microbiología general y bucal
TRANSCRIPT
Microbiología General y Bucal
Práctica 1: El laboratorio de MicrobiologíaPágina principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
Descripción
Un laboratorio de Microbiología es un lugar habilitado para manejar y estudiar microorganismos.
El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares técnicos y de seguridad propios de un laboratorio de Microbiología Clínica.
Es importante recordar que la finalidad es determinar los microorganismos presentes en la muestra por lo que es preciso extremar las
precauciones para evitar contaminaciones que den lugar a resultados erróneos.
Todas las muestras deben ser manejadas con precaución por su potencial patogenicidad.
Para deshacerse del material contaminado se deben utilizar recipientes adecuados que deben ser esterilizados posteriormente.
Nunca se puede tirar nada contaminado por el fregadero o al cubo de la basura común sin haber sido esterilizado previamente.
El el laboratorio deben existir unas recomendaciones generales de limpieza y en caso de vertidos:
Procedimientos de limpieza de superficies externas mediante papel humedecido con solución desinfectante (alcohol 70%,
desinfectante fenólico diluido, etc.). Aclarar con agua los restos de desinfectante.
En caso de usar soluciones de hipoclorito en zonas metálicas, limpiar posteriomente para evitar el efecto corrosivo.
En caso de derramamientos de material peligroso o formación de aerosoles: evitar inspiraciones de esos aerosoles, esperar 30
minutos hasta que las partículas se hayan depositado y limpiar con mascarilla, guantes y otros útiles protectores.
En caso de vertido de materiales, cubrir la superficie con desinfectante y posteriormente cubrir con papel humedecido con
desinfectante. Dejar durante 15 minutos y limpiar. En caso necesario aclarar con agua.
En caso de derramamientos menores limpiar el material vertido mediante papel humedecido y posteriormente aclarar, cuando sea
necesario.
Los laboratorios deberán disponer de los aparatos e instrumental necesario para el correcto desarrollo de su actividad.
Debe existir un procedimiento de control de calidad en el laboratorio de Microbiología Clínica que implique la monitorización de los
medios e instrumentos, con el fin de asegurar la adecuada realización de los aislamientos, identificación y caracterización de los patógenos
y la realización precisa de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos como referencia terapéutica. El sistema de la calidad deberá
contemplar la existencia de registros de formación de personal.
es imprescindible la existencia de un procedimiento sobre medidas de protección personal en el manejo de equipos y aparatos.
Los equipos del laboratorio deben funcionar de forma que se asegure la reproducibilidad de los resultados de las pruebas diagnósticas.
El laboratorio deberá estar bajo la dirección y responsabilidad de un facultativo con la especialidad correspondiente, legalmente capacitado
para realizar aquéllas determinaciones clínicas que el laboratorio tenga autorizadas.
El personal técnico y sanitario del laboratorio deberá disponer la titulación adecuada para las funciones que desarrolla de conformidad con
la legislación vigente.
Estructura de un laboratorio de Microbiología Clínica
Área administrativa
Área de recepción de muestras
Área de extracción que deberá:
Disponer de material de un solo uso para contacto con muestras biológicas.
Disponer de un área de extracciones y toma de muestra, una sala de espera para los pacientes y los servicios de higiene correspondientes.
Disponer de personal legalmente autorizado para la toma de muestras.
Disponer de un manual de extracción, toma y transporte de muestras.
El manual antedicho deberá ser elaborado por el responsable
Área de trabajo: análisis y procesado de muestras
El puesto de trabajo debe debe de estar limpio y ordenado
El material necesario debe prepararse antes de empezar a trabajar y colocarse de forma adecuada para que se facilite su utilización asi se
evitarán accidentes y se minimizará el riesgo de contaminación
Nunca se debe pipetear con la boca. Utilizar siempre elementos manuales o automáticos.
Todo el material utilizado debe estar estéril.
1. Elementos y materiales más frecuentes de un laboratorio de Microbiología Clínica
1.1. Mesas de laboratorio y fregadero
1.2. Vitrinas y armarios
1.3. Mechero Bunsen
Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del mechero (zona aséptica).
En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama
Antes de comenzar a trabajar se procurará disponer de todo el material necesario para el procesamiento de la muestra
Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminación de las muestras o/ y cultivo por microorganismos ambientales
1.4. Gradillas
1.5. Estufa de incubación
Es una cámara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.
Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura óptima de crecimiento (generalmente 35-37º).
1.6. Frigorífico o cámaras refrigeradas
Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como microorganismos.
Generalmente están a una temperatura fija de 4ºC.
1.7. Congeladores
Se utilizan para la conservación de reactivos y microorganismos a temperaturas inferiores a 0ºC, llegando a -80ºC (los más frecuentes son -
20º, -40º y -80º).
1.8. Microscopio óptico
1.9. Centrífuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrífuga lo que permite la separación de los distintos componentes de la muestra mediante
la precipitación en el fondo del tubo de las partículas en suspensión.
1.10. Cámaras de seguridad biológica (ver practica 2)
1.11. Desionizador de agua.
La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiología Clínica necesitan la utilización de agua pura con el fin
de evitar cualquier tipo de interferencia. Entre otra características debe: estar exenta de materiales en suspensión o un pH comprendido
entre 5,0 y 7,5. Durante años se ha utilizado agua destilada, en la actualidad los destiladores se han ido abandonando para dar paso
a desionizadores que funcionan con resinas de intercambio iónico. También se pueden utilizar otras técnicas como la ósmosis inversa.
1.12. Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminación de la placa y una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las
colonias y por tanto facilita su recuento.
1.13. Balanzas
1.14. Baños termostáticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de regulación de la temperatura. Se utilizan para atemperar
medios de cultivo o incluso para incubar cultivos de microorganismos.
