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Manual de Procedimientos

Dra. Amelia Bernardelli

Clasificación fenotípicade las micobacterias

Referente en ParatuberculosisReferente en Tuberculosis Bovina

OIE - Organización Mundial de Sanidad AnimalReferente en Tuberculosis Animal del Mercosur

Dirección de Laboratorio y Control TécnicoCiudad Autónoma de Buenos Aires

Año 2007

2 Dirección de Laboratorio y Control Técnico

SENASAServicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria

Av. Paseo Colón 367 C1063ACD

Ciudad Autónoma de Buenos Aires - República Argentina.

Tel. (054) (011) 4121-5000

website: http://www.senasa.gov.ar

Edición:

Coordinación de Prensa y Comunicaciones Institucionales

Area de Diseño Gráfico.

Fotografías de interior: José Huerga.

Marzo de 2007.

3Manual de Procedimientos / Clasificación fenotípica de las micobacterias

Dr. Jorge Néstor Amaya

Presidente

Ing. Carlos Casamiquela

Vicepresidente

Autoridades del SENASA

Lic. Verónica Torres Leedham

Directora de Laboratorio y Control Técnico

Dr. Ramón Sanguinetti

Coordinador de Bacteriología, Parasitología, Patología y Zooterápicos

Autoridades de laDirección de Laborator io y Control Técnico


Mi agradecimiento:

al Dr. Bernardo Alonso y al Sr. Julio Tinao,por su inestimable colaboración.

A mis hijos: Hernán Pablo y Javier Gonzalo,por su infinita solidaridad.


Indice

Introducción ......................................................................................................................... 7

Identificación fenotípica ........................................................................................................ 9

Protocolo de identificación bioquímica ............................................................................... 10

1. Temperatura de crecimiento ........................................................................................... 10

2. Producción de pigmento ................................................................................................ 10

3. Reacciones bioquímicas ................................................................................................ 12

a. Producción de niacina .................................................................................................... 12

b. Reducción de nitratos .................................................................................................... 14

c. Actividad de catalasa ..................................................................................................... 15

c1. Catalasa semicuantitativa ............................................................................................. 16

c2. Catalasa cualitativa a 68ºC........................................................................................... 17

c3. Método a temperatura ambiente o de la gota. ............................................................. 17

d. Hidrólisis de Tween 80 ................................................................................................... 18

e. Método de Arilsulfatasa .................................................................................................. 19

f. Toma de hierro. ............................................................................................................... 20

g. Reducción del telurito. ................................................................................................... 21

h. Método de la ureasa. ..................................................................................................... 22

i. Presencia de la fosfatasa ácida. ...................................................................................... 22

j. Prueba de la pirazinamidasa. .......................................................................................... 23

k. Prueba de la Β-galactosidasa. ....................................................................................... 24

l. Inositol, Manitol o Citrato. ................................................................................................ 25

4. Crecimiento en presencia de drogas .............................................................................. 26

- Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH)

- Cloruro de sodio

- Acido p-nitrobenzoico

- Acido pícrico

- Hidroxilamina (HA)

- Isoniacida (INH)

5. Plaqueo para el control de pureza en agar Dubos o Middlebrook 7H10........................ 29

6. Referencias .................................................................................................................... 30

7. Anexo. Formulaciones .................................................................................................... 33

8. Diagramas de flujo ......................................................................................................... 47

A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo conel tiempo de crecimiento / producción de pigmento.

B. No cromógenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva.C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato reducción negativa.D. Crecimiento lento. Fotocromógena.


E. Crecimiento lento. Escotocromógena.

F. Crecimiento rápido. No cromógena.

9. Tab las.

N° 1. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM).

N° 2. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM). Rápido crecimiento.

N° 3. Especies de lento crecimiento.

N° 4. Especies de rápido crecimiento.

10. Fotos.


Introducción

La tuberculosis es una enfermedad de importancia global.

Una tercera parte de la población mundial ha sido infectada por el Mycobacterium tubercu-

losis y ocho millones de nuevos casos se producen en cada año.

Un incremento importante en el número se ha detectado por la presencia del síndrome de

inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

La tuberculosis mata 2 millones de personas por año, por lo cual los análisis diagnósticos son

relevantes para aminorar su transmisión.

Por otro lado, Mycobacterium bovis, que produce la enfermedad en el bovino, puede tam-

bién infectar a una amplia variedad de especies y ello nos hace reconocerla como una zoo-

nosis clásica, al considerarla como una infección que es transmisible naturalmente entre los

animales y el ser humano.

El examen mediante la coloración de Ziehl-Neelsen es rápido y económico, pero siguen siendo

los cultivos bacteriológicos los que proveen el resultado definitivo.

Dependiendo de los medios de cultivo y las técnicas de decontaminación utilizadas es posi-

ble incrementar entre 30% a 50 % los hallazgos de la clínica.

Los aislamientos proveen el material necesario para realizar las tipificaciones y las técnicas de

sensibilidad a las drogas, por ello se deberán estandarizar las metodologías, con el fin de lo-

grar la armoni zación de los resultados.


Clasi f icación fenot íp ica de las micobacter ias

Ident i f icac ión fenot íp ica

La denominación de tuberculosis comprende a la producida por el complejo Mycobacterium

tuberculosis integrado por: M. bovis, M. africanum, M. microti, M. caprae, M. canetti y M. pin-

nipedii.

Otro número de micobacterias denominadas No Tuberculosas (NTM) han sido clasificadas por

Runyon en cuatro grupos de acuerdo con su velocidad de crecimiento y producción de pig-

mento en la oscuridad o por exposición a la luz.

Grupo I: Lento crecimiento –Fotocromógenas

Crecimiento abundante de los cultivos que producen pigmentos: cristales amarillos de caro-

teno, por exposición a la luz, pero que no lo generan en la oscuridad.

El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas.

Ej.: M. kansasii, M. xenopi, M. marinum, M. simiae.

Grupo II: Lento crecimiento-Escotocromógenas

Los organismos desarrollan un pigmento amarillo brillante, en la luz y en la oscuridad.

Algunas cepas de M. scrofulaceum intensifican su coloración por exposición a la luz.

El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 6 semanas.

Ej.: M. xenopi, M. gordonae, M. flavescens, M. scrofulaceum, M. szulgai.

Grupo III: Lento crecimiento - No fotocromógenas

Incluye un número de especies que producen una pequeña cantidad de pigmento amarillo

pálido. Expuestas a la luz brillante no intensifican su coloración.

La mayoría presentan coloración crema. El crecimiento es sumamente lento.

Ej.: Complejo M. avium-intracellulare, M. terrae, M. triviale, M. celatum, M. shimodei, M. gas-

tri, M. malmoense, M. nonchromogenicum.

Grupo IV: Rápido crecimiento

Mientras que un grupo de las especies producen pigmento amarillo, otras no lo poseen: M.

fortuitum y M. chelonae.


El desarrollo de las colonias se produce entre 2 a 7 días.

Ej.: M. abscessus, M. mucogenicum, M. phlei, M. smegmatis, M. vaccae, M. peregrinum, M.

parafortuitum, M. chelonae, M. fortuitum.

Protocolo de ident i f icación bioquímica

1. Temperatura de crec imientoDesarrollo a 25 °C, 37 °C y 45 °C.

Diferentes especies con distinto significado clínico muestran variación en el tiempo de creci-

miento y la habilidad de desarrollarse a variadas temperaturas.

Medios y Reactivos

Para la determinación de la temperatura de crecimiento se utiliza un medio de cultivo no selec-

tivo el que se distribuye en tubos en pico de flauta o mejor en cajas de Petri donde es posible

observar detenidamente el desarrollo de las colonias y la posible contaminación.

Se usan los medios de Löwestein-Jensen, Stonebrink, Middlebrook 7H10 ó 7H11.

2. Producción de pigmento

Medios y Reactivos

Se procede con medios de cultivo no inhibitorios. No se usan medios de cultivo selectivo o bien

conteniendo antimicrobianos ya que pueden interferir en la formación del pigmento.

