E ZO DD OA TT EL CU NC IAAF

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LA MOLINA

METODOLOGÍA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO

APLICABLE EN ESTUDIOS DE NUTRICIÓN DE RUMIANTES

METODOLOGÍA DE DIGESTIBILIDAD IN VITRO APLICABLE EN

ESTUDIOS DE NUTRICIÓN DE RUMIANTES

Haydeé González Gonzales, Mg. Sc.

Médico Veterinaria

Especialista en Nutrición

Carlos Vílchez Perales, Ph.D.

Profesor Principal

Departamento Académico de Nutrición

i

ÍNDICE

ÍNDICE i

ÍNDICE DE FIGURAS ii

INTRODUCCIÓN 1

Digestibilidad in vitro 2

Reseña de métodos de digestibilidad in vitro desarrollados 2

Generalidades de la metodología descrita por Tilley & Terry 5

Protocolo de la metodología de digestibilidad in vitro descrita por

Tilley & Terry y modificada por Van Soest. 6

BIBLIOGRAFÍA 12

ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág

Figura 1. Reactivos y saliva artificial de McDougall. 9

Figura 2. Saliva artificial en Baño de María a 39º C. 9

Figura 3. Colección del contenido ruminal del ovino donador. 9

Figura 4. Filtrado del contenido ruminal. 9

Figura 5. Preparación del inóculo con una parte de fluido ruminal y cuatro

de saliva artificial. 9

Figura 6. Matraces Erlenmeyer en el desecador. Nótese el rótulo y el contenido con

muestra molida. 9

Figura 7. Matraz con muestra y accesorios para la instalación del procedimiento. 10

Figura 8. Primera fase del procedimiento. Incubación de las muestras en Baño de

María durante 48 horas. 10

Figura 9. Homogenización manual de las muestras. 10

Figura 10. Muestras en refrigeración. 10

Figura 11. Segunda fase del procedimiento. Digestión de fibra durante una hora. 10

Figura 12. Filtrado de muestras con agua destilada caliente y acetona. 10

Figura 13. Crisoles en estufa durante el proceso de secado de 24 horas. 10

Figura 14. Pesado de crisol con muestra seca. 10

1

INTRODUCCIÓN

El método más representativo de evaluar la calidad nutritiva del forraje es el

estudio del rendimiento o respuesta animal a largo plazo en relación al propósito

productivo. Debido a la influencia de diversos factores en la respuesta animal, como la

calidad y cantidad de forraje, potencial animal y suplementos nutricionales; la calidad

nutritiva se evalúa convencionalmente en forma indirecta a través de variables

relacionadas al rendimiento animal, como el consumo voluntario y la digestibilidad de

nutrientes.

En el estudio de de los factores mencionados, se evidencia que la digestibilidad

del forraje es el resultado de diversos factores que interactúan en la adecuada digestión

y absorción de los nutrientes y condicionan la tasa de consumo del alimento por parte

del animal, eventos que comprende el estudio de la digestibilidad in vivo. Al respecto,

los métodos de digestibilidad in vitro permiten simular eficientemente estas condiciones

químicas y fisiológicas de los compartimientos digestivos del rumiante y los efectos de

éstas sobre los alimentos; permitiendo el estudio y evaluación de los procesos digestivos

simulados, así como, de los productos logrados en estos procesos. En consecuencia, el

desarrollo de métodos de laboratorio que logren simular estos factores es de suma

importancia en el estudio de la nutrición del rumiante. En el estudio de los sistemas de

producción, el obtener información respecto al aprovechamiento de los nutrientes

presentes en el alimento ofrecido es necesario a fin de plantear estrategias de

alimentación que garanticen el desarrollo óptimo del animal y que al mismo tiempo

permitan controlar los efectos sobre el medio ambiente. El complejo aparato digestivo

de los rumiantes, así como la variabilidad en la composición de los pastos y forrajes

condicionan el adecuado aprovechamiento de éstos. Los aparatos y las técnicas

implicadas en estos estudios han evolucionado conjuntamente con la tecnología de la

época y los objetivos de estudio, en relación a las prioridades económicas de la época.

