del análisis, usualmente

a temperatura ambiente)

conservación a largo plazo (conservación a – 20 o – 80º C, pero durante periodos de

tiempo relativamente prolongados).

De cualquier manera, en la siguiente figura esquematizamos el proceso entre la obtención de sangre

y su reparto en alícuotas para su almacenamiento o análisis.

Figura 20.4. Manejo y Transporte de Especimenes

Tubos primarios. La mayoría de analizadores lo permiten

Los tubos de colección, frecuentemente contienen un material separador que forma una barrera entre

el sobrenadante y las células




Por lo que respecta al análisis, éste puede realizarse a partir de tubos primarios (en los mismos en

los que se ha realizado la extracción y posterior centrifugación). Si bien en este caso el proceso

analítico debe ser casi inmediato (no es conveniente conservar tubos primarios mas de unas pocas

horas, sin separar previamente el suero o plasma en los alícuotas adecuados), o a partir de los

alícuotas previamente preparados y conservados en las mejores condiciones posibles.

4.1. Variabilidad analítica. Error total de un sistema analítico.

El procedimiento analítico en sí mismo es susceptible de diferentes tipos de errores que hay que

considerar.

Tipos de errores

Error aleatorio Error sistemático

Siendo el error total una composición de

ambos

En la siguiente figura tenemos una representación del significado de estos errores siendo:

m el valor medio real

x el valor medio obtenido (la media de mediciones repetidas).

Figura 20.5. Componentes del error analítico.

Error total.




Error Sistemático.

Error Aleatorio.

Error aleatorio del muestreo (imprecisión).

Error aleatorio por interferencias.

Error Total = Error Sistemático + Error aleatorio Error aleatorio = Error por interferencias + Imprecisión

Imprecisión = Imprecisión Intradía + Imprecisión Interdía.




La diferencia entre m y x corresponde al error sistemático (inexactitud), mientras que el error aleatorio

corresponde a la dispersión de valores que podemos obtener de las repeticiones de un mismo

procedimiento analítico.

A su vez, el error aleatorio puede considerarse como la suma de dos tipos de errores:

el error aleatorio de muestreo, también conocido como imprecisión,

el error aleatorio debido a las interferencias en la medida (que se va a manifestar de una

manera relativamente constante en unas circunstancias determinadas).

De esta manera, en la siguiente tabla, podemos observar los principales errores característicos del

proceso analítico y algunos procedimientos para su cuantificación.

Tabla 20.10. Componentes del error analítico y su cuantificación.

Tipo de error Experimento Criterios

Error aleatorio Replicación Sobs < Sp, ó 4 * Sobs < ETp

Error proporcional Recuperación (R-100)/100 * Xc < Bp

Error constante Interferencia Bias < Bp

Error sistemático Comparación de métodos (a+bXc) - Xc < Bp

Error Total Replicación y comparación 4 * Sobs + (a+bXc) - Xc < ETp

Sobs, Desviación típica en una experiencia de replicación .R, Recuperación media ; Bias, Sesgo. a y

b, intersección y pendiente (regresión) de un experimento de comparación de métodos. Xc, nivel de

concentración en el que la interpretación médica es más crítica.; Sp, Bp, ETp, desviación típica, sesgo

y error total permisibles.

5. Variabilidad postanalítica. Selección e interpretación de un resultado. ValorClínico. Establecimiento y uso de valores de referencia.




Los componentes de la variabilidad en esta fase son los correspondientes a la fase postanalítica, y

con frecuencia se relacionan con los valores de referencia que estemos utilizando. Por decirlo de una

forma simple:

En la siguiente tabla exponemos algunas de las principales condiciones generales que hay que tener

en cuenta en el momento de obtener unos de valores de referencia que puedan sernos útiles.

Tabla 20.11. Valores de Referencia.

Condiciones generales que se deben cumplir para poder comparar los resultados de un paciente con

unos valores de referencia posibles y válidos:

Los grupos de individuos que forman parte de los grupos de referencia, deben ser definidos

claramente.

El paciente examinado debe parecerse suficientemente a los individuos de referencia, en

todos los aspectos no relacionados con los que se encuentran bajo investigación.

Las condiciones de obtención de muestras y de análisis deben ser conocidas.

Los valores de referencia no son más que el patrón con el que comparamos nuestros resultados para darles un significado y, por

lo tanto, son las principales fuentes de

variabilidad en esta fase.

La tercera fase del proceso analítico es la fase postanalítica, en la que disponemos

de un resultado cualitativo o cuantitativo e intentamos darle un significado dentro de

un escenario concreto.




Todas las cantidades comparadas deben ser del mismo tipo

Todos los resultados de laboratorio deben proceder de métodos perfectamente

estandarizados y sometidos a un cuidadoso control de calidad.

En la tabla siguiente exponemos las principales condiciones específicas para la obtención de los

mismos.

Tabla 20.12. Valores de Referencia

Condiciones específicas que se deben cumplir para poder comparar los resultados de un paciente

con unos valores de referencia posibles y válidos:

Deben demarcarse los estadios evolutivos de la patogénesis de las enfermedades objetivo del

sistema diagnóstico.

Deben conocerse las características de sensibilidad y especificidad diagnóstica, la

prevalencia de la enfermedad y los costes de los errores en la clasificación, para los

resultados de una prueba determinada.

Valores de Referencia vs. Valores Normales:

Concepto (obsoleto) de Valores Normales:

Estadístico (tipo de distribución).

Epidemiológico (los frecuentemente, 95%, encontrados en población no-enferma).

Clínicos: los encontrados en ausencia de enfermedad o de riesgo de la misma.

Un concepto que debemos tener presente es que:




Hablar de valores de referencia no es

equivalente a hablar de valores “normales”. Puesto que estos últimos

tienen diferentes acepciones dependiendo de cual ha sido el mecanismo utilizado

para su obtención, que muchas veces entra en conflicto con la propia teoría de los

valores de referencia (sobre todo cuando se obtienen de poblaciones no

equivalentes a la que es objeto de nuestro estudio).

En la tabla anterior describimos algunos de los tipos de valores “normales” utilizados con más

frecuencia.

Tipos de valores “normales” utilizados con más frecuencia

Los obtenidos de forma estadística.

Los correspondientes a

población no-enferma

(epidemiológicos)

Los clínicos.

Por otra parte, en la tabla siguiente describimos los principales tipos de valores de referencia

existentes distinguiendo por una parte los que dependen del tipo de población utilizada:

poblacionales: cuando se obtienen de múltiples individuos que presentan un estado de salud

determinado.




intraindividuales: cuando se obtienen de múltiples medidas en un mismo individuo, cuando

éste se encuentra en un determinado estado de salud;

y por otra los que dependen de las mediciones realizadas:

en este caso pueden ser univariados: cuando son realizados para un parámetro único.

multivariados: cuando se integran distintos parámetros en la definición.

Tabla 20.13. Valores de Referencia

Tipos de valores de referencia: (Debe definirse la procedencia: Individuos no-enfermos, individuos

diabéticos, individuos diabéticos ambulantes, etc).

Dependiendo del tipo de población:

Valores de Referencia basados en el propio individuo, procedentes de multiples medidas

cuando se encontraba en un definido estado de salud.

Valores de Referencia poblacionales, obtenidos en un grupo de individuos en un

determinado estado de salud.

Dependiendo de la aproximación:

Univariados.

Multivariados.

Una representación de las diferencias que se obtienen con el uso de valores de referencia uni o

multivariados podemos simplificarla en la siguiente figura.




Figura 20.6. Comparación de Valores de referencia univariados y multivariados.

Simplemente con valores bivariados (B, utilizando 2 variables, con un espacio de referencia

representado por la elipse), algunos individuos que entrarían en el 95% de los valores obtenidos para

la primera variable, quedarían fuera de este margen para la segunda, o para la combinación de

ambas.

Si este procedimiento lo realizamos con la medición simultánea de 20 variables (perfil frecuentemente

utilizado en la clínica diaria), el 64 % de los individuos analizados presentarían algún resultado

“anormal”.




Es conveniente tener presente el concepto anterior antes de intentar interpretar un perfil analítico

utilizando valores de referencia univariados, sobre todo cuando realizamos mediciones múltiples (otra

cuestión distinta es cuando las mediciones son en cascada).

Por lo que respecta a los procedimientos de selección de los individuos a utilizar en el proceso de

obtención de valores de referencia, en la siguiente tabla describimos las principales estrategias que se

siguen habitualmente.

Tabla 20.14. Valores de Referencia.

Estrategias para la obtención de Valores de Referencia:

Directa: cuando los individuos son seleccionados en la población susceptible.

Indirecta: cuando se parte de una base de datos tratada con ciertos métodos estadísticos.

A priori: método directo, donde los individuos son seleccionados por cumplir determinadas

condiciones.

A posteriori: cuando se parte de una base de datos, donde se seleccionan los individuos tras

analizar los criterios de inclusión

Aleatorio: con un proceso de selección en que todos los sujetos tienen la misma probabilidad

de ser elegidos.

No Aleatorio: cuando las probabilidades de selección no son iguales.

Por fin otros conceptos importantes para interpretar un resultado analítico es:

el del número de repeticiones de la determinación, que es necesario realizar para que el

resultado obtenido tenga consistencia clínica,

y el de cuando dos resultados consecutivos pueden ser considerados como diferentes.




Ambos conceptos dependen de los criterios de variabilidad antes comentados y se esquematizan en

la siguiente figura.

Figura 20.7. Conceptos importantes para la interpretación:

Como ejemplo de lo anterior, en la siguiente tabla se indica la magnitud de la variabilidad de las

determinaciones relacionadas con el perfil lipídico (las utilizadas en el ejemplo con el que iniciábamos

esta sección).




Tabla 20.15. Variabilidad Biológica aproximada de los principales parámetros lipídicos.

Colesterol Total Triglicéridos cHDL cLDL

Variación Biológica

Media

6,10% 23% 7% 9,50%

Variación Intra-dia 3% 30% Superior a CT Similar a CT

Variación

estacional

Invierno 2,5% >

verano

Difícil de estimar Superior a CT Invierno 2,5% >

verano

En la siguiente figura tenemos una representación esquemática de la evolución del caso clínico inicial.

Figura 20.8. Evolución del cLDL con las sucesivas intervenciones




Si aplicamos las fórmulas que hemos descrito, descubriremos que ningún par de mediciones

consecutivas puede permitirnos decidir que haya existido ningún cambio significativo (a pesar de la

apariencia).

6. Procedimientos utilizados habitualmente (técnicas analíticas)

Una vez revisados los conceptos relacionados con la variabilidad en los resultados del laboratorio,

vamos a profundizar un poco en las técnicas analíticas habituales y en la instrumentación utilizada.

6.1. Espectrofotometría

Existen moléculas con la característica de captar absorber la luz de una determinada longitud de

onda:

si esta longitud de onda está en el espectro visible (entre 380 y 800 nm) la sustancia

presentará un color característico;

mientras que si la longitud de onda de la luz que absorbe es inferior a 380 nm, no seremos

capaces de ver color alguno.

La espectrofotometría se basa en la medida

de la luz absorbida por una disolución, medida en unidades de densidad óptica

(DO).

Así, la DO de una disolución a una determinada longitud de onda será proporcional a la concentración

de sustancias que capten la luz de esa longitud de onda. Utilizando tintes que se unan química o

enzimáticamente a sustancias sin una DO propia, podremos detectar y cuantificar un gran número de

sustancias. Para ello utilizamos las curvas de calibración correspondientes, o la denominada como




“absorción molar”, que no es más que una tabulación de la DO de una molécula en unas

condiciones determinadas de temperatura, pH, etc.

El instrumento que utilizamos para “medir”

la absorción de luz es el

espectrofotómetro.

El espectrofotómetro funciona emitiendo un haz de luz de una longitud de onda determinada, que

pasa a través de la muestra e incide al final en un detector.

Figura 20.9. Espectrofotómetro de doble haz




La diferencia entre la intensidad de luz

emitida y la detectada nos dará la DO de la muestra.

Para este cálculo necesitamos una sustancia de referencia que no absorba la luz a la longitud de

onda que nos interesa y nos proporcione la intensidad de luz emitida.

La fuente de luz suele ser:

una bombilla de tungsteno (para la longitud de onda dentro del espectro visible),

o de deuterio (espectro ultravioleta) ,

o bien de otras sustancias como el xenón que abarcan un espectro relativamente más amplio.

De la luz que emite la fuente mencionada, se aísla una determinada longitud de onda mediante el uso

de filtros, prismas o rejillas de difracción, (o combinaciones de estos elementos, que en conjunto se

denomina “monocromador”, ya que produce luz de una sola longitud de onda, o monocromática). Este

elemento puede estar

Figura 20.10.

antes o después




Figura 20.11.

de que el haz de luz incida sobre la muestra.

La muestra se dispone en cubetas de plástico o cuarzo, que convencionalmente suelen tener una

anchura (paso de luz) de 1 cm, o en celdas de medida (como las celdas de flujo contínuo) que

incorpora el instrumento. También es posible la utilización de sondas de fibra óptica que se introducen

directamente en las soluciones. Como detectores se utilizan los fotomultiplicadores, las celdas de

barrera o agrupamientos de fotodiodos, que permiten detectar varias longitud de onda a la vez.

Una aplicación especial de la

espectrofotometría es la denominada como de absorción atómica.




Figura 20.12. Absorción atómica

En esta técnica, los átomos son colocados en una situación disociada de alta energía a través de una

fuente de calor, como es la de una llama o un horno de grafito. A continuación se hace incidir sobre

ellos una luz de una longitud de onda característica (específica de cada átomo que deseemos medir),

que es la que el átomo excitado puede absorber; al igual que en la espectrofotometría simple. Lo que

medimos es la cantidad de luz absorbida como un reflejo de la concentración de la sustancia a medir.

6.2. Nefelometría y turbidimetría




Estos procedimientos analíticos funcionan

midiendo la luz dispersada, es decir, la turbidez de una solución que puede aparecer por una reacción química o

inmunológica.

Habitualmente, en análisis clínicos, se suele utilizar la reacción inmunológica, ya que puede

discriminar entre los componentes de un fluido biológico.

En la turbidimetría:

Figura 20.13. Turbimetría

desde un emisor (1) un haz de luz (2) incide sobre la muestra (3), la atraviesa y la luz no dispersada

(4) llega al detector (5), donde se cuantifica la diferencia entre la cantidad de luz incidente y la

transmitida por la muestra.

Mientras que en la nefelometría el detector se encuentra formando un ángulo de 90º con el haz de

luz incidente, de esta forma se cuantifica la luz dispersada.




Figura 20.14. Nefelometría

Realizando las curvas de calibración correspondientes podemos extrapolar la concentración de una

molécula en nuestra muestra. Por la geometría de funcionamiento un espectrofotómetro puede

utilizarse como turbidímetro, pero no así como nefelómetro. Este último procedimiento analítico es, en

general, más sensible cuando la turbidez es menor (menor concentración de analito).

Al utilizar reacciones inmunológicas en nefelometría o turbidimetría, la turbidez se genera al formarse

los complejos antígeno-anticuerpo en el medio de reacción. Así, para determinar una proteína sérica

pondremos en contacto la muestra, que contiene la proteína con un anticuerpo contra la proteína que

queremos detectar.

6.3. Fluorescencia




Concepto de emisión de fluorescencia

Tras absorber una radiación

electromagnética, algunas moléculas son capaces de emitir luz. La fluorescencia es

uno de estos fenómenos de emisión.