Löwestein-Jensen es el más frecuentemente utilizado.

Procedimiento para el desarrollo de 1) y 2)

Preparación del inóculo

Cultivar en un medio líquido (7-10 días) o bien en una suspensión de colonias de un medio

sólido en una solución salina o en un medio líquido, con turbidez que no debe sobrepasar el

patrón turbidométrico de Mac Farland 0.5 para obtener un crecimiento moderado, de modo

tal que la producción de pigmento pueda ser observada.


Inocular tres tubos con medio de Löwestein-Jensen y uno con Stonebrink.

Tubo N° 1: dejar sin cubrir a 37 °C.

Tubo N° 2: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 37 °C.

Tubo N° 3: cubierto con papel negro u hoja de aluminio, colocar a 25 °C.

Interpretación

Cuando se controla el crecimiento en el Tubo N° 1, observar también el desarrollo en los Tu-

bos N° 2 y N° 3, los cuales están creciendo en la oscuridad y anotar los resultados:

- Si las colonias en los Tubos N° 2 y N° 3 están pigmentadas: escotocromógenas.

- Si las colonias en el tubo N° 1 no están pigmentadas, descubrir la mitad de los tubos N° 2

y N° 3 de manera tal que una parte del cultivo esté expuesta a la luz y la otra mitad esté

cubierta.

Los tubos deben ser ubicados debajo de una lámpara de 60 W o de luz blanca a una distan-

cia de 20 a 25 cm, por un período de 3 a 5 horas.

Cubrir los tubos totalmente otra vez y observar la producción de pigmentos a las 24, 48 y 72

horas y comparar las colonias expuestas a la luz con las que permanecieron en la oscuridad.

- Crecimiento de colonias no pigmentadas en los Tubos N° 1, 2 y 3: no cromógenas.

- Crecimiento de las colonias pigmentadas en los tubos N° 1 y N° 2: escotocromógenas.

- Crecimiento de las colonias en la parte del tubo N° 2 expuesta a la luz: fotocromógenas.

- Crecimiento de colonias pigmentadas en la parte del tubo N° 3 expuesta a la luz: fotocro-

mógena a 25 °C (M. szulgai es escotocromógena a 37 °C y fotocromógena a 25 °C).

Controles

M. gordonae: escotocromógena.

M. kansasii: fotocromógena.

M. fortuitum: no cromógena.


3. Reacc iones b ioqu ímicas

a. Producción de niacina

La niacina (ácido nicotínico) juega un papel vital en las reacciones de oxidación-reducción que

ocurren durante los procesos metabólicos de todas las micobacterias.

A pesar de que todas estas bacterias producen niacina, estudios comparativos han demos-

trado de que en ocasiones está bloqueado el camino metabólico. debido a la acción de una

enzima que transforma la niacina libre en niacina -ribonucleótido.

M. tuberculosis acumula grandes cantidades de ácido nicotínico y su determinacción es uti-

lizada como diagnóstico definitivo. Son escasas las cepas de M. tuberculosis, niacina nega-

tiva, mientras que algunas otras especies de micobacterias pueden ser niacina positiva.

Medios y Reactivos

1 - - - - - Solución acuosa de bromuro de cianógeno al 10 % y bencidina o anilina al 4 %.

2 - - - - - Alternativa: Tiras de papel reactivas comercial (BBLTM TaxoTM).

Löwestein-Jensen es el medio de cultivo recomendado.

Es muy importante la aireación para la formación de niacina. Aflojar las tapas durante el pe-

ríodo de incubación.

Procedimiento

1----- Agregar 1 mL de agua destilada a un cultivo de 3 a 4 semanas en el medio de Löwestein-

Jensen, se necesita un desarrollo mínimo de 50 colonias. Cortar la superficie del medio con

una espátula para extraer la niacina. Colocar los tubos en forma horizontal para que la super-

ficie del mismo esté en contacto con el agua. Incubar por 15 a 30 minutos. Colocar el tubo

en posición vertical durante 5 minutos para permitir que el fluido se ubique en el fondo del

tubo. Extraer 0.5 mL del mismo y colocar en un tubo limpio con tapa y agregar 0.5 mL de

solución de bencidina o anilina y 0.5 mL de bromuro de cianógeno. Cerrar los tubos y obser-

var en la solución la formación de color (resultado positivo) dentro de los 5 minutos que apa-

rece como un anillo en la interfase de los dos reactivos, al agitar el tubo la coloración pasa a

toda la columna del líquido.

Agregar a cada tubo 2 a 3 mL de Hidróxido de sodio al 4 % y descartar.

Si se utiliza la tira de papel con el reactivo impregnado, se deben colocar el extracto acuo-

so del cultivo y la tira en el tubo a rosca cerrado herméticamente.


La reacción consiste en la evolución del bromuro de cianógeno de la parte superior de la tira

con la niacina ubicada en el fondo del tubo.

Interpretación

Color amarillo, con la tira comercial.

Color púrpura, con la solución de bromuro de cianógeno –bencidina.

Color amarillo, con la solución de bromuro de cianógeno-anilina.

M. tuberculosis, M. simiae, ocasionalmente, algunas cepas de M. marinum y M. chelonae así

como un número de cepas de M. bovis, han perdido esta enzima y la niacina, soluble en agua

es acumulada en el medio de cultivo.

Un resultado negativo se observa cuando existe insuficiente cantidad de cultivo, para aumentar

la masa bacteriana, realizar una reincubación adicional de 2 a 4 semanas y controlar la apari-

ción de por lo menos 50 colonias.

Asimismo se puede producir resultado negativo cuando el crecimiento bacteriano cubre por

completo la superficie del medio de cultivo, por ello es necesario romper la masa de colonias

para lograr liberar la niacina.

Controles

Mycobacterium tuberculosis: positivo.

Mycobacterium intracellulare: negativo.

2-----Las tiras de papel reactivas permiten idéntica determinación de la niacina, se evitan la pre-

paración y almacenamiento de reactivos tóxicos, pero su costo es mayor.

Procedimiento

Realizar los pasos similares indicados para la técnica anterior con los reactivos líquidos, has-

ta colocar 0.5 mL del extracto fluido en el tubo limpio, insertar la tira con la identificación en

la parte inferior y cerrar inmediatamente el tubo. Dejar a temperatura ambiente durante 15 a

20 minutos. Ocasionalmente agitar.

Observar el color del líquido en el fondo del tubo (amarillo: positivo) contra una base blanca,

descartar si la tira tiene este color como propio, ello puede ocurrir por oxidación química es-

pecialmente en la parte superior de la tira.

Neutralizar las tiras con hidróxido de sodio al 10%.


b. Reducción de nitratos

La presencia de la enzima nitratoreductasa es importante para la clasificación de las mico-

bacterias: M. tuberculosis, M. kansasii, M. szulgai, M. fortuitum las que reducen nitratos a

nitritos. Otras especies producen también nitratoreductasa tales como: M. flavescens, M.

terrae, M. triviale y M. chelonae.

Las micobacterias que contienen esta enzima pueden utilizar el oxígeno de los nitratos y de

otros productos de reducción. La reacción química es:

NO3 + 2 ë NO2 + H2O

La presencia de nitrito es detectada por la adición de sulfanilamida y N-naftiletilendiamina a

pH ácido.

Si el nitrito está presente se forma un compuesto rojo de diazonio.

La técnica se efectúa en cultivos de menos de un mes.

Medios y Reactivos

Buffer substrato de nitrato de sodio, ácido clorhídrico al 10 %, solución de sulfanilamida al 0.2

%, solución de N-naftiletilendiamina al 0.1%.

Procedimiento

La reacción se realiza en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a los que se agregan 4

ó 5 gotas de agua destilada, luego se introduce con un anza aproximadamente 10 mg de masa

bacilar, tratando de homogeinizar la mezcla. El substrato lo constituyen 2 mL de la solución

de nitrato de sodio en buffer de fosfato. Se incuba la suspensión 2 horas a 37 °C.