1.15. Agitador/ mezclador
vortex agitador horizontal
1.16. Jarras de anaerobios:
Recipientes que se usan para conseguir una atmósfera libre de oxígeno para el cultivo de microorganismos anaerobios.
1.17. Asas de siembra:
Se utilizan para sembrar. Pueden ser metálicas o de plástico, curvas o rectas (para la siembra por picadura).
1.18. Ph-metros:
1.19. Material fungible
Placas de Petri: recipientes para la preparación de medios de cultivo sólidos
Placas de Petri con medio sólido
Tubos con medio líquido
Tubos con medio sólido
Pipetas de vidrio, de plástico y pipeteadores.
Pipetas
Pipeteador automático Pipeteador manual
Pipetas automáticas (micropipetas) y puntas de pipeta:
Se utilizan para pipetear pequeñas cantidades de líquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamaño y color según la micropipeta. Existen cuatro tamaños: de 0,5-2µm; de 2-20 µm; de
20-200 µm y de 200-1000 µm.
Asas acodadas o Asas de Digralsky:
Se utilizan para la extensión de microorganismos sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri.
Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.
Vasos de precipitados y matraces
Cucharas y espátulas:
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.
Área de limpieza de material y eliminación de residuos
Zona donde se procede a la esterilización mediante autoclave del material utilizado. El material desechable se elimina y con el material
reciclave se procede a la eliminación de residuos y lavado. De esta manera el material queda dispuesto para ser utilizado.
Área de esterilización
Procedimiento por el que se consigue la muerte de todos los organismos vivos y formas de resistencia en un objeto o producto tratado.
Autoclave
Es el equipo más utilizado.
Es un procedimiento de esterilización mediante calor húmedo. Se realiza en al autoclave durante 15 ó 20 min, según el volumen, a
115°C ó 121°C, según la naturaleza del material que se desee esterilizar.
Autoclavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presión (a 1 atmósfera). Como tiene gran poder de penetración la
temperatura y el tiempo utilizados son menores que los que se emplean con el horno Pasteur (121º C, 15-20 minutos).
Se utiliza para esterilizar: Medios de cultivo, ropa, material de plástico resistente al calor húmedo, objetos de metal que no se alteren
con la humedad y sobre todo material de vidrio.
Horno de Pasteur: emplea altas temperaturas (160-180º C) durante un tiempo prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad
de penetración se usa para esterilizar vidrio y metales. Actúa principalmente desnaturalizando las proteínas y secundariamente
oxidando los compuestos celulares.
Área de preparación de medios
Almacén de reactivos
Área de seguridad microbiológica
Debe ser una zona diferenciada y aislada para la manipulación de microorganismos susceptibles de formar aerosoles potencialmente
infecciosos.
Microbiología General y Bucal
Práctica 2: Normas básicas de trabajoPágina principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
El estudio de los agentes infecciosos comporta riesgos que dependen del agente infeccioso y de los procedimientos utilizados.
Las normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso.
La actitud y el modo de proceder de aquellos que trabajan en el Laboratorio de Microbiología determinan su propia seguridad, así como la
del resto del personal.
El riesgo puede ser alto o muy limitado y depende del personal, de la infraestructura y de la metodología empleada.
Cada persona debe responsabilizarse de su propia seguridad y de la del resto de trabajadores.
1.- Normas generales
Son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio.
- El acceso al laboratorio debe estar limitado al personal autorizado.
- No deben entrar en el mismo familiares ni amigos.
- El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de seguridad.
- Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de contención.
- Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica.
- Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca un derrame.
- Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio deben ser transportados en contenedores
cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de residuo.
- El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como almacén. Siempre debe quedar un
espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
- El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de caída, no se produzcan
salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y
resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de
forma oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. No se puede transportar las muestras a mano.
- La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc. debe estar disponible en todo momento. La
ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (cubrebatas) nunca debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe
de ser desechada automáticamente en una bolsa de material contaminado.Nunca debe volver a ser usada.
- Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos. Con este
fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán
desechados antes de salir del área de trabajo. Nunca se saldrá del laboratorio con los guantes puestos, ni se cogerá el teléfono con
ellos puestos, se tocarán los volantes, etc.
- Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
- Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.
- Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de aerosoles.
- Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por
escrito.
- Nadie podrá trabajar en el área de tuberculosis con una prueba de Mantoux negativa.
- Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material adecuado y cada trabajador será
instruido para manejarlo debidamente.
- En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel contaminado es de muy difícil
esterilización.
- No deberán usarse lentes de contacto.
- El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
- Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área de trabajo del laboratorio, así como el
almacenamiento de comida o bebida.
- El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes
de abandonar el laboratorio. Se usará un jabón antiséptico y el secado se realizará con papel.
- Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y después es imprescindible ponerse guantes.
- El uso de agujas hipodérmicas y jeringas debe ser limitado. Sólo deben usarse las unidades ya montadas.
- Nunca se debe volver a poner la capucha a las agujas y éstas no deben ser torcidas ni separadas de la jeringa.
- Las agujas y jeringas usadas, así como los bisturís, deben ser desechados sólo en contenedores especiales destinados a este
propósito.
2.- Clasificación de los agentes biológicos por grupos de riesgo
Agente biológico del grupo 1. Aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre.
Agente biológico del grupo 2. Aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un peligro para los trabajadores,
siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Agente biológico del grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los
trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Agenete biológico del grupo 4. Aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los trabajadores, con
muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.
3.-Niveles de contención
El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El
propósito de la contención es reducir al mínimo la exposición del personal de los laboratorios, otras personas y el entorno a agentes
potencialmente peligrosos.
La Seguridad Biológica se fundamenta en tres elementos:
Técnicas de laboratorio. El elemento más importante para contener los riesgos biológicos es el seguimiento estricto de las prácticas
y técnicas estándar microbiológicas. Como parte de estas prácticas está el desarrollo o adopción por parte de cada laboratorio de un
manual de operaciones (Manual de Seguridad Biológica) en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que
especifique los procedimientos que puedan minimizar esos riesgos.