Antes de la absorción de la luz, prácticamente todas las moléculas están en el modo vibracional de

más baja energía dentro del estado singlete fundamental. Una vez que absorbe la luz, el electrón

pasa a un estado excitado conservando su número de spin (singlete), o cambiando éste (triplete).

Figura 20.15. Número de spin




Una vez en el estado excitado, el electrón

tiende a pasar otra vez al estado fundamental, que se conoce como

desexcitación.

La desexcitación puede ocurrir de modo:

no radiativo (sin emitir radiación),

radiativo (emitiendo un fotón).

Pues bien, la emisión fluorescente es precisamente una emisión radiativa, desde un nivel excitado

singlete de más elevada energía, a un modo vibracional del estado fundamental, emitiendo un fotón

de luz.

Si el paso es de un estado activado triplete a un estado

fundamental, la radiación se denomina de fosforescencia

Por lo tanto, para que una molécula pueda llegar a emitir fluorescencia es necesario que

previamente sea capaz de absorber luz, es decir debe poseer cromóforos (enlaces o conjuntos de

enlaces responsables de dicha absorción de luz). Ahora bien, el hecho de que una molécula posea

un grupo cromóforo no implica necesariamente que pueda emitir fluorescencia.




Para ello, es necesario que la probabilidad

de que se produzca esa vía de desexcitación en la molécula tras la

absorción de fotones, sea superior a otra vía diferente de desexcitación. Cuando esto ocurre, al grupo cromóforo se le

denomina fluoróforo.

Tipo de fluoróforos.

Intrínseco

Cuando una molécula posee de modo natural un fluoróforo

Extrínsecos

En otros casos es conveniente unir a una molécula, covalentemente o no, un fluoróforo ajeno a ella. El fin de esta manipulación es dotarla de fluorescencia, en caso de que no poseyera fluoróforos, o de una fluorescencia diferente a la que pudiera tener de modo natural.




En la fluorescencia, el fotón absorbido lleva generalmente a la molécula a un modo vibracional de

alta energía del estado excitado. Normalmente, antes que se produzca la desexcitación, con emisión

de luz, el electrón emite una cierta radiación que lo hace pasar a un estado vibracional menos

enérgetico del estado activado. Es entonces cuando se produce la transición al estado fundamental

con emisión de un fotón. Pero normalmente el electrón vuelve a un nivel energético superior a aquél

del que partió en su estado fundamental.

Por esto y porque su punto de partida no ha sido el estado más energético de su

nivel excitado, la radiación de emisión de fluorescencia es menos energética que la

radiación inicial absorbida (de menor frecuencia, mayor longitud de onda). Este

principio se conoce como la ley de Stockes o del desplazamiento hacia el rojo del espectro de emisión, en relación al de

absorción.

Aún suponiendo que se ilumine una muestra fluorescente con una luz monocromática, y que, por

tanto, sólo se produzca la transición a un modo vibracional concreto del estado excitado, la vuelta

desde el modo vibracional de menor energía del estado excitado puede llevar a distintos modos

vibracionales del estado fundamental. Como consecuencia, en un conjunto de moléculas que posean

un fluoróforo determinado, aunque todas se exciten con una luz de la misma longitud de onda, los

fotones emitidos pueden tener distintas longitudes de onda de emisión. Es decir, aparecerá un

“espectro de emisión fluorescente”.

Espectrofluorímetros




Para las medidas de fluorescencia sé utilizan unos aparatos nominados espectrofluorímetros que,

aunque parecidos en muchos aspectos a los espectrofotómetros, han de tener unas características

especiales.

Figura 20.16.

En primer lugar hará falta una fuente de luz, la lámpara, para provocar la excitación de la muestra.

Ha de ser de mucha mayor potencia qué las utilizadas en los espectrofotómetros, porque para

detectar la emisión fluorescente será necesario previamente excitar el mayor número de fluoróforos

posible. Por ello, se suelen utilizar lámparas de arco de Xenon, que proporcionan en la zona del UV-

visible una luz policromática muy intensa. Esta luz policromática se resuelve con un sistema

monocromador / colimador.




La muestra que contiene el fluoróforo, al absorber la luz incidente, pasa al estado excitado y, emite

fotones, que son precisamente los que hay que detectar. Para ello, habrá que disponer de un

fotomultiplicador.

En los espectrofotómetros la disposición fotomultiplicador - lámpara – muestra es lineal, puesto que

lo que se mide es la intensidad de la luz transmitida. En el caso de los espectrofluorímetros, el

fotomultiplicador no se podrá colocar en esa posición, ya que, si se hiciera así, se detectaría no solo

la luz emitida por fluorescencia sino, también aquella transmitida. Por tanto, el fotomultiplicador se

coloca en una disposición geométrica tal que el eje muestra / fotomultiplicador sea perpendicular al

eje lámpara / muestra. Así, en principio, solo se detectaran emisiones fluorescentes. Esta disposición

geométrica condiciona el tipo de cubetas a emplear. Han de ser transparentes y pulidas por todas sus

caras, para que la luz emitida se pueda detectar en una dirección perpendicular a la incidente, sin

sufrir desviaciones ni dispersiones como consecuencia de la opacidad o irregularidades de la

superficie. Su forma siempre suele ser rectangular y son de cuarzo.

Para evaluar la luz transmitida a cada longitud de onda y, por tanto, poder registrar un espectro de

emisión, será necesario disponer entre muestra y fotomultiplicador de un nuevo sistema

monocromador / colimador. Ver nuevamente la figura 20.14.

Fluorescencia de proteínas

Las cadenas polipeptídicas poseen varios cromóforos característicos:




Cromóforos característicos

Enlace peptídico

Responsable de la absorción de la luz en la zona UV– lejano.

Cadenas laterales de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptófano

Cuyas principales bandas de absorción se localizan en la zona del UV– próximo. De estos cromóforos, solo los que absorben en el UV– próximo tienen rendimientos apreciables y constituyen los fluoróforos intrínsecos de macromoléculas de este tipo.

En ocasiones, una proteína no posee fluoróforos intrínsecos o éstos presentan muy bajo rendimiento

cuántico de fluorescencia. Entonces, puede ser muy conveniente asociar a la proteína,

fundamentalmente de forma covalente, una molécula de fluoróforo (fluoróforo extrínseco), con el fin

de dotarla de propiedades fluorimétricas. El cloruro de dansilo (DNS-Cl) y el isotiocianato de

fluoresceina (FITC), son algunos de los compuestos utilizados.

6.4. Luminometría




Se basa en la medición de la luz emitida por una solución; para ello se utiliza un tubo fotomultiplicador, cuya función es convertir los fotones en una corriente

eléctrica, fácilmente mesurable, y, si es necesario, amplificar la señal para que sea

detectable.

La luminometría es una técnica indirecta en la mayoría de los casos, ya que existen pocas sustancias

que generen luz de forma natural.

Figura 20.17. Luminometría




Habitualmente, la luz es generada por reacciones enzimáticas o químicas (quimioluminiscencia),

aunque el proceso es similar al de la fluorescencia, en el que el estímulo es la absorción de la

energía proporcionada por un haz de luz generalmente monocromática.

Reacciones luminiscentes más características

Las inducidas por la acción de la luciferasa

En el caso de las enzimáticas

El luminol

En el de la quimioluminiscencia

Todas los procesos que generen ATP, o la propia medida del mismo, se pueden monitorizar usando

la enzima luciferasa, que consume el ATP para generar luz, esta presente en muchos insectos, por

ejemplo en las luciérnagas. El luminol reacciona con agua oxigenada emitiendo luz, este agua

oxigenada puede provenir de una reacción química o enzimática, en este caso lo habitual es utilizar

la peroxidasa de rábano picante.

El aparataje necesario para la medida de

luminometría es el luminómetro.

La gran ventaja de este método es su rango dinámico, es decir, la zona con sensibilidad para realizar

una medición es enorme, de hasta siete ordenes de magnitud.




Su principal desventaja es que existen pocas técnicas que generen luz, de forma que la variedad de

determinaciones es muy limitada. Esta limitación se puede evitar, ya que se pueden obtener reactivos

específicos uniendo una enzima del tipo peroxidasa a un anticuerpo, o a una molécula de ácido

nucleico, acoplando la luminometría a las técnicas inmunológicas y de biología molécular. También

se pueden utilizar reacciones colaterales para generar el ATP o el agua oxigenada necesarios para la

luminometría, pudiendo usar esta medida con técnicas enzimáticas.

Una aplicación especial de esta técnica es la radiografía, ya que la luz impresiona una placa

radiográfica, evitándose así el tradicional uso de sustancias radiactivas. Así, tanto el northern blot

como el western blot se acoplan cada vez más a menudo a reacciones que generen luz. En este

caso, el rango dinámico de la radiografía (dos ordenes de magnitud), limita la utilidad de esta técnica.

Existe, sin embargo, un caso particular de luminometría, que no se basa en el tubo fotomultiplicador,

y que posee un rango dinámico mayor que la radiografía, y es el uso de chips CCD. Estos

dispositivos son los sensores de luz de la fotografía digital y equivalen a una gran cantidad de tubos

fotomultiplicadores, que al estar dispuestos en dos dimensiones, pueden “montar” una imagen y

actuar como el equivalente a una radiografía.

Así, con un dispositivo CCD podremos:

tomar imágenes

en color reales,

en fluorescencia, (utilizando los filtros necesarios),

en luminiscentes;

o monitorizar la emisión atómica y realizar cuantificaciones, ya que cada píxel de la imagen

lleva asociada la información del número de fotones que incidieron en él.

Con el software adecuado se pueden:




contar células marcadas,

cuantificar la cantidad de una proteína, la de un ARN,

localizar el lugar donde se encuentra una molécula en una célula, o en un tejido, etc.

Con este principio funcionan los dispositivos de espectrofotometría de emisión atómica, que

combinan la luminometría con la espectrofotometría. Ya que identifican el átomo emisor por la

longitud de onda de la luz que registra el chip CCD y cuantifican la concentración de dicho átomo a

través de la cantidad de luz detectada.

6.5. Espectrofotometría de emisión atómica

Un caso particular de espectrofotometría que comparte algunos de los principios comentados en las

técnicas anteriores, es el de la emisión atómica.

En esta técnica, los átomos de una disolución son:

disgregados (como en la absorción atómica)

y colocados en una situación excitada gracias a una potente fuente de energía, que suele

suministrarse en forma de calor (fotometría de llama o plasma).

Los átomos excitados regresan a su situación basal gracias a la emisión de energía en forma de luz

de una longitud de onda característica.

Este es el principio que clásicamente utilizaban los fotómetros de llama. Y actualmente los

instrumentos de tipo ICP (“Inductively Coupled Plasma”), con los que puede determinarse la

concentración individual de diversos elementos en una mezcla compleja de las mismos,

aprovechando que las longitudes de onda con que emiten en su “desactivación” es característica de

cada uno de ellos.




En un ICP la solución en forma de aerosol es dirigida a una “antorcha” donde es sometida a un

fuerte campo electromagnético junto con el transportador (Argon). En la antorcha los átomos

adquieren la energía necesaria para su “excitación” y emiten luz de una longitud de onda

característica.

Figura 20.18. ICP

La luz emitida, es concentrada y dirigida a una matriz CCD que “lee” el número de fotones de cada

longitud de onda recibida.




Figura 20.19. CDD

De esta manera, puede medirse simultáneamente la concentración de varios átomos que emitan

líneas de luz distintas. La concentración de cada átomo puede estimarse por comparación con una

curva de calibración obtenida con diversas concentraciones del átomo que queremos medir. Como

podemos observar al analizar los espectros de diversas concentraciones de aluminio y la intensidad

de emisión de las mismas a 167 nm.




Figura 20.20. Espectros

6.6. Espectrometría de masas

Este procedimiento se basa en la detección

de iones en una forma similar a como lo hace un fotomultiplicador, en este caso el

haz incidente son iones, no fotones.

Por lo tanto, para poder detectar una molécula ésta tiene que estar ionizada, para ello se utilizan

básicamente dos métodos:




Métodos

Impacto electrónico Ionización química

Figura 20.21. Ionización química




Impacto electrónico Un filamento genera una corriente de electrones que chocan contra las

moléculas generando iones cargados o neutros. Al ser electrones de alta

energía son capaces de romper las moléculas en iones más pequeños que

formarán el “espectro”, un conjunto de iones de pesos moleculares y

abundancia característicos de cada compuesto.

Ionización química Genera iones añadiendo un protón a cada molécula, para ello se utiliza un

gas de ionización, que sometido a un haz de electrones de baja energía se

ioniza y es capaz de transferir protones. De esta forma obtendremos un ión

con un peso molecular de una unidad atómica mayor que la molécula

original. Esta técnica es más utilizada para obtener información (los pesos

moleculares) de los componentes de una mezcla, y para compuestos que se

fragmentan demasiado al aplicarles el impacto electrónico.

Los iones generados se dirigen al detector de masas, para ello se pueden utilizar dos

procedimientos (en ambos se registra tanto la relación masa/carga (m/z), como el número de iones

que llegan al detector):

Analizador de sector magnético:

Un campo eléctrico acelera los iones formando una trayectoria curva, de forma que para

una intensidad de campo determinada sólo los iones con una relación m/z concreta

inciden en el detector.

El sistema hace un “barrido” de campos magnéticos para cubrir todas las relaciones m/z

que nos interesen y formar el espectro del compuesto.

Analizador caudripolo:

En este caso cuatro electroimanes forman un campo de raidofrecuencia que atrapa

todos los iones excepto los de una determinada m/z, que se dirigen al detector,

realizando un barrido de radiofrecuencias se consigue el espectro m/z.




En el procedimiento denominado masas/masas se combinan dos

ionizaciones distintas.

Habitualmente se realizan dos impactos electrónicos consecutivos, en el primero:

se ionizan las moléculas y aplicando radiofrecuencia, se eliminan todos los iones que no nos

interesen (este proceso se llama “sustracción selectiva de iones”, SIS en sus siglas inglesas)

y se repite el impacto electrónico, obteniendo ya el espectro de masas.

Con ello conseguimos “limpiar” de impurezas la muestra, con lo que aumentamos la sensibilidad del

análisis.

Para que los compuestos lleguen al espectrómetro de masas lo más puros posible se utiliza en

combinación con la cromatografía de gases o con HPLC previas. La gran potencia analítica de este

procedimiento hace que sea la técnica de referencia para una gran cantidad de análisis, en concreto:

para aquellos que necesitan la detección de mínimas cantidades de analito en una matriz muy

compleja, como pueden ser la detección de drogas de abuso en sangre u orina.

muy útil en el análisis de muestras de composición desconocida, dado que los espectros de

masas son característicos de un compuesto determinado. Se pueden utilizar librerías de

espectros de masas para identificar los distintos componentes de una muestra.

La cuantificación de un analito se puede

realizar mediante curvas de calibración o a

través de la denominada dilución isotópica.




En ella se añade a la muestra:

una cantidad conocida de analito en el que se han sustituido uno o varios hidrógenos por

deuterio,

un isótopo estable del hidrógeno que tiene un peso atómico de dos umas (unidades de masa

atómica) en lugar de una uma del hidrógeno.

La sustancia deuterada sometida al proceso de extracción necesario para aplicar el procedimiento

de espectrometría de masas se comportará de forma idéntica al compuesto natural, ya que tiene las

mismas propiedades físicas. Además, el recuento de iones del compuesto deuterado realizado por el

detector de masas, será idéntico al de la misma cantidad del compuesto natural.

