METODOLOGIA SEGÚN Shimeru Kamihira Y Col. 2009

1. Las muestras procesadas fueron cDNA de 19 muestras con Ph+ (mutación conocida), 10 eran especímenes con mutaciones conocidas, de los cuales 8 correspondían a tejido fresco de 6 pacientes con LMC, 2 de pacientes con LLA. Además se evaluó 1 muestra de la línea celular K562 de leucemia Ph +.

2. La extracción de ARN totalse realizo a partir de leucocitos totales lisados utilizando tiocianato de Guanidino y el método ISOGEN.

3. El cDNA fue sintetizado conprimersoligo-dT y el kit para transcripción reversa Superscript III de Invitrogen.

4. Una vez se obtuvo el cDNA, se procedio a realizar el ensayo HRM teniendo como blanco de interés la región TKD de ABL quimérico, con el fin de detectar la mutación, a través de los siguientes 2 pasos:

PRIMER PASO: El screening de la alteración genética se hizo mediante análisis HRM según la figura 1, se explica así:

A- Mediante PCR NESTED, se amplifico selectivamente una parte del dominio TDK (tirosinKinasa) de BCR-ABL quimérico.

B- Se realizó la segunda PCR para el ensayo HRM, utilizando como templado los productos amplificados de BCR-ABL quimérico, generando 4 amplicones HRM-1, 2, 3 y 4( AnexoMetodología Polakova y Col.).

C- El análisis de HRM se realizó mediante la aplicación Gene scanning en el equipo LygthCycler.

D- SEGUNDO PASO: únicamente las muestras positivas que se les hizo screeneng mediante HRM se secuenciaron directamente.

Primero que todo a cada muestra se le evaluó el estatus de BCR-ABL quimérico por el método convencional (Anexo metodología deYanada, y Col). De las muestras que fueron positivas para los tipos quiméricos, mayor o menor, se amplificaron selectivamente los dominios kinasaBCR-ABL,

generando fragmentos de BCR-ABL de 1504 bp para b2/a2 y de 1579 bp para b3/a2.

METODOLOGÍA DE Machova Polakova y Col

METODOLOGÍA DE Yanada, y Col

METODOLOGÍA DE Towatari, y Col 18

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Polakova y Col. High-resolution melt curve analysis: Initial screening for mutations in BCR-ABL kinase domain. Leukemia Research 32 (2008) 1236–1243. Leukemia Research. LEUKEMIA RESEARCH , 32 (2008) 1236-1243.

Yanada, y Col. High Complete Remission Rate and Promising Outcome by

Combination of Imatinib and Chemotherapy for Newly Diagnosed BCR-ABL–Positive Acute LymphoblasticLeukemia: A Phase II Study by the Japan Adult LeukemiaStudy Group. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY.volume 24, number 3 january 20, 2006.

Towatari, y Col. Combination of intensive chemotherapy and imatinib can rapidly induce high-quality complete remission for a majority of patients with newly diagnosed BCR-ABLpositive acute lymphoblastic leukemia .BLOOD .2004 104: 3507-3512.

OSUMI y Col.Rapid Screening of Leukemia Fusion Transcripts in Acute Leukemia by Real-time PCR.Leukemia and Lymphoma. 2002 VOL. 43 (12), pp. 2291-2299

METODOLOGIA A DESARROLLAR SEGÚN Shimeru Kamihira Y Col. 2009

1. Extracción de ARN total a partir de leucocitos totales lisados utilizando tiocianato de Guanidino y el método ISOGEN.

2. Síntesis de cDNA con primersoligo-dT y el kit para transcripción reversa Superscript III de Invitrogen.

3. ensayo HRM teniendo como blanco de interés la región TKD de ABL quimérico, con el fin de detectar la mutación, a través de los siguientes 2 pasos:

PRIMER PASO: Screening de la alteración genética mediante análisis HRM según la figura 1, usando LightCycler 480 (Roche Molecular System, Alameda, CA, USA), para termociclaje en tiempo real.

SEGUNDO PASO: únicamente las muestras positivas que se les hizo screeneng mediante HRM se secuenciaron directamente.

Figura 1. DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO realizado por Shimeru Kamihira Y Col. 2009:

EXPLICACIÓN DEL PROCEDIMIENTO:

1. A todas las muestras se les examino el estatus de BCR/ABL quimérico, mediante el método convencional utilizado por Yanada y Col.