En la presente revisión científica se presentan aspectos generales de diversos

métodos desarrollados, describiéndose principalmente el método desarrollado por Tilley

y Terry, el cual se considera de gran confiabilidad al haber sido evaluado

estadísticamente, en relación a la digestibilidad obtenida in vivo.

2

I. Digestibilidad in vitro

El sistema de digestibilidad in vitro está constituido por un equipo en donde el

contenido ruminal y forraje en estudio son sometidos a procesos de incubación bajo

condiciones ambientales controlables con el objeto de predecir los procesos digestivos

obtenidos en el animal, digestibilidad in vivo (Fuller, 2004; Church & Pond, 1990). El

método puede estar constituido por un sistema de operación cerrado o abierto, así como,

por un sistema de flujo continuo, pudiendo en algunos métodos ser controlado por

sensores químicos (Fuller, 2004).

El sistema permite el estudio de diversos aspectos involucrados en la

digestibilidad in vivo, entre éstos se menciona a los productos de la fermentación

ruminal, el comportamiento de la microflora ruminal, la cinética de degradación de los

componentes del forraje y del alimento, la metanogénesis, entre otros. Los equipos más

complejos comprenden sistemas de diálisis de los productos para simular los procesos

de absorción y de intercambio gaseoso. De esta manera, es posible monitorear y

controlar la temperatura, pH y potencial redox del sistema, permitiendo también el

estudio de ecosistemas microbiales (Fuller, 2004).

II. Reseña de métodos de digestibilidad in vitro desarrollados

A inicios de 1950, los estudios se realizaron conjuntamente con la técnica de

colorimetría, comparando los resultados obtenidos con estándares de celulosa. Los

materiales que se utilizaron en los primeros métodos propuestos intentaban simular las

características físico-químicas del aparato digestivo del rumiante y los objetivos se

enfocaban hacia el entendimiento de la digestión de la fibra. Se evidenció la búsqueda

de un método de digestibilidad in vitro que ofreciera:

Suficiente sensibilidad para detectar el efecto de factores estimuladores de la

degradación de la fibra.

Corto periodo de fermentación,

Mantenimiento de la flora ruminal, y

Estudio de las características de la fibra, principalmente en relación a la

determinación de la fibra indigestible.

3

Louw en 1949 (citado en Huhtanen et al., 1954) utilizó un saco semipermeable para

suspender la muestra en un medio acuoso de crecimiento en donde la microflora

ruminal que introdujo en el procedimiento se mantenía durante 24 horas de incubación.

Huhtanen et al. (1954) modifican la técnica utilizando un saco de celofán conteniendo la

muestra de forraje y fluido ruminal, sumergidos en solución mineral, la saliva artificial

de McDougall.

Bourroughs en 1950 (citado en Huhtanen et al., 1954) realizó reposiciones diarias del

contenido ruminal y su procedimiento ofrecía un periodo fermentativo largo, y

determinación de materia seca digestible de muestras de forraje seco.

En 1963, Tilley y Terry presentan una descripción de ecuación de regresión lineal

simple, para otorgar información de digestibilidad in vivo en relación a la digestibilidad

in vitro obtenida en su procedimiento, el cual presentaba etapas de incubación

controladas con licor ruminal y pepsina.

Van Soest en 1963 (citado en Goering y Van Soest, 1970) modifica este procedimiento

realizando incubaciones con una solución detergente (FDN).

A partir de la década de 1970, los procedimientos planteados están referidos a:

Estudio de las concentraciones de gases.

Mantenimiento de la flora ruminal.

Czerkawski y Breckenridge (1977), presenta un procedimiento que ofrecía periodos

fermentativos cortos y medición de producción de gases, como metano. Posteriormente,

desarrolla el método Rusitec, el cual ofrecía periodos fermentativos largos, utilizando

diversos métodos anteriormente descritos para determinar concentración de ácidos

grasos volátiles, amoniaco y aminoácidos. Este aparato utilizaba bolsas de nylon

sumergidas en una mezcla de contenido ruminal, saliva artificial y agua, realizando

infusiones de saliva artificial en forma secuencial.