Conociendo la cantidad de sustancia deuterada añadida a la muestra podremos calcular la cantidad

del analito presente originalmente. Ambos compuestos se pueden diferenciar tanto por el tiempo de

elución en la cromatografía previa a la detección, como por su espectro de masas, ya que los iones

generados a partir del compuesto deuterado tendrán una m/z mayor en tantas umas como

hidrógenos sean sustituidos por deuterios.

Existe otro tipo de espectrometría de masas específica para compuestos de alto peso molecular, en

este caso se registra tanto la relación m/z como el “tiempo de vuelo”, es decir el tiempo que tarda la

sustancia en llegar al detector desde que se forman los iones. Este aparato se conoce como

detector TOF (time of flight), y suele estar asociado a una ionización en fase sólida, que se realiza

con un láser, a la vez que se calienta la superficie sobre la que se encuentra, la sustancia ionizada

se mueve por medio de un campo eléctrico hacia el detector. Tanto al aparato dedicado como el

procedimiento se conocen como MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of

flight).

6.7. Centrifugación.




La centrifugación es una técnica básica de laboratorio.

Si bien existe también la ultracentrifugación analítica, el uso más

habitual de esta técnica es en forma preparativa: es decir, prepara una muestra para procesarla posteriormente mediante

otras técnicas. Su utilidad principal es separar los componentes de una muestra

líquida compleja para poder aplicar

técnicas especificas de medida.

Por ejemplo, al centrifugar la sangre conseguimos separar sus células de la matriz líquida que las

porta, así extraemos el suero o el plasma necesarios para realizar las determinaciones posteriores.

El principio de la centrifugación es bastante sencillo, la muestra se somete a una fuerza, que se

genera por rotación, y hace que los componentes más “pesados” sedimenten en el fondo del tubo,

quedando los más “ligeros” por encima. La fuerza ejercida se mide en múltiplos de la fuerza de

gravedad (g), cuanto mayor sea la fuerza, más rápidamente se separarán los componentes, sin

embargo este principio no es aplicable siempre. Si aplicamos demasiada fuerza sobre la sangre, las

células se aplastarán contra el fondo del tubo, rompiéndose, y liberando su parte liquida, lo que

contaminara el suero con sustancias no deseadas. La fuerza generada por una centrifuga es

directamente proporcional a la velocidad de giro (medida en revoluciones por minuto, o rpm) y al

cuadrado de la distancia entre el eje de giro y la muestra.

Los componentes de una muestra que posean un “coeficiente de sedimentación” distinto,

determinado por su densidad, tamaño, forma, viscosidad, etc., se podrán separar por centrifugación,




aunque puedan existir otro tipo de limitaciones, por ejemplo, que el tiempo necesario para

conseguirlo sea inabordablemente largo.

El aparataje que se utiliza son máquinas:

Centrifugadoras o centrífugas:

Las centrifugas poseen un motor que produce el movimiento de rotación necesario,

atendiendo a la velocidad de giro existen modelos básicos que giran a unas 6.000 rpm

como máximo (producen unas fuerzas de hasta 4.000 g).

Las centrifugas de alta velocidad producen fuerzas de hasta 20.000 g y necesitan que

los elementos que giran (el rotor) se encuentre en una cámara de vacío, ya que la

fricción con el aire al girar elevaría la temperatura.

Y las ultracentrífugas, que producen hasta 200.000 g y necesitan un alto vacío para no

fundir los rotores por fricción.

Rotores:

Los rotores son los elementos que giran y alojan los tubos de muestra.

Existen varios tipos dependiendo de la posición de los tubos en ellos:

En los flotantes los tubos se encuentran en receptáculos que pueden bascular,

de forma que la fuerza centrífuga deja el tubo en posición horizontal, suelen

tener los radios de giro más grandes, pero por su construcción no pueden girar

a rpm muy altas.




Figura 20.22. Flotantes

Además, al estar los tubos horizontales hay grandes diferencias entre la fuerza

ejercida en el fondo del tubo y su superficie.

Ambas restricciones hacen que el tiempo necesario para la separación sea

mayor que en otros tipos.

Los rotores de ángulo fijo poseen huecos en los que se alojan los tubos de

muestra formando un ángulo con el eje de giro, admiten más altas rpm y

generan menos diferencias de fuerza entre los extremos de los tubos.




Figura 20.23. Ángulo Fijo

Los rotores verticales son de ángulo fijo, con la particularidad de que el tubo

está en posición vertical. Son los que alcanzan mayores rpm. Además, la fuerza

ejercida es muy similar en todo el tubo, ya que sólo varía en función de su

diámetro (por lo general mucho más pequeño que la longitud), por supuesto el

tubo debe estar cerrado para que no se salga su contenido.




Figura 20.24. Verticales

Tubos:

Los tubos de centrífuga son específicos para cada rotor y están fabricados en

materiales que soportan una gran presión (generada por la fuerza centrífuga al actuar

sobre su contenido).

Los tubos para los rotores de ángulo fijo además, deben sellarse para evitar que se

derramen, por lo que se requieren materiales adicionales para vaciar su contenido tras

la centrifugación.

Existen dos técnicas fundamentales para la separación por centrifugación:

los gradientes de densidad:

Como su nombre indica, se utilizan para separar compuestos de distinta densidad.




La muestra se dispone sobre, o bajo otra fase líquida cuya densidad varía a lo largo del

tubo.

En este caso, no se produce una sedimentación, ya que las sustancias migran a través

del tubo hasta que la densidad del medio es igual a la propia, de esta forma podemos

separar en un solo paso varias moléculas distintas.

Por ejemplo, al centrifugar una mezcla de ácidos nucleicos en un gradiente de densidad

de cloruro de cesio se separan las dobles hélices de DNA del DNA de una sola cadena

y ambas del RNA.

El gradiente de densidad puede ser:

continuo

discontinuo (cuando hay cambios abruptos de densidad entre dos o más fases).

la centrifugación secuencial:

Aplica varias rondas de centrifugación para ir separando componentes, combinada o no

con gradientes de densidad.

Por ejemplo, de una muestra de células se pueden ir extrayendo, en base a su distinto

coeficiente de sedimentación:

los núcleos y mitocondrias (partículas más grandes),

las membranas celulares (al romperse las células forman agregados más

pequeños),

retículo endoplásmico y aparato de Golgi (formados por vesículas membranosas

aún más pequeñas)

y, finalmente, los lisosomas, peroxisomas y microsomas.

La selección de un tipo de rotor de Ultracentrifugación dependerá del procedimiento que

pretendamos realizar.




Figura 20.25. Selección

Para conseguir un buen gradiente suelen ser más adecuados los rotores basculantes y los verticales.

Tipo de rotor Ventaja Desventaja

Basculantes Mejor definición de las bandas

separadas.

El tiempo requerido para la

separación.

Verticales Menor tiempo requerido para la

separación.

Ligeramente peor definición de las

bandas separadas

En el caso de técnicas de sedimentación (precipitación o flotación), los rotores preferidos son los de

ángulo fijo.




6.8. Cromatografía

Concepto de cromatografía

Bajo la denominación de cromatografía se

engloban los procesos en los que los componentes de una mezcla, disueltos en una fase móvil, se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase

estacionaria.

La adecuada elección de estas fases puede hacer que tales diferencias se traduzcan en una

separación efectiva de los solutos, a la vez que éstos pueden identificarse atendiendo a su particular

velocidad de avance.

El estado físico de la fase móvil determina la primera gran división de los métodos cromatográficos.

Se puede hablar de:

Cromatografía de gases (CG): cuando se emplean fases móviles gaseosas,

Cromatografía de líquidos (CL):

Cuando son fases líquidas.

El estado de la fase estacionaria puede ser:

Sólido: El primer caso (cromatografía líquido-sólido) no plantea ningún problema

conceptual. Pues se entiende que una fase móvil líquida pueda moverse a través

de una fase estacionaria sólida, con tal de que esta última sea más o menos

porosa.

Líquido: Sin embargo, cuando la fase estacionaria es líquida (cromatografía

líquido-líquido, CLL), la fase móvil, aun siendo inmiscible con ella, podría

arrastrarla. La situación se resuelve inmovilizando el líquido que constituye la fase

estacionaria por medio de algún sólido, que recibe el nombre de soporte. Y cuya




única misión, al menos idealmente, es la de ejercer como matriz de retención

frente al empuje mecánico de la fase móvil.

Antes de introducir nuevos criterios de clasificación, conviene precisar que, en cromatografía de

gases, no sólo la fase móvil ha de ser un gas, también debe serlo la mezcla a separar. Por ello, la CG

requiere un paso previo de volatilización, que no siempre e factible (ej: compuestos iónicos), máxime

si se considera la termolabilidad de muchos compuestos biológicos.

Junto al estado físico de las fases móvil y estacionaria, hay otro gran criterio de clasificación de las

técnicas cromatográficas: la causa por la cual los solutos resultan retrasados en su avance. De

acuerdo con este criterio, se puede proponer la clasificación que se recoge en la siguiente tabla.




Tabla 20.16. Clasificación de las técnicas cromatográficas en función de la causa por la que los

solutos resultan retrasados en su avance.

Clases de

Reparto /

Interacción

Tipo de

Cromatografía

Fase estacionaria Subtipo

Reparto Solubilidad REPARTO Polar FASE NORMAL

Apolar FASE REVERSA

Tamaño PENETRABILIDAD

Interacción Electroestática INTERCAMBIO

IONICO

Aniónica DE CATIONES

Catiónica DE ANIONES

Hidorfóbica INTERACCION

HIDROFOBICA

Afinidad biológica AFINIDAD

Inespecífica ABSORCION Ej. Cromatografía

sobre

Hidroxiapatita

Por último, independientemente del tipo de cromatografía, hay dos modos operativos para su

desarrollo:

Modos operativos

Relacionados con la disposición de la fase

estacionaria sobre superficies planas.

Relacionados con la disposición de la fase

estacionaria sobre columna.




Este último es el más utilizado, con notable diferencia, en los laboratorios de Bioquímica. No obstante,

hay algunos casos en los que también resulta útil el otro; tales son las cromatografías en papel y en

capa fina que se tratan a continuación.

Cromatografía en papel

Es básicamente una cromatografía de reparto, donde la fase estacionaria es el

agua retenida (absorbida) entre las fibras de celulosa de una hoja de papel.

La fase móvil suele ser un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes. Esta cromatografía se

puede llevar a cabo en sentido ascendente, para lo cual el extremo inferior de la hoja de papel

cromatográfico se sumerge en el recipiente que contiene la fase móvil. Ésta irá ascendiendo por la

capilaridad generada por la estructura fibrosa del papel.

También es posible realizar estas cromatografías en sentido descendente, en cuyo caso el

desplazamiento de la fase móvil será el resultado de la acción capilar más la de la gravedad.

Terminado el desarrollo cromatográfico, y seco el papel, los solutos separados podrán ser localizados,

bien directamente si son coloreados, o bien por algún método de detección que los haga visibles. Los

diferentes solutos habrán avanzado más o menos según sus coeficientes de reparto.

Estas distancias no se miden en valores absolutos, sino en términos relativos a la distancia avanzada

por el frente de la fase móvil. El número que expresa esta distancia relativa se llama factor de retraso,

y se denota con el símbolo Rf (del inglés Retardation factor o Relative to front):




Rf = distancia avanzada por un soluto/

distancia avanzada por el frente

Este número (menor o igual de 1) es característico de cada soluto para una composición dada de la

fase móvil y un determinado tipo de papel.

Cromatografía en capa fina

Este método cromatográfico (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography) se

puede considerar como una optimización

de la cromatografía en papel.

La idea subyacente es la misma: hacer avanzar, por capilaridad, una fase móvil sobre una fase

estacionaria plana, de forma que los solutos de la muestra aplicada se separen por su diferente Rf .

El soporte de la fase estacionaria, ya no es una estructura fibrosa, como la del papel, sino un sólido

pulverizado, el cual se encuentra extendido en forma de una fina capa (0.15-0.5 mm de espesor)

sobre una plancha de vidrio, plástico o metal. Para conseguir la cohesión del conjunto, el sólido

pulverizado suele incluir un agente cementante, normalmente sulfato calcio o alcohol polivinílico.

En cromatografía en capa fina, son muchos los sólidos que pueden actuar como soporte, una vez

pulverizados y extendidos:

celulosa,

poliamida,




alúmina

gel de sílice. Este último, también llamado sílica-gel o sílica es, con diferencia, el que más se

utiliza.

Cromatografía en columna

En este modo cromatográfico la fase

estacionaria se dipone como el relleno de un recipiente cilíndrico, de vidrio, plástico o metal, abierto por ambos extremos, que

se denomina columna.

Dicho relleno, también llamado lecho cromatográfico ha de tener una estructura porosa a fin de que

pueda fluir la fase móvil. El flujo estará propiciado por:

la acción de la gravedad,

o de una bomba peristáltica (cromatografía convencional)

o por sistemas de bombeo de alta presión (cromatografía líquida de alta resolución).

En el apartado Cromatografía de exclusión se describirán los parámetros más utilizados en este tipo

de ensayos:

volumen total de la columna,

volumen de elusión de las muestras,

coeficiente de partición,

volumen de exclusión.

Cromatografía convencional

En los apartados siguientes pasarán a comentar algunos de los tipos de cromatografía convencional

más utilizados:




Cromatografía de exclusión o filtración por gel:

Figura 20.26. Filtración por gel

La mayor parte de los soportes para esta cromatografía están basados en polímeros

fuertemente hidrofílicos, que, al ser puestos en contacto con agua, adquieren el aspecto

de un gel. En los soportes que se usan en Bioquímica, tales polímeros suelen ser

polisacáridos (dextranos o agarosa) o poliacrilamida, o mezclas de ellos. Los

fabricantes de estos soportes someten a estos polímeros a reacciones con agentes

bifuncionales que entrecruzan las fibras individuales. El sólido resultante lo fragmentan

hasta quedar en forma de micropartículas esféricas. Finalmente, mediante una

operación de criba, clasifican las micropartículas por intervalos de diámetro.

Entre los soportes de este tipo se encuentra:

Bio-gel (Agarosa),

Ultrogel (Agarosa),




Ultrogel AcA (Agarosa y Poliacrilamida),

Sephacryl (Dextrano y Poliacrilamida),

Sephadex (Dextrano)

Sepharosa (Agarosa).

Las partículas por las que están formadas estos soportes son de forma esférica. Estas

esferas están formadas a su vez por un enrejado que depende de la concentración de

fibras y su grado de entrecruzamiento. En contra de lo que uno pudiera pensar al

emplear la palabra “filtración” por gel, las moléculas que pasan antes, a través de estas

columnas, son las de mayor tamaño, que pasan entre las esferas del material, sin

“enredarse” en él. Las de menor tamaño son detenidas en su avance por el

“entrecruzado” que hay en el interior de las esferas.

Después de aplicar una muestra en la parte superior del lecho de la columna se va

recogiendo el volumen que eluye por la parte inferior, por ejemplo, con un colector de

fracciones (fracciones de un determinado volumen fijo). En esas fracciones se va

midiendo lo que sale de la curva (por métodos colorimétricos, fluorimétricos, contaje

radiactivo, métodos de inmunoensayo....etc), dependiendo del caso concreto. Y así, se

puede dibujar una gráfica que corresponderá al correspondiente perfil de elución de la

sustancia que estamos intentando purificar.

En la siguiente figura se muestran los perfiles de elución a través de Sephadex G-50

medium de la osteocalcina procedente de una mezcla de sueros de sujetos adultos

sanos. Dependiendo del RIA utilizando para el análisis de las fracciones (y por tanto de

la especificidad del anticuerpo utilizado), se obtienen diferentes perfiles de elución.




