mecanismo de quimioprevenciÓn del ester fenetÍlico...

2° Congreso Nacional de Química Médica Beltrán-Ramírez y col.

MECANISMO DE QUIMIOPREVENCIÓN DEL ESTER FENETÍLICO DEL ÁCIDO CAFÉICO (CAPE) EN LA

INICIACIÓN DE UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS:

ALTERACIÓN DE LOS CYP450

Olga Beltrán Ramírez1, Javier Hernández Martínez

3, Adolfo Sierra Santoyo

2, Saúl Villa

Treviño1.

1 Departamento de Biología Celular, CINVESTAV-IPN, México, DF,

2 Sección Externa

de Toxicología, CINVESTAV-IPN, México, DF, 3 Dirección de Tecnología de Alimentos de

Origen Animal, CIAD, AC, Hermosillo, Sonora, México, Autor principal. Mail: [email protected], [email protected]

RESUMEN

El ester fenetílico del ácido caféico (CAPE), es un componente del propóleo, con actividad anticarcinogénica y quimioprotectora en la iniciación y promoción del modelo modificado del hepatocito resistente. La información sobre su mecanismo de acción es limitada. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el efecto de (dietilnitrosamina) DEN y CAPE sobre los citocromos P450 (CYP) en la etapa de iniciación del proceso de hepatocarcinogénesis. Un grupo de ratas fueron pretratadas 12 hr antes de DEN (200 mg/kg) con 20 mg/kg de CAPE, se continuó con el modelo hasta el día 24, se les extrajo el hígado y se realizó una tinción histoquímica para GGT. Otro grupo de ratas fueron pretratadas igual y sacrificadas 0, 12 y 24 hr después de DEN, se les extrajo el hígado y se hizo una tinción histoquímica con hematoxilina-eosina y se prepararon microsomas. CAPE disminuyó 70% de las lesiones preneoplásicas y previno la necrosis producida 24 hr después de DEN. DEN disminuyó 30% los CYP totales y disminuyó las actividades de CYP1A2 y CYP2E1 a las 12 y 24 hr, y de CYP1A1 a las 24 horas. Por otro lado incrementó la actividad de CYP2B1/2B2 tanto a las 12 como a las 24 hr, lo cual sugiere que este CYP podría estar participando en la bioactivación del carcinógeno. El pretratamiento con CAPE, disminuye el 30% del CYP total y reduce la actividad de CYP1A1/2, CYP2B1/2, ambos involucrados en el metabolismo de DEN. A 12 hr después de DEN, CAPE continuó disminuyendo la actividad de CYP1A1/1A2. A las 24 hr después de DEN, cuando éste está totalmente metabolizado continua la disminución de la actividad de CYP1A1. Nuestros resultados sugieren que el mecanismo de acción del CAPE, consiste en modificar la bioactivación del DEN impidiendo su daño e impidiendo así el desarrollo del proceso de hepatocarcinogénesis.

Palabras claves: CAPE (Ester fenetílico del ácido caféico), CYP (citocromo P450), Quimioprevención.

INTRODUCCIÓN

Más de un millón de personas desarrollan cáncer cada año. En Norte América, aproximadamente uno de cada dos hombres y una de cada tres mujeres, desarrollarán algún tipo de cáncer en un punto de su vida. Los factores de riesgo para ésta enfermedad incluyen, edad, sexo, historia médica familiar, hábitos alimenticios, uso de tabaco y alcohol, exposición al sol, etc. Entre más pronto se detecte y se trate, el paciente tendrá mayor oportunidad de una cura o tratamiento, pero en cualquiera de los casos, la prevención de la enfermedad es la mejor opción.


El término de quimioprevención se acuñó para describir una nueva disciplina en oncología, que consiste en el uso de compuestos sintéticos o naturales para inhibir, retardar o revertir la carcinogénesis. La quimioprevención se basa en la hipótesis de que la interrupción de los eventos biológicos involucrados en la carcinogénesis inhibirá este proceso y reducirá la incidencia de cáncer (1-3). Los quimioprotectores se han detectado frecuentemente cuando se estudia el efecto de sustancias purificadas de extractos de productos naturales a los cuales la medicina alternativa ha atribuido propiedades terapéuticas. Este es el caso del propóleo y de sus componentes. Uno de los componentes del propóleo más estudiados en los últimos 10 años, es el éster fenetílico del ácido caféico (CAPE), compuesto fenólico, que posee un amplio espectro de actividades biológicas, incluyendo las de quimioprevención y reversión de tumores (4).

Su efecto anticancerígeno ha sido estudiado en una gran variedad de casos, observando en todos ellos efectos favorables, pero el mecanismo por el cual el CAPE produce esa respuesta es poco clara. Este compuesto también ha sido probado como agente quimioprotector del cáncer en el modelo modificado del hepatocito resistente de Semple-Roberts que induce hepatocarcinogénesis química (5, 6).

En el modelo se administra una dosis de 200 mg/kg de N-dietilnitrosamina (DEN) como carcinógeno iniciador al día cero, luego se administran una dosis diaria de 20 mg/kg de 2-acetilaminofluoreno (2AAF) como promotor en los días 7, 8 y 9 del tratamiento, se realiza una hepatectomía parcial al día 10 como estímulo promotor también y finalmente las ratas se sacrifican al día 25 para observar la presencia focos de hepatocitos alterados GGT+ (FHA-GGT+), los cuales se consideran posibles lesiones preneoplásicas (Fig. 1).

Fig. 1.- Esquema de tratamiento del modelo del Hepatocito Resistente.

El CAPE se ha utilizado como agente quimioprotector en la etapa de iniciación del modelo modificado del hepatocito resistente (7), donde muestra una inhibición notable de la inducción de FHA-GGT+ (84%) en ratas Wistar macho, al administrar una sola dosis de 20 mg/kg del compuesto 12 horas antes de la administración de DEN. El posible mecanismo de quimioprevención es desconocido hasta el momento.

A través de este trabajo se trató de dilucidar si el mecanismo de acción del quimioprotector involucra la modificación de las isoformas de citocromos (CYP) que pueden estar participando en el metabolismo de DEN en la etapa de iniciación del proceso de hepatocarcinogénesis, o bien, conocer el efecto del carcinógeno sobre otras isoformas.

Las isoformas que participan en la bioactivación de DEN varían entre especies, entre los diferentes sistemas de estudio y también con las diferentes técnicas utilizadas, por lo que no esta definido con precisión cuales son las isoformas que participan en su metabolismo, pero se han propuesto las siguientes como las principales: CYP2E1, CYP1A1/1A2 y CYP2B1/2B2 (8-17).

25

DEN HP 2-AAF

7 8 9 10

SACRIFICIO

FHA GGT+

0


Un primer grupo de ratas Fisher-344, fueron pretratadas 12 h antes de DEN (200 mg/kg) con 20 mg/kg de CAPE, se continuó con el modelo hasta el día 24, se les extrajo el hígado y se realizó una tinción histoquímica para GGT.

Otro grupo de ratas fueron pretratadas igual que el anterior con CAPE y sacrificadas 0, 12 y 24 h después de DEN, se les extrajo el hígado, se prepararon microsomas para el análisis de los CYP y se preparó tejido para la tinción histoquímica con hematoxilina-eosina y así observar la integridad del tejido con y sin el quimioprotector.

Cuando administramos el tratamiento completo a las ratas de DEN, 2AAF y la hepatectomía parcial observamos un número elevado de FHA GGT+ (Fig. 2-A), pero cuando pretratamos a las ratas con una sola dosis de CAPE 12 h antes de administrar DEN, observamos una disminución del 70% en la inducción de la formación de FHA GGT+ (Fig. 2-B).

Fig. 2 Efecto quimioprotector del CAPE en la inducción de los FHA GGT+. Tincion histoquímica

para GGT. A. Tratamiento completo. B. Tratamiento completo+CAPE.

El pretratamiento con CAPE disminuye el daño tisular (Fig. 3-B) producido por DEN (Fig. 3-A). Este resultado nos reafirma que el efecto protector del CAPE en el hígado durante la etapa de iniciación, interfiere con el daño causado por el carcinógeno.

Fig. 3 Efecto del CAPE en el daño tisular 24 h después de la administración de DEN. Tinciones de hematoxilina-eosina en cortes de 4 micras de espesor. A= DEN. B= DEN+CAPE. Las flecas indican las zonas de tejido dañadas.