Yanada y Col. Evaluaron el número de copias en muestras de BM, mediante RT-PCR tiempo real (RQ-PCR) en los días 28 y 63 del curso de inicio de remisión, después del primer y tercer ciclo de C1 y C2, luego de un año de tratamiento, y al final del curso de la terapia. La extraccion del RNA total se hizo a partir de células mononucleares y se transcribió a cDNA. El ensayo RQ-PCR se realizó con la tecnología TaqMan (PE Biosystems, Foster City, Ca). Los primers y la detección con sondas la realizaron de acuerdo a la metodología de Towatari, y Col.

Towatari, y Col. obtuvieron ARN a partir de células mononucleares en BM que se transcribio a cDNA y realizaron RQ-PCR Multiplex. Utilizaron doce pares de primers para la detección de diferentes genes, entre ellos mayor y menor BCR-ABL y GAPDH como control interno. El número de copias de la transcripción se normalizó por medio de GAPDH. Los primers utilizados fueron los siguientes:

PRIMERS AMPLIFICAR LA REGION MAJOR (M-BCR-ABL)(Towatari, y Col)

Primer FOWARD Mj-F13: GATGCTGACCAACTCGTGTGTG

Primer reverse ABL 21: TGGCCACAAAATCATACAGTGCCOMPLEMENTARIA: ACCGGTGTTTTAGTATGTCACGInvertida GCACTGTATGATTTTGTGGCCA

Major-P: CCTTC AGCGGCCAGTAGCATCTGACTTT

PRIMERS AMPLIFICAR LA REGION MENOR (m-BCR-ABL) (Towatari, y Col)

Primer FOWARD minor-F1: ATCGTGGGCGTCCGCAAGAC

Primer reverse ABL 22: GCTCAAAGTCAGATGCTACTGCOMPLEMENTARIA: CGAGTTTCAGTCTACGATGACInvertida CAGTAGCATCTGACTTTGAGC

Minor-P1: CGCCCTCGTCATCGTTGGGCCAGATCT

Según Towatari, y Col. el ARN total fue extraído a partir de células mononucleares en BM y transcritas a ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo de RQ-PCR Multiplex se realizó con la tecnología TaqMan siguiendo lo descrito por OSUMI y Col.

De acuerdo a OSUMI y Col. los primers y las sondas TaqMan para cada transcrito de fusión, y para WT1 y GAPDH se muestran en la figura. 1. Todos los cebadores y sondas se sintetizaron por Griner Japón (Tokyo, Japón). La mezcla de reacción con un volumen total de 25 l contenía 2,3 l de cADN (correspondiente a 100 ng de ARN), 7.5pmol de primer foward y reverso, 5 pmol de sonda Ta Man y 12,5l de Master Mix de PCR TaqMan Universal 2X (PE Biosystems, Foster City, CA). La amplificación se realizó con una activación inicial de la polimerasa a 50 ° C durante 2 min y 95 º C durante 10 min, seguido por 50 ciclos en dos pasos: 95 ° C durante 15 s y 60 º C durante 1 min. Los espectros de emisión fluorescente fueron controlados cada 7s y se analizaron utilizando el sistema PRISM7700 con el software Sequence Detection System (ver. 1.6.3. PE Biosystems).Además de los cADN de las muestras, en las placas de 96 pozos de PCR incluyeron un control negativo (H2O), los controles positivos (lOOO copias/pozo de ADN de plásmido por cada transcrito de fusión y WT1 y 10.000 copias/pozo para GAPDH) y un control de la transcripción inversa (GAPDH cDNA: 10,000 copias/pozo de mRNA de voluntarios sanos convertidas en cADN mediante transcripción inversa en paralelo con los ARN de la muestra).Para la cuantificación de los transcripto se realizó clonación de los fragmentos de cADN amplificados en el vector pCRII.

2. Las muestras que fueron positivas para la región mayor o menor en los dominios de Kinansa de BCR-ABL, se amplificaron selectivamente, generando un fragmento de 1504 bp para b2/a2 y 1579 bp para b3/a2, utilizando primers previamente reportados por Rulcova J.

Rulcova J y Col. realizaron una RT-PCR Real-time para BCR-ABL, incluyendo genes de control total-ABL, beta-2-microglobulina y de la glucuronidasa y utilizando primers, sondas y plasmídos de acuerdo con el protocolo de Europa contra el cáncer, según como lo cita J Gabert y Col y E Beillard y Col.