Al cabo de ese tiempo, acidificar con una gota de ácido clorhídrico dilución 10 %. Agregar 2

gotas de solución de sulfanilamida y 2 gotas de solución de N-naftiletilendiamina.

Interpretación

El desarrollo de color se produce entre 30 a 60 segundos. Si no se produce color se confir-

ma el resultado como negativo por el agregado de pequeña cantidad de polvo de zinc. Si el

color rojo desarrolla después del agregado de zinc, significa que el nitrato está todavía pre-

sente y es catalizado por el zinc con formación del color, por lo cual la reacción es verdade-

ramente negativa. Si el color no se produce después del agregado de zinc, repetir la técnica

para confirmar la reacción.


Por estas razones el método no es altamente reproducible entre laboratorios y es conveniente

utilizar una escala de color estándar.

El problema entre las divergencias del método se ha producido con M. szulgai, sobre el cual

algunos informes lo han reportado nitratoreductasa negativo.

Rosado pálido: +/-

Rosado claro: 1+

Rosado intenso: 2+

Rojo:3+

Rojo intenso: 4+

Rojo púrpura: 5+

Solamente son considerados positivos: 3+ y 5+.

Controles

M. tuberculosis H37: fuertemente positivo.

M. kansasii: débilmente positivo.

M. intracellulare: negativo.

c. Actividad de catalasa

La mayoría de las micobacterias producen la enzima catalasa, algunas más que otras, la de-

terminación se puede realizar por tres técnicas:

1- La catalasa semicuantitativa, indica el nivel de producción de la enzima.

2- Pérdida de la actividad a 68 °C y pH.

3- Método a temperatura ambiente o de la gota: realizado en ocasiones para una determina-

ción cualitativa rápida de catalasa.

Los organismos productores de esta enzima tienen la habilidad de descomponer el peróxido

de hidrógeno en agua y oxígeno libre.

La reacción en las micobacterias difiere de la utilizada en otros tipos de bacterias, por el em-

pleo de peróxido de hidrógeno al 30 % y una solución concentrada de detergente: Tween 80


al 10 %, el cual ayuda a dispersar la masa bacteriana hidrofóbica, hasta bacilos separados

individualmente, maximizando la determinación de la enzima.

c1. Catalasa Semicuantitativa

Medios y Reactivos

- Agua oxigenada 110 volúmenes (solución de peróxido de hidrógeno al 30 %). Debe con-

servarse en heladera.

- Solución acuosa de Tween 80 al 10 %. En el momento de usar calentar ligeramente para

obtener una mejor disolución, mantener en heladera.

Procedimiento

Distribuir 5 mL de medio de Löwestein-Jensen en tubos estériles de 18 mm x 150 mm con

tapa rosca.

Coagular el medio con los tubos en posición vertical, lo cual puede efectuarse colocando los

tubos en un baño de agua termorregulado a 85 °C, durante 40 minutos.

Inocular la superficie del medio con 0.1 mL de la suspensión bacilar en agua destilada incu-

bar 2 semanas a 37 °C.

Observar al cabo de ese tiempo que exista un buen desarrollo bacteriano.

Mezclar partes iguales de peróxido de hidrógeno y solución de Tween 80.

Mantener a temperatura ambiente.

Agregar 1.0 mL de la mezcla de soluciones Tween-peróxido de hidrógeno al tubo de cultivo.

Dejar el tubo en posición vertical durante 5 minutos.

Interpretación

Medir en milímetros la altura de la columna de burbujas sobre la superficie del medio.

Menor de 31 mm: negativa ó muy débil.

Entre 31 y 45 mm: resultado no concluyente.

Más de 45 mm: catalasa francamente positiva.

Controles

M. terrae: positivo.

M. bovis: negativo.


c2. Catalasa Cualitativa: a 68 °C

Reactivos

Las soluciones de peróxido de hidrógeno y Tween descritas para la prueba semicuantitativa.

Solución reguladora de fosfatos M/15, pH 7

Procedimiento

Distribuir la solución reguladora, 0.5 mL, en tubos de 12 mm x 100 mm. Agregar en cada uno

de ellos el contenido de un anza cargada de colonias tomada de un cultivo joven en medio a

base de huevo. Colocarlos en baño de agua termorregulado a 68 °C durante 20 min. Retirar

y dejar enfriar a temperatura ambiente. Agregar a los tubos una mezcla de la solución de Tween

y peróxido de hidrógeno.

Interpretación

Observar la formación de burbujas en la superficie. Esperar 20 minutos antes de informar el

resultado negativo: no se han producido burbujas.

Controles

M. terrae: positivo.

M. tuberculosis: negativo.

c3. Método a temperatura ambiente o de la gota

Procedimiento

Agregar 1 ó 2 gotas de una solución recientemente preparada de Tween 80-peróxido de hi-

drógeno a las colonias ubicadas en un tubo con medio de cultivo. Observar en 4 a 5 minu-

tos la aparición de burbujas. En las bacterias fuertemente positivas aparecerá rápidamente,

en las débilmente, más lentamente y en las negativas se observará la ausencia de burbujas.

Interpretación

En cada uno de las técnicas la presencia de catalasa es indicada por las burbujas. El méto-

do de la gota es rápido y simple pero provee solamente una idea aproximada de la cantidad

de enzima presente.

La determinación de catalasa estable a la temperatura es una muy buena ayuda característi-

ca de la identificación de micobacterias no pigmentadas.

La catalasa lábil a la temperatura es característica de: M. tuberculosis, M. bovis, M. gastri, y


ocasionalmente cepas del complejo M. avium-intracellulare.

El método de catalasa semicuantitativa es utilizado para distinguir cepas que son fuertemen-

te catalasa positiva y otras que la poseen en pequeña cantidad y particularmente para la iden-

tificación de M. tuberculosis - INH-resistente que es negativo.

Controles

- M. kansasii: fuertemente positivo, catalasa semicuantitativa y estable al calor.

- M. tuberculosis: H37Rv, ligeramente positivo, catalasa semicuantitativa y lábil al calor.

- M. tuberculosis: INH-resistente es negativo al método de la gota y a la catalasa semicuan-

titativa.

d. Hidról is is de Tween 80

La hidrólisis enzimática del Tween 80 es una importante característica de la diferenciación de

micobacterias.

Con raras excepciones las especies que hidrolizan el Tween 80 en 10 días no son clínicamente

significativas, por ej. el bacilo del agua de canilla M. gastri, M. terrae y M. triviale, mientras que

las especies que tienen importancia clínica, M. scrofulaceum y el complejo M. avium-intrace-

llulare, son negativas.

El Tween 80 es la marca registrada del detergente: monoloeato de polioxietileno sorbitan.

Medios y Reactivos

Sustrato: Solución reguladora de buffer fosfato M/15, pH7, Tween 80 y rojo neutro.

Procedimiento

Suspender en el sustrato colonias de un cultivo joven en medio sólido (aproximadamente, el

contenido de un anza de 3 mm de diámetro). Incubar a 37 ºC, sin contacto con la luz. Exa-

minar a los 5 y a los 10 días. Incubar un tubo control sin inóculo.

Interpretación

Observar los tubos, comparativamente con el control de color ámbar. Se considera posi-

tivo un cambio de color a rosa salmón. Tomar nota de la fecha en que observa ese cam-

bio de color y seguir incubando hasta completar los 10 días para confirmar; el color pue-

de intensificarse a rosado más intenso y hasta rojo pajizo.


Los tubos no deben ser agitados antes de la lectura. Algunas células pueden tomar el colo-

rante, lo que provoca un color rosado en el sedimento del tubo, mientras que el sobrenadante

continua ámbar; en estos casos el informe es negativo.

Controles

- M. kansasii: rápido, positivo.

- M. gordonae: lento, positivo.