4

Nakamura y Kurihara (1978) logran el mantenimiento de la población de protozoos por

un largo periodo de tiempo fermentativo, así como la producción de ácidos grasos

volátiles.

Raab et al. (1983) logran la determinación de la degradación protéica mediante la

medición de la concentración de amonio y producción de gas.

Teather y Sauer (1988) estudian el mantenimiento de población de bacterias y protozoos

en un medio estratificado, similar al contenido ruminal.

A partir de 1990, con los resultados obtenidos de los métodos de digestibilidad in vitro,

se estima la digestibilidad in vivo mediante modelos matemáticos, y los objetivos se

enfocan en los siguientes aspectos, en relación a:

Estudio de los pastos.

Producción de gases.

Medidas de conservación climáticas.

En esta década, la tecnología permite realizar procedimientos de mayor precisión.

Beuvink y Kogut, en 1993 presentan el modelo Gompertz, el cual estima la

digestibilidad in vivo, en relación a la concentración de gas producido in vitro,

realizando un seguimiento de esta producción determinando fases de degradación

ruminal, las que muestran en curvas de producción de gas.

Pell y Schofield en 1993 (citados en Schofield et al., 1994) logra la determiación de la

producción de gases mediante sensores de presión conectados a un sistema de cómputo.

Mauricio, en 1999, presenta múltiples tecnologías en un modelo matemático para la

evaluación de la cinética de fermentación, a partir de la información obtenida acerca de

la producción de gases mediante un aparato que utiliza sensores de presión.

Muetzel (2008), presenta un sistema de fermentación cuya temperatura y pH son

controlados por computadora, así como el movimiento de la muestra, y la estratificación

del contenido. En este sistema, el movimiento del contenido es ejercido por un sistema

controlado por magnetos, y los gases producidos son conducidos por una válvula a una

5

celda en donde se realiza la medición de la concentración de metano e hidrógeno por

medio de sensores específicos.

III. Generalidades de la metodología descrita por Tilley & Terry

En 1963, Tilley & Terry presentan un procedimiento de digestibilidad in vitro

junto a la respectiva descripción de regresión lineal simple a fin de evaluar la

digestibilidad de los rumiantes y otorgar información de los valores de digestibilidad in

vivo en relación a los respectivos de su procedimiento. En la evaluación estadística

presentada por los autores se señala que los coeficientes in vitro e in vivo se encuentran

altamente correlacionados, presentando un coeficiente de correlación de Pearson entre

0,83 y 0,91. Esta metodología presenta etapas de incubación controladas con licor

ruminal y pepsina, posteriormente, Van Soest modifica este procedimiento realizando

incubaciones con una solución detergente (Goering y Van Soest, 1970).

Este procedimiento de digestibilidad in vitro, utilizado en forma universal,

consta de dos fases. La primera fase permite el estudio de la fracción fibrosa digestible

y la fracción soluble digestible. La segunda fase involucra la solubilización con pepsina

del residuo de la primera fase. De esta manera, se simula el desdoblamiento in vivo de

la proteína de la dieta y la producida por los microorganismos ruminales, así como, las

enzimas digestivas del abomaso. Esta segunda fase es modificada por Van Soest, al

reemplazar la solubilización con pepsina del residuo de la primera fase por una

determinación de fibra detergente neutro. En donde, la solución detergente neutro logra

disolver una mayor cantidad de materia seca en comparación con la solución pepsina

ácido, debido a que disuelve la pared celular de las bacterias y otros productos

endógenos. De esta manera, el procedimiento modificado ofrece el coeficiente de la

digestibilidad verdadera del forraje, mientras que el procedimiento original, el

coeficiente de digestibilidad aparente (Goering y Van Soest, 1970).