Equipo de seguridad (barreras primarias). Se incluyen en este apartado tanto dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad
(ej. las cabinas de seguridad biológica), como las prendas de protección personal (guantes, mascarillas, batas,...).
Diseño y construcción de la instalación (barreras secundarias). La magnitud de las barreras secundarias dependerá del tipo de
agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la separación de las zonas donde tiene acceso el
público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación (autoclaves), el filtrado del aire de salida al exterior, el flujo de aire
direccional, etc.
Niveles:
Existen cuatro niveles de contención o de seguridad biológica en función de la combinación de los tres elementos descritos.
Nivel 1. Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1, es decir, los que no producen enfermedad en el ser
humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de
universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patógenas.
Nivel 2. Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de
originar patología infecciosa humana de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado y son los que
con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Microbiología Clínica.
Nivel 3. Cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos que causan patología grave, de difícil y largo tratamiento,
que pueden curar con secuelas y a veces producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la infección adquirida a
través de aerosoles y por fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulación y la
utilización de cabinas de seguridad. En este grupo están: M. tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Sólo pueden ser procesados por
personal cualificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es decir, con aire acondicionado
independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión, cabinas de bioseguridad, etc.
Nivel 4. Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente patógeno e infectocontagioso, exótico o no,
que produce alta mortalidad y para el que no existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva
baja y alta contagiosidad. Este nivel también puede utilizarse para trabajar con animales de experimentación infectados por
microorganismos del grupo 4. En este grupo están los virus de la fiebre de Lassa, virus Machupo, virus Ebola, etc. Además, deben incluirse
en este nivel de contención los microorganismos del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4
(Mycobacterium multirresistente).
En general, la naturaleza infecciosa del material clínico es desconocida y al Laboratorio de Microbiología suelen remitirse muestras
muy diversas.
Excepto en casos excepcionales, el procesamiento inicial de las muestras clínicas y las pruebas serológicas pueden realizarse de forma
segura en un nivel 2, que es el recomendado para trabajar con patógenos que se transmiten por vía sanguínea (virus de la hepatitis B, VIH,
etc.), a lo que habría que añadir las precauciones universales que deben ser tomadas con todas las muestras de sangre y otros materiales
potencialmente infecciosos.
4.- Equipos protecciónLos equipos de protección individual que pueden ser necesarios, en algún momento, en un Laboratorio de Microbiología Clínica: los
protectores de los ojos y de la cara (gafas de seguridad, pantallas faciales), los protectores de las vías respiratorias (mascarillas, máscaras),
los protectores de manos y brazos (guantes, manguitos), los protectores de la totalidad del cuerpo (batas)…
Cabinas de seguridad biológica (CSB)
Son cámaras de circulación forzada que, según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de
protección. Imprescindibles en un Laboratorio de Microbiología Clínica.
Es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biológica.
La campana de gases es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los productos químicos.
Es un equipo muy útil en la contención del riesgo químico, NO ofrece protección frente a riesgos biológicos.
Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA (High
Efficiency Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en
su interior, nunca al operador (no son recomendables en un Laboratorio de Microbiología Clínica).
Las cabinas de Seguridad Biológica son recintos ventilados diseñados para limitar al máximo el riesgo del personal de laboratorio
expuesto a agentes infecciosos (aerosolos, etc.). Estos equipos proporcionan una zona de trabajo que minimiza la probabilidad que una
partícula transportada por el aire pueda escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar al operario y a la zona que le rodea. Además,
algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula.
Una cabina nunca es un sustituto de una técnica microbiológica adecuada.
Clasificación: según el nivel y tipo de protección.
Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación: las barreras de aire y los filtros. Las barreras de aire se crean
permitiendo que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera "cortina" de aire (flujo de aire
laminar). Es un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas contenidas en este flujo de aire y
los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,3 micras de diámetro.
Existen tres categorías:
Cabinas de clase I. Son cámaras cerradas con una abertura al frente para permitir el acceso de los brazos del operador. El aire penetra el
frontal, atraviesa la zona de trabajo y sale al exterior a través de un filtro HEPA. Son apropiadas para manipular agentes biológicos de los
grupos 1, 2 ó 3. No proporcionan protección al material con el que se trabaja, no evita que se pueda contaminar.
Cabinas de clase II. Se diferencian de las de clase I en que, además ofrecen protección al material frente a la contaminación. La superficie
de trabajo está atravesada por aire limpio que ha pasado a través de un filtro HEPA. La salida del aire se produce a través de otro filtro
HEPA. Son equipos válidos para el manejo de agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3. Existen varios tipos de cabinas de clase
II, A, B1, B2 y B3, según sus características de construcción, flujo de aire y sistema de extracción.
Cabinas de clase III. Constituyen el máximo nivel de seguridad. Son recintos herméticos en presión negativa y, por ello, su interior está
completamente aislado del entorno. Se opera en ellas por medio de unos guantes, con trampa para introducir el producto, el aire entra a
través de un filtro HEPA y se expulsa al exterior a través de dos filtros HEPA. Se recomiendan para el manejo de agentes de los grupos 1,
2, 3 ó 4.
Clase I Clase II Clase III
Elección del equipo
Procedimiento de trabajo
Al inicial el trabajo:
1. Poner en marcha la cabina durante 5-10 minutos, a fin de purgar los filtros y "lavar" la zona protegida.
2. Comprobar que el manómetro situado en la parte superior del frontal se estabiliza e indica la presión adecuada (varía con el
modelo de cabina).
3. Apagar la luz ultravioleta (si estuviera encendida) y encender la luz fluorescente.
4. Limpiar la superficie de trabajo con un producto adecuado (por ejemplo, alcohol etílico al 70%).
5. Antes y después de haber trabajado en una cabina deberían lavarse con cuidado manos y brazos, prestando especial atención a las
uñas
6. Se deben usar batas de manga larga con bocamangas ajustadas y guantes de látex.
7. En determinados casos, además es recomendable el empleo de mascarilla.
Durante la manipulación:
1. Todo el material a utilizar se sitúa en la zona de trabajo antes de empezar.
2. Es aconsejable haber descontaminado el exterior del material que se ha introducido en la cabina.
3. Este material se coloca con un orden lógico, de manera que el material contaminado se sitúa en un extremo de la superficie de
trabajo y el no contaminado ocupa el extremo opuesto de la misma.
4. Según el tipo de manipulación y el modelo de la cabina, la zona de máxima seguridad dentro de la superficie de trabajo varía. En
general, se recomienda trabajar a unos 5-10 cm por encima de la superficie y alejado de los bordes de la misma. Especial atención se
prestará a no obstruir las rejillas del aire con materiales o residuos.
5. Una vez que el trabajo haya comenzado y sea imprescindible la introducción de nuevo material, se recomienda esperar 2-3
minutos antes de reiniciar la tarea.
6. Mantener al mínimo la actividad del laboratorio en el que se localiza la cabina en uso, a fin de evitar corrientes de aire que
perturben el flujo.
7. Evitar los movimientos bruscos dentro de la cabina. El movimiento de los brazos y manos será lento, para así impedir la
formación de corrientes de aire que alteren el flujo laminar.
8. Al igual que en el resto del laboratorio, no debe utilizarse el mechero Bunsen, cuya llama crea turbulencias en el flujo y además
puede dañar el filtro HEPA.
9. Cuando deban emplearse asas de platino es aconsejable el incinerador eléctrico o, mejor aún, asas desechables.
10. Si se produce un vertido accidental de material biológico se recogerá inmediatamente, descontaminado la superficie de trabajo y
todo el material que en ese momento exista dentro de la cabina.
11. No se utilizará nunca una cabina cuando esté sonando alguna de sus alarmas.
Al finalizar el trabajo:
1. Limpiar el exterior de todo el material que se haya contaminado.
2. Vaciar la cabina por completo de cualquier material.
3. Limpiar y descontaminar con alcohol etílico al 70%.
4. Dejar en marcha la cabina durante al menos 15 minutos.
5. Conectar si fuera necesario la luz ultravioleta (UV) y recordar que su capacidad descontaminante es muy limitada.
Limpieza y desinfección de la CSB
1. Se llevará a cabo una desinfección completa en las siguientes situaciones: a) en caso de que se haya producido un vertido
importante; b) antes de cualquier reparación; c) antes de iniciarse los chequeos periódicos; d) siempre que se cambie el programa de
trabajo; e) cuando se substituyan los filtros HEPA y f) al cambiarla de lugar (incluso dentro del mismo laboratorio).
2. Se realizará con vapores de formaldehído y siempre por personal debidamente entrenado y con las prendas de protección personal
adecuadas.
3. Una buena limpieza de la zona de trabajo es una garantía de ausencia de polvo y otros contaminantes.
4. Es conveniente una vez a la semana levantar la superficie de trabajo y limpiar y descontaminar por debajo de ella.
5. Nunca se debe utilizar la cabina como almacén transitorio de equipo o material de laboratorio.
6. Evitar introducir en la cabina materiales que emitan partículas fácilmente como algodón, papel, madera, cartón, lápices...
Control de aerosoles infecciosos. Se generan en el procesamiento de muestras o cultivos como:
a.- Manipulación de microorganismos del grupo de riesgo 3.
b.- Machacamiento de tejidos.
c.- Descontaminación de muestras para cultivo de Micobacterias.
d.- Procedimientos de identificación de hongos.
e.- Utilización del Vortex para mezclar muestras con microorganismos del grupo de riesgo 3.
f.- Decantación de líquidos en muestras con microorganismos del grupo de riesgo 3.
Protección de muestras o materiales de la contaminación externa:
a.- Procesamiento de líquidos orgánicos estériles con microorganismos del grupo de riesgo 3.
b.- Cultivos celulares.
c.- Preparación de soluciones de medios y reactivos que deban ser estériles.
Microbiología General y Bucal
Práctica 3: Toma de muestras, transporte y conservación
Página principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
Las principales dificultades para realizar un estudio clínico-microbiológico son:
a) obtener una muestra fehaciente que esté exenta de contaminación con los fluidos orales y/o otros contaminantes
b) el utilizar medios y condiciones de cultivo óptimas para la reproducción del máximo posible de microorganismos
c) emplear métodos precisos para la identificación y la tipificación de los microorganismos reproducidos.
Normas generalesObtención de muestras:
Deben realizarse en condiciones de máxima asepsia, evitando contaminaciones ambientales, del personal médico y del propio
enfermo.
No debe estar en contacto con sustancias desinfectantes.
Volante de petición: se hará constar al menos:
Identificación del paciente.
Identificación del médico.
Datos de la muestra (hora de recogida, tipo de muestra, localización anatómica, procedimiento de obtención de la muestra).
Determinaciones solicitadas.
Identificación de la muestra:
Cada muestra debe estar acompañada siempre de un volante.
El recipiente debe identificarse con nombre y apellidos, tipo de muestra, fecha, y hora de extracción ( imprescindible en los hemocultivos).
Deberán tener etiqueta de color según su conservación (en estufa, en nevera o a temperatura ambiente).
TransporteSe realizará de forma inmediata y se utilizará:
1. Envase estéril de boca ancha:
Para: biopsias, tejidos, orinas, escamas, líquidos, esputos, secreciones bronquiales.
2. Port-A-Cul vial (medio de Cary Blair):
Para: líquidos y exudados obtenidos por aspiración.
3. Port-A-Cul tubo (medio de Cary Blair):
Para: raspados de heridas, escaras, abscesos, úlceras, pequeñas biopsias y tejidos.
4. Hisopo con medio de transporte Stuart:
Para: abscesos y heridas recogidas con escobillón.
No válido para: anaerobios y micobacterias.
5. Tubo estéril:
Para: líquidos estériles.
No válido para: anaerobios, ni para líquidos con alto contenido hemático.
6. Medio de transporte para virus:
Para: aspirados nasofaríngeos, exudados y biopsias.
7. Tubo de plástico estéril:
Para: catéteres (no más de 4 cm), tejidos y líquidos.
8. Hemocultivos:
Para: sangre y líquidos estériles.
1 2 3 4
5 6 7 8: distintas posibilidades de hemocultivos
Conservación de las muestras Muestras para Bacteriología:
A temperatura ambiente: médula ósea, líquidos estériles (pleural, peritoneal, articular,...), muestras oculares, muestras de
cavidad oral, heridas, abscesos, fístulas, adenopatías, del tracto genital, y biopsias.
En NEVERA: orinas, heces, catéteres.
En ESTUFA: hemocultivos, LCR, placas y tubos inoculados.
Muestras para anaerobios: a Temperatura ambiente.
Muestras para micobacterias: en NEVERA, salvo contenido gástrico.
Muestras para virus: en NEVERA, salvo sangre, médula ósea, y Ag CMV.
Muestras para hongos: en NEVERA, salvo LCR, piel, pelo, uñas, vaginal y balano-prepucial.
Según el microorganismo a investigar:
ANAEROBIOS: Máxima asepsia. ASPIRAR. Conservación a Tª ambiente. Enviar en PORT-A-CUL.
MICOBACTERIAS: No recoger con escobillón. Conservar en nevera. Enviar en envases estériles de boca ancha. Rapidez en
envío.
HONGOS: ASPIRAR Y RASPAR. Conservar en nevera (excepto tracto genital, uñas, pelo,...). Rapidez en envío.
VIRUS: Tomar muestras en estadio precoz. Transporte específico. Conservación en nevera.
Estufa Nevera
Criterios de rechazo de una muestra Mala cumplimentación del volante y/o de la muestra.
Muestras derramadas, o rotas,...
Muestra no adecuada para la prueba solicitada.
Muestras sin medio de transporte adecuado.
Toma de muestras en odontología:
Principios generales
La toma de muestra en la cavidad bucal no es tarea fácil ya que es un ecosistema abierto donde conviven tejidos duros y blandos tapizados
por mucosa colonizada con un gran número de microorganismos. La mayoría de los procesos suelen ser de origen polimicrobianos, siendo
las bacterias anaerobias estrictas los agentes etiopatogénicos más frecuentes. Las muestras odontológicas son totalmente distintas a las de
otras localizaciones.
Las tomas obtenidas mediante biopsias y los volúmenes obtenidos de punciones de abscesos o fluidos creviculares, son pequeños y estos
últimos pueden incluso encontrarse absorbidos en puntas de papel.
Es importante que sean recogidas y manipuladas correctamente cumpliendo con normas de bioseguridad y protocolos estandarizados.
Características de la muestra
1. Deben ser representativas del proceso a investigar tanto en cantidad como en calidad de la muestra.
2. Estar libre de contaminación de la microbiota de la boca.
3. Usar un medio de transporte adecuado.
4. Identificación adecuada
5. La conservación debe ser correcta tanto en temperatura y atmósfera
6. Enviar al laboratorio en el menor tiempo posible
El incumplimiento de estas indicaciones puede dar lugar a una contaminación de la muestra con microorganismos de la microbiota, la no
viabilidad de los microorganismos etiopatogénicos o un sobrecrecimiento de microorganismos acompañantes.
Si esto ocurre el informe microbiológico será incorrecto y las medidas terapéuticas inadecuadas
Material necesario
- Algodón
- Hisopos.
- Puntas de papel.
- Anestésico local.
- Cureta.
- Sistema para el transporte de anaerobios.
Las muestras se remiten rápidamente, evitando el contacto con el oxígeno y la desecación. Es utilizado medios de transporte adecuados.
Tipos de muestra
Detección de hongos (candidiasis oral)
Obtención de la muestra:
Solicitar al paciente que se enjuague la boca con agua. Frotar las lesiones con una torunda humedecida con suero fisiológico. Hacer
una extensión sobre un portaobjetos. Repetir la toma con una torunda para el cultivo. Si no se dispone de portaobjetos, enviar las dos
torundas sin medio de transporte.
Envío al Laboratorio: rápido. Mientras tanto conservar a 4º C. Enviar la torunda sin medio de transporte.
Cultivo absceso perioral/gingival
Obtención de la muestra:
La muestra debe recogerse por aspiración y drenaje a través de la superficie externa de la piel no afectada. Si fuere necesario recogerla
a través de las membranas mucosas de la cavidad oral, se aislará la zona con rollos de algodón, se secará con torundas de algodón y se
desinfectará con Povidona durante 1 minuto antes de insertar la aguja. Aspirar el contenido del absceso. Reemplazar la aguja por otra
nueva, eliminar el aire con algo de muestra, e inocularla en un medio de transporte de muestras de anaerobios, evitando la entrada de
aire. La flora presente en las secreciones orales es la que se encuentra normalmente en los abscesos periorales, por tanto es esencial
evitar la contaminación durante el proceso de recogida. Las torundas de sitios orales no sirven para el cultivo. El volumen mínimo
recomendado es de 1 ml.
Envío al Laboratorio: debe ser inmediato. Mientras tanto mantenerla a temperatura ambiente. La muestra debe ir en el medio de transporte
adecuado.
Cultivo de placa subgingival/supragingival
Obtención de la muestra:
Tras aislar la zona de donde se obtendrá la muestra con rollos de algodón y secarla con torundas de algodón, obtener la mayor cantidad
posible de muestra con cureta estéril. Introducir en un tubo de caldo tioglicolato.