J Gabert y Col. utilizaron primers y sondas para amplificar m-bcr y M-bcr de BCR-ABL, como se muestra a continuación:

3. Para el análisis HRM, se recomiendan productos de 50 – 250 bp de longitud para una mejor discriminación. Por lo tanto se aplicó el método previamente reportado por Polakova y Col, generando 4 amplicones, designados como HRM1,2,3 y 4 de 220,225, 239, y 241 bp, correspondientes a nt 629-848, 830-1064, 1030-1268 y 1266-1506 respectivamente, tomaron la referencia NM_005157 que en pubmed corresponde a la secuencia de mRNA del oncogen c-abl.

Polakova y Col. Realizaron una amplificación selectiva de la región Kinasa del gen BCR-ABL, antes de hacer secuenciación y HRM. Los primers que utilizaron en dicha amplificación fueron los mismos que anteriormente cito Rulcova J y Col.

Para la secuenciación Polakova y Col. tomaron los fragmentos amplificados selectivamente y los usaron como templado (1000 × diluido que fueron visibles bajo luz UV después de electroforesis en agarosa), para amplificar la región KD utilizando los primers foward 5’-ACAGCATTCCGCTGACCATCAATA-3’ y de nuevo diseño reverse 5´-GATACTGGATTCCTGGAACA-3’. Un producto de PCR d e914 bp fue purificad utilizando el kit QIAquick PCR purification (Qiagen). Una reacción de secuenciación de ciclos se preparó con los mismos primers utilizando el kit BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del inserto. Los productos de secuencia fueron purificados con el kit DyeEx 2.0 Spin (Qiagen). Las muestras fueron incubadas a 55 ◦C por 30–60 min para secar los productos de secuenciación, que se disolvieron en 25ul de formamida (Applied Biosystems) y denaturados a 96°C por 1min. La secuenciación de ambas cadenas se llevó a cabo en un secuenciador 3130 (Applied Biosystems). Las secuencias fueron evaluadas con el programa Mutation Surveyor (SoftGenetics, State College, PA, USA). La sensibilidad de la secuencia con la detección de mutaciones usando el programa fue probado con mezclas de cDNA que contenian 75%, 50%, 20%, 15%, 10% and 5% de BCR-ABL mutante diluido con cDNA BCR-ABL wild type, respectivamente. Las cantidades de cDNA BCR-ABL mutante y wild type fueron analizados por RT-PCR tiempo real tal como lo describe Rulcova J y Col. mencionado anteriormente.

Posteriormente para el ensayo HRM Polakova y Col. hacen la recomendación de usar productos de PCR de hasta 250bp para una mejor discriminación. Por lo tanto, 4 pares de primers fueron nuevamente diseñados utilizando la herramienta de WWW primer 3

citada por Rozen S y Col. Una secuencia con número de acceso M14752 (NCBI databank) se usó como referencia. Para una mejor identificación designaron los pares de primers y fragmentos de PCR como: HRM1-HRM4, como se muestra a continuación:

Los primers utilizados por Polakova y Col. fueron los siguientes:

PRIMERS PARA LOS AMPLICONES HRM1-HRM4

* Primers para HRM1 (para un fragmento de 221 bp, correspondiente a los nt 989–1209 y cubre los aminoacidos P216-E275 (2)):

Forward 5´ -CTCATCACCACGCTCCATTA-3’ Reverse 5´ -TCTTCCACCTCCATGGTGTC-3’

* Primers para HRM2 (para un fragmento de 225 bp, correspondiente a los nt 1191–1415 y cubre los aminoacidos F283-M343 (3)): Forward: 5´ -ACACCATGGAGGTGGAAGAG-3´Reverse 5´-TGGCTGACGAGATCTGAGTG-3´

* Primers para HRM3 ( para un fragmento de 239 bp, correspondiente a los nt 1391–1629 y cubre los aminoácidos A350-K415; (4) ):

Forward 5´-ATGGCCACTCAGATCTCGTC-3´Reverse 5´-ACGTCGGACTTGATGGAGAA-3´

* Primers para HRM4 (para un fragmento de 241 bp, correspondiente a los nt 1627–1867 y cubre los aminoácidos L429-T495):

Forward 5´-CGTCTGGGCATTTGGAGTAT-3´Reverse 5´-ACTGGATTCCTGGAACATTG-3’