- M. scrofulaceum: negativo.

e. Método de Ari lsulfatasa

Miembros del complejo M. fortuitum-chelonae son los únicos que producen suficiente canti-

dad de enzima para resultar positivos dentro de los 3 días.

Pequeñas cantidades son también producidas por M. xenopi, M. szulgai M. marinum, M.

kansasii, M. gordonae y miembros del complejo M. avium - intracellulare entre otros.

La reacción positiva en menos de 3 días ayuda a identificar a las especies de lento crecimiento

y dentro de ellas los resultados son proporcionales a la masa bacteriana.

Esta técnica es sumamente utilizada para la identificación del complejo M. avium – intrace-

llulare. La arilsulfatasa es una enzima que produce fenolftaleína libre del disulfato de fenolfta-

leína sal tripotásica.

Medios y Reactivos

- Sustrato: Solución 0.08 M de fenolftaleína disulfato tripotásico.

- Preparar 200 mL de medio líquido de Dubos. Agregarle 2.5 mL de sustrato a la prueba de

3 días y 7.5 mL para la de 2 semanas. Distribuir estérilmente 2 mL, en tubos de 16 x 125

mm con tapa rosca.

- Solución de carbonato de sodio 2N.

El método también se puede realizar usando una solución 0.001 M de fenolftaleína, sal sódi-

ca en el caldo Middlebrook 7H9.

Una cantidad de solución de disulfato de fenolftaleína sal tripotásica 0.003 M ha sido pro-

puesta para detectar pequeñas cantidades de la enzima con períodos de incubación su-

periores a 14 días.


Procedimiento

Para cada cepa, colocar 0,1 mL de una suspensión bacilar concentrada de bacterias toma-

das de colonias de un cultivo joven. Incubar a 37 ºC. A los 3 días, agregar en el tubo corres-

pondiente 6 gotas de la solución de Na2CO3. A las 2 semanas proceder en forma idéntica en

el tubo restante.

Colocar un tubo control con sustrato y sin inóculo.

Interpretación

La aparición de una coloración roja o rosada en la parte superior del medio señala resultado

positivo indicando la liberación de fenolftaleína libre.

- Cuando el sustrato contiene fenolftaleína libre, el tubo control no inoculado puede desa-

rrollar color rojo al agregarle la solución de carbonato de sodio.

Para resolver el problema hay que recristalizar el sustrato en etanol absoluto, donde la fenolfta-

leína es soluble, en tanto que el disulfato de fenolftaleína tripotásico es insoluble.

Controles

----- M. fortuitum: : : : : positivo.

- M. avium: negativo.

f . Toma de hierro

Medios y Reactivos

Solución acuosa de citrato de hierro amoniacal al 4 %, esterilizada en autoclave.

Procedimiento

Inocular 2 tubos de medio Löwenstein-Jensen, cada uno con 0,1 mL de una suspensión

bacilar de aproximadamente 1 mg/mL de la cepa. Colocar los tubos inclinados, difundiendo

la siembra en toda la superficie del medio. Luego en posición vertical y añadir en el fondo de

uno de ellos 1 mL de la solución de citrato de hierro amoniacal. En el otro tubo, agregar 1 mL

de agua destilada estéril.

Incubar en posición vertical a 37 ºC.


Interpretación

De ser la reacción positiva aparece en el tubo con citrato, entre la primera y la tercera sema-

na de incubación, un color marrón que se va extendiendo a las colonias por encima del nivel

del líquido. Se compara con el tubo control.

Controles

M. fortuitum: positivo.

M. chelonae: negativo.

g. Reducción del telur i to

Medios y Reactivos

Middlebrook 7H9 distribuir 5 mL en tubos de 18 x 150 mm.

Solución de Telurito de potasio al 2 %, esterilizada en autoclave.

Procedimiento

Colocar 2.5 ml del medio de cultivo en los tubos con tapa a rosca. Inocular 2 tubos con una

gota de suspensión bacteriana. Incubar a 35-37 ºC por 7 días (agitar para mejorar el creci-

miento). Luego de 7 días agregue 2 gotas de solución de telurito a los 2 tubos y agitar. Re-

incubar a 35-37 ºC (no agitar los tubos durante esta re-incubación) y observar luego de 3 días.

Si a los 3 días la prueba da negativa, descartar este tubo y observar el segundo tubo re-in-

cubando por 9 días.

Interpretación

Formación de un precipitado negro metálico: Positivo.

Tubo control sin inóculo: Negativo.

No hay formación de un precipitado negro: Negativo.

Algunas especies producen un precipitado marrón claro o gris, esto debe considerarse como

negativo.

No agitar los tubos. Observar la coloración de la masa bacilar depositada en el fondo.

Controles

Complejo M. avium-intracellulare: positivo.


Complejo M. terrae: negativo.

h. Método de la ureasa

Determina la capacidad del organismo para desdoblar la urea formando dos moléculas de amo-

níaco por acción de la enzima ureasa, que está clasificada como una amidasa, es decir que

cataliza la hidrólisis de las amidas, es capaz de romper la unión entre el carbono y el nitrógeno.

Medios y Reactivos

Medio de cultivo, ver Anexo.

Procedimiento

Con el anza, agregar al tubo colonias de un cultivo joven en medio de huevo. No arrastrar

medio de cultivo. Incubar 3 días a 37 °C.

Interpretación

La aparición de color rosa se interpreta como resultado positivo.

Controles

M. kansasii, M. scrofulaceum: : : : : positivo.

M. avium: negativo.

i . Presencia de la fosfatasa ácida

Medios y Reactivos

Ver Anexo.

Procedimiento

Variante1: Colocar dos anzas del cultivo joven de la micobacteria a ser identificada en un tubo


que contenga 1.5 mL de agua destilada estéril. Agregar 0.5 mL de solución sustrato difosfa-

to de fenolftaleína.

Llevar a 37 ºC durante 2 horas.

Adicionar 0,1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10%.

Variante 2: Utilización como sustrato sal magnésica de monofosfato de timolftaleína.

Colocar dos anzas del cultivo joven en un tubo que contenga el sustrato. Mezclar bien llevar

a 37 °C durante 6 hs.

Adicionar 0.1 mL del reactivo revelador Carbonato de sodio 10 %.

Interpretación

Variante 1. La aparición de color rojo indica que la prueba es positiva.

Incoloro o rosado pálido indica que la prueba es negativa.

Variante 2. La aparición de un color azul indica que la prueba es positiva.

La aparición de color verde, celeste verdoso ó precipitado azul indica que es negativa.

Controles

M. terrae o M. fortuitum: positivo.

M. tuberculosis: negativo.

j . Prueba de la pirazinamidasa

Las cepas de M. tuberculosis que son sensibles a la pirazinamida poseen la enzima pirazina-

midasa que metaboliza la pirazinamida en ácido pirazinoico.

Las cepas pirazinamida - resistente han perdido la actividad pirazinamidasa.

Medios y Reactivos

Agar medio de cultivo, ver Anexo.

Solución de sulfato ferroso al 1 %.

Procedimiento

Cultivar 5 a 10 mg de la masa bacteriana proveniente de un desarrollo joven en medio Löwes-

tein-Jensen, en el medio de agar preparado para el método, incubar a 37 ºC durante 4 días.


Agregar a cada tubo 1 mL de la solución de sulfato ferroso amoniacal al 1 % y colocar los

tubos en el refrigerador. Luego de 4 horas se examina la presencia de una banda rosada de

difusión de la sal ferrosa.

Interpretación

Banda rosa en la interfase, indica la hidrólisis de la pirazinamida con formación de ácido pira-

zinoico.

Controles

M. tuberculosis H37Rv: positivo.

M. bovis, BCG: negativo.

k. Prueba de la ß-galactosidasa

Se demuestra la presencia o ausencia de la enzima ß-galactosidasa, por utilización del com-

puesto orgánico: o-nitrofenil-ß-D-galactopiranósido (ONPG).

Bacteria + ONPG o - nitrofenol (incoloro) (amarillo)

hidrólisis

β-galactosidasa

hidrólisis

β-galactosidasa

o - nitrofenol(ONP)

(ONPG)

OH

OH

OH

OH O

CH2OH

NO2

NO2

Medios y Reactivos

Medio de Dubos modificado.

Procedimiento

Se inoculan 0,5 mL de una suspensión bacilar de aproximadamente 1 mg/mL, en cada tubo


con medio de cultivo. La suspensión bacilar debe prepararse a partir de un cultivo joven. Se

incuba a 37 ºC, durante 4 a 6 semanas.

Interpretación

La aparición de color amarillo indica positivo, debido a la hidrólisis enzimática del sustrato, con

liberación de nitrofenol.

Controles

M. chelonae: : : : : positivo.

M. bovis: negativo.

l . Inositol , Manitol ó Citrato

Utilización del carbono para el desarrollo.

Medios y Reactivos

Ver Anexo.

Procedimiento

Utilizar cultivos de 7 días en caldo ADC-Middlebrook 7H9 ó suspensión de un cultivo en L-

Jensen, preparar diluciones en base 10 en solución salina estéril hasta no observar turbidez.

De la última dilución inocular 0.1 mL en cada tubo con los medios suplementados. Colocar

un tubo de control, sin inocular, por cada medio. Incubar a 37 °C, observar a los 14 días.

Interpretación

Desarrollo en los medios con inositol, manitol ó citrato: positivo.

No se observa crecimiento: negativo.

Controles

M. smegmatis: : : : : desarrolla en los tres medios.

M. fortuitum: no desarrolla en los tres medios.


4. Crec imiento en presenc ia de drogas

Los agentes químicos recomendados para pruebas de tipificación son: Hidracida del ácido

2-Tiofeno carboxílico, Cicloserina, Acido p-aminosalicílico, Isoniacida, Estreptomicina, Etam-

butol y Rifampicina.

Medios y Reactivos

Estas drogas son agregadas en solución concentrada al medio de Löwenstein-Jensen an-

tes de su coagulación y en cantidades establecidas para dar las siguientes concentracio-

nes finales:

Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico: 2 mg/L-1

Cicloserina: 30 mg/L-1

Acido p-aminosalicílico: 0,5 mg/L-1

Isoniacida: 0,2 mg/L-1

Estreptomicina: 4 mg/L-1

Etambutol: 2 mg/L-1

Rifampicina: 40 mg/L-1

El medio de cultivo debe agitarse, luego de la adición de las drogas, para obtener una buena

dispersión de las mismas.

Procedimiento

Se prepara una suspensión bacilar, de aproximadamente 1 mg/ mL-1, a partir de un cultivo

en medio sólido; de esta suspensión madre se realizan diluciones (10-3 y 10-5). Se inoculan

0,1 mL de cada dilución en 2 tubos de medio sin droga y en otros 2 con droga. Se incuba

durante 4 semanas.

Interpretación

La lectura se realiza contando el número de colonias en cada tubo. Se considera que una cepa

es resistente cuando el desarrollo en el tubo con droga es de 10 % de lo que se observa en

el tubo control.

- Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH): 2 mcg/mL.


Materiales y Reactivos

Ver Anexo.

Procedimiento

Inocular con una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 35-37 ºC durante 2-3 semanas.

Interpretación

Crecimiento en ambos medios (con y sin TCH): Micobacteria resistente al TCH.

Crecimiento solamente en medios sin TCH: Micobacteria sensible al TCH.

Controles

M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos.

M. bovis: sensible, solamente crecimiento en el tubo control.

- Cloruro de sodio (NaCl): 5 %

Reactivos

Ver Anexo.

Procedimiento

Inocular una suspensión bacilar, de concentración aproximada igual a 1 mg/mL-1, en agua

destilada, a 2 tubos de Löwenstein-Jensen, uno con NaCl y otro sin agregado. Incubar a 37

ºC y examinar una vez por semana, durante 28 días.

Interpretación

En el tubo control normalmente se obtendrá desarrollo de colonias incontables. Si, en esas

condiciones, en el tubo con NaCl se observa desarrollo de más de 50 colonias, se considera

que la cepa es resistente o tolerante al NaCl. Si el desarrollo es menor de 50 colonias se con-

siderará que es sensible.

Controles

M. triviale: resistente, crecimiento en ambos tubos.

M. avium: sensible, crecimiento solamente en el tubo control.

- Acido p-nitrobenzoico: 0.5 mg/mL.


Medios y Reactivos

Ver Anexo.

Procedimiento

Inocular una gota de suspensión bacteriana. Incubar 35-37 ºC durante 2 ó 3 semanas.

Interpretación

Crecimiento en presencia de PNB: Micobacteria No Tuberculosa (MNT).

Controles

M. fortuitum: resistente.

M. bovis: sensible.

- Acido pícrico: 0.2 %

Ver Anexo.

Procedimiento

Preparar una suspensión de la micobacteria a ser identificada a una concentración de 1 mg/

mL y sembrar 0,2 mL en un tubo de agar Sauton como control de desarrollo de la micobac-

teria y 0,2 mL en un tubo de agar Sauton con ácido pícrico al 0,2%.

Incubar a 37 ºC.

Leer observando la aparición de crecimiento a los 6 días, si es negativo se lee nuevamente a

los mismos tiempos que para detección de tiempo de crecimiento.

Interpretación

En el tubo de agar Sauton debe aparecer crecimiento y en el de agar Sauton con ácido pícri-

co aparecerá crecimiento si se trata de micobacterias de rápido crecimiento, mientras que no

habrá desarrollo si es una micobacteria de crecimiento lento.

En caso de que no aparezca crecimiento en el tubo control de agar Sauton, repetir la prueba.

Controles


M. tuberculosis: sensible.


- Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL.

Ver Anexo.

Procedimiento

Inocular una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 37 ºC durante 2 a 3 semanas.

Controles

M. fortuitum: : : : : resistente.

M. flavescens: sensible.

- Isoniacida (INH) 10 mg/mL.

Ver Anexo.

Preparación

Inocular una gota de la suspensión bacteriana. Incubar a 37 ºC durante 2 a 3 semanas.

Controles


M. bovis: sensible.

5. P laqueo para e l contro l de pureza en agar Dubos oMidd lebrook 7H10

Colocar el medio de cultivo en placas de Petri, dejar solidificar y realizar la inoculación por el

agregado de 0.1 mL, distribuir homogéneamente la suspensión, sellar la placa mediante cin-

ta adhesiva para evitar la evaporación excesiva. Realizar observación semanal del desarrollo

para comprobar la aparición de las colonias de micobacterias y/o contaminantes. Hacer co-

loración de Gram y de Ziehl-Neelsen del cultivo.


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7. Anexo

Formulaciones

Se describen los insumos y metodología de elaboración correspondientes a las reacciones ó

condiciones de desarrollo prescritas.

a. Producción de niacina

Solución de anilina 4%

La anilina es oncogénica y penetra a través de la piel, trabajar con guantes y cuidadosamente.

La anilina cambia de color por exposición al aire y a la luz, preparar solución fresca cuando

sea necesario.

Anilina, fresca, clara, incolora.......................4 mL

Etanol 95 %...................................................96 mL

Mezclar la anilina con el etanol en una botella color ámbar y conservar a oscuras y en la hela-

dera, descartar la solución si cambia a color amarillo.

Solución de bromuro de cianógeno 10 %

El bromuro de cianógeno es tóxico y severo irritante de las mucosas cuando es

inhalado,trabajar en ambiente ventilado cuando se prepara la solución y en cabina de segu-

ridad biológica cuando se procede con los cultivos.

En solución ácida el bromuro de cianógeno se hidroliza a ácido cianhídrico el que es extre-

madamente tóxico Cuando se descartan todos los tubos de la reacción, agregar previamen-

te una solución desinfectante alcalina, adicionando hidróxido de sodio.

Bromuro de cianógeno, cristales......................5 g

Agua destilada.................................................50 mL

Colocar los cristales de bromuro de cianógeno con el agua destilada en un vaso de vidrio,tapar

y dejar bajo campana a temperatura ambiente hasta disolución de los mismos, aproximada-

mente 24 hs.

No calentar la solución con mechero Bunsen.

Colocar dentro de un frasco de colocar ámbar y mantener en el refrigerador.


Calentar a temperatura ambiente para disolver cualquier precipitado formado por el enfriamiento.

Preparar pequeñas cantidades porque el bromuro de cianógeno es volátil y pierde potencia

a través del tiempo. Soluciones débiles pueden llegar a dar resultado falso-negativo.

En algunas regiones se prepara la solución acuosa de cianuro de potasio al 4 % y bromo en

la siguiente forma:

Trabajar en una cabina de bioseguridad.

El agua de bromo es altamente corrosiva y volátil y deberá mantenerse alejada de otros reac-

tivos químicos.

El cianuro de potasio es sumamente venenoso.

Abrir una ampolla de bromo (50 mL) en un frasco de vidrio oscuro de 1000 mL de capacidad

con tapón de vidrio,conteniendo 150 mL de agua destilada fría.

Preparar la solución acuosa de cianuro de potasio al 4 %, disolviendo 4 g de la droga en 100

mL de agua destilada. El cianuro de potasio debe ser puro y no estar hidratado.

Retirar con una pipeta 1 mL de la capa de bromo por debajo de la superficie del agua de bromo

y transferir en el fondo de un frasco erlenmeyer de vidrio de 250 mL, agregar rápidamente,

gota a gota y con mezcla por rotación, la solución de cianuro de potasio, hasta total decolo-

ración de la solución.

b. Reducción de Nitrato

- Método clásico con reactivos líquidos

-Sustrato de nitrato de sodio en buffer

Preparar una solución de nitrato de sodio 0.01M en buffer fosfato 0.022 M, pH7, en la siguiente

forma:

KH2 PO4......................................3.02 g

Agua destilada......................... 1000 mL

Disolver el fosfato de potasio en agua destilada para obtener una solución 0.022 M

..............Solución 1.

Na2 HPO4...........................................3.16 g

Agua destilada................................1000 mL

Disolver el fosfato de sodio en agua destilada para obtener una solución 0.022 M

...............Solución 2.


Agregar 611 mL de la solución 2 a 389 mL de la solución 1 y mezclar bien, controlar el

pH7.............Solución 3.

Preparar el sustrato de nitrato de sodio en buffer en la siguiente forma:

NaNO3 ...............................................0.85 g

Solución 3.........................................1000 mL

Disolver el nitrato de sodio en el buffer y distribuir en alícuotas de 100 mL

Esterilizar por autoclavado a 121 °C durante 15 minutos.

Cuando sea necesario, alicuotar la solución del substrato en forma aséptica en tubos con tapa

esterilizados en cantidad de 2 mL.

- Solución de ácido clorhídrico

Acido clorhídrico concentrado......................................10 mL

Agua destilada...............................................................10 mL

Agregar lentamente el ácido clorhídrico al agua destilada, nunca a la inversa para obtener una

solución 1:1. Mantener en un frasco color ámbar, en la oscuridad, en la heladera.

- Solución de sulfanilamida al 0.2 %

Sulfanilamida.......................0.2 g

Agua destilada.....................100 mL

Disolver la sulfanilamida en agua destilada y mantener en un frasco color ámbar,en la oscuri-

dad, en la heladera.

- Solución de N-naftiletilendiamina 0.1 %..........................0.1 g

Agua destilada................................................................100 mL

Disolver la N-naftiletilendiamina en agua destilada y conservar en frasco color ámbar en la

oscuridad, en la heladera.

- Método con cristales como reactivo

El reactivo en seco, con cristales es fácil de preparar, tiene un tiempo una duración de 6 me-

ses y la ventaja de utilizar un solo compuesto para la determinación de nitrato en lugar de los

tres reactivos líquidos utilizados en el método químico convencional.

Sustrato de nitrato de sodio en buffer

Prepararlo como fue indicado previamente.


Reactivo en cristales

Acido sulfanílico.............................................................1 parte.

Dihidrocloruro de N-(1naftil)-etilendiamina....................1 parte.

Acido tartárico L (+)....................................................10 partes.

Colocar los componentes en un frasco color caramelo y mezclar vigorosamente, mediante

agitación manual durante 30 minutos.

El ácido tartárico es de composición difícil de mezclar, por ello es necesario colocarlo en un

mortero y disgregarlo fuertemente, para que su incorporación a las otras dos drogas sea más

integrada. La mezcla seca tiene una apariencia cristalina heterogénea.

Conservar en frasco color ámbar a temperatura ambiente.

- Técnica de nitrato en tiras de papel

Es un material comercial con el cual se puede determinar la reducción del nitrato.

Se obtienen resultados consistentes especialmente con fuertes reductores de nitrato, tal como

el M. tuberculosis.

Los resultados son reproducibles, la técnica implica mucho menor trabajo que el método

químico, pero es más oneroso.

Estándar de reducción del nitrato

Para asegurar los resultados de la interpretación de la reducción del nitrato es recomendable

preparar una serie estándar donde la intensidad de color varía de +/- a 5+.

Se mantiene en forma indefinida y es posible utilizar cada vez que se realiza la técnica.

Reactivos

- Solución concentrada

a- Fosfato disódico 0.067 M

Na2 HPO4 anhidro.....................................9.47 g

H2O dest..............................................1000 mL

b- Fosfato monopotásico 0.067 M

KH2 PO4..................................................9.07 g

H2O dest............................................. 1000 mL


c- Fosfato trisódico 0.067 M

Na3 PO4 .2H2O......................................25.47 g

H2O dest..............................................1000 mL

d- Fenolftaleína 1 % (1 g en 100mL de alcohol etílico)

e- Azul de bromotimol 1% (1 g en 100 mL de alcohol etílico)

f- Azul de bromotimol 0.01%: preparar mezclando 1.0 mL de la solución e) en 100 mL de agua

destilada).

- Buffer solución de trabajo

Mezclar 35 mL de la solución concentrada a), 1.5 mL de la solución concentrada b) y 100 mL

de la solución concentrada c).

Procedimiento

-Colocar ocho tubos limpios en una gradilla, numerarlos de 1 a 8, usar el mismo tamaño de

tubos que los utilizados en la técnica de nitrato reducción.

-Colocar 2 mL del buffer solución de trabajo en los tubos 2 a 8.

-En 10 mL del buffer solución de trabajo, agregar 0.1 mL de solución d) y 0.2 mL de solución

f)........... solución g).

- Colocar 2 mL de la solución g) en el tubo número 1.

Corresponde a 5+ del estándar de color.

- Al tubo 2, agregar 2 mL de la solución g), mezclar bien y transferir 2 mL al tubo siguiente

número 3, proseguir con la serie de diluciones por el agregado de 2 mL, en todos los tubos

descartando 2 mL del último tubo.

Estándar de color

Tubo 1: 5+

Tubo 2: 4+

Tubo 3: 3+

Tubo 5: 2+

Tubo 6: 1+

Tubo 8: +/-

Autoclavar los tubos, sellar y mantener a 5 °C.


c. Prueba de catalasa cuantitativa y cualitativa

-Solución buffer de fosfatos 0.067 M, pH 7

Mezclar 61.1 mL de una solución de fosfato disódico M/15 (9.47 g. Na2PO4H en 1000 mL de

H2O), con 38.9 mL de una solución de fosfato monopotásico M/15 (9.07 g de KPO4H2 en 1000

mL de H2O).

- Peróxido de hidrógeno al 30 % (mantener en heladera)

No utilizar peróxido de hidrógeno al 3 %, de venta en farmacias.

Manipular el reactivo con guantes y protección ocular.

- Tween 80 al 10 %

Disolver 10 mL de Tween 80 en 90 mL de agua destilada, mezclar y autoclavar 10 minutos a

121 °C. Mantener en refrigeración.

- Reactivo para catalasa

Mezclar inmediatamente antes de su uso, partes iguales de Tween 80 al 10 % y peróxido de

hidrógeno al 30 %. Calcular la utilización de 0.5 mL de la solución por cada cepa a analizar.

d. Hidrólisis de Tween 80

- Tween 80.

- Rojo neutro.

- Solución reguladora de fosfato M/15, pH 7: Mezclar 61.1 mL de fosfato disódico M/15 (9.47

g en 1000 mL de agua) con 38.9 mL de una solución de fosfato monopotásico M/15 (9.07 g

en 1000 mL de agua).

Disolver 0.5 mL de Tween 80 y 2.0 mg de rojo neutro en 100 mL de solución reguladora.

Controlar el pH, que no debe ser menos de 7.0 y el color amarillo ámbar. Distribuir en tubos

de 16 x 125 mm con tapa rosca (4 mL en cada uno). Autoclavar 15 minutos a 121 °C. Con-

servar en refrigeración y sin contacto con la luz, no más de dos semanas.

e. Prueba de Arilsulfatasa

- Sustrato

Fenolftaleína disulfato tripotásico.....................2.6 g

Agua destilada...................................................50 mL


Solución 0.08 M

Esterilizar por filtración. Mantener en refrigeración.

CO3 Na2 anhidro...............................................10.6 g

Agua destilada..................................................100 mL

Solución de Carbonato de sodio 2N

Medio de cultivo

Preparar 200 mL de medio líquido de Dubos. Agregar al medio 2,5 mL de la solución del sus-

trato para la prueba de 3 días, y 7,5 mL para la prueba de 2 semanas. Distribuir asépticamente

en tubos de 16 mm x 125 mm con tapa rosca, a razón de 2,0 mL por tubo.

Reactivo

Solución de carbonato de sodio 2,0 N (disolver 10,6 g de Na2CO3 anhidro en 100 mL de agua

destilada).

f. Toma de Hierro

Citrato de hierro amoniacal................................4 g

Agua destilada................................................100 mL

Esterilizar 15 minutos a 121 °C

g. Reducción del Telurito

Solución de telurito de potasio 0.2 % (telurito de potasio 0.1 g en 500 ml de agua destila-

da). Colocar 2 ml en pequeños tubos o en viales y autoclavar (10 minutos x 121 ºC). Con-

servar a 4 ºC.

Procedimiento

Preparar medio Middlebrook 7H9 y suplementar con 0.5 mL de Tween 80 por cada 1000 mL

de medio, distribuir en volúmenes de 180 mL y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121 °C,

a cada 180 mL del medio estéril mantenido a 50-55 °C suplementar con 20 mL de OADC

(ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa) adquirido en el comercio o bien prepararlo en las

siguientes proporciones:

- Dextrosa 0.8 mL al 50 %, que se prepara disolviendo 50 gramos de la droga en 99 mL

de agua destilada. Se agrega 1 mL de solución de ácido cítrico al 10 %.


Se autoclava 10 minutos a 121 °C.

- Catalasa 1000 mg/mL, agregar 0.4 mL

- Complejo albúmina-ácido oleico, preparado en la siguiente forma:

Disolver 0.12 mL de ácido oleico en 20 mL de Hidróxido de sodio N/20.

Preparar una solución de albúmina bovina al 5 %, mezclando 95 mL de cloruro de sodio

al 0.85 % y 5 g de la fracción V albúmina bovina.

Agregar 5 mL de la solución de ácido oleico a 95 mL de solución de albúmina al 5 %, ajustar

el pH a 6.8. Filtrar por placa o membrana esterilizante. Repartir en tubos esterilizados e

incubarlos a 37 °C, durante una noche.

Colocar en baño de maría a 56 °C durante 30 minutos y conservar a 4 °C.

Distribuir el medio resultante en tubos con tapa a rosca, de 16 x 160 mm, colocar en po-

sición inclinada y dejar solidificar.

h. Método de la ureasa

Medio de cultivo

Peptona.............................................................1 g

Dextrosa............................................................1 g

ClNa..................................................................5 g

PO4H2K..............................................................2 g

Urea................................................................20 g

Rojo de fenol....................................................0.012 g

Agua destilada c.s.p......................................100 mL

Procedimiento

Realizar la mezcla de los componentes y esterilizar por filtración.

Diluir 1:10 con agua destilada estéril y distribuir en tubos esterilizados de 13 x 100 mm con

tapa a rosca. Mantener en oscuridad y en refrigeración.

i. Presencia de la Fosfatasa ácida

Reactivos

Variante 1


Sustrato: Fenolftaleína difosfato 0.5 M.

Solución 1: Acido acético 0.2 M

Acido acético 11.41 mL/1000 mL de agua destilada.

Mantener a 4 °C por el plazo de 1 año.

Solución 2: Acetato de sodio 0.2 M

Acetato de sodio: 16.41 g/1000 mL de agua destilada.

Autoclavar, mantener a 4 °C por el plazo de 1 año.

Procedimiento

Mezclar 14.5 mL de la solución 1 y 85.5 mL de la solución 2, calentar durante 30 minutos. En-

friar a temperatura ambiente y agregar 100 mg de difosfato de fenolftaleína por cada 100 mL

de la solución. Mantener a 4 °C por un plazo no mayor de 6 semanas.

Carbonato de sodio al 10 %

Autoclavar, mantener a 4 °C por un tiempo no mayor de 1 año.

Variante 2

Buffer de acetato de sodio

Soluciones concentradas

1. Acido acético glacial....................................................................30 mL

Agua desionizada.............................................................................470 mL

2. Acetato de sodio

Acetato de sodio.3H2O.....................................................................68 g

Agua desionizada...........................................................................500 mL

Buffer acetato pH 5.0

Solución concentrada 1.....................................................................195 mL

Solución concentrada 2.....................................................................300 mL

Agua desionizada..............................................................................505 mL

El pH final debe ser 5.0.


Sustrato Fosfatasa ácida

Sal magnésica de monofosfato de timolftaleína................................ 25 mg

Hidróxido de sodio 1 N..........................................................................2 mL

Disolver la sal completamente en el hidróxido de sodio, agregar el buffer acetato pH 5.0, hasta

un volumen final de 50 mL. Esterilizar por filtración mediante placa ó membrana de 0.45 υm.

Envasar en tubos con tapa rosca esterilizados volúmenes de 2 mL.

Revelador de la reacción

Hidróxido de sodio 5 N

Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.

j. Prueba de la pirazinamidasa

Medio de cultivo

Caldo base deshidratado de Dubos comercial.......................................6.5 g

Agua destilada.................................................................................1000 mL

Pirazinamida......................................................................................100 mg

Piruvato de sodio.....................................................................................2 g

Agar.......................................................................................................15 g

Procedimiento

Calentar la mezcla hasta fundir el agar, distribuir 5 mL en tubos con tapa rosca de 16 x 125

mm, esterilizar 15 libras, durante 15 minutos, dejar solidificar los tubos en posición vertical.

Sulfato ferroso amoniacal.......................................................................1 g

Agua destilada.................................................................................100 mL

k. Prueba de la β-galactosidasa

Medio de cultivo

Preparar medio de Dubos modificado según la fórmula siguiente:

Fosfato monopotásico anhidro............................ 1 g


Fosfato disódico.12 H2O................................. 0.25 g

Sulfato de magnesio.7 H2O............................... 0.6 g

Citrato de sodio............................................... 1.5 g

Asparragina......................................................2.0 g

Tween 80 solución acuosa 10 %......................5.0 mL

Procedimiento

Se disuelven los componentes, cada uno por separado, en un volumen de 100 mL de agua.

Mezclar y completar a 1000 mL, pH 7.2

Se distribuye en frascos, 100 mL en cada uno. Autoclavar 20 minutos a 121 °C.

Se prepara una solución al 20 % de fracción V de albúmina bovina en solución fisiológica. Esta

solución debe calentarse a 56 °C durante 30 minutos y esterilizarse por filtración.

Se disuelven en 100 mL del medio basal anteriormente descrito, 100 mg del sustrato 2-ni-

trofenil β-D-galactopiranósido, agregándose luego 4 mL de la solución de albúmina.

Se esteriliza por filtración nuevamente y se distribuye en tubos con tapa a rosca, 5 mL en

cada tubo.

l. Citrato, Manitol e Inositol

Medios de cultivo

(NH4)2SO4......................................................................2.4 g

KH2PO4 ………………………………………………………..0.5 g

MgSO4.7 H2O……………………………………………..…. 0.5 g

Agar 2 %………………………………………………….……20 g

Agua destilada……………………………………………..950 mL

Citrato de sodio................................................................5.6 g

Manitol.............................................................................5.0 g

Inositol.............................................................................5.0 g


Procedimiento

Medio basal

Disolver en agua destilada todos los reactivos excepto, citrato de sodio, manitol e inositol.

Ajustar a pH 7, con NaOH 10% ó ClH 10 %, autoclavar durante 20 minutos a 121 °C.

Medio con Citrato

Enfriar a 56 °C en baño de agua, disolver 5.6 g de citrato de sodio en 50 mL de agua destila-

da esterilizar mediante filtración por membrana, agregar asépticamente al medio basal, dis-

tribuir 8 mL por tubo, solidificar en pico de flauta.

Medio con Manitol

Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 °C en baño de agua, di-

solver 5.0 g de manitol en 50 mL de agua destilada, esterilizar mediante filtración por mem-

brana, agregar asépticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar en pico

de flauta.

Medio con Inositol

Ajustar el medio basal a pH 7 antes de autoclavar, dejar enfriar a 56 °C en baño de agua di-

solver 5.0 g de inositol en 50 mL de agua destilada estéril, esterilizar mediante filtración por

membrana, agregar asépticamente al medio basal, distribuir 8 mL por tubo, dejar solidificar

en pico de flauta.

4. Crecimiento en presencia de drogas

- Hidracida del ácido 2-Tiofeno carboxílico (TCH) 2 mcg/mL

Preparar TCH 2 mcg/mL: 20 mg de TCH en 20 mL de agua destilada estéril. Transferir 0.1

mL de esta solución a un tubo con 9 mL con agua destilada. Agregar 1 mL a 100 mL de medio

de L.-Jensen. Distribuir en tubos y coagular en pico de flauta a 80 °C durante 45 minutos.

O bien: dividir 4 cuadrantes en una caja de Petri, colocar en 2 medios de cultivo con TCH y

en los otros dos sin TCH.

- Cloruro de sodio 5 %

Preparar un lote con la concentración final de cloruro de sodio al 5 %, asegurar que la mez-

cla sea homogénea.


- Acido p-nitrobenzoico 0.5 mg/mL

Preparar una solución madre de 25 mg/mL: disolver 2,5 g de PNB en 15 mL de NaOH 1 N,

completar el volumen con agua destilada estéril, agregar 1 ó 2 gotas de fenolftaleína al 0.1 %

(solución en etanol) y agregar 3 mL aproximadamente y gota a gota de solución de HCl 1 N

hasta que el color desaparezca. Si aparece un precipitado es debido al exceso de ácido, agre-

gar entonces otro volumen de NaOH. Completar con agua destilada estéril hasta 100 mL.

Preparar alícuotas de 5 mL, la solución es estable a –20 °C durante 3 meses. Agregar 4 mL

de PNB 25 mg/mL a 200 mL de medio de L-Jensen antes de la coagulación.

- Acido pícrico 0.2 %

Preparar un lote de medio de Sauton con ácido pícrico al 2 % disuelto en agua.

- Hidroxilamina (HA) 500 mg/mL

Pesar 0.5 mg de Hidroxilamina y diluir en 10 mL de agua destilada estéril. Agregar 1 mL de la

solución a 100 mL de medio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm,

coagular en pico de flauta, durante 50 minutos a 85 °C.

- Isoniacida (INH) 10 mg/mL

Pesar 100 mg de isoniacida y diluir en 10 mL de agua destilada estéril. Colocar 1 mL de esta

solución en 9 mL de agua destilada estéril. Agregar 1mL de esta solución a 100 mL de me-

dio base de L-Jensen. Distribuir 2 mL en tubos de 12 x 120 mm. Coagular durante 50 minu-

tos a 85 °C.


8. D iagramas de F lu jo

A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) de acuerdo con el tiempode crecimiento / producción de pigmento.

B. No cromógenas - Lento crecimiento.Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva.

C. No cromógena - Lento crecimiento.Catalasa y Nitrato reducción negativa.

D. Fotocromógena - Lento crecimiento.

E. Escotocromógena - Lento crecimiento.

F. No cromógena - Rápido crecimiento.

9. Tab las.

N° 1. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM).

N° 2. Identificación de Micobacterias No Tuberculosas (NTM) Rápido Crecimiento.

N° 3. Especies de Lento Crecimiento.

N° 4. Especies de Rápido Crecimiento.

10. Fotos.


8. Diagramas de f lu jo

Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypic identification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004.

A. Clasificación inicial de Micobacterias No Tuberculosas (NTM)de acuerdo con el tiempo de crecimiento / producción de pigmento.


B. No cromógenas - Lento crecimiento. Catalasa e Hidrólisis de Tween positiva.


C. Crecimiento lento. Catalasa y Nitrato Reducción negativa



(*): M. szulgai es fotocromógena a 25 °C.

D. Crecimiento lento. Fotocromógena



(*): M. flavescens se identifica como de crecimiento rápido.

E. Crecimiento lento. Escotocromógena

Ref.: Practical handbook for phenotypic and genotypicidentification of mycobacteria INCO-DEV-CA-2004.

M. mucogenicum M. abscessus M. chelonae

M. chitaeM. smegmatis

M. fortuitumM. peregrinum

F. Crecimiento rápido. No cromógena


9. Tab las

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M. c

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10. Fotos

1. Mycobacterium bovis AN5.

2. Niacina. Cepa H37 Rv:reacción positiva.


3. Reducción de nitrato. Mycobacteriumphlei: reacción positiva.

4. Reducción de nitrato.Mycobacterium fortuitum: reacción

positiva.


6. Catalasa a temperaturaambiente y a 68 °C. Tubos 1 y 2:

negativo. Tubos 3 y 4: positivo.

5. Catalasa semicuantitativa. Ladoderecho: reacción positiva.


7. Arisulfatasa - 3 días. Cepa 10: reacción positiva.

8. Toma de hierro. Lado izquierdo:reacción positiva.


9. Reducción del telurito. Tubo central:reacción positiva.

10. Reducción del telurito. Ladoizquierdo: reacción positiva.


12. Fosfatasa ácida. Cepa166: reacción positiva.

11. Ureasa. Tubo color rojo: reacción positiva.


13. Pirazinamidasa. Cepa 534. Reacciónpositiva: anillo rosado.

14. Reacción de la beta-galactosidasa.Lado izq.: tubo control negativo.

Lado der.: reacción positiva.


15. Mycobacterium phlei: desarrollo enpresencia de ClNa.

16. Crecimiento enpresencia de drogasPNB, HA, ClNa, INH,

TCH, cepa 2615.

17. Crecimiento en presenciade drogas, cepa 2610.


19. Crecimiento en presen-cia de drogas, cepa 2617.

18. Crecimiento en presencia de dro-gas, cepa Mycobacterium bovis AN5.

CoordinaciónGeneral deLaboratorio Animal

Direcciónde Laboratorioy Control Técnico

manual de procedimientosnuevaweb.senasa.gob.ar/sites/default/files/arbol_senasa/... ·...

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