Envío al Laboratorio: rápido. Mientras tanto mantenerla a 35 - 37ºC. Se debe enviar la mayor cantidad posible en tubo de caldo tioglicolato.
Cultivo de canal dental
Obtención de la muestra:
Se desinfecta y se introduce en el canal 1 ó 2 puntas de papel estéril hasta el fondo del canal y se dejan 10 segundos. Introducir las
puntas en el fondo de un tubo de caldo tioglicolato. Obtener la mayor cantidad posible
Envío al Laboratorio: debe ser inmediato. Mientras tanto mantener a 35-37ºC.
Cultivo de bolsa periodontal
Obtención de la muestra:
El área de donde se toma la muestra se aísla con rollos de algodón y se seca con torundas de algodón estériles. Para desinfectar y secar
la superficie puede usarse etanol al 70%. Eliminar la placa supragingival y obtener la muestra con cureta estéril introduciéndola lo más
vertical posible hasta el fondo de la bolsa periodontal. Obtener la mayor cantidad posible. Introducir la muestra en un tubo de caldo
tioglicolato.
Envío al Laboratorio: debe ser inmediato. Mientras tanto mantener a 35-37ºC. Se debe enviar la mayor cantidad posible en un tubo de caldo
tioglicolato.
Microbiología General y Bucal
Práctica 4: Diagnóstico microbiológico directoPágina principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
En el Laboratorio de Microbiología el microorganismo o sus productos pueden detectarse a través de:
1.- Visualización
Uno de los procedimientos básicos y no por ello menos importante es la visualización del microorganismo en las muestras.
El microscopio óptico es el más utilizado en los laboratorios de microbiología de forma rutinaria. También pueden emplearse el de campo
oscuro,contraste de fases, fluorescencia o electrónico.
El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse una visualización microscópica en 2 momentos: a)
directamente de la muestra clínica y b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escalón en la identificación.
¿Cómo se pueden ver los microorganismos?
Puede realizarse
1-Directamente: examen en fresco. Se estudian las bacterias "al natural", sin teñir. Tiene el inconveniente de que las bacterias tienen una
densidad óptica similar a la del agua (transparentes) por lo que es difícil examinarlas.
2-Mediante una técnica denominada gota pendiente que se utiliza para observar la movilidad.
3-Tinciones negativas (Tinta china). No son una verdadera tinción. Se llaman así porque lo que realmente se tiñe es el fondo sobre el que
están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teñir. Se emplea para ver la cápsula de S. pneumoniae y Cryptococcus
neoformans en LCR.
4-Tinciones. Existen muchas y en general se pueden clasificar en:
4.1. simples (utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observación de levaduras y protozoos intestinales
4.2. diferenciales (utilizan más de un colorante y permiten la agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial).
Destacan latinción de Gram que agrupa a las bacterias en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, y la
de Ziehl-Neelsenutilizada, entre otros, para la tinción de micobacterias.
4.3. especiales: tinciones fluorescentes , tinciones de determinadas estructuras como la tinción del esporo, tinción de flagelos...
Tinción de Gram:
PASOS GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS
Colorante
principal: cristal violeta
Violeta Violeta
Mordiente: Lugol Violeta Violeta
Decolorante: alcohol-
acetona
Violeta “Transparente”
Colorante de
contraste:safranina
Violeta Rojo
¿Cómo se ven las bacterias tras realizar una tinción de Gram?
A través de la tinción de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en 1) grampositivas (violetas) que retienen el colorante principal tras la
decoloración con alcohol o alcohol-acetona y 2) gramnegativas (rojas) que pierden el colorante principal tras la decoloración por lo que es
necesario aplicar un colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloración está basada en la diferencia estructural de la
pared. En las grampositivas el colorante se fija fuertemente al peptidoglicano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En
las gramnegativas el colorante es retenido con menos fuerza al ser más delgada la capa de peptidoglicano. Además la mayor cantidad de
lípidos presentes hace que el colorante se elimine al solubiliarse los lípidos en el alcohol.
- Pueden tener diferentes formas:
- esféricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)
- cilíndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)
- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi
- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas
(estreptococcos), tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias), etc
- Tamaño: las bacterias se miden en µmetros (1µmetro = 10-3 mm) y, en general y como ejemplo, las bacterias esféricas tienen un
diámetro de 1µm y las bacterias alargadas 1.5-8 µm de longitud, aunque este parámetro varía en función de los diferentes géneros
bacterianos.
Cocos grampositivos
Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos
Visualización de la tinción de Gram
2.- Aislamiento en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas
bioquímicas y enzimáticas-, etc.)
¿Cómo se cultivan en el laboratorio?
Se utilizan medios de cultivo compuestos por una mezcla de nutrientes (proteínas, hidratos de carbono, minerales,
oligoelementos...) que permiten el crecimiento de las bacterias en el laboratorio, in vitro.
Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a varios parámetros:
a) Según su origen pueden ser 1) naturales: constituidos por sustancias naturales de composición compleja y en ocasiones variable (extracto
de carne, extracto de levadura, patata...), 2) sintéticos o químicamente definidos en los que se conoce la participación exacta de hidratos de
carbono, aminoácidos.... y 3) semisintéticos.
b) Según su consistencia pueden ser 1) líquidos, 2) sólidos: son medios líquidos a los que se les añade para darles consistencia una
sustancia gelificante (agar-agar) obtenida de algas marinas y 3) semisólidos: líquidos a los que se les añade menor concentración de agar
que a los sólidos.