Figura 20.27.

En el caso del ejemplo de la cromatografía anterior, purificación de osteocalcina, el

volumen de elución sería aproximadamente de 300ml= 50x6 ml = número de fracción

del pico máximo de la curva de elución (ver figura anterior) por volumen en ml de cada

fracción. Mediante uno de los RIAs utilizados, en el análisis posterior del eluído, se

Se denomina volumen de elución (ve) de una sustancia, al volumen necesario de eluyente, para llegar al máximo del pico

correspondiente a la elución de esa sustancia.




encuentra más de 1 pico de elución, lo que indica que no se trata de una especie

molecular homogénea.

Siguiendo con el ejemplo del Sephadex G-50 medium, el volumen de exclusión (Vo)

de la columna corresponde al Ve de una muestra de albúmina sérica (peso molecular

66000 Da). Esto es debido a que la albúmina es lo primero que sale por el fondo de la

columna, ya que no se retiene en absoluto, al ser su tamaño molecular mayor que el

rango superior de separación del gel (30.000 Da). Es decir, que el volumen de exclusión

(Vo) de una columna es el volumen de elución de una muestra que no se retiene en

absoluto por la columna.

El volumen total de la columna (Vt) corresponde al Ve del rojo fenol, ya que su masa

molecular (550 Da) es menor que el rango inferior de separación del gel (1500 Da). Y

por tanto, es lo último que sale de la columna, lo que más se “enreda” en ella. En

realidad, en este tipo de cromatografía, la penetrabilidad de una muestra depende de su

tamaño y de su forma molecular.

Cuando se quiere realizar una calibración de la columna en función de pesos

moleculares, se representa el coeficiente de partición entre la fase líquida y la fase del

gel (Kav) de diversos patrones aplicados de Pm conocido, frente al logaritmo de su

peso molecular. El Kav de cada muestra se obtiene aplicando la fórmula matemática

Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo). En la siguiente figura se muestra la curva de calibración de una

columna de Sephadex G-50 en que se han utilizado como patrones de peso molecular

conocido Insulina, Ribonucleasa A y el Inhibidor de la Tripsina.




Figura 20.28.

Este tipo de cromatografía se utiliza ampliamente en el campo de la bioquímica,

especialmente para procesos de purificación.

Cromatografía de intercambio iónico:

En este tipo de cromatografía la fase estacionaria tiene grupos cargados que

interaccionan electrostáticamente con iones de signo contrario de la fase móvil. El

soporte sobre el que están anclados estos grupos suele ser una resina. Entre estas

resinas, una de las más utilizadas es el “Amberlite” o “Dowex”, poliestireno

entrecruzado con divinil-benceno.




Cromatoenfoque:

Este nombre se aplica a una variación en el empleo de la cromatografía de intercambio

iónico, que permite que los diferentes solutos se separan de acuerdo con su

punto isoelécrtico, pI.

Lo normal es emplear un intercambiador de aniones, que se equilibra a un pH superior

a los pI de los solutos a separar. El tampón de elución es de pH inferior a los pI de los

solutos. Conforme va fluyendo el tampón de elución se genera un gradiente de pH a lo

largo de la columna.

Cromatografía de afinidad:

La mayor parte de las funciones biológicas son el resultado de interacciones específicas

entre dos biomoléculas: hormona-receptor, antígeno-anticuerpo...etc.

Si el segundo componente va en la fase móvil se producirá su unión específica a la

columna. De este modo se podrán purificar biomoléculas muy complejas, ya que el resto

de los solutos pasará de largo a través de la columna. El problema más complejo a

resolver es el de encontrar después las condiciones de elución del soluto retenido.

La cromatografía de afinidad se basa en

anclar covalentemente a un soportte cromatográfico uno de los componentes de

tales sistemas biológicos.

Cromatografía líquida de alta resolución




Este método constituye la forma más eficaz

de llevar a cabo un proceso cromatográfico.

En español se denomina CLAE (Cromatografía líquida de alta eficacia), pero el término más utilizado

para denominarla es HPLC del inglés “hig pressure liquid chromatography” o “high performance liquid

chromatography”.

En realidad, este método consiste en una

cromatografía en columna, pero en la que

el soluto atraviesa dicha columna

separadora a altas presiones.

Las elevadas eficiencias en HPLC derivan del empleo de fases estacionarias (columnas) mucho más

finamente divididas que en la cromatografía convencional, lo que se traduce en picos de elución muy

estrechos que dan cuenta de elevadas resoluciones cromatográficas.

Los materiales empleados en cromatografía convencional no pueden ser utilizadas en HPLC, ya que

su elevada porosidad los haría deformarse o romperse al someterlos a elevadas presiones. En HPLC

las fases estacionarios han de estar formadas por partículas de mucha mayor rigidez mecánica. En

este sentido “la sílica” constituye uno de los soportes cromatográficos más ventajosos. El

empaquetado del soporte es muy importante, por lo que lo normal en la actualidad es trabajar con

columnas comerciales empaquetadas en fábrica. Dado que la presión de trabajo es muy elevada, la

parte exterior de las columnas suelen ser de acero inoxidable. En la siguiente figura puede observarse

una típica columna de HPLC.




Figura 20.29.

Componentes básicos de un equipo de HPLC

Inyector Sistema de registro gráfico u

ordenador.

Bomba Elemento de detección.

La columna

Los componentes básicos de un equipo de HPLC son:

Inyector, o el lugar por el que se introduce la muestra en el sistema:

Elemento de ayuda a esta técnica, aunque no es básico, es un inyector automático de

muestras, que permite que el analista se despreocupe de introducir cada determinado

tiempo una muestra en el sistema, ya que el inyector lo hace secuencialmente.

Esto permite que los aparatos trabajen continuamente, sin la presencia de un técnico

(por ejemplo, durante la noche)

Bomba:

Proporciona el flujo adecuado de disolvente.

En HPLC el disolvente se denomina fase móvil.




Si vamos a trabajar en:

condiciones “isocráticas”, es decir, siempre con el mismo disolvente

podremos usar una sola bomba.

“gradiente” , es decir, que va a ir variando la composición de la fase móvil a lo

largo del tiempo, entonces necesitaremos al menos dos bombas (que van

tomando los volúmenes relativos de disolvente) y un módulo de gradiente que

mezclará adecuadamente las proporciones de dichos disolventes en función del

tiempo.

Columna:

Elemento fundamental para conseguir la separación deseada.

Un elemento de detección que vaya analizando las sustancias que eluyen por el final de la

columna.

Este detector podrá ser del tipo espectofotómetro UV/VIS, fluorímetro, detector

electroquímico, contador de radiactividad...etc, dependiendo de las sustancias que

intentemos separar e identificar.

Muchas veces también es conveniente adaptar al final del sistema un colector de

fracciones, si se desean procesar de algún modo posteriormente las sustancias

separadas por el HPLC.

Sistema de registro gráfico u ordenador.

La siguiente figura muestra un aparato de HPLC que dispone de inyector automático, bomba,

columna, detector UV/VIS y ordenador adaptado al sistema.




Figura 20.30.

Los parámetros que determinan las condiciones de una medida por HPLC son:

Naturaleza de la columna analítica.

Composición de la fase móvil.

Velocidad de flujo de dicha fase móvil.

En algunos casos, temperatura del ensayo.

Tiempo de retención de una determinada sustancia, es el tiempo que tarda en eluir de la

columna en unas determinadas condiciones.

Tipos de columnas y fases móviles

Como hemos dicho anteriormente, la sílice es el soporte cromatográfico más empleado en

HPLC.

Sin embargo, no se suele usar como tal (es decir como grupos Si-OH), sino que se hace

reaccionar la superficie de la sílice con grupos silanos, de modo que la superficie pasa de ser

polar (-OH), a hidrofóbica –CH2-(CH2)n-CH3.

Las columnas así preparadas son las que se denominan de fase reversa, y las fases móviles

que se emplean con ellas son eluyentes polares o acuosos. Los nombres comerciales Zorbax

Sil (Du Pont), Lichrosorb (Merck) o Resolve (Waters), entre otros, corresponden a este tipo de

columnas.

Si las columnas de sílice no se recubren de cadenas de hidrocarburos, entonces la columna

se llama de fase normal.




Un disolvente típico de una columna de fase normal es el hexano:etanol. Un eluyente típico de

una cromatografía de fase reversa es el metanol/agua.

Por supuesto, las columnas de sílice se pueden también tratar para convertirlas en columnas

de intercambio iónico. Algo similar puede decirse para el resto de medios cromatográficos,

existiendo rellenos especiales que permiten separación por exclusión por gel, adsorción...etc.

Algunos ejemplos prácticos se muestran en la siguiente figura.

Figura 20.31.




Cromatografía de gases

En este caso la fase móvil es un gas inerte, se suele utilizar helio, que se mueve a

través de una columna capilar cuyo relleno puede unir distintas moléculas según su

naturaleza, existen rellenos polares,

apolares, etc.

La separación se produce en parte por exclusión molecular y en parte por afinidad. El principal

inconveniente es que la muestra tiene que ser volátil para poder entrar en la corriente de gas, si no lo

es, es necesario “derivatizarla”, es decir, introducir una modificación química que aumente la

volatilidad de la muestra.

Por supuesto el disolvente también tiene que ser volátil, por ello en muestras biológicas es necesario

realizar un proceso de extracción que purifique la muestra, cambie el disolvente, y modifique las

moléculas para hacerlas volátiles.

Este tratamiento de la muestra antes de la cromatografía hace imprescindible el uso de estándares

internos. La ventaja que ofrece es el alto poder de resolución ya que los compuestos eluyen de la

columna en “picos” que duran segundos, así se pueden separar una gran cantidad de moléculas en

un tiempo muy corto.




Procesos del funcionamiento de un cromatógrafo de gases:

Inyección Detección Cromatografía

El funcionamiento de un cromatógrafo de gases se puede esquematizar en tres procesos:

Inyección:

Se suele realizar en una cámara a alta temperatura, así, el líquido inyectado se vaporiza

y pasa a la corriente de gas.

Si los compuestos a separar son volátiles se puede realizar una inyección de espacio

en cabeza.

En un tubo sellado se sitúa la muestra y se aumenta la temperatura. Los compuestos

volátiles pasan a la cámara de aire del tubo, y esta mezcla gaseosa se inyecta en la

columna de cromatografía.

La gran ventaja de esta técnica es que no requiere un tratamiento complejo de la

muestra, por ejemplo, de un suero se puede extraer así el alcohol que contiene y

realizar su medida de forma rápida y fiable.

Cromatografía de gases:

Se puede desarrollar a temperatura constante o utilizar rampas de temperatura, que

permiten disminuir el tiempo que tardan en eluir los compuestos.

Las velocidad del flujo de gas en la columna cromatografica puede ser de unos 50 cm

por segundo, así, utilizando columnas de 30 metros, se consigue una separación muy

fina en tiempos muy cortos.




De hecho, una columna de 30 metros es capaz de separar el metanol del etanol (que se

diferencian sólo en un átomo de carbono y dos de hidrógeno) en cuatro minutos, por

simple exclusión molecular.

La detección de los compuestos al final de la columna:

Se puede realizar de distintas formas, las más habituales son los detectores FID y los

espectrómetros de masas (link).

Los detectores FID utilizan una llama de hidrógeno puro (que se quema sin producir luz)

al final de la columna.

Al llegar al detector compuestos que se puedan “quemar” producen un destello,

proporcional a la masa, detectable y que se traduce en un impulsos eléctricos que

formarán el cromatograma.

6.9. Electroforesis

Concepto de electroforesis: electroforesis libre y de zona.

Se entiende por electroforesis la migración

de solutos o partículas cargadas en un medio líquido bajo la influencia de un

campo eléctrico.

Por lo tanto, la primera condición indispensable para poder someter a una molécula a electroforesis

es que posea carga eléctrica.

El parámetro que determina la movilidad de una molécula en un campo eléctrico es la “movilidad

electroforética”, m,:

Se define como la velocidad de migración por unidad de campo.

Se expresa en cm2.s-1.volt-1;




Depende de la carga, de la forma y del tamaño de las moléculas, pero es difícil de calcular a

priori, ya que depende del medio (pH y fuerza iónica).

La electroforesis se puede desarrollar de dos maneras:

En la llamada electroforesis libre:

El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones.

Aunque históricamente esta modalidad es el origen de la electroforesis, desarrollada por

Arne Tiselius a partir de 1937 (y por lo que recibió el Premio Nobel en 1948),

actualmente está en desuso.

Sin embargo, la electroforesis de zona:

Es una de las técnicas más utilizadas en Bioquímica por su gran resolución.

Aquí, el campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante, en vez de a un

fluido, evitando sus inconvenientes.

La muestra se deposita en una reducida zona del soporte, lo que da nombre a esta

modalidad.

Electroforesis de zona. Equipo electroforético.

Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan los elementos mostrados en la

siguientes figuras y explicados a continuación:.

Figura 20.32.




Figura 20.33.

Figura 20.34.




Figura 20.35.




Figura 20.36.

Figura 20.37.




Figura 20.38.

Una fuente de tensión (o de alimentación) que proporciona el campo eléctrico, mediante dos

electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece una diferencia de

potencial.

Una cubeta o recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos. Un soporte

electroforético. Y, por último, el tampón de electroforesis. El soporte es el elemento

fundamental en una electroforesis.

Aunque todas las electroforesis responden a un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos

tipos en función del soporte que se utilice. En todos los casos la muestra se dispone inicialmente

ocupando una pequeña zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsada por el campo

eléctrico.





obtención.

Tipos en función del soporte

Soportes no restrictivos

Soportes restrictivos: gel de poliacrilamida

(PAGE)

Soportes no restrictivos:

A este grupo pertenecen la agarosa y el papel. Una variedad de este último es el acetato de

celulosa, que presenta la ventaja de que se vuelve transparente mediante deshidratación con

mezclas de alcohol y agua, con lo que podrá ser densitometrado.

La electroforesis sobre soporte de agarosa se ha utilizado ampliamente para la separación de

proteínas. En este caso, el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el

tamaño de poro del soporte, de tal modo que el entramado no interfiere en la migración. La

separación depende de la densidad de carga y la masa, al pH seleccionado. Cuanto mayor

sea esa relación para una molécula, mayor será su velocidad de migración en un campo

eléctrico.

Para que el sistema presente continuidad de la corriente eléctrica, en el caso de los geles

de agar, el tampón está embebido en el soporte. En el caso de papel o del acetato de

celulosa, es necesario humedecer el soporte para que sea conductor. Para ello, el soporte se

impregna de tampón de electroforesis, de forma simultánea por ambos extremos, para que se

desplace por capilaridad a lo largo de todo el soporte.

La primera etapa del proceso analítico, es la aplicación de la muestra. En papel o acetato de

celulosa se puede efectuar puntual o longitudinalmente. En los geles de agarosa, se perfora el

gel con un troquel de diámetro adecuado, se elimina esa porción, y en el pocillo resultante se

aplica la muestra. Se deposita en una pequeña zona, lo más estrecha posible, en el centro o



en un extremo del soporte (si se conoce cuál va a ser la dirección de desplazamiento), de

modo perpendicular a la dirección del campo eléctrico

Figura 20.39.

Al aplicar una diferencia de potencial, comienza la electroforesis, y cada componente de la

muestra migrará hacia uno u otro polo en función de la carga. La electroforesis finalizará

cuando se haya producido la máxima separación de los componentes de la muestra, sin

sobrepasar los límites del soporte. En caso contrario, acabarían mezclados con el tampón de

la cubeta. Para evitar esto, se usan los marcadores electroforéticos. Éstos son moléculas

coloreadas de elevada U (gran carga respecto a su tamaño), superior la de cualquier

componente de la muestra. Se aplican a ambos lados de ésta. Su desplazamiento se puede

observar por ser coloreados, y cuando alcanzan los extremos del soporte se da por finalizada

la electroforesis. De esta manera se tiene la certeza de que ningún componente de la muestra

ha abandonado el soporte. Entre los marcadores más utilizados se encuentran la dinitrofenil-

lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol.

Una vez acabada la electroforesis, para conocer el resultado del proceso, se procede a la

etapa de tinción. El soporte se retira de la cubeta, y se sumerge en un recipiente que

contenga una disolución de un colorante que se una de manera específica a los componentes




de la muestra. Esta disolución, además de teñir, precipita a los componentes separados, en la

posición en la que se encuentren.

Como medios de tinción en el caso de las proteínas son muy utilizadas las disoluciones de

negro amida al 1% (p/v) en ácido acético y de Azul de Coomassie al 0.1% (p7v) en

metanol/agua/ácido acético (9:9:2; v/v/v). Por último, se puede estimar el contenido de cada

banda por densitometrado. La siguiente figura, muestra el resultado de la electroforesis sobre

agarosa de una muestra de suero humano, así como el correspondiente densitometrado de

las bandas de una muestra normal y de una muestra de suero que presenta un componente

homogéneo (paraproteina correspondiente a una inmunoglobulina monoclonal).

Figura 20.40.




Figura 20.41. Muestra normal




Figura 20.42.Componente homogéneo




Soportes restrictivos: gel de poliacrilamida (PAGE).

La electroforesis en geles de poliacrilamida

(PAGE, del inglés PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) se utiliza

mayoritariamente para la separación de proteínas, aunque también es útil para

ácidos nucleicos.

Es el método zonal más utilizado debido a sus numerosas ventajas. La fundamental es que

posee un gran poder de separación. Los geles de poliacrilamida (PA) son soportes

restrictivos, del tipo II. No solo evitan la convección y minimizan la difusión, como los otros

soportes, sino que, además, participan directamente en el proceso de separación. Se

preparan de modo que sus poros sean de un tamaño comparable al de las proteínas, de

manera que produzcan un efecto de tamizado molecular. La separación electroforética

depende entonces de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño.

La PAGE en placa es la forma habitual de desarrollo de esta técnica. Las placas pueden

prepararse de modo manual, según las instrucciones del fabricante del gel, o bien, adquirirse

ya preparadas para colocar entre dos cristales dentro de una cubeta. Las PAGE pueden

llevarse a cabo en posición

Vertical: lo más habitual para la separación de proteínas.

Horizontal, según el tipo de cubeta empleada. Las siguientes figuras muestran las

fotografías de dos cubetas para PAGE horizontales y vertical respectivamente.




Figura 20.43. PAGE Horizontal




Figura 20.44. PAGE Vertical

En este tipo de electroforesis, el tampón del reservorio cubre el gel y los pocillos en los que

se carga la muestra. Por ello, y con el fin de que éste no difunda al depositarla en los pocillos,

se le añade un compuesto que aumenta su densidad (sacarosa o glicerol). La aplicación se

realiza mediante pipetas automáticas especiales que permitan dispensar pequeños

volúmenes. En el tampón de muestra, también se añade un marcador electroforético para

determinar el máximo avance de la movilidad electroforética. El azul de bromofenol es el

marcador más utilizado.

Finalizada la PAGE, se separa el gel de las placas de vidrio que han servido como molde.

Entonces, hay que proceder a la visualización de la muestra. Para la detección de proteínas

en PAGE se utiliza ampliamente el azul de Coomasie, que permite visualizar 0 – 0,5 mg de

proteína por fondo.




La tinción mediante sales de plata es también un método muy extendido, y cuya principal

ventaja es que permite detectar hasta 0,1 ng de proteína por banda. Un método muy sensible

es utilizar compuestos fluorescentes que se unen específicamente a las proteínas. Entre ellos,

destaca el cloruro de dansilo, capaz de detectar 10 ng de proteína/banda. Marcar proteínas

con algún radioisótopo es el método de detectar más sensible actualmente disponible. Si la

detección de bandas se hace sobre el gel entero, puede realizarse por autorradiografía. En la

autorradiografía, el gel impresiona la película, produciéndose bandas oscuras en las zonas

correspondientes a la posición de las proteínas en el gel. La autorradiografía directa puede

hacerse cuando las proteínas están marcadas con 125I, 14C, 32S ó 32P. Como alternativa a

lo anterior, también puede cortarse el gel en pequeños trozos y contarse su radiactividad en

un contador adecuado..

Finalizada la PAGE, se puede también obtener información acerca de la identidad de las

proteínas si éstas se transfieren desde el gel a una membrana. El proceso de transferencia se

suele denominar “blotting” (pues un “blotting-paper” es un papel secante, y la transferencia

se “seca” el gel, al pasar las bandas a la membrana). Una vez en la membrana, las proteínas

están accesibles (cosa que no ocurre en el gel) para interaccionar con otras moléculas que

permitan su identificación. En la mayoría de los casos se trata de anticuerpos (el

procedimiento se conoce como “immunoblotting”), pero también pueden ser lectinas,

receptores, ácidos nucleicos o cualquier otro ligando. Incluso, se puede determinar la

secuencia de aminoácidos de las proteínas transferidas a la membrana, o llevar a cabo

digestiones enzimáticas o tratamientos químicos para la obtención de péptidos. Igualmente

pueden ser utilizadas como inmunógenos para la obtención de anticuerpos.

La transferencia de moléculas desde geles a membranas fue originalmente descrita por

E.M.Southern para el caso del DNA (transferencia de Southern). Posteriormente se describió

para el caso de RNA (se denominó transferencia tipo northern), y, continuando con la misma

terminología, la transferencia de proteínas se denominó tipo western (western blotting).




PAGE-SDS

No existe una relación clara entre m, movilidad electroforética, y otros parámetros

moleculares, ya que la carga de una molécula depende del medio, de la esfera de solvatación

de las moléculas… etc.

Sin embargo, en la PAGE-SDS, los complejos SDS-proteína se separan estrictamente según

su tamaño molecular, de modo que es posible estimar su masa molecular. El SDS

interacciona con la gran mayoría de las proteínas formando complejos con características

comunes, independientemente de las de cada proteína.

En presencia de una concentración de SDS superior a 8 mM, las proteínas unen 1,4 g de SDS

por cada dos aminoácidos. Las cargas propias de las proteínas quedan así enmascaradas o

anuladas. La separación ocurre sólo como resultado del tamizado molecular a través del gel,

de manera que cuanto menor sea la masa mayor será U, y viceversa.

La PAGE-SDS es la electroforesis más

utilizada para el análisis de proteínas.

Factores que afectan a la electroforesis

El resultado de una electroforesis depende de diversos factores, y es necesario

conocerlos para lograr la máxima resolución.




Factores que afectan a la electroforesis

Campo eléctrico Elección adecuada del tampón de electroforesis

Movilidad electroforética

Así, en primer lugar es fundamental el campo eléctrico (gradiente de potencial), que depende a su

vez de diversos parámetros:

Diferencia de potencial entre los electrodos:

Se mide en voltios y es lo que define el campo eléctrico (diferencia de potencial entre

electrodos referida a la distancia, d, entre éstos, V/d).

Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración de las moléculas.

Las electroforesis realizadas a 10-500 voltios se suelen considerar de bajo voltaje (la

gran mayoría), siendo de alto voltaje las que se llevan a cabo entre 500 y 10000 voltios.

Intensidad (en amperios)

Resistencia de soporte (ohmios):

Este parámetro depende fundamentalmente del soporte y de la concentración del

tampón de electroforesis.

Temperatura.

Debe controlarse de forma estricta, porque puede afectar a la muestra,

desnaturalizándola.

En segundo lugar es fundamental la movilidad electroforética (U) de la muestra. La U de una

molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga. Y disminuye según aumenta su tamaño, pues

mayor es la fricción de la molécula con el medio y menor su carga por unidad de superficie (factor que




multiplicado por el valor del campo daría el de la fuerza que actúa sobre la molécula). Así las

moléculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas (la esfera presenta la mínima

superficie a igualdad de volumen). Por ello moléculas del mismo tamaño y carga, pero distinta forma,

pueden diferir en U, y ser separables por electroforesis.

También es muy importante una elección adecuada del tampón de electroforesis y del soporte

empleado.

Inmunoelectroforesis (IEF)

Es una combinación de una electroforesis en gel de agar (o agarosa) seguida de una

inmunodifusión.

En la primera se realiza una aplicación puntual de la muestra, lo que al final se traduce en que los

distintos componentes (proteínas) estarán distribuidos a lo largo del gel según el eje de migración.

Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tinción, se practica en el gel un canal o “trinchera”,

paralelo a la dirección de migración. En ella se deposita un antisuero que contenga anticuerpos

específicos frente a una o varias de las proteínas separadas en la electroforesis. Los anticuerpos y las

proteínas (antígenos) difunden y, si se encuentran en la proporción adecuada, producen complejos

insolubles (complejos antígeno-anticuerpo) que precipitan y aparecen en el gel como bandas

elipsoidales.




La IEF es una técnica eminentemente

cualitativa, que se desarrolla en condiciones nativas, y es especialmente

apropiada para el análisis de líquidos fisiológicos y extractos celulares.

Permite identificar sustancias en mezclas muy complejas, aun estando presentes en muy baja

concentración. Pero, requiere que tales sustancias sean inmunogénicas, y depende de los antisueros

utilizados, por lo que es difícil de estandarizar.

Un ejemplo especial de inmunoelectroforesis, es la inmunofijación.

Figura 20.45. Inmunofijación.




La inmunofijación consiste en tratar con

anticuerpos específicos, que se disponen por encima de la carrera, las bandas

previamente separadas por electroforesis, de manera que puedan identificarse las

proteínas que corresponden a los anticuerpos utilizados.

Electroenfoque.

El electroenfoque (EEF) es un tipo

particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros (esencialmente se

usa para el análisis de proteínas) se separan según su punto isoeléctrico, pI (pH

al cual su carga neta es nula), en un gradiente continuo de pH.

La carga neta de una proteína es función del pH. A valores de pH > pI la proteína está cargada

negativamente, mientras que a valores de pH < pI su carga es positiva, siendo cero cuando pH = pI.

En esto es en lo que se basa el electroenfoque.

En un soporte en el que hubiera establecido un gradiente continuo de pH, al aplicar un campo

eléctrico, las proteínas migrarían según su carga neta, hasta alcanzar la zona de pH en la que ésta se

anulase (pI). Cada proteína se detendría en ese punto particular y quedaría focalizada (concentrada)

en una estrecha banda.

Electroforesis capilar




La electroforesis capilar (EC) comprende un conjunto de técnicas, iniciadas en la

década de los 80, que emplean capilares (7-100 cm de longitud; 20-200 mm de diámetro

interno) para la separación de moléculas.

Su objetivo es eminentemente analítico, aunque puede utilizarse de forma preparativa.

Su uso se debe a las ventajas que ofrece frente a otros métodos:

utiliza altos voltajes (> 500 V/cm; 10-20 mA), lo cual da lugar a procesos muy rápidos (5-30

minutos; incluso se pueden conseguir separaciones en 1 segundo);

la migración de las moléculas se sigue mediante detectores (absorbancia, fluorescencia,

índice de refracción, conductividad, etc…);

se aplica a todo tipo de sustancias, desde pequeños iones a proteínas y ácidos nucleicos;

admite todas las modalidades de electroforesis conocidas, libre o de zona, con multitud de

soportes;

consigue una gran resolución, denominándose habitualmente HPCE, acrónimo en inglés de

Electroforesis Capilar de Alta Resolución;

se lleva a cabo en equipos totalmente automatizados (un ordenador controla la inyección de la

muestra, la temperatura, el voltaje, el tiempo, etc…), lo que garantiza la reproducibilidad;

emplea cantidades ínfimas de muestra (pmoles), con volúmenes de nl (10-50 nl);

consume volúmenes muy reducidos de tampón, considérese que el equilibrado capilar, antes

de la electroforesis, con 5-10 veces su volumen interno, requiere un total de 25-50 ml (100

ensayos consumen menos de 1 ml de tampón);




en condiciones estándar pueden conseguirse resoluciones similares a las de los sistemas

cromatográficos más eficaces, con 100.000-500.000 platos teóricos/m; en condiciones

óptimas estos valores pueden doblarse;

pueden conectarse a otros aparatos, constituyendo técnicas combinadas de análisis

(EC/espectrometría de masas, EC/cromatografía, etc.).

Equipo necesario

Capilar de cuarzo o sílice fundida

Un detector acoplado

Los extremos del capilar van colocados en sendos reservorios de tampón, donde se ubican los

electrodos, conectados a la fuente de alimentación (capaz de generar 30 KV). El capilar de cuarzo va

recubierto de un polímero que le confiere flexibilidad. La duración del capilar está limitada sólo por el

tratamiento que reciba. Salvo que se rompa, o quede inutilizado por la muestra (unión irreversible de

proteínas, por ejemplo), puede usarse casi indefinidamente (es habitual usarlos varios años).

Transparente a la radiación UV

7. Técnicas enzimáticas




Son las más utilizadas en clínica dada su

gran especificidad.

Las enzimas son capaces de localizar su sustrato entre una mezcla compleja de moléculas y catalizan

una reacción química, que puede ser detectada.

Estas técnicas pueden utilizarse para:

detectar una actividad enzimática

para cuantificar la cantidad de un sustrato presente en una muestra.

Figura 20.46.




En cualquier caso, es indispensable que el sustrato o el producto sean detectables:

directamente (tengan propiedades de absorción o emisión de luz, sean radiactivos, etc)

indirectamente (puedan ser objeto de reacciones secundarias que den lugar a sustancias

detectables).

Figura 30.47.

En unos casos, mediremos la desaparición del sustrato y en otros, la aparición del producto. Para ello

usaremos dos técnicas diferentes, la medida a un punto o a dos puntos:

En las mediciones a un punto:

Asumimos que antes del inicio de la reacción (el iniciador puede ser el enzima, cuando

pretendemos medir un sustrato, o un sustrato necesario para la reacción, cuando

pretendemos medir la actividad enzimática), la señal (densidad óptica, fluorescencia o

cualquier otra propiedad característica del ensayo) es de cero o no diferente del fondo

(señal inespecífica que obtendríamos en ausencia de lo que pretendemos medir).




Tras el inicio de la reacción, dejamos transcurrir el tiempo necesario para obtener una

señal adecuada y medimos su intensidad.

Este tipo de procedimiento es el que suele utilizarse para la cuantificación de un

sustrato, y el tiempo de reacción suele ser el necesario para que éste se haya

consumido por completo.

En las mediciones a dos puntos (cinéticas):

Lo que cuantificamos es la diferencia de señal que se produce en un intérvalo de tiempo

concreto.

Este es el procedimiento que suele utilizarse en las mediciones de actividad enzimática,

ya que en presencia de un exceso de sustrato, la velocidad de reacción solo depende

de la actividad del enzima presente.

No obstante, en algunas ocasiones puede utilizarse para la cuantificación de sustratos,

ya que en presencia de una cantidad fija de enzima (usualmente pequeña), la velocidad

inicial de reacción dependerá de la concentración del sustrato.

Una aplicación especial de las técnicas enzimáticas es la detección cualitativa, ya sea de una

actividad enzimática o de un sustrato. Por ejemplo, la presencia de una enzima específica puede

indicar que existe una bacteria infectando un organismo, o la ausencia de una actividad enzimática

implica un problema genético que de origen a una enfermedad.

En la medida de actividades enzimáticas existe un factor a tener en cuenta, la actividad enzimática

es dependiente de la concentración de sustrato, y, a veces, de la de producto, aunque no de forma

lineal. Así, es posible que estemos detectando actividades bajas por el simple hecho de que nuestra

reacción está agotando el sustrato y se enlentece. Existen varias formas de evitar este problema, una

de ellas son los sistemas de regeneración, en los que una reacción alternativa elimina un producto de

la reacción generando nuevo sustrato, de esta forma se mantienen constantes sus concentraciones

en todo el proceso y obtenemos una cinética lineal.




8. Técnicas inmunoquímicas

8.1. Inmunoensayo por inmunodifusión radial

En esta técnica, el anticuerpo a medir se deposita en pocillos sobre un gel en el que se encuentra homogéneamente distribuido

un anticuerpo de ese antígeno.

El antígeno se va difundiendo sobre el gel hasta que se produce una precipitación dependiente de su

concentración. El grado de difusión depende del tamaño molecular del antígeno, de su peso molecular

y de su concentración. En pocillos de la misma placa se colocan concentraciones conocidas de

antígeno como estándares.

8.2. Inmunoelectroforesis

Esta técnica se encuentra descrita en el capítulo de electroforesis

8.3. Técnicas turbidimétricas y nefelométricas

La turbidimetría y la nefelometría, descritas en un apartado anterior, son técnicas que

permiten la medida del grado de formación

de complejos antígeno-anticuerpo in vitro.

8.4. Ensayos inmunoquímicos con compuestos marcados




Los métodos que se van a describir a continuación están basados en la cuantificación de un

determinado compuesto (antígeno), mediante la formación de un complejo antígeno-anticuerpo.

Sin embargo, tienen la peculiaridad de que para aumentar la sensibilidad de la cuantificación de dicho

complejo inmune formado, el antígeno y/o el anticuerpo están “marcados”, de modo que resultan más

fácil su detección. Este marcaje puede ser radiactivo, de tipo colorimétrico, fluorométrico, etc… La

asociación marcaje-inmunoquímica permite cuantificaciones en rangos que hace años resultaban

imposibles.

Tipos de ensayos: competitivo y no competitivos; homogéneos y heterogéneos

Tipos de ensayos

Competitivo y no competitivos

Homogéneos y heterogéneos

Ensayos competitivos y no competitivos:

En un ensayo inmunoquímico competitivo todos los reactivos se mezclan juntos, de modo:




Figura 30.48. Competitivo

Competitivo simultáneo: el antígeno que se desea cuantificar (Ag) se mezcla con una

cantidad fija y conocida de antígeno marcado (Ag*) y con una cantidad de anticuerpo

(Ac) no suficiente para ligarse totalmente con Ag y Ag*. Por supuesto, la capacidad del

Ac para unirse con el Ag debe ser exactamente la misma que para unirse a Ag*. En

estas condiciones, la probabilidad de formación del complejo Ag*-Ac es inversamente

proporcional a la concentración de Ag. Por lo tanto, la medida de Ag*-Ac o de Ag* no

unido al final del proceso nos permitirá conocer la cantidad inicial de Ag.

Competitivos no simultáneos: lo que se hace es mezclar primero Ag con un exceso

de Ac, de modo que prácticamente todo el Ag se queda en forma de Ag-Ac. Entonces

se añade Ag*, y parte del Ag del complejo Ag-Ac es desplazado, formándose Ag*-Ac.




Después de la correspondiente separación, se cuantifica a cantidad de Ag*-Ac, que al

igual que en el caso anterior es inversamente proporcional a la cantidad de Ag de la

muestra. Usando este modo competitivo secuencial se une una mayor cantidad de Ag al

Ac que en la técnica simultánea. De modo que, este método, permite detectar

cantidades más pequeñas de Ag (es más sensible) que el anterior.

En los inmunoensayos no competitivos, no se utiliza el antígeno marcado (Ag*) para que

en su unión a Ac compita con Ag.

Figura 20.49. Inmunoensayos no competitivos

El anticuerpo de captura Ac se une al principio del ensayo a una fase sólida. Esta unión a la

fase sólida puede ser directa, o realizada de modo más complejo para evitar, sobre todo, los

impedimentos de tipo espacial en la unión posterior anticuerpo-antígeno. Una vez situado el

anticuerpo sobre la fase sólida, y eliminado su exceso, se añade la muestra con el antígeno a




medir, Ag. Todo el Ag se une a la fase sólida. Se realiza después un lavado para eliminar

otras sustancias y entonces se marca Ag.

El marcaje se realiza con un segundo anticuerpo anti-antígeno conjugado, que se une a éste

por un lugar diferente al de unión al primer anticuerpo ligado a la fase sólida. El conjugado es

el que va a permitir la detección del antígeno presente en la muestra por radiactividad,

colorimetría, etc… Los ensayos no competitivos se pueden realizar de modo simultáneo o

secuencial.

Ensayos inmunoquímicos homogéneos y heterogéneos.

En los ensayos inmunoquímicos heterogéneos es necesaria la separación del antígeno

marcado unido al anticuerpo (Ag*-Ac), del antígeno marcado libre (Ag*), con objeto de realizar

la cuantificación de Ag*-Ac. Existen diversos métodos utilizados para realizar esta separación

entre los que se encuentran:

la precipitación con una mezcla de carbón activo-dextrano (precipita Ag*),

la precipitación con un anticuerpo antiAc (precipita Ag*-Ac-antiAc)

la adsorción a una fase sólida del Ag*, como ocurre en los ensayos no competitivos en

que uno de los anticuerpos va unido a una fase sólida (el interior del tubo de reacción,

una esfera de plástico, el fondo de una placa multi-pocillo…).

En los ensayos inmunoquímicos homogéneos no es necesaria la separación del antígeno

marcado ligado y no ligado al anticuerpo. En este tipo de ensayos, la cantidad de “marcaje”

del antígeno viene directamente dado por su unión al anticuerpo, lo que convierte estas

técnicas en más sencillas y rápidas.

Ejemplos de ensayos inmunoquímicos con compuestos marcados




Ejemplos de ensayos inmunoquímicos con compuestos marcados

Inmunoensayos con compuestos radiactivos

Inmunoensayos con compuestos radiactivos

RIA IRMA

Enzimoinmunoanálisis (EIA) Fluoroinmunoensayo. Electroquimioluminiscencia.

Inmunoensayos con compuestos radiactivos: RIA e IRMA

Reciben el nombre de radioinmunoensayos, aquellos ensayos inmunoquímicos en que el marcaje del

antígeno se realiza con un isótopo

radiactivo; en general 125I ó 3H.

Estos inmunoensayos, de amplia utilización en el laboratorio, son de tipo competitivo, tanto

simultáneos como no simultáneos.

Existe un tipo particular de inmunoensayo con compuestos radioactivos de tipo no competitivo

(IRMA) en que lo que va marcado con radiactividad es el segundo anticuerpo que se añade a

la reacción, siendo la cantidad de antígeno a medir proporcional a la radiactividad final del

tubo de ensayo.




Inmunoensayos no isotópicos:

Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Los EIA utilizan las propiedades catalíticas de las enzimas para detectar y cuantificar

las reacciones inmunológicas.

En la práctica, los anticuerpos o los antígenos se “marcan” en este caso con enzimas

(son los denominados conjugados). Se hacen entonces reaccionar con su ligando, y por

último se añade un sustrato enzimático.

Al producirse la reacción enzimática es posible cuantificar la reacción antígeno-

anticuerpo para la que se estaba efectuando el inmunoensayo.

En los EIA se suelen utilizar como marcadores enzimáticos la fosfatasa alcalina, la

peroxidasa, la glucosa 6 fosfato deshidrogenasa y la b-galactosidasa.

Los conjugados de antígeno o anticuerpo y la enzima se preparan por procesos de

acoplamiento covalente.

Se utilizan especialmente los ensayos que producen compuestos que pueden ser

monitorizados fotométricamente.

La siguiente figura muestra un lector de placas para ELISA capaz de leer de modo muy

rápido y efectivo la absorbancia a UV-visible de todos los pocillos de una placa para

ELISA (ver párrafo siguiente) en que se ha desarrollado un ensayo de este tipo.

Figura 20.50.




Figura 20.51. Placa para ELISA

A pesar de ello, los EIA’s que utilizan marcajes con sustratos quimioluminiscentes o

fluorescentes son aún más sencillas que los que utilizan la fotometría.

Una técnica de enzimoinmunoanálisis heterogéneo que se utiliza ampliamente en

los análisis clínicos es el ELISA (enzyme-linked inmunoassay). Por ejemplo, es muy

usado el formato de microplaca de 96 pocillos. El fondo de la placa está recubierto de

una fase sólida que contiene el primer anticuerpo (Ac). Una alícuota exactamente

medida de la muestra o el calibrador que contiene el antígeno se añade sobre la placa,

uniéndose al antícuerpo.

Después de un lavado, se añade un segundo anticuerpo “marcado con una enzima” que

se une al antígeno, de modo que éste queda embutido en un “sándwich”: Ac 1º - Ag –

Ac 2º - enzima.

Se efectúa un segundo lavado entonces para eliminar el exceso de “Ac 2º - enzima”. Se

añade entonces el sustrato enzimático y se desarrolla la reacción llevada a cabo por la

enzima, cuantificándose por el producto formado (por ejemplo, coloreado), la cantidad

de antígeno presente en la muestra.

Figura 20.52.




Fluoroinmunoensayo.

Electroquimioluminiscencia.

9. Biología molecular

La mayoría de las técnicas en biología

molecular se basan en la capacidad que tienen los ácidos nucleicos de reconocer

una secuencia de bases nitrogenadas específica, denominada complementaria,

mediante el llamado “apareamiento de bases”, que da lugar a la doble hélice de

ADN.




De forma análoga a los anticuerpos, los ácidos nucleicos pueden encontrar, entre toda una variedad

de moléculas, aquella que es complementaria a su propia secuencia, y unirse a ella. Este proceso,

llamado hibridación, es dependiente de la temperatura (Tm).

Para una determinada longitud de la molécula de ADN (se suele expresar en pares de bases, o pb), y

su composición (porcentaje de guanina y citosina presentes, o porcentaje G+C) se puede calcular a

que temperatura hibridará con su cadena complementaria. Para poder trabajar con el ADN es

necesario que esté fragmentada, esto se consigue de forma automática durante el proceso de

extracción, o se pueden utilizar enzimas de restricción, que cortan una cadena de ADN por una

secuencia específica. Así obtendremos siempre los mismos fragmentos de ADN cuando usemos las

mismas enzimas de restricción.

Los ácidos nucleicos se pueden detectar de varias formas, por ejemplo, utilizando en su síntesis

bases nitrogenadas unidas a moléculas fluorescentes. La forma más habitual es la tinción con

bromuro de etidio, que es una molécula fluorescente con la capacidad de intercalarse en las

moléculas de ácidos nucleicos. De esta forma se pueden teñir los geles de agarosa, o el propio ácido

nucleico antes de una electroforesis, y así se pueden visualizar, bajo luz ultravioleta, las bandas de

ADN en el gel.

9.1.Técnicas de extracción de ácidos nucleicos.

Tradicionalmente se han utilizado técnicas de centrifugación combinadas con precipitación por

variación de la fuerza iónica del medio para separar el contenido celular de los ácidos nucleicos.

Actualmente se utilizan más la cromatografía de afinidad, con la que se obtiene suficiente cantidad

de ADN o ARN para utilizarlo con las técnicas más sensibles (PCR). Existen kits comerciales que dan

excelentes resultados a un bajo coste, incluyendo estaciones robotizadas que trabajan con placas




microtiter, y permiten realizar extracciones de ácidos nucleicos a gran cantidad de muestras de una

sola vez.

Un caso especial es la extracción de ARN mensajero (ARNm), en el caso de los eucariotas, este

ARN siempre acaba con una repetición del nucleótido adenina (llamada cola de poliA), que se puede

utilizar para el proceso de extracción, realizando una cromatografía de afinidad contra un nucleótido

poliT que retendrá los ARNm y los separará del resto de ácidos nucleicos.

9.2.Southern blot.

Figura 20.53. Southern blot

Así denominado por el apellido de la persona que lo describió por primera vez, es una técnica que permite localizar una

secuencia en el ADN total de un organismo.




Para ello el ADN total se somete a una electroforesis en gel de agarosa (imagen 1 de la figura

20.42.), que en este caso sí es una electroforesis restrictiva, ya que las moléculas son tan grandes

que encuentran impedimento al migrar por estos geles.

Tras la electroforesis (imagen 2 de la figura 20.42.), el ADN se transfiere (imagen 3 de la figura

20.42.), por capilaridad o mediante una corriente eléctrica, a otro soporte, una membrana de

nitrocelulosa (imagen 4 de la figura 20.42.), donde queda fijada.

Por otro lado, se sintetiza una “sonda” (imagen 5 de la figura 20.42.), una secuencia de ADN marcado,

generalmente con un isótopo radiactivo (imagen 6 de la figura 20.42.), complementaria a la secuencia

que queremos encontrar, habitualmente se utilizan secuencias largas, de al menos 200 pb.

En estas secuencias largas el contenido en G+C viene a ser el 50%, por lo que la Tm sólo depende

del tamaño en pbs.

El ADN fijado a la membrana y la sonda se “desnaturalizan”, es decir, se separan las dos cadenas

que los forman, se ponen en contacto, y se hibrida (imagen 7 de la figura 20.42.), si en el ADN existe

una secuencia complementaria a la de nuestra sonda se podrá detectar por auto radiografía una

banda de ADN marcado (imagen 8 de la figura 20.42.).

Desde la aparición de la PCR esta técnica esta prácticamente abandonada.

9.3. Northern blot.

El proceso es el mismo al del Southern

blot, pero en este caso el ácido nucleico

que se quiere localizar es un ARN.




Estos estudios permiten conocer si un gen se está expresando en un determinado momento, o si su

expresión varía por alguna razón.

La intensidad de la radiactividad detectada permite, de forma semicuantitativa, establecer estas

distinciones.

Sigue siendo una técnica muy utilizada, ya que es barata y muy sensible.

9.4. PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha revolucionado la biología molecular, permitiendo de

forma barata y rápida realizar una gran cantidad de estudios.

En ella se utiliza un “primer”, o cebador, que es una secuencia corta de ADN (unos veinte nucleótidos)

complementaria a la de un fragmento genómico.

En un tubo de ensayo, siguiente figura, se ponen en contacto el primer y el ADN, y se añade ADN

polimerasa, una enzima capaz de sintetizar una cadena complementaria a partir de un molde, siempre

que exista un fragmento de doble hélice.




Figura 20.54.

La PCR es la repetición de “n” veces la siguiente reacción de síntesis::

se desnaturaliza el ADN al aumentar la temperatura (imagen 1 de la figura 44), al bajar ésta,

los fragmentos de idéntica secuencia hibridan,

y el primero se une a su secuencia complementaria, formando una molécula con una parte

en doble hélice,

y una parte en cadena sencilla (imagen 2 de la figura 20.44.),

la ADN polimerasa sintetiza la parte de cadena complementaria que falta, fase de elongación

(imagen 3 de la figura 20.44.),

aumentando al doble el número de copias del gen. Si se repite el proceso, el número de

copias crece de forma exponencial.




Al final existe un gran número de copias de un fragmento de ADN:

si se ha introducido un nucleótido marcado radiactivamente obtendremos una sonda para

realizar un southern o northern blot,

o podremos utilizar el producto para secuenciar un gen,

o sometido a electroforesis reconoceremos la presencia de un ADN específico. Por ejemplo

la presencia de una bacteria infecciosa, si utilizamos varios primers distintos podremos

amplificar varias secuencias, estableciendo los marcadores genéticos que identifican a un

individuo, etc.

El aparato necesario es un termociclador, en el que se especifican:

las temperaturas de desnaturalización, hibridación y elongación,

su duración y el número de repeticiones.

9.5. RT-PCR.

También podemos amplificar un ARN si

primero lo transformamos en ADN.

Existen enzimas que permiten este paso, las retrotranscriptasas, y que sintetizan una cadena de ADN

complementaria al ARN. Esta reacción, llamada retrotranscripción, de ahí el nombre de RT-PCR.

No necesita primers y permite trabajar con la reacción de PCR a partir de ARN. La molécula que se

genera se denomina ADN complementario o ADNc (ya que su secuencia es complementaria a la de

la cadena que se transcribe).




Una aplicación especial es la denominada RT-PCR cuantitativa, utilizando un número de copias

conocido de un fragmento de ADN se puede realizar una curva de calibración, comparando el

resultado de nuestra RT-PCR con la curva obtendremos el número de moléculas de ARN presentes

inicialmente en la muestra.

9.6. Ensayos de protección de nucleasas.

Se utilizan como alternativa a los northern blot y a la RT-PCR para cuantificar un

ARNm.

En estos ensayos se hibridan una o varias sondas marcadas con la totalidad del ARN celular. Las

dobles hélices así formadas impiden que las nucleasas, añadidas posteriormente a la hibridación,

degraden los ARNs de interés, pero todos los demás desaparecerán.

Posteriormente se realiza una electroforesis y una autoradiografía, detectándose las cantidades

relativas de los ARN de interés.

Esta técnica tiene la ventaja de ser muy sensible, más que la RT-PCR y muy específica, más que el

northern blot.

9.7. Secuenciación.

Actualmente es una técnica bastante

económica y rápida que permite establecer la secuencia de ADN de un organismo, o la

búsqueda de mutaciones.




Se realiza una amplificación por PCR del fragmento que queremos secuenciar (es necesaria una

información previa de la secuencia del gen, o se pueden utilizar primers genéricos), en el tubo de

reacción se incluye una pequeña cantidad de los cuatro nucleótidos marcados con una molécula

fluorescente distinta cada uno, y que impide que progrese la ADN polimerasa.

Al acabar la PCR se realiza una electroforesis capilar, y un láser se desplaza por las moléculas

separadas, identificando el nucleótido final de la cadena. De esta forma que podemos “leer” la

secuencia de ADN.

Actualmente se pueden secuenciar unos 250 pares de bases en una sola reacción.

El siguiente primer para seguir secuenciando se deduce de la secuencia leída, y así se va

progresando por la cadena de ADN.

Otra forma de secuenciar es crear primers genéricos (muchos genes contienen al principio

secuencias similares) que amplifiquen varias zonas a la vez, con esta información se diseñan nuevos

primers, etc. Al final sólo hay que encontrar las secuencias idénticas y yuxtaponerlas.

La secuenciación se puede utilizar para el diagnóstico de enfermedades congénitas, si conocemos

que una secuencia (genotipo), da lugar a una determinada enfermedad; para estudios poblacionales

por la presencia de determinadas secuencias específicas de una población; para estudios evolutivos,

por la similitud en la secuencia de genes homólogos, etc.

9.8. Estudios de restricción.

Como vimos al principio, las enzimas de restricción reconocen secuencias de ADN, produciendo un

corte en la cadena.




Esta propiedad se puede utilizar para localizar mutaciones en genes, siempre que estas eliminen o

creen dianas para las enzimas de restricción.

9.9. DNA Arrays.

Son colecciones de ADN sobre soportes sólidos de distintos tipos que permiten

comprobar mediante un solo experimento los genes que se están expresando en un

determinado momento (por ejemplo oncogenes), o localizar secuencias

mutantes generadores de enfermedades,

etc.

Existen varios tipos según su tamaño:

los macroarrays:

cuyo soporte suelen ser membranas plásticas,

permiten a simple vista comprobar el experimento,

los microarrays;

cuyo soporte son portas de cristal,

requieren equipamiento especial para su lectura.

La técnica es bastante sencilla, se realiza una retrotranscripción del ARNm utilizando nucleotidos

marcados, y el ADNc obtenido se hibrida con el ADN array.




Así localizamos los genes que se están expresando, así como su cantidad relativa (dado que la

reacción de retrotranscripción no amplifica el ADN cuantas más moléculas de ARN de un gen existan,

más fuerte será la señal que producen en el array).

Si se tiene en cuenta que un microarray puede contener unas 10.000 secuencias, la cantidad de

información adquirida puede ser enorme.

Para los arrays más completos son necesarios equipos muy costosos, tanto para generarlos, como

para su lectura, aunque existen macroarrays comerciales bastante asequibles que suelen estar

“dedicados” a un estudio concreto, oncogenes, interleuquinas y citoquinas, apoptosis, etc.

9.10.Terapia génica.

Bajo este nombre se agrupa un conjunto

de técnicas cuyo objetivo es introducir un ADN de otro organismo en el genoma de

un organismo.

En las células procariotas basta con generar un plásmido que porte el gen de interés para conseguir

que éste se exprese, así se han generado proteínas recombinantes, sobre todo hormonas, para su

comercialización.

Se denominan recombinantes por motivos históricos, los primeros plásmidos con genes foráneos

se generaron mediante el proceso de recombinación. Existen secuencias de ADN que tienen la

propiedad de unir otra cadena de ADN, con las enzimas adecuadas se produce un corte en esta

secuencia y se inserta la otra cadena. La recombinación se produce de forma natural en la división

meiotica de los eucariotas.




Actualmente se pueden producir ADNs “recombinantes” sin necesidad de recombinación. En las

células eucariotas, o en embriones animales, se pueden introducir genes foráneos de distintas formas,

a través de:

retrovirus,

adenovirus,

transformación química o eléctrica, etc.

El objetivo de estas técnicas es expresar un gen que permita tratar una enfermedad, que confiera

una característica deseada (resistencia a las heladas en las plantas), producción de proteínas, etc.

La técnica más actual de terapia génica se conoce como silenciación génica, y se basa en una

característica de algunos ARNs, la interferencia. Existen moléculas de ARN que pueden bloquear la

producción de una proteína mediante la eliminación del ARN mensajero del gen que la codifica (de ahí

el nombre de interferencia), este fenómeno parece estar implicado en la lucha contra las infecciones

víricas, y en la regulación del desarrollo embrionario.

En su vertiente terapéutica se utiliza un ARN diseñado para bloquear un gen determinado, de forma

que aunque un oncogen, por ejemplo, pueda ser muy activo, la proteína efectora nunca se sintetizará.

El fenómeno está bien documentado en plantas, insectos y platelmintos, y actualmente se está

intentando ampliar su acción a los mamíferos.




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Lecturas recomendadas del tema “Variabilidad de los resultados obtenidos por el laboratorio”.

1. NEWHOUSE I J , JOHNSON K P, MONTELPARE W J and MCAULIFFE J

Variability within individuals of plasma ionic magnesium Concentrations.

Abstract

Background: With the invention of the ion-selective electrode (ISE), ionic magnesium (iMg) is a

common blood assay. This could be advantageous, as iMg is the biologically active form of Mg.

There is some evidence that iMg has considerable within subject variability.

Results: Individual ranges averaged .08 mmol/L (range .05 to .14). Coefficients of variation (CV)




ranged from 3% to 7% (mean 4%) while analytical variation was determined to be 2.3%. Biological

variability thus accounts for almost half of the variability, which is clinically significant, as 9 of the13

subjects recorded at least one value below a reference range of .46 – .60 mmol/L. A significant

within-day variation (p < .001) was noted, with differences between 7:00 and 10:00 as well as

10:00 and 22:00. Between day variations were not significant (p = .56).

Conclusions: A plausible explanation of this data is that iMg has a circadian rhythm. Thus, cautious

interpretation of single iMg values is warranted until future research determines the nature of iMg

variability.

2. HEGSTED D. M. AND NICOLOSIt R J.

Individual variation in serum cholesterol levels

Abstrac

The intraindividual variances in serum/plasma cholesterol levels from a variety of sources have

been examined. It is apparent that these are very substantial with mean coefficients of variation

usually between 5% and 10%, even when the diet is controlled in metabolic studies. Some

subjects show extreme variability from one blood sample to the next. Thus, it is very difficult to

assess the degree of risk of individuals according to the guidelines provided by the Consensus.

Conference on lowering blood cholesterol levels to prevent heart disease, and many individuals

will be misclassified unless particular attention is paid to this problem.

3. WIDJAJA A, MORRIS R.J., LEVY J C., FRAYN K N., MANLEY S. E., and TURNER R. C.

Within- and Between-Subject Variation in Commonly Measured Anthropometric and Biochemical

Variables.

Background:

The biological variation of some commonly assessed metabolic variables in healthy subjects

has not been studied extensively. The aim of the study was to assess, in 12 healthy subjects (6

male and 6 female; mean (SD) age; 22.7 (1.5) years) following an overnight fast, the day-to-day




variation of body fat (impedance method), triglycerides, nonesterified fatty acid (NEFAs), glycerol,

3-hydroxybutyrate (3-OHB), lactate, glucose, insulin (RIA), C-peptide, and glucagon on 12

consecutive days.

Methods: Between- and within-subject coefficients of variation (CVG and CVW) were estimated

using a random effects analysis of variance, and assay variation was subtracted to give the

coefficient of within-subject biological variation (CVI). Individuality indices were calculated as

CVW/CVG.

Results: The overall means, CVI, and individuality indices were as follows: for body fat, 24.2%,

10%, and 0.3; for triglycerides, 0.61 mmol/L, 21%, and 1.1; for NEFAs, 376 mmol/L, 45%, and 1.4;

for glycerol, 48 mmol/L, 36%, and 0.8; for 3-OHB, 43 mmol/L, 61%, and 1.5; for lactate, 0.88

mmol/L, 31%, and 1.1; for glucose, 4.9 mmol/L, 4.8%, and 0.7; for insulin, 52 pmol/L, 26%, and

1.0; for C-peptide, 0.39 nmol/L, 24%, and 0.9; and for glucagon, 53 ng/L, 19%, and 0.8.

Conclusions: The data presented here are necessary for the evaluation of several important

metabolic variables in individual and group studies. The biological variation of some metabolites

makes it difficult to characterize the status of healthy subjects with a single measurement.

4. GARDE A. H., HANSEN Å. M., SKOVGAARD L. T. , and CHRISTENSEN J. M.

Seasonal and Biological Variation of Blood Concentrations of Total Cholesterol,

Dehydroepiandrosterone Sulfate, Hemoglobin A1c, IgA, Prolactin, and Free Testosterone in

Healthy Women.

Background:

Concentrations of physiological response variables fluctuate over time. The present study

describes within-day and seasonal fluctuations for total cholesterol, dehydroepiandrosterone

sulfate (DHEA-S), hemoglobin A1c (HbA1c), IgA, prolactin, and free testosterone in blood, and

estimates within- (CVi) and between-subject (CVg) CVs for healthy women. In addition, the index

of individuality, prediction intervals, and power calculations were derived.




Methods: A total of 21 healthy female subjects participated in the study. Using a random effects

analysis of variance, we estimated CVg and total within-subject variation (CVti), i.e., the combined

within-subject and analytical variation, from logarithmically transformed data. Analytical variation

was subtracted from CVti to give CVi. CVi was estimated from samples taken monthly during 1

year (CViy), weekly during 1 month (CVim), and six times within 1 day (CVid).

Results: A cyclic seasonal variation was demonstrated for total cholesterol, DHEA-S, HbA1c,

prolactin, and free testosterone. Within-day variation was shown for prolactin and free

testosterone. The overall mean values for the group and the variability (CViy and CVg) were: 5.1

mmol/L, 5.5%, and 5.0% for total cholesterol; 6.6 mmol/L, 7.1%, and 21% for DHEA-S; 4.3%,

2.6%, and 3.3% for HbA1c/hemoglobintotal; 2.1 g/L, 5.9%, and 13% for IgA; 136 mIU/L, 23%, and

27% for prolactin; and 5.4 pmol/L, 21%, and 29% for free testosterone.

Conclusions: Collecting samples at specific hours of the day or times of the year may reduce high

biological variation. Alternatively, the number of individuals may be increased and a paired study

design chosen to obtain adequate statistical power.

5. LEDUE T. B. and RIFAI N.

Preanalytic and Analytic Sources of Variations in C-reactive Protein Measurement: Implications for

Cardiovascular Disease Risk Assessment.

Background:

C-reactive protein (CRP) is a widely recognized indicator of inflammation and is known to play an

important role in atherogenesis. Recent prospective studies have demonstrated that increased

CRP concentrations within the reference interval are a strong predictor of myocardial infarction,

stroke, sudden cardiac death, and peripheral vascular disease in apparently healthy adults. On the

basis of available evidence, the American Heart Association and the CDC have issued guidelines

for the utility of CRP in the primary prevention of coronary heart disease and in patients with stable

coronary disease or acute coronary syndromes. Nevertheless, there remains considerable work to

optimize the utility of this marker for risk assessment.




Issues: Most traditional CRP tests designed to monitor acute and chronic inflammation have

inadequate sensitivity for risk stratification of coronary disease. Thus, manufacturers have had to

develop tests with higher sensitivity. Because an individual’s CRP concentration will be interpreted

according to fixed cut-points, issues related to the preanalytic and analytic components of CRP

measurement must be considered and standardized where possible to avoid potential

misclassification of cardiovascular risk.

Conclusions: Efforts to define performance criteria for high-sensitivity CRP applications coupled

with growing awareness of the physiologic aspects of CRP most likely will lead to refinements in

standardization, improved performance in quality-assessment schemes, and enhanced risk

prediction.

7. VOORTMAN A., MELSE-BOONSTRA A., SCHULZ J. M., BUREMA J., KATAN M. B., and

VERHOEF P.

Optimal Time Interval between Repeated Blood Sampling for Measurements of Total

Homocysteine in Healthy Individuals.

8. BONINI P., PLEBANI M., CERIOTTI F., and RUBBOLI F.

Errors in Laboratory Medicine.

Background:

The problem of medical errors has recently received a great deal of attention, which will

probably increase. In this minireview, we focus on this issue in the fields of laboratory medicine

and blood transfusion.

Methods: We conducted several MEDLINE queries and searched the literature by hand. Searches

were limited to the last 8 years to identify results that were not biased by obsolete technology. In

addition, data on the frequency and type of preanalytical errors in our institution were collected.

Results: Our search revealed large heterogeneity in study designs and quality on this topic as well

as




relatively few available data and the lack of a shared definition of “laboratory error” (also referred to

as “blunder”, “mistake”, “problem”, or “defect”). Despite these limitations, there was considerable

concordance on the distribution of errors throughout the laboratory working process: most

occurred in the pre- or postanalytical phases, whereas a minority (13–32% according to the

studies) occurred in the analytical portion. The reported frequency of errors was related to how

they were identified: when a careful process analysis was performed, substantially more errors

were discovered than when studies relied on complaints or report of near accidents.

