MTODOS DE ESTUDIO EN

BIOLOGA CELULAR

Profesora Carla Maturana Valdivia

BIOLOGA CELULAR - CLASE 05

Identifica mtodos de estudio de las

clulas y sus fundamentos.

Microscopia ptica: Partes de un

microscopio ptico, sistema ptico y

mecnico.

Microscopa electrnica de transmisin

y barrido.

Cultivo celular y/o de tejidos.

Centrifugacin fraccionada y en

gradiente.

Electroforesis de DNA y protenas.

Microscopio

Instrumento que permite la observacin de objetos, organismos,

tejidos o clulas de un tamao inferior al que se puede reconocer a

simple vista por el ojo humano.

Tipos de microscopios

Microscopios pticos

De Campo Claro

De Campo Oscuro

De Contraste de Fases

De Interferencia

De Luz Polarizada

De Fluorescencia

Lser Confocal

Microscopio Electrnico

De Transmisin

De Barrido

Microscopio ptico

Instrumento que permite aumentar la imagen utilizando uno o ms

lentes.

Dos principios estn involucrados en el uso del microscopio:

la magnificacin (capacidad de aumentar el tamao de una

imagen) y la resolucin (capacidad de producir imgenes bien

definidas de puntos situados muy cerca uno del otro).

Se pueden utilizar aceites de alta viscosidad para aumentar el

ndice de refraccin (en comparacin con la refraccin del aire = 1) y mejor la resolucin de la imagen formada.

Ventajas:

Permite el estudio de microorganismos vivos.

Limitantes:

Poder de resolucin (debido a que existe un lmite de resolucin

correspondiente a 0,2 micrmetros.

Microscopio ptico: Simple y Compuesto

Microscopio de

Zaccarias y Hans

Jenssen (1595)

Aumento: 9x

Microscopio de van

Leeuwenhoek

(1668)

Aumento: 275x

Microscopio

de Hooke

(1665)

Aumento: 30x

Microscopio

de Gallileo Galilei

(1609)

Aumento: 8x

Giovanni Faber adoptado el trmino microscopio para describir la invencin de Galileo en (1625)

Componentes del Microscopio ptico

Partes del Microscopio ptico

Tubo

Revlver

Sistema ptico del microscopio

Sistema de Amplificacin

Lente ocular

Lentes objetivos

Sistema de Iluminacin

Fuente Luminosa

Condensador

Diafragma

Anillo Porta Filtro

Sistema mecnico del microscopio

Tubo o caon

Revlver

Columna o brazo

Pie

Platina

Tornillos de focalizacin:

Macromtrico

Micromtrico

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Campo Claro: la muestra se

observa ms oscura que el campo que la

rodea.

Microscopio de Campo Oscuro: se bloquea la

luz que no atraviesa por la muestra y solo

atraviesan los haces de luz refractados y

alcanzan al lente objetivo (La muestra aparece

iluminada en un fondo oscuro).

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Contraste de Fases: utiliza

las diferencias de densidad de las

estructuras celulares (diferente ndice de

reaccin). Las estructuras ms densas se

observan ms oscuras mientras que las

menos densas (densidad cercana al agua) se

observan ms claras.

Microscopio Diferencial de Contraste de

Interferencia de Nomarski (DIC): utiliza un

prisma refrigente que divide la luz en dos

rayos polarizados que interfieren entre s

proporcional una imagen tridimensional.

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Fluorescencia: se utilizan sustancias

fluorescentes llamadas fluorocromos para teir ciertas

estructuras subcelulares de inters. El microscopio posee una

lmpara que que emiten las radiaciones en el espectro UV de las longitudes de onda necesarias para que el compuesto

brille en la oscuridad (fluoresca).

_

Tipos de microscopios pticos

Microscopio Lser Confocal: Emplea un sistema de iluminacin con

rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un

punto de barrido muy poco profundo, iluminando un solo punto por

vez.

Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con

este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin.

Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible

tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro

del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. _

Microscopio electrnico

Microscopio que usa electrones para iluminar el objeto que se

desea observar y lo refleja en una pantalla fluorescente,

obtenindose imgenes ms amplificadas que en un microscopio

convencional.

Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual

debe mantenerse el vaco.

Ventajas:

La resolucin y el aumento son mayores.

Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente

pueden verse a travs del microscopio electrnico.

Limitaciones:

No se pueden observar microorganismos vivos.

Microscopio Electrnico de Transmisin

(MET)

Es un instrumento que aprovecha los fenmenos fsico-atmicos que se

producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona

con una muestra delgada convenientemente preparada (requiere que se

aumente el contraste utilizando metales pesados como el osmio).

Cuando los electrones colisionan con la muestra, en funcin de su grosor y

del tipo de tomos que la forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, es decir, hay una gradacin entre los electrones que la

atraviesan directamente y los que son totalmente desviados.

Se obtienen imgenes bidimensionales.

Se pueden observar detalles finos de estructuras subcelulares.

Componentes del Microscopio

electrnico de Transmisin

Ocular o lente electromagntica,

que aumenta la imagen.

Proyector o lente proyectora que

ampla la imagen.