A

B

10X 20X 40X

A B


Al analizar la cantidad de CYP total observamos una reducción similar en la cantidad en todos los tratamientos (Datos no mostrados). Después de analizar las actividades enzimáticas encontramos diferencias muy importantes producidas por los tratamientos, mostrándonos un efecto totalmente diferente entre ellos.

Fig. 4 Efecto de los tratamientos en las actividades enzimáticas. A: las barras corresponden a NT (ratas sin tratamiento), DEN 12h, DEN 24h respectivamente. B: NT, CAPE 0h, DMSO 0h. C: NT, DEN 12h, CAPE+DEN 12h. D: NT, DEN 24 h, CAPE+DEN 24h. Las unidades de actividad de los CYP1A1/2, CYP2B1/2, están dadas en pmoles de resorufina/min/mg prot., y del CYP2E1 en nmoles de 4-nitrocatecol/min/mg prot.*p<0.05 respecto a NT y ** p<0.05 respecto a NT y DEN.

DEN disminuyó alrededor del 30% los CYP totales y disminuyó las actividades enzimáticas de manera significativa de CYP1A2 y CYP2E1 a las 12 y 24 h, y de CYP1A1 a las 24 horas. Por otro lado incrementó la actividad de CYP2B1/2B2 tanto a las 12 como a las 24 h, lo cual sugiere que este CYP podría estar participando de manera más activa que las otras en la bioactivación del carcinógeno.

El pretratamiento con CAPE, disminuye alrededor del 30% del CYP total y reduce la actividad de CYP1A1/2, CYP2B1/2, todos involucrados en el metabolismo de DEN. A las 12 h después de DEN, CAPE continuó disminuyendo la actividad de CYP1A1/1A2, mientras que las isoformas CYP2E1 y CYP2B1/2 no se afectan significativamente aunque hay reducción en la actividad de ambas. Se ha sugerido que DEN se metaboliza alrededor de 12 h después de su administración, por lo que esta disminución podría continuar afectando la bioactivación del carcinógeno, A las 24 h después de DEN, cuando éste está totalmente metabolizado continua la disminución de la actividad de CYP1A1, CYP1A2 es regenerado arriba de los niveles normales y no hay un efecto significativo en las otras isoformas.

En este trabajo se confirma el efecto quimioprotector de CAPE cuando se administra 12 horas antes de la iniciación, determinado por la inhibición en la formación de FHA GGT+ en el día 24 en ratas Fisher-344. Este resultado es importante ya que una sola dosis disminuye en un 70% la posibilidad de que las ratas desarrollen cáncer, por lo

CYP1A1 CYP1A2 CYP2B1/2 CYP2E10

5

10

15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica


5

10

15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

A B

D C

* *

*

* *

*

* *

*

*

*

* *

*


5

10

15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

*

*

** ** **

**

* * * *

*

*

* *

*


5

10

15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica


que tiene sus ventajas dar seguimiento a un efecto tan notable producido por una sola dosis.

Al observar que el quimioprotector reduce el daño tisular causado por DEN en las primeras 24 hr después de su administración, se confirma que el daño del carcinógeno es bloqueado por CAPE. Este hallazgo es distinto a lo que se ha propuesto anteriormente, donde se sugirió que actuaba sólo como antioxidante y atrapaba los metabolitos reactivos de DEN, por lo que se evitaba el daño producido por el estrés oxidativo y el daño genotóxico, pero si DEN no se metaboliza tampoco existirán este tipo de daños.

Los resultados de este estudio sugieren que un posible mecanismo quimioprotector del CAPE es a través del metabolismo del DEN, pues el CAPE modificó la actividad de algunos CYP que podrían estar involucrados en su metabolismo, como el CYP1A1/1A2 y el CYP2B1/2B2. Se ha reportado que el extracto alcohólico del propóleo, el cual contiene al CAPE, disminuye la actividad de las isoformas CYP1A1/1A2 evitando la bioactivación de carcinógenos como el benzo[a]pireno, lo cual apoya la hipótesis de que CAPE pudiera modificar el metabolismo DEN.

En conclusión, las diferentes isoformas de CYP participan importantemente en el proceso de carcinogénesis en el modelo modificado del hepatocito resistente y con los resultados mostrados en este trabajo tenemos solo una pequeña muestra de una variedad de fenómenos que pueden ser analizados para caracterizar y prevenir el desarrollo de la carcinogénesis.

BIBLIOGRAFÍA

1. Weinstein I B. Cancer prevention: recent progress and future opportunities. Cancer Res. 1991.

51:5080s-5085s.

2. Tsao A S, Kim E S, Hong W K. Chemoprevention of cancer. CA Cancer J Clin. 2004; 54:150–180.

3. Klaunig J E, Kamendulis L M. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol.

Toxicol. 2004. 44:239-67.

4. Farré R, Frasket I, Sánchez A. El própolis y la salud. Ars Pharmaceutica. 2004. 45:1; 21-43.

5. Carrasco-Legueu C E, et al. Chemoprotective effect of caffeic acid phenethyl ester on promotion in a

medium-term rat hepatocarcinogenesis assay. Int. J. Cancer. 2004. 108:488-492.

6. Semple-Roberts E, Sarma DS, Armstrong D, Becker RA, Racz WJ, Farber E. Alternative methods of

selecting rat hepatocellular nodules resistant to 2-acetylaminofluorene. Int. J. Cancer. 1987. 40:643-5.

7. Carrasco-Legleu C E. Efecto protector del éster fenetílico del ácido caféico in vivo e in vitro en

hepatocitos de rata Wistar tratados con carcinógenos. Tesis de maestría. Biología celular. CINVESTAV.

Jen SN, Shih MK, Kao CM, Liu TZ, Chen SC. Antimutagenicity of ethanol extracts of bee glue against

environmental mutagens. Food and Chem. Toxicol. 2000. 38: 893-897.

8. Park KA, Kweon S, Choi H. Anticarcinogenic effect and modification of cytochrome P450 2E1 by dietary

garlic powder in diethylnitrosamine-initiated rat hepatocarcinogenessis. J Biochem Mol Biol. 2002. 35 (6):

615-22.

9. Soucek P, Gut I. Cytochromes P-450 in rats: structures, functions, properties and relevant human forms.

Xenobiotica. 1992. 22(1):83-103.

10. Koop DR. Oxidative and reductive metabolism by cytochrome P450 2E1. FASEB J. 1992. 6: 724-30.

10. Caro AA, Cederbaum AI. Oxidative stress, toxicology, and pharmacology of CYP2E1. Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 2004. 44: 27-42.


11. Verna L, Whysner J, Williams G M. N-Nitrosodiethylamine mechanistic data and risk assessment:

bioactivation, DNA-aduct formation, mutagenicity, and tumor iniciation. Pharmacol. Ther. 1996. 71:57-81.

979-985.

12. Yamasaki H, Oda Y,, Funae Y, Imaoka S, Inui Y, Guenguerich FP, Shimada T.. Participation of rat liver

cytochome P450 2E1 in the activation of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine to productos

genotoxic in an acetyltransferase-overexpressing Salmonella thyphimurium strain (NM2009).

Carcinogenesis. 1992. 13(6):

13. Yamazaki H, Inui Y, Guenguerich FP, Shimada T. Cytochrome P450 2E1 and 2A6 enzymes as a

major catalyst for metabolic activation of N-nitrosodialquilamines and tobacco-related nitrosamines in

human liver microsomes. Carcinogenesis. 1992. 13(10): 1789-1794.

14. Sook-Jeong HY, Ishizaki H, Yang CS. Roles of cytochrome P450IIE1 in the dealkylation and

denitrosation of N-nitrosodimethylamine in rat liver microsomes. Carcinogenesis. 1990. 11(12): 2239-2243.

15. Amenizad Z, et. al. Effect of antibodies against cytochromes P-450 on demethylation and denitrosation

of N-nitrosodimethylamine and N-nitrosodimethylaniline. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1988. 144: 380-384.

16. Costas Ioannides. Cytochromes P450: metabolic and toxicological aspects. CRC press. United States

of America. 1996. 411 pp.

17. Espinoza-Aguirre JJ, Rubio J, López I, Nosti R, Asteinza J. Characterization of the CYP isozime profile

induced by ciclohexanol. Mutagenesis. 1997. 12(3): 159-162.

mecanismo de quimioprevenciÓn del ester fenetÍlico...

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