Conclusions: The large heterogeneity of literature on laboratory errors together with the prevalence

of evidence that most errors occur in the preanalytical phase suggest the implementation of a

more rigorous methodology for error detection and classification and the adoption of proper

technologies for error reduction. Clinical audits should be used as a tool to detect errors caused by

organizational problems outside the laboratory.

Lecturas recomendadas generales:

1. LASNE F., CREPIN N, ASHENDEN M, ALDRAN M and de CEAURRIZ J.

Detecttion of Hemoglobin.Based Oxigen Carriers in Human Serum for Doping Análisis: Screening

by Electrophoresis. Clinical Chemistry; 2004; 50,410-415.

2. D’AMOUR P., BROSSARD J-H, ROUSSEAO L., ROY L R.

Amino-terminal form of parathyroid hormone (PTH) with immunologic similarities to hPTH (1-84) Is

overproduced in primary and secondary Hyperparatiroidism.

Clinical Chemistry; 2003; 49:2037-2044

3. WRANG J., WEN J., LI J.; YIN J.

Assessment of immunoreactive synthetic peptides from the structural proteins of severe acute

respiratory syndrome coronavirus. Clinical Chemistry; 2003; 49: 1989-1996




4. FRENCH D. C., SALTZQUEBER, HICKS D., COWPER A, and HOLT D. W.

HPLC Assay with Ultraviolet Detection for Therapeutic Drug Monitoring of Sirolimus, Clinical

Chemistry 2001;47: 1316-1319

5. INABA M; NAKATSUBA K, IMANISHI Y., WARANABE M.

Technical and Clinical Characterization of the Bio-PTH (1-84) Immunochemiluminometric assay

and comparison with a second-generation assay for patrathyroid hormone. Clinical Chemistry;

2004; 50:385-390

6. COOPER A.J, CONWAY M, HUTSON SM.

A continuous 96-well plate spectrophotometric assay for branched-chain amino acid

aminotransferases. Anal Biochem. 2002 ;308(1):100-5.

A new, continuous 96-well plate spectrophotometric assay for the branched-chain amino acid

aminotransferases is described. Transamination of L-leucine with alpha-ketoglutarate results in

formation of alpha-ketoisocaproate, which is reductively aminated back to L-leucine by leucine

dehydrogenase in the presence of ammonia and NADH. The disappearance of absorbance at 340

nm due to NADH oxidation is measured continuously. The specific activities obtained by this

procedure for the highly purified human mitochondrial and cytosolic isoforms of BCAT compare

favorably with those obtained by a commonly used radiochemical procedure, which measures

transamination between alpha-ketoiso[1-14C]valerate and L-isoleucine. Due to the presence of

glutamate dehydrogenase substrates (alpha-ketoglutarate, ammonia, and NADH) and L-leucine

(an activator of glutamate dehydrogenase) in the standard assay mixture, interference with the

measurement of BCAT activity in tissue homogenates by glutamate dehydrogenase is observed.

However, by limiting the amount of ammonia and including the inhibitor GTP in the assay mixture,

the interference from the glutamate dehydrogenase reaction is minimized. By comparing the rate

of loss of absorbance at 340 nm in the modified spectrophotometric assay mixture containing

leucine dehydrogenase to that obtained in the modified spectrophotometric assay mixture lacking




leucine dehydrogenase, it is possible to measure BCAT activity in microliter amounts of rat tissue

homogenates. The specific activities of BCAT in homogenates of selected rat tissues obtained by

this method are comparable to those obtained previously by the radiochemical procedure.

7. LIN H.S, JENNER A.M., ONG C., HUANG SH, WHITEMAN M, ALLIWELL B.

High-throughput and sensitive methodology for the quantitation of urinary 8-hydroxy-2’-

Deoxyguanosine: measurement with gas chromatography-mass spectrometry after single solid

phase extraction.

8. Biochemical Journal: BJ2004/0004

Summary 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) is a widely-used biomarker for the

measurement of endogenous oxidative DNA damage. A sensitive method for the quantitation of

8OHdG in urine by single solid phase extraction and gas chromatographymass spectrometry (GC-

MS) using selective ion monitoring is described. After solid phase extraction, samples are freeze

dried, derivatised by trimethylsilylation, and analyzed by GCMS.

The urinary 8OHdG was quantified using heavy isotope dilution with 18O-8OHdG. The recovery of

8OHdG in the solid phase extraction ranged from 70-80% over a wide range of urinary 8OHdG

levels. Using 1 mL urine, the limit of quantification was below 2.5 nM (2.5 pmol/mL) and the

calibration curve was linear in the range of 2.5 to 200 nM. This method was applied to measure

8OHdG in urine samples from twelve healthy subjects. The intra-day and inter-day variations were

less than 9%. Urinary 8OHdG levels in spot urine samples from four healthy subjects were also

measured over 1 week, and again variation was small.

The presence of hydrogen peroxide in urine did not cause artefactual formation of 8OHdG. As this

assay is simple, rapid, sensitive, and reproducible, it seems suitable to be used as a routine

methodology for the measurement of urinary excretion of 8OHdG in large population studies.




9. LOZINSKY EM, MARTINA LV, SHAMES AI, UZLANER N, MASARWA A, LIKHTENSHTEIN

GI,

Detection of nitric oxide from pig trachea by a fluorescence method. Analytical Biochemistry 326

(2004) 139–145.

A nitronyl nitroxide radical covalently linked to an organic fluorophore, pyrene, was used to detect

nitric oxide (NO) from freshly excited tissues. This approach is based on the phenomenon of the

intramolecular fluorescence quenching of the fluorophore fragment by the nitroxide. The pyrene-

nitronyl (PN) reacts with NO to yield a pyrene-imino nitroxide radical (PI) and NO(2). Conversion of

PN to PI is accompanied by changes in the electron paramagnetic resonance (EPR) spectrum

from a five-line pattern (two equivalent N nuclei) into a seven-line pattern (two nonequivalent N

nuclei). The transformation of the EPR signal is accompanied by an increase in the fluorescence

intensity since the imino nitroxide radical is a weaker quencher than the nitronyl one. The results

indicate that the fluorescence measurements enable detection of nanomolar concentrations of NO

compared to a sensitivity threshold of only several micromolar for the EPR technique. The method

was applied to the determination of NO and [Formula: see text] -nitroso compounds in tissue from

pig trachea epithelia. The measured basal flux of [Formula: see text] -nitroso compounds obtained

from the tissues was about 1.2nmol/gxmin, and NO-synthase stimulated by extracellular

adenosine [Formula: see text] -triphosphate produced NO flux of 0.9nmol/gxmin.

10. BD™ Luciferase. Assay and Detection System

11. TSUKADA Y, YASUKAKE M, JIA D, KUSAMA Y, KISHIDA H, TAKANO T, TSUKADA S.

Real-time measurement of nitric oxide by luminol-hydrogen peroxide reaction in crystalloid

perfused rat heart. Life Sciences 72 (2003) 989–1000

The objective of this study was to develop an assay system that allows continuous monitoring of

nitric oxide (NO) released from crystalloid perfused hearts. We utilized chemiluminescence

reaction between NO and luminol-H(2)O(2) to quantify the NO level in coronary effluent. Isolated




rat hearts were subjected to ordinary Langendorff's perfusion, and the right ventricle was

cannulated to sample coronary effluent. After equilibration, the coronary flow rate was set constant

and the hearts were paced at 300 bpm. Coronary effluent was continuously sampled and mixed

with the chemiluminescent probe containing 0.018 mmol/l luminol plus 10 mmol/l H(2)O(2).

Chemiluminescence from the mixture of coronary effluent and the probe was continuously

measured. NO concentration was calibrated by various concentrations (0.5-400 pmol/l) of standard

NO solution. The lower detection limit of NO was 1 pmol/l. Basal NO release from isolated

perfused rat heart was 0.41 +/- 0.17 pmol/min/g of heart weight, and that was significantly

suppressed by 0.1 mmol/l of L-NAME to 0.18 +/- 0.10 pmol/min/g of heart weight (n = 7).

Application of 0.1 and 0.3 micromol/l acetylcholine increased NO level in the coronary effluent, in a

concentration-dependent manner, from 6.6 +/- 1.7 in a baseline condition to 16.3 +/- 7.4 and 30.3

+/- 16.1 pmol/l at each peak, respectively. Thrombin at 1 and 10 U/ml also increased NO level

from 17.6 +/- 4.3 in control to 35.5 +/- 10.4 and 48.7 +/- 8.7 pmol/l at each peak, respectively (n =

7). Thus, this assay system is applicable to the continuous real-time measurement of NO released

from crystalloid perfused hearts, and it may be useful for the study of physiological or

pathophysiological role of NO in coronary circulation.

12. AGUILERA B, VAN DER VLUGT KG, MARIETTE T. J., HELMOND M, OUT JM, DONKER-

KOOPMAN W E,

Transglycosidase Activity of Chitotriosidase. M , J Biol Chem 2003;278: 40911–40916.

Chitotriosidase is a chitinase that is massively expressed by lipid-laden tissue macrophages in

man. Its enzymatic activity is markedly elevated in serum of patients suffering from lysosomal lipid

storage disorders, sarcoidosis, thalassemia, and visceral Leishmaniasis. Monitoring of serum

chitotriosidase activity in Gaucher disease patients during progression and therapeutic correction

of their disease is useful to obtain insight in changes in body burden on pathological macrophages.

However, accurate quantification of chitotriosidase levels by enzyme assay is complicated by

apparent substrate inhibition, which prohibits the use of saturating substrate concentrations. We




have therefore studied the catalytic features of chitotriosidase in more detail. It is demonstrated

that the inhibition of enzyme activity at excess substrate concentration can be fully explained by

transglycosylation of substrate molecules. The potential physiological consequences of the ability

of chitotriosidase to hydrolyze as well as transglycosylate are discussed. The novel insight in

transglycosidase activity of chitotriosidase has led to the design of a new substrate molecule, 4-

methylumbelliferyl-(4-deoxy)chitobiose. With this substrate, which is no acceptor for

transglycosylation, chitotriosidase shows normal Michaelis-Menten kinetics, resulting in major

improvements in sensitivity and reproducibility of enzymatic activity measurements. The novel

convenient chitotriosidase enzyme assay should facilitate the accurate monitoring of Gaucher

disease patients receiving costly enzyme replacement therapy.

13. LOLEKHA PH, SRISAWASDE P, JEARANAIKOON P, WETPRASIT N, SRIWANTHANA B,

KROLL MH.

Performance of four sources of cholesterol oxidase for serum cholesterol determination by the

enzymatic endpoint method. Clinica Chimica Acta 339 (2004) 135–145

Background:

Cholesterol oxidase is used for the determination of serum cholesterol. It can be derived from

Streptomyces, Pseudomonas fluorescens, Cellulomonas, and Brevibacterium. This study

compared the performance characteristics of four enzymes in the endpoint cholesterol

determination. METHODS: Using the Mega analyzer, we studied assay optimization, linearity,

precision, recovery, interference, stability, and compared 110 patient samples. RESULTS: The

linearity for the four enzymes was up to 13.0 mmol/l at the optimal enzyme activity. The average

within-run CVs ranged from 1.6% to 1.9% and between-day ranged from 2.8% to 3.0%, within the

NCEP analytical criteria. The analytical recoveries obtained from four reagents ( approximately

96.5%) were excellent. The assays using these enzyme sources compared favorably with the

commercial method and appeared accurate near the clinical decision cut-points. Hemoglobin

concentration at 1.9 g/l interfered with the P. fluorescens cholesterol oxidase. Bilirubin caused a




negative interference while lipemia generated a positive interference with all enzyme sources.

Reagents were stable up to 6 weeks. CONCLUSIONS: Streptomyces, Cellulomonas, and

Brevibacterium were essentially analytically equivalent. Streptomyces and Cellulomonas

cholesterol oxidase are one-quarter as expensive Brevibacterium. Cellulomonas is a new source

of cholesterol oxidase for determining serum cholesterol by the endpoint method.

14. TWISTY CR, WINSON MK, ROWLAND JJ, and KELLA DB.

Single-nucleotide polymorphism detection using nanomolar

nucleotides and single-molecule Fluorescence. Analytical Biochemistry 327 (2004) 35–44

We have exploited three methods for discriminating single-nucleotide polymorphisms (SNPs) by

detecting the incorporation or otherwise of labeled dideoxy nucleotides at the end of a primer chain

using single-molecule fluorescence detection methods. Good discrimination of incorporated vs free

nucleotide may be obtained in a homogeneous assay (without washing steps) via confocal

fluorescence correlation spectroscopy or by polarization anisotropy obtained from confocal

fluorescence intensity distribution analysis. Moreover, the ratio of the fluorescence intensities on

each polarization channel may be used directly to discriminate the nucleotides incorporated. Each

measurement took just a few seconds and was done in microliter volumes with nanomolar

concentrations of labeled nucleotides. Since the confocal volumes interrogated are approximately

1fL and the reaction volume could easily be lowered to nanoliters, the possibility of SNP analysis

with attomoles of reagents opens up a route to very rapid and inexpensive SNP detection. The

method was applied with success to the detections of SNPs that are known to occur in the BRCA1

and CFTR genes.

16. PAGLIARULO V, GEORGE B, BEIL SJ, GROSHEN S, LAIRD PW, CAI J, WILLEY J, COTE

RJ, DATAR RH.

Sensitivity and reproducibility of standardized-competitive RT-PCR for transcript quantification and

its comparison with real time RT-PCR.




Mol Cancer. 2004 Jan 23;3(1):5.

Backgroud:

Probe based detection assays form the mainstay of transcript quantification. Problems with these

assays include varying hybridization efficiencies of the probes used for transcript quantification and

the expense involved. We examined the ability of a standardized competitive RT-PCR (StaRT

PCR) assay to quantify transcripts of 4 cell cycle associated genes (RB, E2F1, CDKN2A and

PCNA) in two cell lines (T24 & LD419) and compared its efficacy with the established Taqman real

time quantitative RT-PCR assay. We also assessed the sensitivity, reproducibility and consistency

of StaRT PCR. StaRT PCR assay is based on the incorporation of competitive templates (CT) in

precisely standardized quantities along with the native template (NT) in a PCR reaction. This

enables transcript quantification by comparing the NT and CT band intensities at the end of the

PCR amplification. The CT serves as an ideal internal control. The transcript numbers are

expressed as copies per million transcripts of a control gene such as beta-actin (ACTB).

RESULTS: The NT and CT were amplified at remarkably similar rates throughout the StaRT PCR

amplification cycles, and the coefficient of variation was least (<3.8%) when the NT/CT ratio was

kept as close to 1:1 as possible. The variability between the rates of amplification in different tubes

subjected to the same StaRT PCR reaction was very low and within the range of experimental

noise. Further, StaRT PCR was sensitive enough to detect variations as low as 10% in

endogenous actin transcript quantity (p < 0.01 by the paired student's t-test). StaRT PCR

correlated well with Taqman real time RT-PCR assay in terms of transcript quantification efficacy

(p < 0.01 for all 4 genes by the Spearman Rank correlation method) and the ability to discriminate

between cell types and confluence patterns. CONCLUSION: StaRT PCR is thus a reliable and

sensitive technique that can be applied to medium-high throughput quantitative transcript

measurement. Further, it correlates well with Taqman real time PCR in terms of quantitative and

discriminatory ability. This label-free, inexpensive technique may provide the ability to generate

prognostically important molecular signatures unique to individual tumors and may enable

identification of novel therapeutic targets.


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