La ventaja de este método es que utiliza aparatos simples, es reproducible y

permite la evaluación de múltiples muestras en forma simultánea. Sin embargo, la

colección de licor ruminal y la dieta suministrada a los animales fistulados son los

principales factores que logran alterar los resultados, debido a que es necesaria la

normalización de la capacidad proteolítica del líquido ruminal dependiendo del material

a evaluarse (Chakeredza et al, 1998; Jarrige, 1981).

6

IV. Protocolo de la metodología de digestibilidad in vitro descrita por

Tilley & Terry y modificada por Van Soest.

El procedimiento de digestibilidad in vitro que se presenta a continuación

corresponde a la mencionada metodología, descrita por Tilley & Terry modificada por

Van Soest. En donde, se requiere la preparación de una solución similar a la saliva del

rumiante, denominada saliva artificial de Mc Dougall; y la obtención del fluido ruminal

mediante colección del mismo de un rumiante donador. Las fases de digestibilidad que

comprende el procedimiento se explican a continuación, según la experiencia práctica

basada en la descripción presentada por Goering, & Van Soest (1970).

El siguiente cuadro muestra el implemento necesario del procedimiento.

Cuadro 1: Equipo, materiales y reactivos del procedimiento de digestibilidad in

vitro.

EQUIPO MATERIALES REACTIVOS

Potenciómetro.

Equipo de Baño de

María.

Bomba de vacío.

Equipo de digestión de

fibra.

Termómetro.

Tanque de CO2.

Matraces Erlenmeyer de 125

ml.

Aros de acero.

Matraz de 1L.

Matraces Kitasato de 500 ml.

Tapones y tubos.

Mangueras.

Equipo de venoclisis.

Pinzas.

Pipeta de 1ml.

Gasa.

Embudos.

Fibra de vidrio

Termo portátil.

Bicarbonato de sodio.

Fosfato ácido de sodio

dehidratado.

Cloruro de potasio.

Cloruro de sodio.

Sulfato de magnesio

anhidro.

Cloruro de calcio.

Sulfato de amonio.

Glucosa.

Agua destilada.

Solución detergente neutra.

Decahidronaftaleno.

Acetona.

1. Preparación de la saliva artificial de Mc Dougall.

La preparación del buffer comprende la disolución de los siguientes reactivos en

un matraz de 1 L (Fig. 1).

Bicarbonato de sodio (9,8 g.).

Fosfato ácido de sodio dehidratado (4,65 g.).

7

Cloruro de potasio (0,57 g.).

Cloruro de sodio (0,47 g.).

Sulfato de magnesio (0,059 g.).

Sulfato de amonio (0,17 g.).

Glucosa (0,5 g.).

Seguidamente, se adiciona 1 ml de Cloruro de calcio al 4%.

La solución obtenida se lleva a proceso de incubación en Baño de María a 39°C

(Fig.2).

Simultáneamente, se introduce CO2 durante una hora.

2. Preparación del fluido ruminal

Se alimenta a un rumiante fistulado con media ración de forraje a primeras horas

de la mañana.

Se colecta fluido ruminal en un termo conservador atemperado a una

temperatura de 39° C, luego de dos horas de la alimentación del ovino, evitando

la exposición al oxígeno (Fig.3).

Se filtra 200 ml del fluido ruminal en un matraz de 1 L, previamente calentado a

39° C, a través de una capa de fibra de vidrio envuelta en varias capas de gasa

(Fig. 4).

Se introduce CO2 al matraz, conteniendo el filtrado, por un minuto.

3. Primera fase del proceso de digestibilidad in vitro.

Se prepara el inóculo, con una parte de fluido ruminal y cuatro partes de saliva

artificial Mc Dougall, en un matraz de 1L (Fig. 5).

El inóculo se lleva a incubación en Baño de María a 39°C, adicionando CO2

durante 10 minutos.

Se rotula cada uno de los matraces Erlenmeyer de 125 ml del estudio con un

código respectivo.

Se pesa aproximadamente 0,5 g. de muestra seca, molida a 1 mm. de diámetro,

en cada uno de los matraces (Fig. 6 y Fig. 7).

Se adiciona 2 ml de agua destilada a cada matraz.

Los matraces se llevan a incubación en Baño de María a 39° C (Fig. 8).

Se adiciona 50 ml de inóculo y CO2 a cada matraz, en un sistema cerrado.

8

Se añade CO2 adicional por 15 segundos para desplazar el oxígeno que pudiera

estar presente en los matraces.

Transcurrida una hora de incubación, se homogeniza el contenido de los

matraces en sentido rotatorio. Esta operación se realiza tres veces el primer día y

cada 8 horas el segundo día (Fig. 9).

Transcurridas 48 horas de incubación, se retira los matraces de la cámara de

incubación y se conservan cubiertos en refrigeración hasta la instalación de la

segunda fase del procedimiento (Fig. 10).

4. Segunda fase del proceso de digestibilidad in vitro.

Se retira la cubierta protectora de los matraces y se lavan con un mínimo de agua

destilada a fin de recuperar las partículas de muestra adheridas a la pared del

matraz.

El contenido de los matraces se traslada a vasos de precipitado Kitasato de 500

ml, adecuadamente rotulados, y se lavan con 100 ml de solución detergente

neutra hasta completar un volumen de 150 ml.

Se añade 2 ml de decahidronaftaleno a cada uno de los vasos Kitasato y se

colocan en el equipo de digestión de fibra por una hora (Fig. 11).

Se filtra el contenido de cada vaso en un crisol de porosidad gruesa de 50 ml,

adecuadamente rotulado, realizando lavados sucesivos con agua destilada

caliente y dos veces con 100 ml de acetona (Fig. 12).

Los crisoles se llevan a proceso de desecación en estufa a 105°C por 24 horas

(Fig. 13).

Transcurrido el tiempo, se dejan enfriar en el desecador y se pesan (Fig. 14).

9

Fig.1. Reactivos y saliva artificial de

McDougall.

Fig. 3. Colección del contenido ruminal del

ovino donador.

Fig. 5. Preparación del inóculo con una

parte de fluido ruminal y cuatro de saliva

artificial. Nótese la conexión a la vía de

CO2.

Fig.2. Saliva artificial en Baño de María a

39º C. Nótese el termómetro en la cámara.

Fig. 4. Filtrado del contenido ruminal.

Fig. 6. Matraces Erlenmeyer en el

desecador. Nótese el rótulo y el contenido

con muestra molida.

10

Fig. 7. Matraz con muestra y accesorios

para la instalación del procedimiento.

Fig. 9. Homogenización manual de las

muestras.

Fig. 11. Segunda fase del procedimiento.

Digestión de fibra durante una hora.

Fig. 13. Crisoles en estufa durante el

proceso de secado de 24 horas.

Fig. 8. Primera fase del procedimiento.

Incubación de las muestras en Baño de

María durante 48 horas.

Fig. 10. Muestras en refrigeración. Nótese

la cubierta protectora de cada matraz.

Fig. 12. Filtrado de muestras con agua

destilada caliente y acetona.

Fig. 14. Pesado de crisol con muestra seca

11

5. Determinación de la digestibilidad in vitro

Se calcula el coeficiente de digestibilidad in vitro según la siguiente fórmula (Goering,

& Van Soest, 1970):

DIV (MS) = (PIMS – PRS)/ PIMS x 100

En donde,

PIMS: Peso inicial de la muestra seca.

PRS: Peso de residuo seco.

DIV (MS): Digestibilidad in vitro, en materia seca.

A continuación se muestra una tabla modelo para la introducción de los datos del

experimento.

Nº. Matraz Nº.Muestra A: Peso Seco (g) B: Peso de Crisol (g) C: Peso Crisol con Residuo (g)

En donde se deben considerar las siguientes relaciones:

A = Peso inicial de la muestra seca.

C-B = Peso de residuo seco.

12

BIBLIOGRAFÍA

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