Pantalla fluorescente, que recoge

la imagen para hacerla visible al

ojo humano.

Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones.

Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones.

Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz.

Microscopio Electrnico de Barrido

(MEB o SEM)

Su funcionamiento se basa en el recorrido de la muestra con un haz muy

concentrado de electrones.

Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la

aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los

secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico

situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pixel en la pantalla. A medida que el haz de electrones

barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.

No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo

con un SEM si no que puede colocarse en

el microscopio con muy pocos preparativos.

Produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie

del objeto.

Microscopio Electrnico de Barrido

(MEB o SEM)

Funcionamiento de los diferentes Microscopios

Cultivo celular

Conjunto de tcnicas de aislamiento y obtencin de clulas, con la

obtencin de poblaciones celulares in vitro manteniendo al mximo

sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.

Cultivo celular

Aplicaciones:

Estudios de Investigacin:

Comprender la fisiologa celular, toxicologa y

virologa.

Ingeniera de Tejidos:

Trasplantes

Injertos (piel, hueso, cartlagos, piel, etc)

Cultivo celular

Aplicaciones:

Produccin de compuestos qumicos de importancia:

Enzimas

Vacunas

Hormonas

Citogentica:

Estudios cromosmicos

Agronoma:

Transgnicos

Organismos genticamente modificados

Cultivo tisular

Cultivo de rganos:

mantenimiento de rganos o

parte de rganos in vitro

Cultivo de tejidos y explantes:

Mantenimiento de tejidos in vitro

Cultivo de clulas madres

Centrifugacin

Tcnica que permita la separacin de slidos de lquidos

a partir de la densidad que posean, utilizando la fuerza

giratoria (centrifuga).

Se puede utilizar como una tcnica de tipo:

Preparativo: Se utiliza para aislar partculas para su

aprovechamiento posterior.

Analtico: permite determinar propiedades fsicas como la

velocidad de sedimentacin o el peso molecular.

Centrifugacin fraccionada

Se utiliza para separar partculas segn la velocidad de sedimentacin

(centrifugacin diferencial).

Centrifugacin en gradiente

Se obtienen partculas que se distribuyen en

fracciones de diferentes densidades de un

fluido lquido.

Puede ser de dos tipos:

Centrifugacin zona: Separacin debido a la

masa.

Centrifugacin isopcnica: Separacin

debido la densidad.

Centrifugacin en gradiente

Mtodo de separacin de molculas con

carga elctrica que se desplazan al

exponerse a un campo

electromagntico.

La migracin de produce desde el nodo

(-) al ctodo (+) y depende del pH del

medio(buffer).

Electroforesis

El desplazamiento de las muestras en el medio (movilidad

electrofortica), est determinada por:

La carga de la molcula.

Tamao y forma

Aplicaciones de la electroforesis :

Determinacin de la masa molecular de protenas (kDa) y de ADN (pb),

Determinacin del punto isoelctrico de las protenas.

Diferenciacin de isoenzimas.

Diseo de mapas de restriccin.

Secuenciacin de ADN.

Friccin (porosidad del soporte)

Velocidad del desplazamiento

Potencial elctrico

Electroforesis

Cubetas de Electroforesis, electrodos

y peine

Marcador Micropipetas

Escalera Revelador

Fuente de voltaje

Tampn

Electroforesis: Componentes

Medios de alta porosidad Medios de baja porosidad

Papel

Acetato de celulosa

Gel de almidn

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida

Gel de agarosa+poliacrilamida

Separacin principalmente

por carga

Separacin por carga, tamao y forma

Naturaleza y disposicin

Macromolculas Soporte

Geles

cidos Nucleicos

Agarosa (horizontal)

Protenas Poliacrilamida

(vertical)

Medios de Soporte

Naturaleza Compuesto intercalante

Reveladores

ADN

Bromuro de Etidio

GelRed

Protenas Azul de

Coomasie

Necesitan instrumento

revelador UV

Transluminador UV

Reveladores

Electroforesis de ADN

Electroforesis de Protenas

Cromatografa

Mtodo fsico-qumico de separacin de componentes estrechamente

relacionados en mezclas complejas.

Existen distintos tipos de mtodos cromatogrficos.

Algunas de las ventajas que poseen las tcnicas cromatogrficas son:

Rapidez

Simplicidad

Moderado coste que poseen (dependiendo del tipo de tcnica),

Una gran aplicacin como mtodo de separacin

Permite proporcionar tambin resultados cuantitativos de los compuestos ya

separadas.

Cromatografa: Componentes

Fase mvil (FM) La muestra se disuelve en ella para permitir la separacin.

Normalmente est formada por un gas, o un lquido.

Fase estacionaria (FE) Es inmiscible.

La cual se mantiene fija en un soporte que puede ser una columna o

en una superficie slida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la

muestra, se distribuyen de forma distinta entre ambas.

Anlisis

Cuantitativos

Anlisis

Cualitativos

Afinidad con Fase Mvil

Afinidad con Fase

Estacionaria

Cromatografa: Revelada

Tipos de Cromatografa: Plana

Tipos de Cromatografa: En columna