Cada uno tiene sus finalidades. En la superficie de los medios sólidos es posible ver las colonias resultantes de la multiplicación
bacteriana. Los medios líquidos facilitan el crecimiento de las bacterias pero en ellos no se ven colonias, el crecimiento suele detectarse por
turbidez. Los medios semisólidos suelen utilizarse para valorar la movilidad de los microorganismos.
c) De acuerdo a su finalidad y aplicación pueden ser:
1.- Básicos: aquellos que llevan todos los elementos básicos para el desarrollo de los microorganismos no exigentes.
2.- Enriquecidos: incorporan diferentes sustancias para permitir el crecimiento de microorganismos más exigentes. Ej.: agar sangre, agar
chocolate,...
3.- Selectivos: medios a los que se añaden diferentes sustancias (colorantes, sales biliares, antibióticos...) que son capaces de inhibir a
determinados microorganismos y permitir el crecimiento de otros. En general se utilizan para inhibir el crecimiento de la flora acompañante
y permitir el crecimiento del patógeno. También colaboran en la identificación pues proporcionan un parámetro más: “no se inhibe por...”
4.- Diferenciales: se les añade un hidrato de carbono y un indicados de pH de forma que si el microorganismo es capaz de utilizar ese
hidrato de carbono se produce un cambio de pH que hace que el indicador cambie de color y evidencie la reacción. Así las colonias son
fácilmente reconocibles por su color.
5.- Otros medios: de enriquecimiento (son medios líquidos a los que se les añades sustancias que inhiben el crecimiento de
microorganismos acompañantes favoreciendo el crecimiento de otros (los patógenos buscados), de transporte, etc.
Siembra de los medios de cultivo
Lo primero que hay que hacer es sembrar la muestra en los medios de cultivo reseñados. Una vez cultivada se procede al aislamiento
en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas bioquímicas y
enzimáticas-, etc.).
Prodecimientos de siembra 1
Procedimientos de siembra 2
Esquemas
Cuando la siembra se realiza a partir de un cultivo debe obtenerse una pequeña porción del mismo.
Condiciones de cultivo
-Temperatura: la mayoría crecen bien a temperaturas entre 35-37ºC aunque hay excepciones
-Tiempo de incubación: depende del tiempo de generación (tiempo requerido para que el número de bacterias se duplique) de cada
microorganismo. Generalmente 18-24 h. Otros requieren más tiempo de incubación: Brucella spp. , M. tuberculosis.
-Atmósfera de incubación. Los microorganismos respecto al tipo de respiración pueden ser:
1.- Aerobios: requieren la presencia de oxígeno molecular.
2.- Anaerobios facultativos: pueden vivir y multiplicarse en presencia o en ausencia de oxígeno.
3.- Anaerobios: el oxígeno libre es tóxico para ellos (algunos son aerotolerantes).
4.- Microaerofilos: necesitan la presencia de oxígeno libre pero a una concentración menor que la atmosférica (2-10%).
Este hecho tiene como consecuencia que haya que incubarlos en estas condiciones. Otros hay que incubarlos en una atmósfera con
un 5-10% de CO2 (no es tipo de respiración sino un requerimiento): se denominan capnófilos
Identificación
Se valoran entre otros parámetros:
1) morfología y aspecto de las colonias (masa constituida por bacterias que es visible a simple viste en la superficie de los medios
sólidos).
2) capacidad de crecer a una determinada temperatura
3) crecimiento en medios selectivos y diferenciales
4) presencia de hemólisis que en los medios con sangre da lugar a la aparición de un halo alrededor de la colonia. Puede ser
transparente (hemólisis total o ß-hemólisis), verdoso (hemólisis parcial o α-hemólisis o no aparecer (no hemolíticas o γ–hemólisis)
5) pruebas bioquímicas y enzimáticas adecuadas para la bacteria que se sospeche por las pruebas preliminares
6) movilidad
3.- detección de productos estructurales: antígenos (reacciones antígeno-anticuerpo), ácidos nucleicos (hibridación, PCR, etc)
3.1. detección de antígenos se verán con más detalle al estudiar las reacciones antígeno-anticuerpo
3.2. técnicas genéticas de detección de ácidos nucleicos: hibridación, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), etc.
3.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):
En 1983, Kary Mullis dio a conocer la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa que es una técnica para la síntesis in vitro de secuencias específicas de DNA evitandop de esta forma uno de los principales problemas que se planteaban que era la insuficiente cantidad de ADN para realizar ciualquier procedimiento de laboratorio.
La técnica se basa en la replicación del ADN inducida por la DNA polimerasa, enzima que es capaz de real9izar una síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de ciclos que están formados por tres etapas:
1.- Desnaturalización del ADN doble cadena: la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
2.- Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: los cebadores, iniciadores o primers se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C).
3.- Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa (elongación): se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.
Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas.
Esquemas de trabajo
Elementos químicos necesarios para realizar la PCR
Termociclador
Carga de un gel de agarosa
Lectura de un gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio, bajo la luz ultravioleta
3.2.2. Hibridación
La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ARN o ADN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea radiactivo o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de
secuencia parecida.
En el esquema está representado el fundamento de la técnica.
Para saber más
4.- detección de productos metabólicos: Cromatografía (anaerobios, micobacterias), ATP bacteriano (bioluminiscencia), toxinas, etc.
4.1. cromatografía se basa en la identificación de microorganismos a partir de productos de su metabolismo (alcoholes, ácidos grasos) o de
componentes de la pared celular. Se emplea sobre todo para la identificación de micobacterias y anaerobios.
Algunas de estas técnicas como la PCR pueden utilizarse para realizar el diagnóstico directamente sobre la muestra clínica sin
necesidad de hacer un cultivo previo.
REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO
Son estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción antígeno-anticuerpo producida en el laboratorio ha tenido
lugar. Se basan en la especificidad de la reacción, es decir, en que un anticuerpo sólo reaccionará con el antígeno que haya dado lugar a su
formación.
Pueden utilizarse para realizar tanto diagnóstico directo como indirecto. Si conocemos el anticuerpo (están disponibles en el
laboratorio, por ej. anticuerpos monoclonales) podremos identificar el antígeno (en la muestra clínica) que reacciona específicamente con
él: diagnóstico directo.
Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 1)
Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 2)
La inmunofluorescencia es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos. Los fluorocromos son moléculas que al ser excitadas con la energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor.
Una de las técnicas más utilizadas es la Inmunofluorescencia Directa que permite la detección de antígenos en un paso. Utiliza anticuerpos conjugados a isotiocianato de fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, que emite luz ultravioleta de una
determinada longitud de onda.
Reacción positiva
Reacción negativa
La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de anticuerpos circulantes. Si el antígeno es conocido (disponible en el laboratorio), detectaremos los anticuerpos que se encuentran en la muestra clínica y por tanto son desconocidos y que reaccionan específicamente con ellos:diagnóstico indirecto.
Otras técnicas que se emplean en el diagnóstico microbiológico directo son: detección de antígeno capsular mediante técnicas de aglutinación con anticuerpos unido a partículas de látex, CIE, RIA y EIA. La descripción de estas técnicas se verán en la práctica 5.
Microbiología General y Bucal
Práctica 5: Diagnóstico microbiológico indirectoPágina principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
Se realiza en muestras de suero, utilizando diversos tipos de reacciones antígeno-anticuerpo: aglutinación, precipitación, fijación del
complemente, etc.
El diagnóstico indirecto suele utilizarse entre otros ante:
- Imposibilidad de realizar un diagnóstico directo
- Cuando la realización del diagnóstico directo es muy complicada o costosa
- Estudios epidemiológicos (por ejemplo para saber que porcentaje de población ha tenido contacto con un determinado patógeno).
Algunos conceptos importantes son:
- Título de un suero: es un concepto cuantitativo que determina la concentración de anticuerpos de un suero determinado. Se realiza
por una técnica de diluciones seriadas.
- Seroconversión: se define como el incremento (generalmente 4 veces) en la concentración de anticuerpos específicos al comparar dos
muestras de suero separadas en el tiempo, habitualmente 2 semanas. Indica la presencia de un estímulo antigénico en ese momento.
- Detección de IgM: determina infección aguda.
Algunas de las pruebas que se utilizan en el diagnóstico microbiológico indirecto son:
Enzimoinmunoanálisis (Inmunoanálisis ligado a enzimas o también llamado enzimoinmunoanálisis de adsorción): Técnica inmunoquímica cuantitativa basada en reacciones antígeno-anticuerpo. El marcaje se hace con un enzima. Se puede marcar tanto el antígeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias). La cuantificación se hace, por tanto, basándose en la medida de la actividad del enzima marcador.Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, seañade
un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un compuesto coloreado lo que permite la medida de la
actividad enzimática con ayuda de un espectrofotómetro.
ELISA. Es una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como método de separación, lo que es lo más habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
Reacción de precipitación:
Microbiología General y Bucal
Práctica 6: AntibiogramaPágina principal Práctica 1 Práctica 2 Práctica 3 Práctica 4 Práctica 5 Práctica 6
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD BACTERIANA
Las pruebas de sensibilidad bacteriana se llevan a cabo mediante el antibiograma que sirve para medir la sensibilidad de una cepa bacteriana a uno o varios antibióticos. El estudio de la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. También es importante para realizar estudios sobre la evolución de las resistencias bacterianas que permite revisar los protocolos de la antibioticoterapia empírica.
Conceptos:
La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) es la medida de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la
mínima cantidad de ntimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas. Es el
método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica. Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control (de
referencia) con el fin de que los resultados sean reproducibles y comparables. Este método nos ofrece información sobre la sensibilidad de
las bacterias S (sensible), I (intermedia) y R (resistente).
Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).
Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma rutinaria, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos
manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Se puede realizar mediante:
1.- Difusión en agar: Disco placa y E test
2.- Dilución: Medio sólido y Medio líquido (micro/macrodilución)
3.- Mecanizados y Automatizados
La Concentración Mínima Bactericida (CMB) es la mínima cantidad de antibiótico capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada
en condiciones estandarizadas.
Métodos
En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el de dilución en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo. Actualmente existen varios métodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibióticos y todos ellos se realizan bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales.
Dilución en caldo
Se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que mantiene el desarrollo del microorganismo. Los antibióticos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Después de un periodo de incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos que indica el desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los que no contengan suficiente antibiótico que sea capaz de inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento es la Concentración Mínima Inhibitoria.
Para medir la CMB se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.
A partir de la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no tienen turbidez en placas de agar, y el número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del cultivo original. La mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM).
Difusión en agar
Este método incorpora el antimicrobiano a discos de papel de filtro. Su introducción permitió agilizar la determinación de la sensibilidad de las cepas bacterianas frente a un número importante de antimicrobianos de forma simultanea. El empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad está estandarizado y se correlaciona con las CMIs. Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente cualitativa, el método de difusión por disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre todo de su comodidad, economía y
fiabilidad, ha sido uno de los más utilizados en los laboratorios.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas y se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas por la NCCLS. De esta manera se sabe si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los antibióticos.
Método de E-test
Es un método más reciente, es una combinación de características de los métodos anteriores. Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico.
El microorganismo se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Se incuba durante 16-24 horas a 35ºC y se valora la zona de inhibición alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente el crecimiento.
E-Test
Métodos automatizados
La mayoría de estos métodos utilizan sistemas de microdilución en medio líquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia). Anteriormente se hacia por lectura óptica del técnico a través de un espejo invertido.
Son sistemas fáciles y rápidos, generalmente automatizada o semiautomatizada. Son métodos ideales para grandes volúmenes de trabajo. Una de sus grandes limitaciones es que sólo ofrecen garantía para investigar microorganismos de crecimiento rápido y que no tengan requerimientos especiales.