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

E Beillard y Col. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using ‘real-time’ quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) – a Europe against cancer program. LEUKEMIA (2003) 17, 2474–2486

J Gabert y Col. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – A Europe Against Cancer Program. LEUKEMIA (2003) 17, 2318–2357 & 2003 Nature Publishing Group All rights

OSUMI y Col. Rapid Screening of Leukemia Fusion Transcripts in Acute Leukemia by Real-time PCR. LEUKEMIA AND LYMPHOMA. 2002 VOL. 43 (12), pp. 2291-2299

Polakova y Col. High-resolution melt curve analysis: Initial screening for mutations in BCR-ABL kinase domain. Leukemia Research 32 (2008) 1236–1243. Leukemia Research. LEUKEMIA RESEARCH, 32 (2008) 1236-1243.

Rozen S, Skaletsky HJ. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 2000;132:365–86.

Rulcov´a y Col. The effect of total-ABL, GUS and B2M control genes on BCR-ABL monitoring by real-time RT-PCR. LEUKEMIA RESEARCH, 31 (2007) 483–49.

Towatari, y Col. Combination of intensive chemotherapy and imatinib can rapidly induce high-quality complete remission for a majority of patients with newly diagnosed BCR-ABLpositive acute lymphoblastic leukemia .BLOOD .2004 104: 3507-3512.

Yanada, y Col. High Complete Remission Rate and Promising Outcome by Combination of Imatinib and Chemotherapy for Newly Diagnosed BCR-ABL–Positive Acute LymphoblasticLeukemia: A Phase II Study by the Japan Adult LeukemiaStudy Group. JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY.volume 24, number 3 january 20, 2006.

DIAGRAMA DE FLUJO METODOLOGIA HRM

Foward : 5’-ACAGCATTCCGCTGACCATCAATA-3’ Reverse: 5´-GATACTGGATTCCTGGAACA-3’

EXTRACCIÓN DE ARN de leucocitos totales lisados (Shimeru y Col. 2009)

SINTESIS DE cDNA (Shimeru y Col. 2009)

1. DETECCIÓN DE BCR/ABL (Yanada y Col.)

Con tiocianato de Guanidino y el método de ISOGEN

Con el Kit Superscript III (Invitrogen) para transcripción reversa

Evaluación del número de copias BCR/ABL de muestras de BM.

Mediante la tecnología TaqMan (PE Biosystems, Foster City,Ca)

Mediante RT-PCR tiempo real para amplificar: la Región Mayor (M) y menor (m) BCR-ABL

2. AMPLIFICACIÓN SELECTIVA (Rulcova y Col.) y (Gabert y Col.)

3. SECUENCIACION (Polakova y Col.) Fragmentos amplificados selectivamente visualizados en electroforesis con gel de agarosa

Fragmentos amplificados se usaron como templados para amplificar KD, con los siguientes primers:

PRIMERS PARA LOS AMPLICONES HRM1-HRM4 (Polakova y Col.)

4. ENSAYO HRM (Polakova y Col.)

Mediante el Kit QIAquick PCR purification (Qiagen).

SECUENCIA Utilizando el Kit BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems)

1ra PURIFICACIÓNFragmento de 914 bp

2da PURIFICACIÓN Con el kit DyeEx 2.0 Spin (Qiagen).

Se recomienda usar productos de PCR hasta 250 bp para una mejor discriminación

Se utilizó como referencia una secuencia con acceso M14752 (NCBI databank) Los pares de primers y fragmentos se designaron HRM1- HRM4, así:

* Primers para HRM1 (para un fragmento de 221 bp, correspondiente a los nt 989–1209 y a los aminoacidos P216-E275 (2)):

Forward 5´ -CTCATCACCACGCTCCATTA-3’ Reverse 5´ -TCTTCCACCTCCATGGTGTC-3’

* Primers para HRM2 (para un fragmento de 225 bp, correspondiente a los nt 1191–1415 y a los aminoacidos F283-M343 (3)): Forward: 5´ -ACACCATGGAGGTGGAAGAG-3´Reverse 5´-TGGCTGACGAGATCTGAGTG-3´

* Primers para HRM3 ( para un fragmento de 239 bp, correspondiente a los nt 1391–1629 y a los aminoácidos A350-K415; (4) ):

Forward 5´-ATGGCCACTCAGATCTCGTC-3´Reverse 5´-ACGTCGGACTTGATGGAGAA-3´

* Primers para HRM4 (para un fragmento de 241 bp, correspondiente a los nt 1627–1867 y a los aminoácidos L429-T495):

Forward 5´-CGTCTGGGCATTTGGAGTAT-3´Reverse 5´-ACTGGATTCCTGGAACATTG-3’

METODOLOGÍA PARA la DETECCIÓN DE BCR/ABL

El procedimiento que se debe llevar a cabo es:

1. Extraer ARN a partir de leucocitos lisados totales mediante un kit establecido para dicho procedimiento.

2. Realizar la retro-transcripción del ARN extraído a ADNc, utilizando primers oligo-dT y la tecnología Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen).

3. Evaluar el número de copias de BCR/ABL utilizando el ADNc, mediante RT-PCR tiempo real (RQ-PCR). El número de copias de transcripto fue normalizado por medio de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), y convertido en moléculas/g de ARN. El umbral para la cuantificación fue de 50 copias /g de ARN, correspondiente a una sensibilidad de 10 -5. Los niveles por debajo del umbral se diferenciaron en no detectado y detectado pero no cuantificable y la PCR negativa se categorizo como la primera.

Los primers y sonda utilizados para la amplificación de GAPDH son:

Además de utilizar GAPDH como control interno para evaluar el número de copias del transcripto, también se puede utilizar beta-2-microglobulina (B2M). Para su amplificación se presentan los siguientes primers y sonda:

4. A partir de las muestras positivas para BCR/ABL, llevar a cabo la amplificación selectiva de la región mayor y menor de BCR/ABL (M-BCR-ABL y m-BCR-ABL), mediante RT-PCR multiplex en tiempo real, utilizando los siguientes primers y sondas:

Según Towari:

Para la región MAYOR de BCR-ABL (M-BCR-ABL):

Primer Foward: Mj-F13 (GATGCTGACCAACTCGTGTGTG),Primer Reverse: ABL-R21 (TGGCCACAAAATCATACAGTGC),Sonda: major-P (CCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTT)

Para la región menor de BCR-ABL (m-BCR-ABL):

Primer Foward: minor-F1 (ATCGTGGGCGTCCGCAAGAC),Primer Reverse: ABL- R22 (GCTCAAAGTCAGATGCTACTG), Sonda: minor-P1 (CGCCCTCGTCATCGTTGGGCCAGATCT)

Según (Rulcova y Col.) y (Gabert y Col.):

5. Posteriormente realizar otra PCR para el ensayo HRM (Según Polakova y Col), utilizando como templado los productos de BCR/ABL antes amplificados (se recomienda hasta 250 bp) y pares de primers para los siguientes 4 fragmentos (amplicones) designados como HRM1, HMR2, HMR3 y HRM4:

Los primers designados para estos cuatro (4) amplicones son los siguientes:

* Primers para HRM1 (para un fragmento de 221 bp, correspondiente a los nt 989–1209 y los aminoácidos P216-E275):

Forward 5´ - CTCATCACCACGCTCCATTA-3’ Reverse 5´ - TCTTCCACCTCCATGGTGTC-3’

* Primers para HRM2 (para un fragmento de 225 bp, correspondiente a los nt 1191–1415 y los aminoácidos F283-M343): Forward: 5´ - ACACCATGGAGGTGGAAGAG-3´Reverse 5´- TGGCTGACGAGATCTGAGTG-3´

* Primers para HRM3 (para un fragmento de 239 bp, correspondiente a los nt 1391–1629 y los aminoácidos A350-K415):

Forward 5´ - ATGGCCACTCAGATCTCGTC -3´Reverse 5´ - ACGTCGGACTTGATGGAGAA -3´

* Primers para HRM4 (para un fragmento de 241 bp, correspondiente a los nt 1627–1867 y los aminoácidos L429-T495):

Forward 5´ - CGTCTGGGCATTTGGAGTAT-3´Reverse 5´ - ACTGGATTCCTGGAACATTG-3’

6. Posteriormente realizar otra PCR para el ensayo HRM (Según Polakova y Col), utilizando como templado los productos de BCR/ABL antes amplificados (se recomienda hasta 250 bp) y pares de primers para los siguientes 4 fragmentos (amplicones) designados como HRM1, HMR2, HMR3 y HRM4: