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INTRODUCCIÓN

Las microalgas corresponden a uno de los microorganismos más primitivos que aparecieron en nuestro planeta y tienen un rol

fundamental en la evolución de la vida desde hace más de dos billones de años. La producción de oxígeno microalgal contribuyó en gran

medida a la formación de la atmósfera de nuestro planeta, permitiendo el predominio de las formas de vida aeróbicas, primer paso para

el surgimiento de las plantas y el origen de los diversos grupos de eucariotas.

Estos microorganismos presentan un rol ecológico fundamental, ya que son el primer eslabón que sustenta la cadena trófica

marina contribuyendo a los procesos de producción de los ecosistemas acuáticos (revisado en Purvina y Balode, 2004). En los ambientes

terrestres, por otra parte, participan en la formación del suelo, renovación de la fertilidad y los ciclos biogeoquímicas (Gollerbah y

Shtina, 1969)).

Las microalgas han formado parte del quehacer del hombre desde tiempos remotos. Las proliferaciones masivas planctónicas en

la superficie del mar fueron reconocidas por algunos pueblos antiguos y registradas en la historia. La narración contada en la Biblia

sobre la primera plaga de Egipto es una convincente descripción de un bloom de dinoflagelados y su efecto sobre los peces en el Nilo. Las

tribus indias en el Pacífico noroeste poseían conciencia de una conexión entre la bioluminiscencia en el mar durante la estación cálida, y

el envenenamiento de los mítilidos, probablemente producido por un bloom de dinoflagelados, al igual que pueblos indígenas en África y

Australia conocían su naturaleza venenosa (Codd y cols. y cols.. 2005). Es hacia fines del siglo XIX cuando se inician estudios más

detallados del comportamiento de estos florecimientos planctónicos de microalgas, incluyendo observaciones a través del microscopio.

El primer informe científico que da cuenta de la naturaleza tóxica de cianobacterias fue escrito por George Francis, quien describió en

1878 la muerte de animales en el Lago Alexandrina en el sur de Australia (Francis 1878).

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Sin embargo, las microalgas también han sido utilizadas de forma beneficiosa por el ser humano. Existen numerosos registros

históricos sobre sus usos en la alimentación humana. Por ejemplo, los Aztecas utilizaban microalgas del género Spirulina (nombre

científico Arthrospira; Tomaselli y cols.y cols.. 1996) como parte habitual de su alimentación. Alrededor del año 1300 DC, cronistas

españoles describieron como nativos recogían masas verde-azules desde el Lago Texcoco (Mexico), utilizándola para preparar una torta

seca conocida como tecuitlatl (Farrar 1966; Henrikson 1997). De la misma forma, durante siglos la población local en la Republica de

Chad ha cosechado y usado la Spirulina, conocida en el Idioma local como “dihe”, en la alimentación diaria (Ciferri 1983). La tribu de los

Kanembu, en el lago Chad, la utiliza actualmente en la preparación de alimentos y además es vendida en los mercados locales y

mayoristas (Abdulqader y cols.. 2000). Otras microalgas verde-azules filamentosas que han sido ampliamente utilizadas como alimento

en Asia pertenecen al género Nostoc. La microalga Nostoc commune forma colonias al principio esféricas, que luego se aplanan en forma

de grandes y gelatinosas hojas, las que son consumidas crudas, secas, fritas y en sopas, y también son usadas como espesante (Facciola

1998). También muy utilizada en la cocina china y vietnamita, la microalga Nostoc flageliforme es especialmente popular durante la

temporada de fiestas (Takenaka y cols. 1998). Esta microalga, conocida también como “fa cai” o “faat choi”, crece muy lentamente en

forma de una alfombra adherida al sustrato en las regiones desérticas del norte y noroeste de China (But y cols. 2002). N. punctiforme es

tradicionalmente utilizada en la dieta humana en China, Mongolia y América del Sur (Soeder 1980), en particular Nostoc es consumida

tambien por la comunidad nativa del Norte de Chile.

Además de la variedad filamentosa, las microalgas unicelulares son también parte de la dieta humana. Aphanotheca sacro

(originalmente identificada como Phylloderma sacro) es otra microalga comestible que se consume en Japón y se conoce como ''suizenji-

nori” (Fujishiro y cols. 2004). Algunas algas filamentosas verde (Spirogyra y Oedogonium) se utilizan también como componente de la

dieta en Birmania, Tailandia, Vietnam, y la India (Richmond 1986).

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Aún cuando las microalgas pueden encontrarse como parte de la dieta normal de distintos pueblos y culturas, la obtención de

biomasa microalgal es artesanalmente desde la naturaleza. El desarrollo de la ciencia y las aplicaciones tecnológicas en el último siglo

permitieron aproximaciones a la producción de microalgas en laboratorio y su posterior escalamiento a la producción masiva de estos

organismos.

Los primeros pasos en el cultivo de las microalgas se dan con el uso de Chlorella como modelo para el estudio de la fotosíntesis, lo

que le valió en Premio Nobel de Medicina en 1931 al bioquímico alemán Otto Heinrich Warnburg. Como resultado de la Segunda Guerra

Mundial, la gente pensaba que el hambre en el mundo era un problema en crecimiento, donde las microalgas se vislumbraban como una

alternativa atractiva para obtener alimento de alta calidad nutricional a bajo costo. Las investigaciones científicas de la aplicación de las

microalgas fueron publicadas en el reporte “Algal culture from laboratory to pilot plant” (Burlew, 1953). Tamiya, en 1956, concluyó que

la producción de 1 tonelada de Chlorella podía costar cerca de US 520 dolares, pero no competía con la barata producción plantas como

la soya, ricas en proteínas (Tamiya, 1956). Sin embargo, la producción de Chlorella ha sido un éxito comercial en Japón y Taiwán, debido

principalmente a que los productos de esta microalga han sido introducidos como alimenticios favorables para la salud en el lejano

oriente.

Con el desarrollo de la tecnología, el cultivo de microalgas ha tenido un importante desarrollo y su estudio ha iniciado una nueva

fase a través de la utilización de los cultivos masivos para distintos propósitos.

Además de su valor nutricional inherente, las microalgas son fuente de gran variedad de productos bioactivos de importancia

comercial como los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) (Meireles y cols 2003, Kachroo y cols 2006), agentes antivirales naturales

(Kokk y cols 2010), antifúngicos (Katircioglu y cols 2006) y pigmentos (revisado en Dufosse y cols, 2005), entre otros. El conocimiento

de las variadas propiedades de las microalgas ha despertado gran interés por estos microorganismos y muchas investigaciones se han

orientado ha desarrollar sus aplicaciones biotecnológicas. Chlorella sp. se ubica entre las microalgas de mayor importancia económica y

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nutricional, además de ser una de las más estudiadas por su fácil adaptación en condiciones de laboratorio. Spirulina sp ha sido también

utilizada como fuente de proteína para la alimentación de ganado y humano (Becker y Venkataraman 1984). Una de las líneas de

investigación actuales en microalgas es la búsqueda y selección de cepas microalgales para la producción de ácidos grasos esenciales,

como el omega 3 (Carvalho y cols, 2005; Meireles y cols 2003; Hammond y cols, 2002; Otleş y Pires, 2001; Barclay y cols, 1998; Cohen y

cols, 1995) y vitaminas (Pinto y cols, 2002; Barbosa y cols, 2005).

En Chile, cinco empresas producen microalgas (principalmente Spirulina), todas ubicadas en la zona norte. El 2003 se exportaron

13 toneladas de alga que implicaron US$ 129.751. Sus cultivos son desarrollados exclusivamente en sistemas tipo raceway el cual genera

limitantes para elaboración de productos de mayor valor agregado. El desarrollo de la fase elaboradora es aún incipiente siendo

necesario para esta industria, la incorporación de tecnología tanto en fase de cultivo como en procesamiento.

Como se puede ver hay una variedad de usos y aplicaciones en las cuales se pueden utilizar las microalgas, las cuales van desde la

utilización directa como alimento a partir de microalgas secas hasta la producción de compuestos químicos altamente elaborados por la

industria biotecnológica. Sin duda estos microorganismos autotróficos son una veta aún inexplorada en gran medida y que requiere la

pronta motivación e incorporación de talentos de jóvenes y nuevos científicos que incursionen en investigaciones que tiendan a

masificar el uso de microalgas para diversos fines que son de beneficio para la sociedad en los campos de la industria alimentaria y

farmacéutica. Es particularmente importante de desarrollar este tipo de investigaciones en nuestros paises en vias de desarrollo lo cual

permitirá generar nuevos emprendimientos para una incipiente industria biotecnológica en estas latitudes.

El presente manual presenta, en un lenguaje muy sencillo, una visión sobre que son las microalgas, dónde se encuentran y su

potencial aplicación desde la industria de alimento animal hasta su uso como fuente energética.

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Capitulo I: Proceso de Cultivo

1Mª Cristina Ayala R, 1Jazmin Bazaes D, 1Yery Luza P, 1Paola Marticorena D, 1Claudia Sepúlveda V, 1,2Carlos Riquelme S.

1Unidad de Microbiología Aplicada, 2Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad De Recursos Del Mar & Centro de Bioinnovación, Universidad de Antofagasta, Av.

Angamos 601, Antofagasta, Chile. Email: uma@uantof.cl

1. Introducción

En los últimos años se ha producido gran interés por el potencial biotecnológico de las microalgas, principalmente debido a la

identificación de diversas sustancias producidas por estos organismos. La inmensa biodiversidad y consecuente variabilidad en la

composición bioquímica obtenida de los cultivos de microalgas, aliada a un mejoramiento genético y un establecimiento de tecnología de

cultivo a gran escala, van permitiendo que determinadas especies sean utilizadas con fines comerciales. En este sentido, los cultivos de

microalgas han sido realizados visualizando la producción de biomasa tanto para uso en la elaboración de alimentos como para la

obtención de compuestos naturales con alto valor en el mercado mundial (Bianchini y cols, 2006).

El proceso de cultivo se inicia a partir de colonias algales axénicas mantenidas sobre medio solidó con las que se siembran

cultivos líquidos de bajos volúmenes,los que son mantenidos como ceparios y la vez sirven como inóculo para el cultivo intermedio

(normalmente de 1 litro) dando asi inicio a un proceso que finalizará con la cosecha del cultivo para obtener la biomasa microagal

concentrada. Estas primeras etapas se inician en cámaras cerradas con luz y temperatura controlada y se consiguen producciones fijas

de microalgas en un estado fisiológico óptimo.

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Según Borowitzka y Borowitzka (1988), estos organismos pueden ser cultivados en diversos sistemas de producción, con

volúmenes que varían desde pocos litros a billones de litros, siendo sistemas muy poco sofisticados, lo que va a determinar la

estandarización del proceso de cultivo para cada microalga utilizada.

La actividad acuícola ha tenido un importante desarrollo en la última década en nuestro país y el mundo, lo que va acompañado

de continuas demandas de alimento para suplir los requerimientos nutricionales de los organismos en cultivo (Riquelme y cols. 2003). El

mas abundante uso para el cultivo de microalgas es la industria acuícola (Yepez de Leal & Silva 1997), aunque el desarrollo de alimento

artificial como sustituyentes de algas ha avanzada para muchas especies en cultivo (Cahu e Infante 2001; Lazo y cols. 2000; Holt 1993),

una gran cantidad de especies prefieren el alimento vivo, especialmente durante la etapa larval (Coutteau 1996; Takeuchi y cols. 2002;

Shields, 2001; Hagiwara y cols. 2001). La expansión de la industria acuícola requiere tecnologías para la producción de alimento (Rusch

y Christensen 2003).

Sin duda, el uso más extendido de las microalgas es como base de la cadena trófica en la acuicultura, ya que son necesarias para el

alimento de larvas de peces, crustáceos y moluscos o como alimento de las presas vivas que se utilizan en los distintos estadios larvarios

(Domínguez y cols., 2006). Sin embargo, algunos autores consideran que la calidad de las microalgas es un criterio totalmente subjetivo y

depende de los organismos que se están alimentando y de las técnicas y condiciones del cutlivo de las especies de interés comercial.

(Voltolina y cols. 1998)

El proceso por el cual se llega a obtener biomasa microalgal altamente concentrada va a depender de la especie de microalga a

cultivar y del resultado de interacción entre los factores biológicos, físicos y químicos (Raven, 1988).

Los factores biológicos están relacionados a las tasas metabólicas de la especie cultivada y va depender de la influencia de otros

organismos sobre el desenvolvimiento microalgal. En cuanto a los factores fisico-quimicos, los más estudiados corresponden a la

iluminación, temperatura, salinidad y disponibilidad de nutrientes (revisado en Bianchini y cols 2006). La productividad microagal va

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estar limitada además por el control de los distintos parámetros de cultivo como lo son: inóculo, agitación, fuentes de carbono, calidad

del agua, evaporación del sistema y pH. La separación de la microalgas del líquido de cultivo también ha sido un problema para el

desarrollo del cultivo a gran escala de las microalgas.

Por otro lado, el costo asociado al empleo de microalgas vivas en operaciones de acuicultura constituyen un problema cuando se

requiern de manera masiva, lo que ha llevado a numerosas investigaciones cuyo objetivo es preservar las microalgas para su posterior

empleo en la alimentación de las diferentes especies acuícolas. Por ejemplo, algunas especies de diatomeas pueden ser almacenadas

hasta tres años a bajas temperaturas (5 ºC) y oscuridad, para después ser transferidas a un medio fresco y comenzar su crecimiento

(Jaime-Ceballos y cols, 2006). El almacenamiento de microalgas para su posterior utilización presentan muchas ventajas cuando se

están cultivando larvas de animales marinos, ya que reduce la dependencia de los cultivos frescos para alimentación y disminuye los

riesgos de pérdida total de larvas por algún motivo que impide el buen desarrollo del cultivo del fitoplancton (Buitrago, 1988).

Las múltiples aplicaciones de las microalgas promueven la necesidad de generar a través de actividades informativas y científicas,

estrategias de trabajo a corto o mediano plazo que permitan la conservación del medio ambiente y la generación de ingresos a partir de

la producción industrial (Albarracín 2005). Sin embrago, el mercado de producción de biomasa o pastas microalgales es incipiente ya

que una de las grandes dificultades es la producción de biomasa significativa, dondeestandarizar el proceso de cultivo es el objetivo

principal para la obtención biomasa microalgal en forma constante y controlada.

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Microalgas dulceacuícolas.

La distribución de microalgas de agua dulce depende no solamente de la acción selectiva del medioambiente fisicoquímico sino

que también de la habilidad del organismo a colonizar determinado medioambiente (Watanabe M. 2005). Sin embargo, el aislamiento y

cultivo de estas microalgas en el laboratorio requiere de condiciones particulares, que permitan imitar favorablemente los

requerimientos de nutrientes de los individuos y, por otro lado, establecer los parámetros ecológicos para cada tipo de cultivo. De

acuerdo al World Catalogue of Algae publicado por Komagata y cols (1989), existen cerca de 11.000 cepas de microalgas, clasificadas en

3.000 especies, las que son mantenidas en 40 colecciones de cultivos representando a 16 países. El número de especies cultivables es

menor del 10% de aquellas especies descritas, por lo tanto nuevos intentos deben hacerse en determinar los medios de cultivos más

adecuados para cada especie, y esto está a menudo basado en la química del hábitat o los requerimientos específicos de nutrientes por

las algas.

Microalgas marinas

Uno de los medios de cultivo más utilizados y recomendados por su amplio espectro de uso en algas marinas es el medio f/2 y

variaciones (Guillard y Ryther 1962, Guillard 1975), diferentes versiones de medio Erdschreiber (e.g., Medio Plymouth Erdschreiber), y

ESNW (según sus siglas en inglés: Enriched Seawater Natural Seawater o agua de mar natural enriquecida, en castellano) parecen

dominar las citas (Berges y cols.2001). La familia de los medios-K (Keller y cols. 1987) ha sido específicamente desarrollada para

especies marinas oligotróficas (oceánicas), y dos nuevos medios oceánicos, MNK y Pro99 (Moore y cols. 2007), ofrecen promisorias

mejoras. Medios más especie-específicos que son frecuentemente usados incluyen la familia del medio L (Guillard y Hargraves 1993,

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Guillard 1995), GPM y variaciones (Sweeney y cols.. 1989 modificado por Loeblich 1975 y Blackburn y cols.. 1989), y medio para

cianobacterias oceánicas, SN (Waterbury y cols.. 1986).

Es difícil proveer un set comprensivo de recomendaciones de cual medio de cultivo es mejor para ciertas especies. Un buen punto

de inicio es utilizar el mismo medio de cultivo en el cual la especie está siendo mantenida y de donde fue obtenido en las colecciones de

cultivos (ver sitios web de colecciones de cultivos). En términos de vitaminas hay una importante consistencia entre los medios:

tiamina, biotina, y B12 son normalmente adicionadas en similares concentraciones, aunque podrían no ser requeridas. Para algunos

medios específicos la esterilización por autoclave puede evitarse debido a la descomposición de las vitaminas y, aunque existen especies

que requieren vitaminas, son viables de crecer con los productos degradados (Ver McLachlan 1973). Una estrategia práctica es agregar

las vitaminas filtrándolas luego de autoclavar el medio, de esa manera uno puede asegurarse que todo el medio está estéril y las

microalgas contarán con los nutrientes que requieren.

2. Obtención De Células Microalgales

El cultivo de microalgas consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan

multiplicarse de forma controlada. Los procesos o caminos establecidos para la obtención de biomasa microalgal en cantidades

económicamente factibles se denominan “Métodos de Cultivo”. El método de cultivo comienza con la preparación del material necesario

para iniciar el aislamiento de la especie de interés, es por ello que se debe conocer cuales son los requerimientos previos de las

microalgas en general, mecanismos de esterilización de los materiales, esterilización de medios de cultivo, técnicas de masificación del

cultivo y finalmente cuales son las opciones de cultivo microalgal (cultivo continuo, semicontinuo y discontinuo.

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Recolección de la muestra

El método de colecta es crucial para el éxito, debido a que células dañadas o muertas provocan el fracaso. Si la especie objetivo es

bien conocida y si ha sido colectada y estudiada previamente, entonces el investigador tiene experiencia substancial para guiar el

proceso de colección. El uso de redes de plancton o botellas Niskin Go-Flow (General Oceanics Inc.), dependerá del lugar de colecta de la

muestra, ya que otras variables pueden afectar la sobrevivencia de las especies objetivos. Muchas especies oceánicas son

particularmente sensibles a la colecta y a la concentración celular. Muestras colectadas a mayor profundidad pueden ser sensibles a la

presión, luz o cambios de temperatura. El investigador debe invertir más tiempo tratando de encontrar las especies objetivos en

muestras diluídas, ya que en esas condiciones la célula es usualmente viable. Las muestras naturales a menudo contienen zooplancton

que se alimenta de algas yuna vez concentrados, estos animales pueden rápidamente comer las algas contenidas. Para ello es necesario

remover prefiltrando gentilmente la muestra, permitiendo el paso de las algas y no de los animales, cuidando de no dañar o provocar

desecación de las muestras. El tiempo es un factor importante cuando se aislan algas. Algunos organismos mueren después de 1 hora o

unas pocas horas después del muestreo, para lo cual el aislamiento debe hacerse rápidamente. La aplicación de buenas técnicas de

esterilización también es importante cuando se colectan muestras, ya que vasos, matraces, mangueras, redes, sistemas de filtración

sucios y/u otros dispositivos de muestreo pueden contener cystos, que contaminen las muestras. Los microscopios de disección e

invertidos son los más usados. Los microscopios de disección tienen buenos lentes e iluminación permitiendo ajustar las muestras

celulares hasta hacerlas claramente visibles. Los microscopios invertidos tienen alejado el condensador para proveer fácil acceso cuando

se usa micropipetas y placas multipozo. Los cultivos enriquecidos en placas multipozo y unicultivos algales aislados son fácilmente

monitoreados con este tipo de microscopio, y las células pueden ser aisladas directamente desde los pozos.

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Metodologías de aislamiento de microalgas

El primer paso para un aislamiento exitoso es comprender e imitar las condiciones naturales en las que se encuentran las

microalgas en el medioambiente. En el caso de las algas marinas costeras, la temperatura y la salinidad son importantes, mientras que

para el fitoplancton oceánico la calidad del agua y la toxicidad de metales son componentes adicionales. El conocimiento taxonómico de

la especie objetivo también es importante. Las diatomeas requieren silicio, los euglenoides requieren amonio, y otros géneros requieren

selenium (e.g. Chrysochromulina). Especies mixotróficas, como ciertos dinoflagelados y crysofitos, requieren de una fuente bacteriana de

alimento.

El segundo paso lo constituye la eliminación de contaminantes, especialmente de aquellos que puedan competir con la especie

objetivo. Las técnicas de dilución, aislamiento de células aisladas por micropipeteo, y siembra en estrías sobre placas de agar son

ampliamente usados.

El paso final requiere lograr el crecimiento contínuo de los cultivos subsecuentes. No es raro que la especie objetivo crezca en las

etapas iniciales de aislamiento, pero luego muera después de una o más transferencias a medio de cultivo fresco. Esto a menudo indica

que el medio de cultivo carece de un elemento particular o compuesto orgánico, el cual no se manifiesta inmediatamente. Además estos

mismos organismos podrían acumular desechos que envenenan su medio causando la muerte, o provocan la aparición de otros

organismos que metabolizan aquellos compuestos (e.g. Bacterias).

El aislamiento de células desde una colecta natural de algas microscópicas produce cultivos monoespecíficos, sin embargo la

preparación de cultivos axénicos requieren paciencia y perseverancia. Los medios enriquecidos son comúnmente usados como un paso

preliminar en el aislamiento de células únicas, adicionando nutrientes a la muestra de agua natural, lo cual permite favorecer el

crecimiento de las algas contenidas en una muestra (Ver Medios de cultivo).

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a) Aislamiento de células mediante micropipetas

El método más común es el aislamiento por micropipetas, realizada con una pipeta Pasteur o un capilar de vidrio. La pipeta Pasteur

puede ser calentada, extendida y quebrada. Con una practica mínima, esta técnica se hace fácil y rápida, pero el principiante debe gastar

tiempo practicando antes de producir micropipetas adecuadas. La forma de hacer estas pipetas es calentando el extremo delgado

rotando suavemente en un mechero sujetado en el extremo con unas pinzas hasta llegar al punto de fundición del vidrio, posteriormente

la pipeta es removida del fuego y se estira hasta producir un delgado tubo (Fig. 1.1).

Figura1.1. Preparación de una micropipeta a partir de una pipeta

Pasteur. a) La pipeta es sujeta en el extremo mas caliente por unas

pinzas. La pipeta debe ser rotada a medida que se derrite el vidrio. b)

Una vez que el vidrio se vuelto suave es removida rapidamente del fuego

y estirada para producir un tubo fino. C) las pinzas deben ser

relocalizadas apropiadamente en la región delgada del tubo. D) con las

pinzas se dobla cuidadosamente el tubo hasta que se quiebre, formando

la micropipeta. E) Este tipo de corte mostrando bordes irregulares no es

adecuado. F) una punta larga con un corte recto es adecuado para usar.

Note que el diámetro de la punta tan largo como el flagelo de una célula

flagelada, así se reduce la posibilidad de que varias células entren a la

micropipeta durante la aislación.

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El objetivo del aislamiento por micropipeta es recoger una célula desde una muestra, depositandola sin dañarla en medio de

cultivo estéril. Un microscopio es necesario para observar y aislar las células. La muestra conteniendo la especie objetivo puede ser

dispuesta en un portaobjeto, portaobjeto escavado, placas multipozo o contenedores similares. Se deben preparar con anticipación

goteros estériles y el medio de cultivo nuevo. Una manguera flexible es adherida a una boquilla en un extremo y la micropipeta o capilar

al otro. El operador coloca la boquilla en la boca cubriendo con la lengua un extremo y se acerca al organismo objetivo con el tubo fino,

succionando suavemente de manera de permitir que la acción capilar absroba a la célula al interior de la micropipeta. Después de

capturar la célula, la micropipeta es removida y se dispone en el medio nuevo contenido en un tubo de ensayo, placas multipozo, etc.

Mediante el movimiento suave de la micropipeta la célula es descargada en el segundo medio de cultivo estéril. A continuación se

examina microscópicamente la muestra extraída (Fig 1.2). Este procedimiento es repetido solo hasta que una única célula sea aislada de

las otras células. (Andersen & Kawachi, 2005)

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Figura 1.2. Aislamiento mediante Microfishing. Paso 1, muestra

problema disuelta en medio estéril; Paso2, identificación de la célula a

aislar; Paso 3, traspaso a las siguientes gotas para su dilución; Paso 4,

traspaso de la célula a

un tubo de cultivo estéril

Protocolo de Aislamiento por micropipeteo (Microfishing):

- Sobre un portaobjetos limpio, deposite una gota de la muestra, si está demasiado densa diluir con una gota de medio de cultivo

(figura 1.2.1).

- Sobre otro portaobjeto, deposite 4 gotas separadas de medio de cultivo para el “lavado” de la muestra.Con la ayuda del microscopio

enfoque la gota de la muestra e identifique la especie deseada (figura 1.2.2).

- Tome un microcapilar, ubique su extremo en el campo visual sobre la gota, diríjalo sobre el blanco elegido y aspírelo rápidamente

por capilaridad. Dirija suavemente el líquido retirado en la gota estéril Nº 1. Verifique bajo aumento si la especie está presente

(figura 1.2.3). Con un nuevo capilar retomar la célula de la gota Nº 1 y transfiérala a la gota Nº 2, para el segundo lavado, repita éste

procedimiento una dos veces más hasta el último lavado (gota Nº 4) (figura 1.2.3).

3

1

2

4

Gota 1 2 3 4

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- Si la célula parece bien aislada y sigue viable, tomarla por última vez con un microcapilar nuevo y expulsarlo dentro de un tubo

inclinado con medio de cultivo adecuado (figura 1.2.4). Otra opción es quebrar el extremo del micro capilar que contiene la célula

aislada y depositarlo en el tubo con medio de cultivo (figura 1.2.4).

b) Aislamiento con Uso de Agar

Una de las metodologías utilizadas es la siembra extendida de la muestra microalgal, es decir, inocular el líquido directamente al

agar y expandirlo con un asa de vidrio (Fig 1.3). Para lograr un aislamiento exitoso, la microalga debe ser capaz de crecer sobre este

medio. Algunos flagelados (e.g., Heterosigma, Pelagomonas y Peridinium) no crecen sobre agar, pero otras (e.g., Chlamidomonas, Pavlova,

Synura, Navicula y Tetraselmis) crecen muy bien en agar. La mayoría de las diatomeas y chlorarachniophytes crecen muy bien sobre

agar, no tanto los dinoflagelados. El agar es también un buen medio para hongos y bacterias. Estos microorganismos crecen rápido,

contaminando las muestras. Si se observan hongos en las placas selladas con parafilm, es mejor descartar las placas sin abrirlas, ya que la

presencia de esporas podrían producir mayores complicaciones Las bacterias usualmente producen colonias pequeñas y bien limitadas.

Es posible obtener un cultivo unialgal si la placa ha sido estriada apropiadamente. (Fig 1.4). Un asa de siembra con una pequeña

cantidad de muestra, se dispersa a través del agar en diferentes formas o patrones. Normalmente, el inóculo en el asa de siembra tiene

muchas células que no están separadas, por lo que se aumenta la distancia de las estrías desde el origen de manera de ir aislando las

células hasta obtener una sola célula (Fig.3) Luego, la placa de agar es incubada hasta que las colonias de células aparezcan. Los tiempos

de incubación varían desde unos pocos días para muestras de suelo y agua dulce hasta varios meses para especies oceánicas. Cuando la

coloniaaparece sobre el agarpueden ser dispuestas en medio líquidos o sólidos.

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Figura 1.3. Técnica siembra extendida.

Protocolo Siembra Extendida

- Limpie con alcohol la superficie de trabajo y sus manos (secuencia 1).

- Deposite sobre la superficie de una placa petri una gota o 0.1 ml de la determinada dilución (secuencias 2 y 3).

- Esterilice el cayado o asa de vidrio mediante un flameado en el mechero (4).

- Enfríe el cayado oasa de vidrio flameado en la tapa de la placa petri, con movimientos suaves (5).

- Extienda la gota con ayuda del cayado o asa de vidrio en todas direcciones hasta que se observe completamente seco (6).

4 5 6

1 2 3

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Figura 1. 4. Aislamiento por siembra estriada.

Protocolo Siembra Estriada:

- Limpie con alcohol la superficie de trabajo y manos.

- Esterilice el asa de siembra, flameándola con el mechero y luego enfríe (Fig 1.4)

- Tome una muestra y extienda sobre un área pequeña de la placa petri en forma de estrías pequeñas (secuencia 1 y 2).

- Tenga cuidado de hacer estrías muy juntas y con poca presión para no dañar el agar nutritivo (3).

- Después de terminar la 1º estría, prosiga con la segunda hasta completar la placa petri (4)

- Repita sucesivamente este proceso, flameando u enfriando el asa al comienzo de la toma de cada muestra.

- Incube la placa en forma invertida (5).

4 5

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c) Técnica de Dilución

Esta técnica es efectiva cuando los organismos son muy abundantes en las muestras pero muy ineficiente en individuos raros o en

baja concentración. El objetivo del método de dilución es depositar solo una célula en un tubo de ensayo, matraz, o pozo de una placa

multipozo, estableciendo células únicas aisladas. Si la concentración aproximada es conocida, entonces es fácil calcular la dilución

necesaria, sobre la base de la probabilidad para un pequeño volumen (por ejemplo una gota, 50µL, 1mL) que contendrá a una sola célula

de la muestra. En la práctica, algunas contienen mas de una célula y otras no contienen células del todo. La técnica de dilución es quizás

la mas frecuente cuando se intenta cultivar especies algales aleatorias desde muestras de terreno, a menudo con el objeto de descubrir

nuevas especies. La técnica puede ser variada en diferentes formas: Primero, la dilución puede hacerse con medio de cultivo, agua

destilada, agua de mar, agua filtrada o alguna combinación de estas. El medio de cultivo puede fortalecer a algunos organismos o no

permitir el crecimiento de otros presentes en menor concentración. Segundo, estimar la concentración en la cual se obtendrá el cultivo a

nivel unialgal. Comúnmente se inocula un gran número de tubos, asumiendo que algunas células morirán, algunas contendrán dos o más

especies, y que algunos no recibirán células. Tercero, elementos como amonio o selenio pueden ser adicionados en algunos tubos de

aislamiento para seleccionar especies determinadas que requieran ciertos nutrientes. De manera similar, se pueden experimentar

diferentes temperaturas, régimen de luz u otros parámetros. Los aislados axénicos no son obtenidos a menudo con la técnica de dilución

ya que las bacterias normalmente son más abundantes que las microalgas presentes (Fig 1.5).

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Figura 1.5. Técnica de dilución. Una alícuota es removida desde la

muestra original y colocada en tubos de ensayo conteniendo medio

estéril. Después de mezclar una alícuota es removida desde el tubo y

dispensada en las placas multipozo conteniendo medio estéril, y una

segunda alícuota es adicionada al siguiente tubo de ensayo con medio

estéril. El ciclo se detiene cuando se hace probable que no haya células a

transferir.

Protocolo de Aislamiento por diluciones

Se toma 1 ml de la muestra microalgal y se suspende en 9 ml de agua de mar filtrada y autoclavada Ésta sería la primera

dilución rotulada como -1, que quiere decir que la muestra microalgal problema esta diluida 10 veces.

A partir de esta dilución (-1), se toma 1 ml de muestra y se agregua a 9 ml de agua de mar filtrada y autoclavada,

correspondiendo en esta ocasión a una dilución -2.

Realice este procedimiento 4 veces, obteniendo una un factor de dilución de 10000 o 10 -4.

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d) Separación por gravedad: Centrifugación.

La separación por gravedad puede ser efectiva para particionar grandes y pequeños organismos y los dos principales métodos

son la centrifugación y el asentamiento. La centrifugaciónse utiliza frecuentemente para concentrar organismos en cultivos unialgales. El

objetivo es separar las células grandes y pesadas de las algas y bacterias. Una centrifugación a baja velocidad durante corto tiempo trae

grandes dinoflagelados y diatomeas a formar un holgado pellet y las células pequeñas pueden ser decantadas. Las células objetivos

entonces pueden ser resuspendidas, y si es necesario se repite el proceso. Sin embrago, una excesiva centrifugación puede dañar las

células, especialmente aquellas con organelos eyéctiles. Esta técnica es efectiva para concentrar grandes células, pero es difícil obtener

cultivos unialgales, por lo tanto se emplea en combinación con otras técnicas descritas (Andersen & Kawachi, 2005).

2. Escalamiento De Cultivo

El cultivo microalgal comienza con la obtención de la cepa aislada y posterior mantención de un stock en pequeños recipientes,

mantenidos en condiciones axénicas para ser utilizados en el escalamiento de cultivo, el cual se refiere básicamente a ir aumentando

gradualmente el volumen de cultivo, con el objeto de obtener la mayor cantidad celular para su posterior cosecha.

El escalamiento comienza con el denominado cultivo primario, éste se lleva a cabo en matraces erlenmeyer de 150 ó 250 mL,

generalmente en volúmenes de 60 y 100 mL de cultivo respectivamente; el medio de cultivo se esteriliza mediante calor húmedo y sin

aireación. Al tiempo de obtener la máxima densidad celular (según la especie y su curva de crecimiento), se procede al traspaso de un

volumen de cultivo fresco (inóculo) a recipientes de mayor volumen. El siguiente nivel del escalamiento será el Cultivo

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Semiintermedio, el cual se realiza en bolones de fondo plano de 1 - 2 litros y matraces erlenmeyer de 2 litros, los volúmenes de cultivo

fluctúan entre 500 – 1600 mL. En este caso se recomienda la utilización de aireación leve en recipientes con volúmenes superiores a

1000 mL y la esterilización del medio de cultivo al igual que el cultivo primario se realiza mediante calor húmedo (autoclave). En el

cultivo intermedio, los recipientes utilizados son botellones de polietileno de 20 litros de capacidad. Estos cultivos son realizados en

volúmenes de 17 litros con una aireación que permita la mezcla de nutrientes y la utilización adecuada de la luz. El último nivel del

escalamiento es el cultivo masivo, el cual se puede realizar tanto en invernaderos con condiciones de luz y temperatura controladas,

como al aire libre, siendo en este caso la elección del lugar uno de los principales factores a considerar. Es necesario un clima apropiado,

buen suministro de agua, en calidad y cantidad, y además fuente de energía disponible. En el caso de microalgas marinas, el agua puede

ser natural o artificial. Para el cultivo masivo se pueden utilizar estanques o piscinas (race-way), bolsas y reactores cilíndricos. En

cualquiera sea el caso hay factores a considerar en el diseño sistema de cultivo:

1. Columna de agua: La profundidad del cultivo debe ser la óptima para permitir la penetración de la luz a toda la columna de agua.

2. Revestimiento: Las superficies de estanque o reactores deben ser lisas, para favorecer la circulación del líquido y evitar el

estancamiento de las células en ranuras o pliegues.

3. Evaporación: Esto cambia las condiciones del medio de cultivo, las cuales pueden ser perjudiciales para el cultivo. Para

minimizar la evaporación se recomienda la utilización de revestimientos trasparentes en las piscinas o estanques.

4. Agitación: Al igual que en el cultivo semiintermedio e intermedio, la agitación del cultivo permite un aprovechamiento

homogéneo de los nutrientes y luz por parte de las células. En estanques la agitación suele ser por paletas o hélices, en el caso de

los reactores es mediante la incorporación de aire.

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Cualquiera sea el nivel en el que se esté trabajando, el traspaso o escalamiento se realiza previa verificación de las condiciones en

las que se encuentre el cultivo, siendo necesario conocer la densidad celular y así inocular el volumen adecuado al siguiente nivel.

Generalmente, las densidades de inóculo van entre 1E +04 a 5E +04 cel/mL; las densidades finales y el tiempo de cultivo va a depender

de la especie, entre 7E +05 a 3E +06 cel/mL y un tiempo entre 6 a 8 días aproximadamente.

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OBTENCIÓN CEPARIO

Cultivo semiintermedio 500 – 1600 mL

Cultivo primario 100 -150 mL

Cultivo intermedio 18 – 50 litros

- Matraces erlenmeyer.

- Sin aireación.

- 7-8 días de cultivo.

- traspaso a volúmenes

iguales o superiores.

- Estanques (race-way).

- Reactores.

- Agitación mediante paletas o

hélices.

- 8-12 días de cultivo.

- listo para la cosecha

- Matraces erlenmeyer. – Bolones fondo plano.

- Aireación. – 7-8 días de cultivo.

- traspaso a volúmenes iguales o superiores.

- Reactores, botellones y bolsas.

- Aireación - 7-8 días de cultivo

- Sólo traspaso a volúmenes superiores

Cultivo Masivo > 400 litros.

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3. Técnicas de Recuento

A continuación se hace una descripción breve de los métodos que se utilizan para determinar el número de células presentes en

una muestra de microalgas.

a) Hematocitómetro o Cámara de Neubauer

Mediante una pipeta Pasteur o una micropipeta se toma una muestra de microalgas (10-20 µl) y se desliza en la cámara de Neubauer que

previamente tiene adherido el cubreobjetos (Fig 1.6), se deja pasar 5~10 minutos para que la muestra se estabilice; se procede a contar

utilizando un contador de mano (Fig 1.7).

Figura 6.- Conteo celular en homatocímetro.

Figura 7.- Cuadrantes de la cámara de conteo.

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En algunos casos es necesario diluir la muestra cuando la densidad es alta y también fijarla cuando la microalga es móvil, siguiendo

los siguientes pasos:

1. Se toma un milílitro de la muestra.

2. Se añade un mililitro de agua de mar filtrada ya preparada con formaldehído al 4%.

3. Se deja reposar por tres minutos.

4. La muestra se homogeniza con una Pipeta Pasteur.

5. Se cuentan las células de cada una de las cámaras.

Una vez que se tiene el promedio de células de las cámaras, el cálculo total de células por mililitro se lleva a cabo de la siguiente

manera:

N° de Células = (F.D.) (P.H.) (1,000) (N.P.)

F.D.: factor de dilución

m = Muestra problema (ml)

f = Agua de mar con formaldehído

P.H.: Profundidad del Hematocímetro, está incluida en la parte inferior derecha de la cámara

N.P. = Número promedio de células por ml

Todo el cálculo se multiplica por 1,000 para convertir a mililitros.

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b) Densidad Óptica

Mediante el uso de un espectrofotómetro es posible determinar la concentración celular de una muestra por densidad óptica. Para

esto, es necesario calibrar primero el equipo con el medio de cultivo utilizado, asignándole el valor de 0 absorbancia o densidad óptica.

Con diluciones decrecientes de la muestra se determina el número de células para cada una y se realiza una curva de calibración. Para

esta curva, se determina la absorbancia de cada dilución preparada, lo que se graficará posteriormente de manera que en el eje de las

absisas se indica la concentración de la muestra (en número de células por ml) y, en el eje de las ordenadas, se indica la densidad óptica o

absorbancia. La longitud de onda escogida para trabajar dependerá de la especie de microalga que se está caracterizando. De esta

manera, es posible determinar la densidad ótpica de diferentes muestras, ya sea a través del gráfico de la curva de calibración o

utilizando la ecuación de la recta determinada para esta curva. Este procedimiento es particular para cada especie.

c) Volumen Celular

Es posible determinar la cantidad de células o de biomasa de la muestra (peso/volumen , p/v o w/v en inglés) por centrifugación,

donde se descarta el sobrenadante y el “pellet” puede ser pesado húmedo o seco (3-4 días en estufa a 40-40°C).

d) Composición Química

En algunos estudios se puede determinar la concentración de clorofila A, B y otros pigmentos presentes en la muestra. Debe

considerarse que la composición química del fitoplancton varía de acuerdo al tipo de cultivo usado, medio nutritivo y otros factores por

lo que es necesario realizar un análisis proximal de la especie en estudio en relación al tipo de cultivo desarrollado.

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4. Medios De Cultivo

Uno de los métodos más importantes para la identificación de microalgas es observar su crecimiento en sustancias alimenticias

artificiales, preparadas en laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es denominado medio de cultivo y

el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Se han diseñado muchos medios de cultivo diferentes, siendo varios de ellos

desarrollados y usados para el aislamiento y el cultivo de microalgas tanto de agua de mar como de agua dulce.

La forma de cultivo microalgal más usual es aquella en la que una disolución acuosa de volumen limitado es mezclada en forma

equilibrada, conteniendo los nutrientes orgánicos e inorgánicos en concentraciones necesarias: una base mineral, una fuente de carbono,

nitrógeno y azufre, además de una atmósfera adecuada las cuales permiten un buen crecimiento de microalgas.En ésta se inocula un

número relativamente pequeño de células y se expone a condiciones favorables de luz y temperatura. Podemos mencionar que el agua

de mar enriquecida es la base para la preparación de muchos medios de cultivos de microalgas marinas, empezando con las fórmulas

más sencillas basadas en la de Miguel, hasta las mezclas actuales más complejas.

Es importante considerar, cuando se examinan recetas para medios de cultivo, que diferentes microalgas pueden poseer

requerimientos nutricionales distintos. Por ello, para tener éxito en el cultivo de una determinada microalga, es necesario conocer estos

y suministrarle nutrientes esenciales en la forma y proporciones adecuadas; entonces, si se es cuidadoso en la preparación de éstos es

bastante fácil cultivar microorganismos en el laboratorio.

Por otro lado, la modificación del medio de cultivo ha sido un método ampliamente utilizado para incrementar la producción de

biomasa o variar su composición. A partir de medios descritos en la literatura, la mayor parte de los estudios han utilizado la estrategia

de la modificación cuantitativa en los nutrientes suministrados. Así, se han obtenido variaciones importantes en la productividad y

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composición bioquímica modificando la concentración de nitrógeno, fósforo o la relación entre ellos. El contenido y composición de

ácidos grasos, vitaminas y aminoácidos libres también varía con las condiciones de nutrientes del medio.

Naturaleza química de los medios de cultivo.

En general, el medio de cultivo debe proporcionar los requerimientos mínimos de la especie a cultivar, pudiendo utilizarse

medios no definidos químicamente (naturales y/o enriquecidos) o medios definidos (artificiales) , los que se emplean con mayor

frecuencia . En la literatura existen listas de medios definidos que han sido utilizados por diversos investigadores para cultivar variados

grupos de microalgas, se utilizan también para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles.

Dichos medios se preparan añadiendo al agua destilada, cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente

purificados, por ello se conoce la composición química exacta. Estos medios pueden ser preparados en laboratorio o adquirirse

comercialmente y tienen la ventaja de soportar el crecimiento de un gran número de especies de microalgas; por otra parte, si estos

medios son muy ricos en compuestos orgánicos se corre el riesgo de contaminación con bacterias más fácilmente que los inorgánicos. Un

medio de cultivo no definido (enriquecido) es un medio preparado con agua de mar limpia y filtrada para eliminar el material

particulado o en suspensión, a la que se añaden algunos compuestos que los organismos necesitan en cantidades grandes en relación a

su concentración en el agua de mar. Estos medios son bastante sencillos: contienen fuentes de nitrógeno, fósforo, silicio y hierro; los más

sofisticados contienen además mezclas de metales traza y vitaminas y se utilizan para microalgas que tienen grandes exigencias

nutricionales. Los medios definidos naturales y/o enriquecidos pueden prepararse en estado líquido y/o sólido. Como agente

solidificante se usa agar al 1,5 o 3% (p/p). Las ventajas de trabajar con un medio sólido son las siguientes: se inmovilizan las unidades

algales, se pueden separar las unidades algales de otros organismos que puedan interferir con su crecimiento y se proporcionan

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nutrientes y otras condiciones favorables para su multiplicación. La desventaja es el problema de contaminación con bacterias y hongos,

problemas que se minimizan si se trabaja en condiciones asépticas.

Microorganismo a cultivar.

Los diversos tipos de nutrición organotrófica en microorganismos fotosintéticos están relacionados con la utilización de energía

luminosa y CO2, además de los compuestos orgánicos asimilados. El carbono puede aportarse a las microalgas en forma muy diversa

dependiendo del tipo de metabolismo que posean y es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgánicos

requeridos para las estructuras y funciones de la célula. Algunas microalgas son capaces de crecer en condiciones de fotoautotrofía,

esto significa que los organismos obtienen la energía necesaria para realizar sus funciones metabólicas utilizando la luz y componentes

inorgánicos, de esta manera sintetizan los esqueletos carbonados de los metabolitos orgánicos; en condiciones de mixotrofía los

organismo utilizan una fuente de carbono orgánico y energía luminosa como fuente de electrones y en condiciones de heterotrofía los

organismos requieren de una fuente de carbono orgánico y pueden crecer en la oscuridad. Las fuentes de carbono orgánico más

comúnmente citadas son el etanol, el acetato y la glucosa.

Utilización u objetivo del cultivo.

Algunos cultivos están dirigidos a la obtención de biomasa microalgal enriquecida con sustancias de interés comercial. Entre

estas sustancias se destacan los pigmentos, tales como la clorofila a y los carotenoides, vitaminas, proteínas, ácidos grasos

poliinsaturados, y compuestos bioactivos. La biomasa microalgal también es una fuente alternativa con alto contenido proteico: los

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cultivos de microalgas se han empleado en la alimentación de animales, humanos, en acuicultura para la cría de microcrustáceos, para

tratamiento de aguas residuales y como fuente energética, además de contribuir a la eliminación de desechos. La mayor parte de la

biomasa microalgal se comercializa como alimentos medicinales, en forma de tabletas y cápsulas; además se están incluyendo sus

extractos, como suplemento, en algunas pastas, vinos, refrescos, cereales y cosméticos.

En algunos casos se requieren cultivos unialgales o puros (aquellos cultivos que contienen una sola especie de alga), y este tipo de

cultivo se puede iniciar con un solo individuo o con varios, conteniendo además bacterias. Los cultivos axénicos o puros absolutos son

aquellos exentos de bacterias.

Otros cultivos realizados en medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que, brindan resultados

constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento,

las principales fórmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-

Schereiber de 1934, y Medio f/2 Guillard que es utilizado para un gran número de especies unicelulares.

Estado del medio de cultivo.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios

líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en laboratorio. Los medios líquidos son una solución acuosa que incluyen los nutrientes

que las microalgas precisan: una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno. Además el medio de cultivo debe aportar una fuente de

energía química, que puede proceder de un compuesto inorgánico u orgánico. Favorecen mucho el desarrollo y la multiplicación de las

microalgas porque al difundirse éstas por todo el medio encuentran con facilidad las sustancias que necesitan para nutrirse y son de

gran utilidad para la realización de múltiples pruebas, a diferencia de los medios sólidos o semisólidos los cuales llevan un agente

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solidificante: agar. El agar es un polisacárido acídico elaborado a partir de ciertas algas Rodofíceas que gelifica por debajo de 45° C, éste

se utiliza a una concentración en una proporción por encima del 15% (15 g/L) para medio sólido y 0.7 o 3 % (0.7-3 g/L) para medios

semisólidos. La utilidad del agar en el medio de cultivo es al día de hoy irreemplazable, porque hasta ahora no se ha encontrado otro

agente solidificante con las ventajas que tiene el agar. En estado sólido el agar se nos muestra con un aspecto blanco tendiendo a lo

amarillento. No es soluble en agua a 25 ºC, pero sí lo es en agua a 100 ºC y en formamida y lo ligeramente en etanolamina. Asimismo, su

equilibrio eléctrico se desplaza en solución, ultimando sales como sulfato de magnesio, de sodio o de amonio, causa de la precipitación

parcial de la agaropectina. En estos medios sólidos o semisólidos las microalgas crecen con mayor dificultad, pues los nutrientes se

agotan con rápidez en el punto donde se desarrollan; no obstante, nos permite el aislamiento, purificación y visualización de su

crecimiento.

Requerimientos nutricionales.

Así como las microalgas requieren de factores físico-químicos para su crecimiento también requieren de factores nutritivos. Entre

estos últimos son relevantes los macronutrientes, que son utilizados para sintetizar compuestos orgánicos y los micronutrientes, usados

como catalizadores. En términos generales los macronutrientes son el carbono, nitrógeno, fósforo, silicio, magnesio, potasio y calcio, que

se requieren en cantidades relativamente grandes, cada especie de microalga responde ante la disponibilidad y proporción de estos

macronutrientes y en el caso específico de las diatomeas la disponibilidad de sílice, mientras que los llamados micronutrientes como el

fierro, manganeso, cobre, zinc, sodio, molibdeno, cloro y cobalto se necesitan en menores cantidades. El crecimiento microalgal se rige

por la ley de mínimo, es decir, el factor limitante del crecimiento es aquel que está presente en cantidades más próximas al mínimo

crítico necesario.

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Los macronutrientes agregados a los medios de cultivo pueden ser muy diferentes Normalmente deben encontrarse en

cualquier medio de cultivo nitrógeno, fósforo y silicio, sin embargo, el silicio es requerido sólo en las diatomeas, silicoflagelados, y

algunas crisofíceas. También se considera el dióxido de carbono en forma de carbonatos o bicarbonatos. Estos macronutrientes son

generalmente requeridos en una proporción de 16N:16Si:1P; en ambientes marinos estas proporciones a menudo son similares, excepto

en algunos estuarios donde hay entradas de nitrógeno y fósforo.

Las microalgas presentan la capacidad de utilizar diferentes sustratos como fuente de nitrógeno. No obstante, en función del

estado de óxido-reducción del nitrógeno, éste será asimilado por diferentes rutas metabólicas que requerirán un diferente gasto del

poder reductor y energía generados durante la fotosíntesis. Así, la fuente de nitrógeno se ha descrito como un factor que puede afectar al

crecimiento y composición bioquímica de una microalga en cultivo. Algunas investigaciones señalan que el reparto del carbono fijado

fotosintéticamente entre las fracciones proteicas, glucídica y lipídica, difiere en función de la fuente de nitrógeno asimilada, en relación a

esto, microalgas marinas pertenecientes a distintas clases taxonómicas pueden utilizar nitrato, nitrito, amonio incorporada como NH4Cl

o urea como únicas fuentes de nitrógeno, a su vez la utilización de diferentes fuentes de nitrógeno afecta a la capacidad de carga de los

distintos medios, de esta manera nitrato y fósforo son normalmente adicionadas como NaNO3 y NaHPO4. En algunos medios, el fósforo

agregado como glicerofosfato de sodio y puede precipitar como una sal de calcio y elevar la temperatura del medio. El silicato es

adicionado como Na2SiO3 debido a que el ácido del sílice aumenta la precipitación, es útil omitirlo del medio si la especie no requiere el

silicato.

Los micronutrientes corresponden a los metales que intervienen en el enriquecimiento del agua de mar. Las concentraciones de

éstos compuestos varían según la formula del medio que se trate. Se recomienda utilizar sales hidratadas para facilitar su dilución

cuando se prepara la solución de metales traza. Estos metales son agregados en forma quelada, siendo el Na2EDTA el principal quelante

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y con el se evitan precipitados durante la combinación de las sales. El cobalto, cobre, magnesio, molibdeno, zinc, selenio y níquel se

pueden preparar por separado como soluciones stocks primarios y diluir, para luego formar parte de una solución stock de trabajo.

Las tres vitaminas mayormente utilizadas en orden de importancia en el crecimiento de las microalgas son: vitamina B12

(cianocobalamina), vitamina B1 (tiamina) y vitamina B7 ó vitamina H (biotina) son requeridas generalmente en cultivos de microalgas

axénicas, ellas son usadas en muy bajas concentraciones y almacenadas a temperatura de congelamiento. Pueden ser adicionadas

asépticamente al medio esterilizado a través de filtración con membrana 0.2 µm o autoclavada.

La vitamina B12 (cianocobalamina) ha sido reconocida como un componente necesario para el crecimiento de muchas

microalgas; aunque su rol metabólico no es claro, evidencias de estudios recientes sugieren que es un cofactor principalmente para la

metionina sintetasa (Croft y cols. 2005). Esta vitamina es estable en forma de polvo y contiene un 12% de humedad. En la preparación

de los medios pueden usarse ampollas que contienen 10 mg del compuesto, para lo cual se prepara una solución stock primaria de

cianocabolamina disolviendo el contenido de una ampolla en agua destilada. Se ajusta el pH a 4.5 con HCl y se diluye a un volumen

determinado. Ella también puede ser filtrada con membrana millipore. Se debe almacenar la solución a –20º C esta vitamina resiste los

recongelamientos y reautoclavados.

La vitamina H (biotina) es estable en forma de cristal y contiene un 4% de humedad la solución stock primaria se prepara

pesando lo requerido. Su acidificación la vuelve estable para el autoclavado.

Por otro lado, la cantidad de vitamina B1 (tiamina) requerida puede diluirse en la solución de biotina y ajustar a pH 5.5 puede

autoclavarse en esta condición y guardarse a -20°C. Las 3 vitaminas pueden combinarse para formar una solución stock de trabajo hasta

para mil diluciones. Cuando se prepara un medio se agregan las vitaminas en forma aséptica por filtración a través de membranas de

0,22 um, aunque ellas son frecuentemente autoclavadas con el medio, por que su condición ácida permite su autoclavado.

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Requerimientos físicos-químicos.

Las microalgas requieren diferentes requerimientos físico-químicos, entre los que se destacan la luz, temperatura, salinidad, pH y

CO2.

a) Temperatura.

No sólo afecta las reacciones celulares, sino también los requerimientos nutricionales y la composición de la biomasa, así como la

solubilidad de los gases en el agua, la que tiene un rango óptimo: un incremento en ella estimula el crecimiento hasta el máximo y

después disminuye. La temperatura puede cambiar según el tipo, especie y variedad de microalga, se puede mantener un margen de 18-

25 ºC. Cada especie tiene un óptimo, normalmente alrededor de 20-22 ºC, por debajo de los 16 ºC se ralentiza mucho el crecimiento y

por encima de 30 ºC hay muerte de microalgas. Para tener un cultivo en buenas condiciones, se debe mantener en salas atemperadas,

sobre todo en volúmenes pequeños (10-100 litros). Sólo interesa mantener la temperatura por debajo de 18 ºC cuando se hace

referencia a cepas puras, para mantenerlas en las condiciones más axénicas o estériles posibles.

b) pH

La respuesta de las microalgas al pH varía ampliamente, debido a que este factor determina la solubilidad del dióxido de carbono

y de los minerales en los cultivos e influye directa o indirectamente en su metabolismo. El pH óptimo está entre 7 y 8, el agua de mar

tiene un pH de 8,2-8,3. Si se diluye el agua de mar, entre otras cosas puede haber una acidificación más o menos importante. Se deben

añadir sustancias para mantener este pH por encima de 7, añadiendo carbonatos o suministrar en el aire de burbujeo un aporte de CO2,

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que pasa a H2CO3. Cuando se agota el CO2 por consumo de las microalgas provoca una disminución de pH. Para mantener estos valores,

se debe añadir CaCO3.

c) Aire

Dentro de estos factores hay que considerar en los cultivos masivos la aireación, ya que es un factor muy importante para la

homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el

agua no se mezcla, esto también depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro

factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz

incidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz

es más efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es

recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético. El crecimiento y la división celular son afectados por

la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de iluminación y oscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en

Diatomeas a 20 °C y 1.000 lux se obtiene un crecimiento favorable.

d) Luz

La luz afecta el crecimiento de las microalgas de forma que, a mayor intensidad de luz, responde con un incremento del número

de células pero se satura. Puede usarse cualquier tipo de luz (día o fluorescente). Hasta avolúmenes de 400 litros se usan tubos de luz

fluorescentes. En volúmenes superiores, se usan invernaderos. La respuesta a la luz continua es buena (24 h de luz). Depende del

volumen que haga falta, pudiendocombinarse las dos cosas. Normalmente, en la producción intensiva se trabaja con menos de 200 litros.

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Con menos litros, los luxs son más altos que a volúmenes elevados. Los tubos fluorescentes son la forma más barata y no se aconseja que

se incremente mucho la temperatura del medio.

Hay que tener en cuenta que, cuando las microalgas están asociadas a bacterias en la naturaleza (no axénicas), se ejerce una

interacción que puede ser beneficiosa para ambos, de manera que la microalga es capaz de asimilar productos de la actividad bacteriana

en el medio. Así mismo, la flora microbiana asociada está implicada en la regulación de parámetros fisiológicos como pH, temperatura y

salinidad. En cambio, en condiciones axénicas, las microalgas no llegan a alcanzar un crecimiento óptimo, por carecer de la flora

microbiana asociada, la cual le aportará factores esenciales para estimular el crecimiento. Los cultivos axénicos de microalgas de interés

en biotecnología pueden ser utilizados para fines farmacológicos y de nutrición humana, mientras que los cultivos no axénicos en los

cuales se mantiene la flora bacteriana asociada, pueden ser seleccionados para acuicultura, nutrición animal o para biofertilizantes. Sin

embargo, la respuesta de las microalgas para cada condición de cultivo es susceptible de ser modificada en función de diversos

parámetros de cultivos.

Es posible incluir el uso de antibióticos cuando se quieren eliminar del cultivo las algas verde-azules contaminantes. En este caso,

debe tenerse precaución en la concentración del antibiótico a usar ya que concentraciones muy altas pueden inhibir el crecimiento de

algas eucariontes. Si el investigador está interesado en aislar algas verde-azules fijadoras de nitrógeno, deberá eliminar la fuente de

nitrógeno del medio de cultivo; como este elemento es esencial para la mayor parte de las algas, sólo se desarrollarán aquéllas capaces

de fijar nitrógeno atmosférico.

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Preparación del medio de cultivo.

Los medios son generalmente preparados en soluciones stock previamente mezcladas, para simplificar su preparación, luego,

alícuotas desde éstos son medidas y agregadas a un volumen dado de agua destilada. Sin embargo, algunos medios son preparados

pesando o midiendo el componente que se requiere y agregando esto directamente a un volumen de líquido (agua de mar, agua dulce o

agua destilada según sea el caso de la microalga que quiere cultivarse), ya que la combinación directa de varias soluciones stock de

trabajo sin diluir en agua pueden causar una precipitación. Las soluciones stock pueden ser preparadas y almacenadas a bajas

temperaturas por un largo período de tiempo, pero siempre hay que tener cuidado con el recipiente donde se almacena: deben usarse

recipientes con tapa de vidrio, éste debe tener un sellado firme para evitar la evaporación ya que esta influye en la concentración del

determinado stock. Siempre es aconsejable preparar las soluciones stock en el momento que se vaya a realizar un experimento, ya que

algunos procedimientos incorrectos pueden causar precipitaciones, por ejemplo, de nitratos y fosfatos.

Los componentes químicos usados para preparar los medios deben ser de buena calidad, la que esta determinada por la pureza

de los compuestos. Uno de los puntos mas importantes a considerar en la preparación de los medios de cultivo es la precisión requerida

en la pesada de los compuestos; para ello, se debe contar con una balanza analítica.

En general, los recipientes de cultivo utilizados son de vidrio, y dentro de éstos, los de borosilicato son los preferidos. En

experimentos de nutrición, particularmente para individuos que contienen impregnaciones de sílice, como es el caso de las diatomeas y

silicoflagelado, no es recomendable el uso de material de vidrio, ya que éste contiene silicios solubles. En estos casos, se recomienda

recubrir el recipiente por ejemplo con parafina, o usar recipientes de plásticos desechables (poliestireno), los cuales vienen esterilizados

de fábrica. En la actualidad, es posible conseguir accesorios para cultivo de policarbonato con tapa de polipropileno, que tienen la

ventaja de ser esterilizados por autoclave. Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las

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placas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos

a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los más recomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas

rurales son los sistemas más económicos.

Como se señaló anteriormente, el material más utilizado para preparar los medios es el vidrio, que puede ser reutilizado así que,

el proceso de limpieza no debe producir daño a los recipientes. Cuando el material de vidrio está extremadamente sucio, se recomienda

lavar con una solución de ácido crómico o sulfocrómico y luego lavar con abundante agua corriente. Para terminar la limpieza y

neutralizar los recipientes de vidrio es recomendable utilizar un detergente especial, el que debe eliminarse con enjuagues sucesivos de

agua corriente y, finalmente, con agua destilada. Si los recipientes de vidrio son nuevos y no vienen estériles de fábrica, deben

sumergirse en una solución diluida de ácido clorhídrico para remover álcalis libres presentes. El instrumental de vidrio que no se limpie

con detergente, o que su limpieza sea difícil de efectuar debe sumergirse en solución concentrada de ácido clorhídrico saturado con

ácido nítrico (conocida también como “agua regia” por su capacidad de disolver el oro).

Una vez limpios los recipientes se procede a la preparación de los medios de cultivo, ésta es una labor que ha de hacerse

cuidadosamente y por ello se eligen técnicas y métodos lo más sencillos y rápidos posible, que evitan el riesgo de que cualquiera de sus

componentes se contamine con otras sustancias o sufra un tratamiento físico que altere sus características: recoger el agua de zonas lo

más limpia posible, libre de sedimentos finos, comprobar que la salinidad es la adecuada, almacenarla en recipientes que no sean tóxicos

para la especie que se va a cultivar, filtrarlas por filtros de poro de 0.45 µm para eliminar las partículas en suspensión. La filtración

puede hacerse con varios tipos de filtros, según se empleen para filtrar grandes o pequeñas volúmenes de agua de mar y según sea el

tamaño de poro requerido. Para volúmenes grandes, los más usuales son los filtros cilíndricos, de diferentes poros y materiales,

incluidos en una carcasa a través de la cual circula el agua. Normalmente los filtros de poros grandes, entre 100 y 10 µm, e incluso hasta

1 µm son de algodón fibra sintética entrelazada. Los filtros de poro pequeño, entre 0.45 µm y 0.2 µm son de fibra de vidrio o de

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membranas ésteres de celulosa. Ninguno de ellos es lavable, por lo cual deben eliminarse una vez que se hayan saturado. Para pequeños

volúmenes se usan filtros de membrana, que son pequeños discos de 2.5 a 4.7 cm. de diámetro, de ésteres de celulosa o de compuestos,

que se colocan en equipos de filtración especiales a los que se acopla una bomba de vacío para acelerar la filtración. Los poros más

frecuentes en estos filtros son de 0.45 y 0.22 µm.

Luego de ser agregado el medio de cultivo a los recipientes, éstos deben sellarse, mediante un algodón hidrófobo envuelto en un

trozo de gasa, el que permite una buena aireación y evita el ingreso de contaminantes. Es posible también usar tapones de goma. Ambos

tipos de tapones pueden ser reutilizados después de un proceso de esterilización. En algunos casos, dependiendo del tipo de goma, éstas

deberían ser hervidas en una solución de fosfato trisódico y luego enjuagadas abundantemente con agua destilada. También existen los

tubos de ensayos que tienen tapas metálicas o de plástico autoclavable para la mantención cultivos unialgales por períodos prolongados

de tiempo, evitando la contaminación y retardando la evaporación. También se pueden utilizar con este propósito láminas de papel de

aluminio, paraplast, parafilm, alusafoil y alusaplus. El éxito de un cultivo en particular será la mejor recomendación para la elección del

material utilizado.

40

Algunos Ejemplos De Medios De Cultivo (extraído de http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/AB473S02.htm)

Medio CHU10 (O. Umebayashi, 1975)

Recomendado para aislamiento de microalgas de hábitats

oligotróficos y eutróficos.

Ca (NO3)2.............................. 0.04%

K2HPO4................................. 0.01%

Na2CO3.................................. 0.02%

MgSO4 * 7H2O...................... 0.025%

Na2SiO3.................................. 0.025%

Citrato de Fierro Amoniacal... 0.005%

Para medio solidificado puede usarse:

Agar-Agar............................. 1.0%

MEDIO ENRIQUECIDO

Medio Miguel o Agua de Miguel (Allen-Nelson, 1910)

Solución A

KNO3....................................... 20.2 g

H2O.......................................... 100 ml

Solución B

Na2HPO4 * 12H2O.................. 4 g

CaCl2 * 6H2O ........................... 4 g

HCl concentrado........................ 2 ml

FeCl3.......................................... 2 ml

H2O............................................ 80 ml

Agregar 2 ml de la solución A y 1 ml de Solución B a un litro de

agua de mar y calentar a 70ºC por 20 minutos.

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Medio Erd-Sahreiber enriquecido (Foyn, 1934)

NaNO3..........................................10 mg

Na2HPO4 * 12H2O......................2 mg

Extracto de suelo..........................5 ml

Agua de mar...............................100 ml

Medio Erd-Schreiber

Agua de mar................................... 1 litro

Extracto de suelo............................ 50 ml

NaNO3............................................ 0.2 g

Na2HPO4 * 12H2O.......................... 0.03 g

Yanase & Imai (1968) para cultivar Monochrysis lutheri, Platymonas sp., Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans.

NaCl............................... 18 mg Metal mix Vitamina mix

KC.................................. 600 mg Na2EDTA........ 100 mg B12................. 10 ug

NaNO3............................ 500 mg Fe..................... 1 mg Biotina........... 50 ug

MgSO4 * H2O................. 5 g Zn..................... 0.5 mg B1................... 5 mg

Ca (as Cl-)...................... 100 mg Mn.................... 4 mg H2O................ 50 ml

K2HPO4.......................... 30 mg Co..................... 0.01 mg

Metal Mix*..................... 30 ml Cu..................... 0.004 mg

Fe (as Cl-)....................... 100 ug B....................... 20 mg

Tris...................................1 g H2O................... 100 ml

Vitamina B12 .................. 3 ug

Na2SiO3...........................1 ml

Vitamina mix *................1 L

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MEDIO DE CULTIVO (Agua Dulce) (Stein, 1979).

Se toma 1 ml de cada solución (A, B y C) y se adicionan a 1 litro

de agua esterilizada

Macronutrientes (Solución A):

CaCl2 * 2H2O.............................. 36.76 g/l

MgSO4 * 7H2O........................... 36.97 g/l

NaHCO3...................................... 12.60 g/l

K2HPO4....................................... 8.71 g/l

NaNO3......................................... 85.01 g/l

Na2SiO3 * 9H2O.......................... 28.42 g/l

Micronutrientes (Solución B):

Na2EDTA....................................4.36 g/l

FeCl3 * 6H2O...............................3.15 g/l

CuSO4 * 5 H2O........................... 0.01 g/l

ZnSO4 * 7H2O............................ 0.022 g/l

CoCl2 * 6H2O............................. 0.01 g/l

MnCl2 * 4H2O............................ 0.18 g/l

Na2MoO4 * 2H2O.............. ........ 0.006 g/l

c. Vitaminas (Solución C):

Tiamina. HCl............................... 0.1 mg/l

Biotina......................................... 0.5 g/l

Cianocobalamina......................... 0.5 g/l

Se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada.

d. Tris:

Tris (Hidroximetil)-Aminometano.....50.g

H2O destialda.................................... 200 ml

Una vez preparado el medio de cultivo, se debe hacer ajuste de

pH a 7.2 con HCl cuidadósamente para no obtener el pH ácido.

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MEDIO MET 44 (Schone & Schone, 1982) Para microalgas

marinas de la Familia Bacillariophycea

NaNO3........................................ 3.4 mg

Na2HPO4 *12H2O....................... 0.925 mg

Na2SiO3 * 9H2O........................... 0.803 mg

FeSO4 * 7H2O............................ 60.0 μg

MnCl2 * 4H2O............................ 14.4 μg

Vitamina B12............................... 0.5 μg

Biotina......................................... 0.5 μg

Tiamina-HCl............................... 0.5 μg

Agua de mar.................................1 L

NOTA: La solución stock de Fierro y Silicato debe de

acidificarse un poco con una gota de Acido Sulfúrico

concentrado, y la solución de EDTA debe acidificarse con Acido

Clorhídrico. El EDTA puede ser adicionado antes que el Fierro.

Medio Guillard F/2 (Stein 1979) Ajustar a pH 8.0 con 1 M

NaOH o HCl. Esterilizar en autoclave

NaNO3................................... 0.075 g

NaH2PO4 * 2H2O.................. 0.00565 g

* Elementos trazas................ 1 ml

* Vitamina mix.................... 1 ml

Agua de mar......................... 1 l

Elementos trazas

Na2 EDTA................................ 4.16 g

FeCl3 * 6H2O........................... 3.15 g

CuSO4 * 5H2O......................... 0.01 g

ZnSO4 * 7H2O......................... 0.022 g

CoCl2 * 6H2O.......................... 0.01 g

MnCl2 * 4H2O.......................... 0.18 g

Na2MoO4 * 2H2O.................... 0.006 g

H2O destilada........................... 1 l

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Stock de Vitaminas

vitamina B12............................ 0.0005 g

vitamina B1............................... 0.1 g

biotina....................................... 0.0005 g

H2O destilada........................... 1 l

Medio Mínimo (Sueoka, 1960) para el cultivo de Chlorella.

Solución 1: Diluir 25 mL en 1 L de agua destilada

NH4Cl..................................16.00

CaCl2 2H2O........................2.04

MgSO4.............................................4.00

Solución 2: Diluir 25 mL en 1 L de agua destilada

K2HPO4.............................. 37.42

KH2PO4.............................. 14.52

Solución Trazas: Diluir 1 ml en 1 L de agua destilada

EDTA ................................. 50.00

ZnSO4 * 7H2O................... 22.00

H3BO3................................. 11.40

MnCl2 * 4H2O..................... 5.06

FeSO4 * 7H2O..................... 4.99

CoCl2 * 6H2O...................... 1.61

CuSO4 * 5H2O.................... 1.57

(NH4)6Mo7O24..................... 1.10

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Medio de cultivo Zarrouk (1966) para el cultivo de Spirulina

Concentración g/L Solución A5 + Co *

NaHCO3 ..................... 13.61 H3BO3....................... 2.86 g/l

Na2CO3........................ 1.03 MnCl2 * 4H2O ........... 1.81 g/l

K2HPO4........................ 0.50 ZnSO4 * 7H2O.......... 0.22 g/l

NaNO3......................... 2.50 NaMoO4 * 2H2O........ 0.39 g/l

KSO4............................ 1.00 CuSO4 * 5H2O............ 0.079 g/l

NaCl.............................. 0.20 Co(NO3) 2 * 6H2O...... 0.049 g/l

MgSO4 7H2O ................ 0.04

CaCl2 2H2O................... 0.01

FeSO4 7H2O................... 0.05 Solution B6 *

Sol A5 +CO * ................1 ml VOSO4 * 5H2O...............49.6 g/l

Sol B6 * .........................1 ml K2Cr2(SO4)4 * 2H2O..... 96 g/l

NiSO4 * 7H2O................ 47.8 g/l

Na2WO4 * 2H2O............ 17.9 g/l

TiOSO4.......................... 33.3 g/l

Co(NO3)2* 6H2O........... 44.9 g/l

46

5. Esterilización De Materiales Para Un Cultivo

Tanto el agua como los recipientes a utilizar para el cultivo microalgal requieren de tratamientos previos para la remoción de

agentes contaminantes al cultivo, agentes que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento del normal del

microorganismo deseado. Los sistemas clásicos para la esterilización se dividen en: Mecanismos de calor (calor seco y calor húmedo),

filtración, esterilización electromagnética (radiación UV) y desinfección química (hipoclorito de sodio, alcohol 70%). El sistema clásico

para esterilizar los medios de cultivo en pequeños volúmenes (hasta 5 litros) es la autoclave. En el caso de cultivos superiores a los 20

litros la filtración mecánica, radiación UV y desinfección mediante hipoclorito de sodio son los tratamientos utilizados para el

tratamiento del agua.

El principal objetivo de esterilizar el agua de cultivo es la eliminación de materia orgánica, partículas, plantón, zooplancton y

bacterias.

Esterilización por Calor

a) Calor seco

Es utilizado para la esterilización del material de trabajo (material de vidrio y metal), este procedimiento se debe realizar previo a

la preparación del cultivo y consiste en la exposición del material a temperaturas que varían entre 120 – 180°C, según el tiempo de

exposición. Generalmente el tiempo de mas utilizado es a 160°C por un periodo de 2 hrs.

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b) Calor Húmedo (Autoclave)

El autoclavado es el mecanismo mas efectivo y comúnmente utilizados a nivel de laboratorio para la esterilización de medios

líquidos, medio agar y equipamiento de vidrio y metal. La esterilización utiliza vapor de agua a presión y consiste en la

desnaturalización celular y coagular de proteínas utilizando una temperatura de 121 °C con un tiempo de exposición de 15 minutos (Fig.

1.8)

Figura 1. 8. Equipamiento para la esterilización mediante calor húmedo

(A: autoclave), y calor seco (B: estufa).

A B

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c) Esterilización por Filtración

Tanto para cultivos internos y externos, la filtración mecánica se realiza mediante la utilización de membranas filtrantes (0,2 –

0,45 µm), o cartuchos dispuestos en serie con un radiante de filtración de entre 10-0,5 µm. (Fig 1.9), para la eliminación mecánica de

sólidos, microalgas y bacterias. Las membranas filtrantes son de tamaño determinado, el que dependerá del uso al que se va a someter la

muestra.

d) Esterilización por Radiación UV

En los cultivos en los cuales los volúmenes de cultivo son superiores a los 20 litros es necesario utilizar otros mecanismos de

esterilización. La radiación UV es letalmente efectiva a 260 nm, debido principalmente a que provoca la formación de enlaces covalentes

entre la tiaminas adyacentes en el ADN. Estos enlaces causan errores en la replicación del ADN dando como resultado mutantes

potencialmente letales. Sin embargo se recomienda para la filtración de agua la utilización de filtros mecánicos complementarios a la

radiación UV.

e) Desinfección por Hipoclorito de Sodio

La desinfección mediante la cloración es usada en acuicultura para cultivos especialmente masivos, que requieren elevados

volúmenes de agua. Si bien el proceso de desinfección puede no matar los quistes presentes en el agua de mar, es un mecanismo

efectivo en la eliminación de una serie de microorganismos no deseados, como los protozoos.

49

La figura muestra el proceso de esterilización de agua de mar para ser utilizada en cultivo internos y externos. El agua pasa por

una serie de poros filtrantes (10 - 0,5 um), para finalmente ser expuesto a luz UV y posteriormente ser utilizada en el cultivo.

Figura 1.9. Proceso de esterilización de agua de mar, para ser utilizada en cultivo internos y externos. El agua pasa por una serie de poros filtrantes (10 -

0,5 um), para finalmente ser expuesto a luz UV.

SISTEMA TRATAMIENTO

DE AGUA

CULTIVOS

Internos (< 30 L) Externos (> 30 L)

RESERVORIO

AGUA MAR

10 5 1 0,5 (µm) filtro uv

Cartuchos filtrantes

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6. Problemas Asociados al Manejo.

Los cultivos microalgales generalmente se ven afectados por contaminantes microscópicos como bacterias, hongos y protozoos,

los cuales pueden invadir el cultivo. Éstos contaminantes pueden ser transportados por aire (suministros de aire o del medio ambiente),

materiales mal esterilizados, inóculos contaminados o simplemente por problemas de manejo durante la inoculación. Es por ello que

durante la inoculación de un medio de cultivo nuevo, primero se debe evaluar el inóculo y realizar el traspaso en un ambiente limpio,

idealmente bajo campana de flujo laminar, evitando así las corrientes de aire. En los cultivos interiores en los cuales se utilizan pequeños

recipientes, éstos deben estar aislados mediante tapones de algodón o de gomas estériles y selladas con papel aluminio u otro. En el caso

de los cultivos externos estos suelen contaminarse debido a que la forma de desinfección del agua se realiza mediante la aplicación de

químicos, los cuales son eficaces en la eliminación de protozoos y bacterias, sin embrago, no eliminan los quistes y esporas en reposo los

cuales proliferan al momento de encontrarse con un medio fresco creciendo a lo largo del cultivo. Un buen sistema de filtración del agua

de mar acompañado de filtros uv, minimiza notablemente la contaminación. La esterilización mediante autoclave sigue siendo la técnica

preferida, sin embargo, ésta no puede ser útil en sistemas productivos.

Los cultivos microalgales que han sido contaminados con otra clase de microalga, presentan un crecimiento más lento y suelen no

alcanzar las densidades habituales. Si bien estos cultivos no pueden ser utilizados como inóculos se pueden utilizar para la alimentación

de larvas, siempre que las algas contaminantes sean del tamaño adecuado para utilizarlos como alimento, ya que diatomeas y

dinoflagelados de alrededor de 25 um son demasiados grandes para los bivalvos.

51

En la practica es muy difícil obtener un cultivo libre de bacterias, aunque un grado de contaminación bacteriana con frecuencia es

aceptable, debido principalmente a que la asociación bacteria-microalga desempeña un papel positivo en el crecimiento microalgal y en

la nutrición larval. La clave está en seguir al pie de la letra las indicaciones durante el manejo de los cultivos: contar con el material

estéril e inóculos libres de contaminantes asegura el éxito del cultivo.

La contaminación por hongos y levaduras ocurre generalmente en los cultivos de lagunas o abiertos y en cultivos realizados con

nutrientes de origen orgánico. No presenta mayor problema al comportamiento algal ni para el consumidor.

El zooplanton contaminante aparece generalmente en cultivos de algas verdes, teniendo apenas efecto sobre crecimiento algal,

peo sí tiene causa una deficiencia en alcanzar las densidades habituales; en estos casos es recomendable desechar en cultivo

contaminado. Las especies mas comúnmente encontrados como contaminantes son Lycrymanis sp.,Colpidium sp., y Vorticella sp.

Es necesario el examen microscópico del cultivo antes de realizar suescalamiento,para evitar la contaminación de las etapas

siguientes (cultivos secundarios, intermedios y masivos). Cuando se observa contaminación es necesario probar con diluciones del

inóculo con medio de cultivo fresco, favoreciendo la tasa de duplicación de la microalga por sobre la de el contaminante.

Mecanismos de eliminación

Cuando el cultivo se ve afectado por la contaminación bacteriana el mejor remedio es utilizar las técnicas tradicionales de

aislamiento (micropipeteo, siembra estriada o extendida, filtración y centrifugación), acompañado de un tratamiento de antibiótico. Los

mejores resultados se obtenen cuando el cultivo se encuentra en una fase de crecimiento exponencial. En este caso, una mezcla de

antibióticos por un periodo de 48 hrs es suficiente para reducir las bacterias viables.

52

Filtración del cultivo

Es utilizado generalmente para la mantención de cepas y cultivos primarios, eliminando procariontes no deseados y levaduras.

En el caso de levaduras de tamaños similares a las de las microalgas se recomienda enriquecer el medio (con extracto de malta, por

ejmplo), que no sea perjudicial para el crecimiento microalgal. El enriquecimiento provoca la germinación de las levaduras en filamentos

que sí quedarán atrapados por las membranas filtrantes.

Centrifugación Diferencial

Generalmente se utiliza como estrategia complementaria a la eliminación de procariontes. La centrifugación provoca la

sedimentación de las microalgas y los contaminantes permaecen en el sobrenadante, el que será remplazado por medio de cultivo

fresco. El lavado del cultivo se recomiendo por lo menos tres veces.

Tratamiento con Antibióticos

La ausencia de crecimiento bacteriano no se puede asegurar del todo, en la práctica, el concepto de cultivo axénico significa que

son cultivos sin procariontes no deseados demostrables. Sin embargo, existen casos en los cuales el cultivo microalgal puede morir en

ausencia de bacterias debido a la relación simbionte entre ellas. El uso de antibióticos reduce notablemente las bacterias viables de tal

manera que al realizar la dilución o tomar una pequeña cantidad de inóculo la densidad bacteriana es mínima o inexistente. Diferentes

especies de microalgas toleran diferentes concentraciones de antibióticos, por lo que deben usarse diferentes concentraciones en el

53

tratamiento. La dosis y el período de exposición es la clave del éxito de la técnica. La mezcla de antibióticos generalmente utilizada para

el tratamiento es: penicilina, estreptomicina y gentamicina en proporciones de 100/25/25 mg diluidas en 10 ml de agua destilada estéril

filtrada a 0,2 um, conservadas a -20°C hasta su uso.

La purificación parte inoculando 1 ml de cultivo a 50 ml de medio fresco, posteriormente se agrega la mezcla de antibióticos en

una serie de concentraciones (en un rango entre 50-500 mg/L) y expuesta por un periodo de 24-48 hrs, complementando éste

tratamiento se recomienda realizar a las 24 y 48 hrs la transferencia de una única célula a tubos de ensayo con medio de cultivo estéril y

libre de antibióticos por triplicado. Finalmente, teniendo las células aisladas por micropipeteo se deben incubar los tubos en condiciones

favorables por un periodo de 14 a 21 días (Fig. 1.10)

Figura 1.10. Secuencia de tratamiento con antibióticos. – Se agrega a un matraz erlenmeyer 50 ml de medio fresco más 1 ml de inóculo contaminado, cada matraz contiene la dosis de mezcla de antibióticos entre 50-500 mg/l.- Posterior a 24 y 48 hrs. se transfiere mediante pipeteo una única célula a un tubo de ensayo con medio fresco libre de antibióticos en triplicado.

24 hrs. 48 hrs.

Micropipeteo

2

Capitulo II: Cianobacterias del Desierto de Atacama: Potencialidades y Cultivo de Cepas Nativas

del Género Nostoc

Héctor Olivares y Benito Gómez-Silva

Grupo de Bioquímica, Depto. Biomédico, Facultad Ciencias de la Salud, Universidad de Antofagasta, Av. Angamos 601, Antofagasta, Chile. E-mail:

holivares@uantof.cl; bgomez@uantof.cl

1. Introducción

Las cianobacterias (algas verde-azuladas) son microorganismos fotoautotróficos oxigénicos, unicelulares o filamentos, que

colonizan una gran variedad de hábitats, incluyendo desiertos fríos y calientes (Gómez-Silva y cols., 2008). Como células libres o como

ficobiontes en asociación simbiótica en líquenes, este diverso grupo de microorganismos Gram-negativo son productores primarios

claves en la colonización de nuevos hábitats y en la sobrevivencia de miembros heterotróficos de comunidades microbianas (Dodds,

1995; Warren-Rhodes y cols.. 2006; Dávila y cols.. 2008). Algunas especies poseen la capacidad de diferenciar una o más células

vegetativas en heterocistos, células especializadas en la fijación fotosintética de nitrógeno atmosférico, jugando un importante rol

ecológico en la formación de suelos y en la entrada de nitrógeno a ecosistemas terrestres y acuáticos naturales.

3

2. El Género Nostoc

Las cianobacterias del ubicuo género Nostoc, Sección IV, Familia Nostocaceae, Orden Nostocales (Rippka, 1979, 1988) son

microorganismos filamentosos fijadores de nitrógeno, con heterocistos localizados cada 8-10 células vegetativas a lo largo del tricoma

(Fig. 2.1). Las células se dividen por fisión binaria en un plano y se reproducen por medio de hormogonios (pequeñas tricomas móviles)

y aquinetos (estructura tipo espora) en cadena, próximos a los heterocistos. Las especies de Nostoc son miembros esenciales en

comunidades de ambientes extremos y pueden localizar lugares favorables para la formación de colonias mediante respuestas

quimiotácticas y fototácticas (Dodds, 1995). Estos organismos crecen en forma natural formando macrocolonias que han sido

históricamente usadas como alimento y medicina en África, Asia, Europa y Norte y Sudamérica (Aldave-Pajáres, 1989; Becker, 1998;

Richmond, 2003). Los bofedales y estuarios son hábitats con inundaciones estacionales particularmente adecuados para Nostoc. En

ambientes acuáticos, Nostoc se asocia principalmente al bentos y puede generar masas planctónica flotantes. Colonias macroscópicas de

Nostoc se encuentran abundantemente en humedales por sobre los 3.000 msnm a lo largo de la Precordillera de los Andes en el norte de

Chile (Fig. 2.2).

Las especies de ambientes terrestres poseen la capacidad de soportar ciclos repetidos de congelamiento-descongelamiento,

permanecer en estado de desecación por meses y recuperar completamente la actividad metabólica después de horas o días de

rehidratación (Potts, 1994; Helm, 2000; Satoh, 2002). Representantes del género que proliferan en hábitats terrestres y acuáticos poco

profundos sintetizan compuesto protectores contra la dañina radiación ultravioleta (RUV) (Böhm, 1995; Ehling-Schulz, 1997; Araoz,

1998; Sinha y cols.., 2001; Sinha y Häder, 2008). Adicionalmente, las cianobacterias del género Nostoc son relativamente resistente a la

predación a consecuencia de la presencia de una cubierta celular masiva, la biosíntesis de toxinas y la formación de macro colonias, entre

otros factores (Sivonen, 1990). Las células de Nostoc commune secretan un exopolisacárido (EPS) cuyo contenido es modulado por los

4

niveles de radiación UV-B (280-315 nm) (Ehling-Schulz and Scherer, 1997). Las macromoléculas de EPS forma una matriz protectora

que participa en la disminución de la pérdida de agua, aumentando la estabilidad de membranas y así permitiendo la sobrevivencia del

organismo en condiciones extremas de déficit de agua. En el estado de desecación, el material de la envoltura celular de las colonias

forma una estructura vidriosa, quebradiza y altamente higroscópica que, una vez que la colonia es rehidratada, se transforma en un gel

semirígido y maleable (Potts, 1994). Así, las diversas estrategias adaptativas permiten explicar la abundancia y la presencia dominante

de representantes del género Nostoc en los humedales de la Precordillera altiplánica del Norte de Chile.

Figura 2.1. Fotografías de una suspensión de filamentos de la cianobacteria Nostoc sp. var. Machuca cultivada en ausencia de nitrógeno combinado. Las

flechas indican la posición de los heterocistos bajo el microscopio de luz (A) y microscopio fluorescente (B).

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Figura 2.2. Macrocolonias de cianobacterias del género Nostoc existentes en humedales precordilleranos del norte de Chile. A-B: Machuca, Región de

Antofagasta. C: Parinacota, Parque Nacional Lauca, Región de Arica y Parinacota. D: Salar de Huasco, Región de Tarapacá.

6

3. Aplicaciones de la Biomasa de Nostoc

Un bajo número compuestos químicos sintetizados por microalgas tienen un éxito comercial sólido en la actualidad. Sin contar

con las microalgas y cianobacterias que aún no han sido identificadas y/o cultivadas, existe un número significativamente superior de

especies que esperan ser evaluadas en términos del tipo de metabolitos primarios y secundarios de interés económico que ellas

sintetizan y la capacidad de producción masiva de biomasa y/o compuestos. Las cianobacterias fijadoras de nitrógeno bajo condiciones

aeróbicas son particularmente atractivas para la fotoproducción de biomasa y compuestos químicos al sintetizar todos sus componentes

celulares en base a energía solar, sales minerales y agua dulce, salobre y/o salada, sin necesidad de una fuente de nitrógeno combinado.

Su naturaleza filamentosa representa otra ventaja evidente en la cosecha de la biomasa.

La utilización biotecnológica de representantes del género Nostoc es una área en desarrollo sin aplicaciones concretas a la fecha,

aún cuando existen ejemplos del uso de algunas especies como fertilizantes naturales en cultivos agrícolas de impacto social, sin

mayores desarrollos tecnológicos y otras tienen un uso alimenticio que se remonta a tiempos prehispánicos en el cono sur de

Sudamérica y otros lugares del nuestro planeta (Aldave-Pajares, 1969; Rother, 1989).

Producción de Pigmentos Naturales

a) Ficobiliproteínas

El aparato fotosintético de las cianobacterias se caracteriza por la presencia de clorofila a como pigmento fotosintético principal y

carotenoides más ficobiliproteínas (FBPs) como pigmentos accesorios. Las FBPs se organizan en la forma de complejos multiprotéicos,

los ficobilisomas, que actúan como antenas captadoras de energía lumínica en la superficie de las membranas tilacoidales. Las FBPs son

7

proteínas altamente fluorescentes que poseen grupos cromóforos (pirroles de cadena abierta) que se unen covalentemente a las

apoproteinas. Tres tipos de FBPs se encuentran en los ficobilisomas de cianobacterias: C-aloficocianina (AC), C-ficocianina (FC) y C-

ficoeritrina (FE), con longitudes de onda de absorción máxima de 650 nm, 620 nm y 562 nm, respectivamente (Fig. 2.3).

Todas las cianobacterias poseen AC y FC constitutivamente; sin embargo, algunas especies poseen FE en sus ficobilisomas. En ellas, los

contenidos relativos de FC y FE pueden ser modulados por la calidad espectral de la luz incidente a través de un proceso denominado

Adaptación Cromática (AC). De acuerdo a la capacidad para responder a cambios en la calidad de la luz incidente, las cianobacterias con

AC pueden clasificarse en tres grupos: Grupo I, cianobacterias que no alteran la composición de sus FBPs, Grupo II, cianobacterias que

sólo pueden modificar los niveles de FE y Grupo III, cianobacterias que pueden modular diferencialmente la síntesis tanto de FC y FE en

un fenómeno denominado adaptación cromática complementaria (Tandeau de Marsac, 1977).

Las tres FBPs de cianobacterias son altamente fluorescentes, de modo que las proteínas purificadas han encontrado diversas

aplicaciones biotecnológicas como colorantes naturales alternativos a los pigmentos sintéticos en la industria de alimentos, cosmética y

farmacéutica. FE ha sido evaluada como marcador fluorescente en técnicas de inmunoensayos, microscopía, diagnósticos e

investigaciones biomédicas, con ventajas frente a trazadores fluorescentes tradicionales (Glazer, 1981).

Una cianobacteria filamentosa del género Nostoc ha sido aislada del bofedal de Caquena, Región de Tarapacá y Parinacota. En cultivo, la

estirpe nativa del altiplano chileno muestra altos niveles de FE y adaptación cromática complementaria, siendo un excelente candidato

para la producción masiva de biomasa y FE (Acosta y González, 1995; Pineda Tello, 1997).

1

Figura 2.3. Espectro de absorción de una suspensión de filamentos de la

cianobacteria Nostoc sp. var. Machuca (línea suave) y del

correspondiente extracto acuoso luego de la ruptura celular (línea

gruesa). Las flechas indican los máximos de absorción de clorofila a

(415-440 y 680 nm), carotenoides (500 nm) y C-ficocianina (620 nm).

b) Pigmentos Fotoprotectores de RUV

La biosíntesis los pigmentos tipo micosporina-similar-a-aminoácidos (MAAs) y escitonemina, es un eficiente mecanismo de

defensa de algunas especies de Nostoc al estrés por RUV. MAAs son un grupo de compuestos hidrosolubles que pueden constituir hasta

el 19% de la biomasa seca de colonias de Nostoc; sin embargo, las moléculas de MAAs son liberadas extracelularmente durante los

eventos de rehidratación y representan pérdidas cíclicas y drenaje de recursos celulares (Potts, 1994). Sus máximos de absorción en el

rango 309-362 nm cubren las radiaciones incidentes en las regiones UV-A (315-400 nm) and UV-B (280-315 nm), disipando la energía

absorbida en la forma de calor. MAAs son los metabolitos filtradores excretados por especies de Nostoc commune resistentes a la

2

desecación y se acumulan en la envoltura extracelular unidos a oligosacáridos. En especies cianobacteriales halotolerantes, MAAs actúan

además como osmoreguladores pero su distribución intracelular no está aún bien establecida (Sinha and Häder, 2008).

Alternativamente, escitonemina es un dímero liposoluble, de coloración amarillo-pardo, común y único de cianobacterias de

ambientes terrestres (Potts, 2000). Las moléculas de escitonemina poseen un máximo de absorción in vivo a 370 nm y se localizan en las

envolturas extracelulares de un gran número de especies de cianobacterias. A diferencia de MAAs, las escitoneminas son altamente

estables una vez que se han sintetizado, manteniendo su rol protector frente a RUV sin que las células tengan la necesidad de invertir

energía metabólica adicional durante períodos de prolongada inactividad metabólica (por ejemplo, períodos de desecación), cuando

otros procesos de protección y reparación no son efectivos (Sinha and Häder, 2008). Las propiedades antiinflamatorias y el rol protector

contra la radiación UVA y UVB de escitonemina conforman una combinación que consolida la idea de promover investigaciones relativas

al desarrollo de la producción industrial farmacéutica de estos compuestos con aplicación en la preparación de cremas protectoras para

uso humano (Sinha and Häder, 2008).

Recientemente, hemos confirmado la abundante presencia de escitonemina en colonias secas de Llaita. El espectro de absorción

del extracto acetónico de Llaita seca se muestra en la Fig. 2.4 con un máximo de absorción a 384 nm, característico del pigmento in vitro.

Esto confirma que las macro colonias de Nostoc en los humedales a lo largo de la precordillera del Norte de Chile sintetizan masivamente

pigmentos protectores a la luz UV, como una de las estrategias clave de adaptación a las condiciones medioambientales extremas.

Consecuentemente, se requieren estudios para evaluar la posibilidad de que estos microorganismos sean considerados una alternativa

de interés comercial en la producción de este tipo de pigmentos.

1

Figura 2.4. Espectro de absorción de una muestra de colonias secas de

Llaita extraída con acetona al 100%. Las flechas indican los máximos de

absorción de escitonemina (384 nm) y clorofila a (430 y 663 nm).

c) Producción de EPS

La biosíntesis de EPS en microalgas y cianobacterias es influenciada por factores externos tales como temperatura, concentración

de nitrógeno, irradiancia y turbulencia de los cultivos (De Philipis y cols.., 1991; Moreno y cols.., 1998). El EPS bacteriano está

constituido por diversos polímeros de alta viscosidad que forma capas en la envoltura externa de las células. Dada su naturaleza

higroscópica, los EPS disminuyen la pérdida de agua en células sometidas a estrés hídrico y, en conjunto con polisacáridos

intracelulares, estabilizan macromoléculas y membranas, aumentando la probabilidad de sobrevivencia en condiciones extremas de

desecación (Potts, 1994).

2

Los exopolisacáridos han sido tradicionalmente usados como emulsionantes, estabilizantes y espesantes en la industria

alimenticia, textil, cosmética, farmacéutica y en la producción de pinturas y papel. Las fuentes de EPS son las plantas y macroalgas, por lo

que EPS de origen microbiano son una alternativa comercial de gran interés dada las propiedades físicas de estos y las ventajas relativas

de manejo y manipulación de las condiciones que inciden en el aumento en las tasas de crecimiento y/o producción de EPS (Bertocchi y

cols.., 1990; Sutherland, 1990, 1996). El efecto de EPS de origen cianobacterial en la remoción de metales pesados de líquidos

contaminados ha sido recientemente evaluada (Paperi y cols.., 2006); sin embargo, el uso de cianobacterias y EPS en procesos de

acondicionamiento físico de suelos, particularmente la recuperación de suelos de ambientes áridos, no ha sido suficientemente

estudiado (Barclay, 1985).

d) Biomasa de Nostoc como Fuente Alimenticia

Las cianobacterias son un recurso biológico que ha sido usado como suplemento alimenticio desde tiempos precolombinos por

los asentamientos humanos a lo largo de los Andes de Ecuador, Perú, Bolivia, Argentina y Chile. Esta costumbre ancestral permanece

activa al interior de Arica (Putre, Visviri y otros). Las colonias secas de cianobacterias de los bofedales altiplánicos chilenos y bolivianos,

conocidas bajo los nombres vernaculares de Llaita, Llacta o Cuschuro, son cosechadas y secadas al sol (Fig. 2.5). Las colonias secas de

Llaita se comercializan en los mercados de las ciudades de Arica e Iquique y se usan ocasionalmente como aditivo alimenticio en la

preparación de platos locales. Esta costumbre es prácticamente desconocida en la Región de Antofagasta, con excepción de unos pocos

poblados altiplánicos (Mendizábal, 1994; Gómez-Silva y cols., 1995).

Las colonias de Llaita son acumulaciones masivas de filamentos de una cianobacteria del género Nostoc. Las composiciones

bioquímicas (proteínas aminoácidos esenciales, ácidos grasos poliinsaturados) de la biomasa seca y la de cultivos del microorganismo

3

aislado (Nostoc sp. var. Llaita), confirman que este recurso posee calidad nutricional adecuada para ser considerada un suplemento

alimenticio humano y/o animal (Tablas 1-3) (Vargas y cols.., 1988). López y Yutronic (2005) han formulado y evaluado un producto

alimenticio en base a una mezcla de harinas de Llaita y espinaca; esto representa un primer paso en la búsqueda de alternativas válidas

para la recuperación y utilización de un recurso natural nativo del norte chileno.

Aún cuando el uso de este recurso alimenticio ancestral se ha perdido en la Región de Antofagasta y es ocasionalmente usado por

las poblaciones de Arica e Iquique, colonias de cianobacterias del género Nostoc crecen en bofedales y vegas a lo largo de la precordillera

del norte de Chile (Parque Nacional Lauca, Salar de Huasco, Turi, Río Grande, Machuca; Fig. 2.5). Los análisis comparativos de las

secuencias del gen 16S rRNA de los genomas de las cianobacterias que forman las colonias de Llaita y las colonias del bofedal de

Machuca han permitido concluir que ambas pertenecen a la misma especies del género Nostoc (Linsambart, Pastenes y Rojas, 2005).

El análisis proximal de las colonias de Machuca indica un alto contenido de proteínas, carbohidratos y lípidos (Tabla 4). Lo

anterior reafirma nuestra noción sobre el uso comercial de las cianobacterias de Nostoc sp. var. Machuca y otras estirpes que beneficie a

los asentamientos precordilleranos en el norte de Chile dada su relación geográfica e histórica con estos recursos genéticos.

1

Figura 2.5. Fotografía de una macrocolonia seca de Llaita (A; escala: 1

cm) y microfotografía al microscopio electrónico de barrido de Llaita

(B) mostrando abundantes filamentos embebidos en una matriz de

exopolisacáridos (escala: 10 m).

4. Cultivo de Especies del Género Nostoc del Norte de Chile

Condiciones de Cultivo

Para cultivo líquidos o sólidos (agar al 1,5% p/v) se utiliza el medio descrito por Arnon y cols. (1974) sin fuentes de nitrógeno

combinado (Tabla 5). El cultivo en medio líquido se realiza en frascos de vidrio de 800 ml y 5 cm de paso de luz o en cilindros de vidrio

de 200 ml y 4 cm de diámetro por 15 cm de alto, terminado en forma de cono en su parte inferior para facilitar la agitación por la

2

aireación. Los cultivos son iluminados lateralmente con tubos fluorescentes o focos con filamentos de Hg, de acuerdo a la intensidad de

luz deseada. Los cultivos son burbujeados continuamente con aire enriquecido en 1% v/v CO2.

a) Cultivos Semicontinuos.

El manejo de los cultivos en régimen semicontinuo se realiza mediante diluciones diarias cada 24 h para mantener la densidad

celular deseada. La pérdida de agua por evaporación se repone con H2O desionizada estéril. Luego de cada ciclo de retiro de un volumen

de cultivo, éste se repone con medio fresco de acuerdo a la siguiente ecuación:

)(.*DCmed

DCdes-DCmed = VR LcultivoVol ;

Donde VR: volumen en litros (L)

DCmed: densidad celular medida;

DCdes: densidad celular deseada.

El volumen de cultivo colectado permite medir biomasa (peso seco) y pigmentos.

3

La productividad se evalúa de acuerdo a las siguientes fórmulas:

Biomasa (g m-2d-1)PS g l VR

AC T

( / ) *

*;

Biomasa (mg L cultivo-1d-1) = PS mg l VR

VC T

( / ) *

*;

PS = peso seco (g l-1 o mg l-1);

VR = volumen a ser reemplazado (L);

AC = área expuesta a la luz (m2);

VC = volumen de cultivo (L);

T = tiempo de incubación entre cada dilución (días).

Para calcular la velocidad específica de crecimiento en los cultivos mantenidos en modo semicontinuo se utiliza la siguiente

fórmula:

µ (d-1)LN DC LN DC

T

( ) ( )2 1;

LN(DC2) = logaritmo natural de la densidad celular medida antes de la dilución (final)

LN(DC1) = logaritmo natural de la densidad celular en el tiempo cero (inicial), que se mide una vez que se realiza la dilución

T = intervalo de tiempo entre cada dilución expresada en días

4

b) Cultivos Masivos

El cultivo masivo de la variedad Nostoc sp. Llaita ha sido evaluado en un fotobioreactor tubular cerrado de 90 m de largo total y

2,2 m2 de superficie fotosintéticamente activa. Por otra parte, la variedad Nostoc sp. Caquena fue cultivada en fotoquimiostato con

control de pH, oxígeno y dióxido de carbono disueltos, temperatura, entre otros. Usando condiciones de crecimiento continuo a la

intemperie, la productividad máxima en el fotobioreactor fue de 10 g (biomasa seca var. Llaita) m-2 d-1. Por otra parte y usando la

biomasa de la variedad Caquena para la producción del pigmento C-ficoeritrina, la fotoproducción semicontinua en quimiostato fue de

0,6 g FE m-2 d-1 (Olivares y cols.., manuscrito en preparación).

En base a la información que disponemos, se puede indicar que actualmente no existen actividades industriales relacionadas con

la producción masiva de cianobacterias del género Nostoc. Sin embargo, tanto la biomasa como alguno de sus metabolitos representan

alternativas potenciales de aplicación comercial (pigmentos, polisacáridos y biomasa rica en proteínas, ácidos grasos insaturados y

aminoácidos esenciales).

Algunas de las características propias de este género de microorganismos (crecimiento en filamentos, fijación de nitrógeno

atmosférico y otras) son ventajas comparativas para su cultivo masivo.

Las experiencias obtenidas en el cultivo y productividad en fotobioreactores y quimiostatos fortalecen la noción sobre la

factibilidad técnica de cultivar masivamente una o más de las variedades de Nostoc para la obtención de biomasa con fines alimenticios o

para la extracción de metabolitos de valor comercial.

La íntima relación geográfica e histórica de las poblaciones precordilleranas con este recurso natural renovable del norte de Chile

debería reflejarse en que futuras actividades productivas que usen este recurso genético beneficien el desarrollo socioeconómico de

estos asentamientos.

5

Tabla 2.1. Composición bioquímica de colonias de Llaita y Nostoc sp. (var. Llaita). La cianobacteria fue cultivada fototróficamente en

medio mineral Arnon sin nitrato, con o sin suplemento de NaCl, y colectada al inicio de la fase estacionaria del crecimiento. Los

resultados corresponden al promedio con la desviación estándar. El número de determinaciones se muestran entre paréntesis. AG:

Ácidos grasos; CG: cromatografía de gases; ENN: extracto no nitrogenado; nd: no determinado.

Componente Método Concentración (% del peso seco)

Colonias de

Llaita

Nostoc sp. (var. Llaita)

Sin NaCl NaCl 3%

Proteínas Kjeldahl 30.46 0.20 (6) 46.05 0.20 (3) 40.04 0.50 (3)

Folin-

Lowry

35.60 0.06 (3) 47.70 3.00

(10)

35.80 1.70

(10) Lípidos Soxhlet 2.40 0.03 (6) 12,14 0.10 (2) 5.25 0.30 (3)

AG Totales CG 1.16 (3) nd Nd

Carbohidrato

s

ENN 60.79 (6) 36.22 (6) 46.76 (6)

Antrona 41.80 0.10 (3) 20.20 1.50

(10)

21.00 0.20 (3)

Cenizas Calcinación 6.35 0.01 (6) 5.58 0.02 (3) 7.95 0.10 (3)

6

Tabla 2.2. Contenido y composición de ácidos grasos de colonias naturales de Llaita.

Ácido graso % del peso

seco

% del total de

ácidos grasos

Ácido caproico (10:0) 0.077 6.5

Ácido mirístico (14:0) 0.017 1.4

Ácido palmítico (16:0) 0.370 31.1

Ácido margárico

(17:0)

0.009 0.8

Ácido esteárico (18:0) 0.122 10.2

Ácido behénico (22:0) 0.008 0.7

Ácido palmitoleico

(16:1)

0.155 13.0

Ácido oleico (18:1) 0.066 5.5

Ácido linoléico (18:2) 0.082 6.9

Ácido linolénico (18:3) 0.285 23.9

7

Tabla 2.3. Composición aminoacídica de Nostoc sp. (var. Llaita) creciendo bajo condiciones de laboratorio en medio libre de nitrógeno

combinado.

Aminoácido % del total de

aminoácidos

Leucina 9.3

Treonina 7.2

Valina 5.6

Isoleucina 5.0

Lisina 4.9

Triptófano 1.2

Histidina 1.0

Arginina 8.2

Fenilalanin

a

4.7

Metionina 2.8

Glutamato 15.1

Aspartato 10.9

Alanina 7.9

Tirosina 5.5

Glicina 5.3

Serina 5.0

Cisteína 0.5

8

Tabla 2.4. Composición bioquímica de Nostoc sp. (var. Machuca) cultivado a nivel de laboratorio. Los valores corresponden a la media de

cuatro determinaciones independientes ± la desviación estándar. Los cultivos en régimen estanco, se realizaron a 30 °C, pH 8,5 con una

irradiancia de 180 µE m-2 s-1.

Componente % Peso seco

Proteínas 53,76 ± 4,9

Lípidos totales 19,52 ± 2,09

Carbohidratos 31,07 ± 6,69

Ficobiliproteínas:

C-Ficocianina 19,07 ± 1,65

C-Ficoeritrina 0,59 ± 0,07

C-Aloficocianina 7,88 ± 1,14

9

Capítulo III: Microalgas ricas en PUFAs

1Fernando Silva-Aciares, 2Claudia D. Infante, 1,2Carlos Riquelme S.

1Unidad de Microbiología Aplicada, 2Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovación, Universidad de

Antofagasta. Avenida Angamos 601, Antofagasta. Email: fsaciares@gmail.com, cinfante@uantof.cl.

1. INTRODUCCION

Actualmente, la aplicación en la industria alimenticia de biotecnología de microalgas ha retomado un gran interés. Sin embargo, la

colecta y el cultivo para utilización en la alimentación humana son realizados hace siglos (Richmond, 1988). Son varias las especies

cultivadas comercialmente en algunos países y la biomasa producida es usada como fuente de productos para la industria de alimentos.

Según Pulz y Gross (2004), los productos naturales obtenidos de microalgas pueden ser usados en la preparación de masas, panes,

yogures y bebidas, presentando un rápido desarrollo en países como Francia, Estados Unidos, China y Tailandia. Las principales

microalgas cultivadas comercialmente son especies de los géneros Chlorella Beyerinck, (Chlorophyceae) y Arthrospira Stizenberger

(Cyanophyceae) para la adición en alimentos naturales (“health food”), Dunaliella salina Teodoresco, (Chlorophyceae) para la obtención

de betacaroteno, Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la obtención de astaxantina y Muriellopsis para la obtención del

pigmento luteína. (Del Campo y cols.., 2001; Becker, 2004).

Las microalgas, además de poseer importantes atributos biológicos y de no presentar muchas exigencias en cuanto a condiciones de

cultivo, son relativamente fáciles de procesar con la tecnología existente y producen una vasta gama de productos naturales entre los cuales

10

están los ácidos grasos poliinsaturados (polyunsaturated fatty acids o PUFAs, según sus siglas en inglés) y pigmentos fotosintéticos,

destacando los carotenoides.

Los organismos marinos superiores así como los mamíferos tienen una limitada capacidad para sintetizar ácidos grasos

poliinsaturados (PUFAs) esenciales como el ácido eicosapentaenoico (eicosapentaenoic acid, EPA) y el ácido docosahexaenoico

(docosahexaenoic acid, DHA), por lo cual estos deben ser incorporados en la dieta para un desarrollo normal sobre todo del sistema

nervioso y ocular. El crecimiento experimentado por la acuicultura a nivel mundial ha aumentado los requerimientos de PUFAs, los

cuales son obtenidos principalmente a partir del aceite de pescado. Sin embargo, en los últimos años debido a la sobreexplotación de los

recursos marinos ha decrecido la capacidad de captura y además se ha acentuado el cuestionamiento al aceite de pescado debido a

posibles contaminantes como dioxina (Oberg y cols. 2002; Jacobs y cols. 2002). Tonon y cols. (2002) plantean la necesidad imperiosa de

desarrollar nuevos sistemas de producción de PUFAs a bajo costo con tecnología ambientalmente amigable alternativos al uso de

harinas de pescado. Esto último se basa principalmente en proyecciones que señalan que la utilización de harinas de pescado por parte

de la industria acuícola desde el 2000 al 2010 aumentaría desde un 54% a un 97%. Esto significaría que prácticamente la demanda total

de harinas sería utilizada por la industria de la acuicultura (Zaldivar, 2004).

11

Figura 3.1: A: Acido docosahexaenoico (DHA). B: Acido Eicosapentaenoico

Las microalgas, y específicamente las diatomeas, comprenden un amplio grupo de microorganismos fotosintéticos y

heterotróficos que incluye al fitoplancton, fuente primaria en la cadena alimenticia del océano y son una de las principales fuentes de

ácidos grasos polinsaturados (López Alonzo y cols., 2000; Molina Grima, 2003). Existen varios antecedentes del desarrollo de cultivos de

12

microalgas tales como Phaeodactylum tricornutum una diatomea que produce 33.5 mg x lt-1 x día-1 de EPA (Molina-Grima, 2003) y

Crypthecodinium cohnii que puede llegar a producir 53 mg x lt-1 x h-1 de DHA (de Swaaf y cols. 2003).

Figura 3.2: Crypthecodinium cohnii y Phaeodactylum tricornutum

De las aproximadamente 30.000 especies descritas de microalgas, sólo un número limitado ha sido estudiado y analizado para la

producción de lípidos. El producto obtenido no posee el olor y sabor característicos del aceite de pescado. Los aceites producidos por las

microalgas contienen una alta proporción de DHA y EPA, y son más estables a la degradación oxidativa que aquellos obtenidos de otras

fuentes (Barclay y col.., 1998). La producción comercial de algas posee algunos obstáculos entre los que se encuentra la necesidad de

procesar grandes volúmenes de agua, razón por la cual los costos de cosecha pueden representar hasta el 33% del costo total de

13

producción (Barclay y cols., 1994). Además, la producción de biomasa en estanques y piscinas depende de la estación del año. En cultivos

de Porphyridium cruentum, desarrollados para la producción de EPA, la productividad en biomasa presentó valores de 12 y 24 g (m3

día)-1 en los meses de invierno y verano, respectivamente (Cohen y cols., 1988).

En cultivos de microalgas fototrópicas realizados en fermentadores para la producción de ácidos grasos, se obtienen bajos

rendimientos principalmente debido a que la producción de biomasa es limitada por el suministro de luz y oxígeno (Barbosa,2003).

Martek Biosciences (EE.UU.) ha desarrollado la tecnología para la producción de PUFAs a partir de cepas de la diatomea Nitzschia,

productora de EPA, y del dinoflagelado marino heterotrófico estricto Cryptheconidium cohnii, productor de DHA. La concentración

celular obtenida en el cultivo de cepas de Nitzschia alba en fermentadores es de 45 - 48 g L-1, en procesos realizados durante 64 horas.

El contenido de aceite en la biomasa puede ser superior al 50% del peso seco. Se han descrito densidades superiores a 40 g L-1, en

tiempos de fermentación de 60-90 horas, para el cultivo del dinoflagelado. El contenido de aceite en la biomasa se encuentra entre 15 a

30%, del cual el 20 - 35% es DHA (Barclay, 1994).

Estudios realizados con Cryptheconidium cohnii muestran que el contenido de lípidos puede ser superior al 20% del peso seco de

la biomasa, y la fracción de DHA se encuentra entre 30 y 50% (de Swaaf y cols., 1999). Al usar glucosa como fuente de carbono para el

crecimiento, los principales ácidos grasos producidos por C. cohnii son C16:0 y C22:6 con una productividad de 19 mg (L h)-1 (Jiang y

cols., 1999). Otras fuentes de carbono como ácido acético y etanol se han usado en operaciones de fermentación.

Se han obtenido productividades de 45 y 53 mg (L h)-1 al usar ácido acético y etanol, respectivamente (de Swaaf y cols., 2003;

Ratledge y cols., 2001). Las nuevas estrategias de cultivo consideran el uso de aireación forzada, ya que se ha comprobado que el proceso

de biosíntesis de PUFAs requiere oxígeno (Jiang y cols., 1999). La relación carbono:nitrógeno (C:N) es uno de los parámetros importantes

en la producción de PUFAs por microalgas. En cultivos en los cuales se ha suprimido la fuente de nitrógeno, se ha obtenido un

incremento de hasta tres veces en el contenido de ácidos grasos, en conjunto con aumentos en peso y tamaño celular (Roessler, 1990).

14

Este fenómeno se atribuye a la acumulación de sustancias de reserva en condiciones de crecimiento limitado, característica de los

microorganismos oleaginosos.

2. Las microalgas en la nutrición humana y animal

En los últimos años ha merecido especial atención en nutrición humana y, por lo tanto en salud, las grasas, los aceites y los

antioxidantes. Son numerosos los estudios que demuestran la estrecha relación entre diversas enfermedades y el desequilibrio o la

carencia en la dieta de determinadas grasas, especialmente los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga. La carencia o

desequilibrio dietético en estos compuestos provoca daños importantes en el desarrollo neurológico y de la retina, enfermedades

cardiovasculares, artritis y otros problemas inflamatorios, además de cáncer. Los ácidos grasos poli-insaturados (polyunsaturated fatty

acids, PUFAs) más importantes en nutrición son los ácidos -linoleico y acido -linoleico, y sus derivados, los ácidos araquidónico (AA),

eicosapentaenoico (EPA) y docohexadecanoico (DHA) (Spolaore y cols., 2006). Los dos primeros son considerados esenciales, porque

además de ser precursores de AA, EPA y DHA, son sintetizados exclusivamente por los vegetales, por lo que, las células animales,

incapaces de producirlos, los incorporan a través de la dieta. Los desequilibrios en la composición de ácidos grasos en la dieta es algo

frecuente y peligroso en los países ricos, debido al aumento en el consumo de carne y grasas animales y a la reducción de vegetales de

hoja verde y pescado, ricos en ácidos grasos poli-insaturados (Jiang y cols., 1999; Molina-Grima y cols., 2003; Wen y Chen 2003). En los

países empobrecidos el problema es sencillamente la escasez de alimentos (cerca de 800 millones de personas en el mundo padecen

desnutrición según Naciones Unidas). Las demandas alimenticias de la creciente población mundial son muy altas, y esto plantea serios

problemas. Es necesario, por lo tanto, buscar fuentes alternativas de alimentos. La fuente común de EPA es el aceite de pescado, donde la

15

composición y contenido varía según la especie de pez, estación, localización geográfica de los sitios de pesca, etc. En el año 2000, la

producción mundial anual de aceite de pescado fue de 1 millón de toneladas, con 100.000-250.000 toneladas de EPA y DHA (Lebeau,

2003), las que serían suficientes sólo para 55-100 millones de personas, con un suplemento de 5 g por día. La demanda de EPA el año

2000 sólo en Japón fue de 125 toneladas, aproximadamente, alcanzando un precio de U$650 por kilo de etil éster de EPA (95% puro)

Desafortunadamente, la mayor parte del aceite de pescado producido es hidrogenado e incorporado a la margarina, de manera que los

ácidos -3 son degradados. Además, el aceite de pescado fluctúa en precio y calidad y actualmente se ha agregado como preocupación la

posible contaminación de los aceites con pesticidas y metales pesados. Esto hace necesario buscar fuentes alternativas de ác -3

de mejor calidad y más estables

En este sentido, la producción de ácidos grasos poli-insaturados a partir de microalgas presenta grandes ventajas frente a otras

fuentes: permite alcanzar niveles de producción elevados en condiciones altamente controladas y con un bajo riesgo de contaminación;

es una actividad de una baja demanda de energía que no requiere suelo fértil ni agua de calidad, no compite, por tanto, con otras

actividades agrarias. En la actualidad ciertas microalgas son la base de una floreciente industria biotecnológica. Crypthecodinium cohnii,

un dinoflagelado marino heterotrófico, es uno de los principales productores del ácido omega-3 DHA (uno de los PUFAs más importantes

y demandados). A partir de cepas seleccionadas de esta microalga, la empresa norteamericana Martek Biosciences Corporation ha

conseguido un aceite rico en DHA de gran calidad con el que suplementa leches maternizadas. Una de las dificultades asociadas a la

producción de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga a partir del cultivo de microalgas es la localización e identificación de las

especies adecuadas. Se conocen más de 40.000 especies de microalgas, de las cuales sólo se han explorado los usos potenciales de apenas

unas decenas, no más de 10 son explotadas comercialmente a gran escala. Los trabajos de selección de nuevas especies son lentos,

complejos y costosos, especialmente para la localización de nuevas especies ricas en ácidos grasos. Además de la consolidada producción

para la obtención de biomasa, diversas microalgas han sido cultivadas por su capacidad de sintetizar compuestos considerados

16

nutracéuticos, como los ya mencionados PUFAs y pigmentos carotenoides (astaxantina, betacaroteno, luteína, cantaxantina etc.), que

presentan propiedades terapéuticas (Tripathi y cols., 1999). Actualmente, son comercializadas como alimento natural o suplemento

alimenticio y son encontradas en formulaciones en forma de polvo, pastillas, cápsulas o extractos. Son también incorporadas en masas,

dulces, bebidas etc., tanto como suplemento nutricional y como colorantes naturales (Becker, 2004; Pulz y Gross, 2004; Spolaore y cols.,

2006).

La aplicación más común es en Acuicultura, para la alimentación directa o indirecta de algunas especies de peces, moluscos,

crustáceos y de diversos organismos foráneos de interés económico. Son empleadas especies como Chaetoceros spp., Thalassiosira spp.,

Phaeodactylum tricornutum, Skeletonema costatum, Isochrysis spp., Rhodomonas spp., Monochrysis spp., Tetraselmis spp., Arthrospira spp.,

Spirulina spp., Chlorella spp., Dunaliella spp. y Scenedesmus spp. y otras diversas especies (Silva y cols., 2003; Muller-Feuga, 2004).

Para el uso en la elaboración de alimentos, así como para la extracción de alguna sustancia de interés, es necesario separar la

biomasa del medio de cultivo por lo que, el proceso de separación envuelve una o más etapas sólido-líquido, como floculación,

centrifugación y filtración, por ejemplo. A continuación, la biomasa es deshidratada y para esto pueden ser empleadas diversas técnicas,

como secado al sol, spray-drying o liofilización. Para la extracción de los compuestos, las células microalgales son rotas, empleando

diversos métodos como homogeneización, ultra-sonido, choque osmótico, disolventes, enzimas etc. Las sustancias de interés son

entonces recuperadas y, en la mayoría de los casos, sufren algún proceso de purificación, como ultrafiltración, cromatografía o

fraccionamiento (Molina-Grima, 2004).

17

3. Importancia de los ácidos grasos poliinsaturados

Debido a los cambios en la dieta humana en los últimos años, y a la acentuada aparición de una serie de enfermedades

relacionadas al bajo consumo de estos compuestos, así como su reconocida significancia terapéutica, especialmente a aquellos de la

familia Omega-3 (Simopoulos, 2002) se ha comenzado la búsqueda de nuevas fuentes alternativas de PUFAs. Según Ratledge (2001), la

producción de aceite a partir de organismos unicelulares (single cell oil–SCO) es un concepto relativamente nuevo, siendo las microalgas

una prometedora opción. El contenido de lípidos de la biomasa microalgal puede variar entre 1 a un 40% del peso seco y, en ciertas

condiciones de cultivo, puede alcanzar hasta un 85% (Becker, 2004).

Los lípidos algales están típicamente compuestos por glicerol, azúcares o bases esterificadas y ácidos grasos con cadenas

carbonadas teniendo entre 12 y 22 carbonos, pudiendo ser saturadas, mono o poliinsaturadas. Los ácidos grasos corresponden a la

mayor fracción de los lípidos y, en algunas especies, los PUFA representan entre 25 y un 60% de los lipídos totales (Becker, 2004). Los

lipídos de algunas especies (casi siempre marinas) contienen cantidades relativamente altas de ácidos grasos poliinsaturados de cadena

larga, principalmente EPA (20:5 n-3) y DHA (22:6 n-3) (Robles Medina y cols., 1998). Jiang y cols. (1999) confirmaron la importancia de

los PUFAs que esta dada por diversos estudios clínicos y epidemiológicos. Los PUFAs participan en la prevención y tratamiento de una

serie de enfermedades cardiovasculares, de la ateroclorosis y de la arritmia, de la reducción de la presión arterial, de la reducción de los

niveles de colesterol y triglicerídios en el plasma, de la artritis reumatoide, del cáncer y son aparentemente esenciales en la nutrición

infantil y en el desarrollo cerebral (Gill y Valivety, 1997; Simopoulos, 2002).

En el caso de alimentación humana, los ácidos grasos como docosahexanoico (DHA) o eicosapentanoico (EPA) y sus derivados son

efectivos en la prevención y el tratamiento de ciertas patologías, incluyendo enfermedades coronarias, agregación plaquetaria, niveles

anómalos de colesterol, y algunos tipos de cáncer, siendo además altamente prometedores para el tratamiento de ciertas formas de

18

enfermedad mental (Thierry 2002). Estos ácidos grasos son esenciales ya que no pueden ser sintetizados por el organismo y cumplen un

rol fundamental estructural, y también en los componentes de la membrana de fosfolípidos, son propulsores de la síntesis de la

prostaglandina, control de inflamación, en la presión de sangre, dolor y fiebre (Ward & Singh 2005). Nutricionalmente los ácidos grasos

poliinsaturados juegan un rol importante en la prevención y tratamientos de enfermedades humanas severas,

El uso más extendido de las microalgas sin embargo es como base de la cadena trófica en la acuicultura, ya que son necesarias

para el alimento de larvas de peces, crustáceos y moluscos en sus primeros estadios, directamente o bien como alimento de las presas

vivas que se utilizan en los distintos estadios larvarios (Domínguez y cols. 2006).

Los peces marinos son una conocida fuente de estos compuestos nutricionalmente muy importantes. Sin embargo, existen

considerables evidencias indicando que los ácidos grasos poliinsaturados encontrados en los aceites de peces provienen de la ingestión

de organismos que constituyen el zooplancton, los cuales tienen las microalgas como su principal alimento. De esta manera, a través de

la cadena trófica, los PUFA sintetizados y acumulados por las microalgas son direccionados hasta los peces (Robles Medina y cols., 1998).

Sin embargo, los ácidos grasos extraídos de estas fuentes tienen varias desventajas como olor desagradable, contaminación con metales

pesados, baja estabilidad, presencia de colesterol, producción variable y un complejo perfil de ácidos grasos, pudiendo presentar más de

50 tipos diferentes (Robles Medina y cols., 1998). En contraste, los ácidos grasos de las microalgas no presentan las desventajas citadas.

Además, en los cultivos, las condiciones ambientales pueden ser controladas y las especies seleccionadas según los ácidos grasos

requeridos. Además por presentar una composición más simple, el proceso de purificación de los PUFA es relativamente más sencillo

(Zittelli y cols., 1999; Wen y Chen, 2003). Entre las especies conocidas de microalgas que presentan cantidades significativas de PUFAs

Omega-3 y Omega-6, están representantes de Haptophyceae (Isochrysis spp. y Pavlova lutheri), Bacillariophyceae (Phaeodactylum

tricornutum, Thalassiosira spp. y Odontella aurita), Dinophyceae (Crypthecodinium cohnii), Rhodophyceae (Porphyridium cruentum) y, en

19

menor cantidad, de las Chlorophyceaes. En consecuencia los ácidos grasos poliinsaturados de origen microalgal tienen un mercado muy

prometedor en la biotecnología, en especial en la industria de alimentos funcionales (Pulz y Gross, 2004).

4. Selección de microalgas ricas en ácidos grasos poliinsaturados

Las condiciones de luminosidad características del Desierto de Atacama, permiten obtener cultivos masivos a bajo costo, con

microalgas de colección (Phaeodactylum tricornutum) o nativas aisladas desde diferentes hábitat acuáticos. Una de las dificultades

asociadas a la producción de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga a partir del cultivo de microalgas es la localización e

identificación de las especies adecuadas. Se conocen más de 40.000 especies de microalgas, de las cuales sólo se han explorado los usos

potenciales de apenas unas decenas, no más de 10 son explotadas comercialmente a gran escala. Los trabajos de screening de nuevas

especies son lentos, complejos y costosos, especialmente para la localización de nuevas especies ricas en ácidos grasos. En cambio, la

técnica de Rojo Nilo nos permite seleccionar preliminarmente cepas de microalgas con alto contenido de ácidos grasos, lo que se

confirma con los perfiles obtenidos para las microalgas estudiadas. Los altos contenidos de PUFAS en las microalgas nativas plantean la

necesidad de profundizar su estudio nutricional, para incorporarlas en dietas que puedan utilizarse en la industria acuícola. Esto nos

permite avanzar con celeridad en la búsqueda de un producto nutricionalmente completo para la industria acuícola principalmente, sin

descartar su posible uso para la industria nutraceútica.

Cooksey y cols., (1987) optimizó el uso de la tinción con Rojo Nilo para microalgas, donde la tinción permanece estable entre 7 a

15 minutos en células vivas teñidas, variando la cinética entre las diferentes especies posiblemente debido a diferencias en la

permeabilidad de la pared celular a la tinción, y a cómo son almacenados los lípidos en las células (gotas grandes o pequeñas). A pesar

20

de las diferencias en la tinción de las cepas, este método permite compararlas sin necesidad de extraer los lípidos para cuantificar su

contenido. Aún cuando el Rojo Nilo no permite discriminar entre la estructura de los compuestos, es un método simple, rápido y sensible

para medir lípidos totales en las microalgas, lo que permite seleccionar preliminarmente cepas nativas con alto contenido de ácidos

grasos (Fig. 3.3).

Figura 3.3: Fotografía de microscopia de epifluorescencia para Rojo Nilo (-1) y campo claro (-2) de microalgas nativas de 6 días. En (A): se observa

fluorescencia de color amarillo oro, indicando presencia de cuerpos lipídicos, mientras que en (B) no se observa fluorescencia amarilla para el Rojo Nilo.

21

Capitulo IV: Biodiesel desde microalgas

1Mariella Rivas A, 2Claudia Sepúlveda, 2,3Carlos Riquelme S.

1Centro de Investigación Científico-Tecnológica para la minería, CICITEM.

2Unidad de Microbiología Aplicada, 3Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & centro de bioinnovación, Universidad de

Antofagasta. Avenida Angamos 601, Antofagasta. Email: mrivas@uantof.cl

El uso continuado del petróleo en los próximos años como hasta ahora ha sido es técnicamente imposible e insostenible debido al

agotamiento de las fuentes y a la contribución de este tipo de combustible a la acumulación de dióxido de carbono al medioambiente.

Para la sustentabilidad ambiental y económica se hace necesario el desarrollo de combustibles renovables y neutrales en aportes de

emisión de gases. El biodiesel producido a partir de cultivos agrícolas como maíz, soya, raps son una alternativa potencial. Sin embargo,

en forma realista se necesitan grandes cantidades de hectáreas y terreno dedicado sólo a la producción de combustible, desmereciendo

la producción de cosechas con destino alimentario. Una alternativa que ha ido tomando fuerza los últimos años, es el uso de microalgas

ricas en ácidos grasos de cadena larga como fuente de combustibles capaces de sostener la demanda global. Las microalgas usan la luz

del sol para producir aceites con beneficios medioambientales por el uso de CO2 para crecer y sin la emisión de gases tóxicos por lo que,

el biodiesel microalgal en el futuro será una alternativa económicamente competitiva con el petróleo diesel.

22

1. Introducción

Las microalgas son pequeñas fábricas celulares dirigidas por la luz del sol que convierten el dióxido de carbono a un potencial

combustible, alimentos, semillas y sustancias bioactivas de alto valor agregado (Metting y Pyne, 1986; Borowitzka, 1999; Banerjee y cols.,

2002). Además, estos microorganismos fotosintéticos tienen aplicaciones en biorremediación (Kalin y cols.., 2005; Muñoz y Guieysse,

2006).

Las microalgas pueden dar origen a varios tipos diferentes de biocombustibles renovables. Estos incluyen metano producido por

digestión anaeróbica de la biomasa algal (Spolaore y cols.., 2006), biodiesel derivado desde el aceite (Sawayama y cols.., 1995; Banerjee y

cols.., 2002) y biohidrógeno producido fotobiológicamente (Melis, 2002). La idea de usar microalgas como fuente de combustible no es

nueva (Chisti, 1980; Sawayama y cols.., 1995) pero solo ahora se ha tomado en serio debido al gran aumento en el precio del petróleo y

más importante, el fenómeno del calentamiento global asociado a la quema de combustibles fósiles (Gravrilescu y Chisti, 2005).

Los ácidos grasos metil esteres provenientes desde aceites vegetales y grasas animales son conocidos como biodiesel. El biodiesel

es biodegradable, renovable y no-tóxico. Además, no contribuye con dióxido de carbono o sulfuros a la atmósfera y emite menos

contaminantes gaseosos que el diesel normal (Lang y cols., 2001; Antolin y cols., 2002; Vicente y cols., 2004).

Sin embargo, a pesar del impacto favorable que la comercialización del biodiesel puede otorgar, el aspecto económico de su

producción previene el desarrollo y uso a gran escala, principalmente debido al alto costo del aceite vegetal (Lang y cols., 2001; Antolin y

cols., 2002). Los costos del biodiesel usualmente sobrepasan los 0.5US$/l, comparado a los 0.35US$/l para el diesel normal (Zhang y

cols., 2003). Investigar maneras de reducir los costos de producción de biodiesel es de mucho interés entonces, especialmente métodos

para concentrar o minimizar la materia prima.

23

Las microalgas son una excelente alternativa para la producción de combustible tomando ventaja de su alta eficiencia

fotosintética, alta producción de biomasa y rápido crecimiento en comparación a otras cosechas energéticas (Milne y cols., 1990;

Minowa y cols., 1995). El crecimiento heterotrófico de algunas microalgas es usado para la producción eficiente de biomasa y algunos

metabolitos tales como lípidos (Shi y cols., 2002; Wen y cols., 2002), los que pueden reducir el costo de la producción de biomasa

microalgal y la producción de aceite microalgal.

El biodiesel es producido hoy en día desde plantas y aceites animales pero no desde microalgas, pero actualmente existen varios

proyectos para hacer comercial el biodiesel microalgal, como por ejemplo, GreenFuel Technologies Corporation en Estados Unidos y el

de BioKing en Holanda-Canadá. La tecnología para producir biodiesel se ha conocido desde hace más de 50 años. En Estados Unidos el

biodiesel es producido principalmente desde la soya, aceite de canola, grasa animal, aceite de palma, aceite de desechos de cocinerías y

aceite de jatrofa. Una superficie de una hectárea, puede producir el equivalente a 136.900 litros de aceite con microalgas cuya biomasa

contenga un 70% de aceite. En cambio una hectárea de suelo fértil para cultivo de soya produciría sólo 446 litros (tabla 1).

Si bien existen aspectos tecnológicos a desarrollar para abaratar costos, las microalgas ofrecen muchas posibilidades como por

ejemplo, luego de extraer el aceite, el resto de la biomasa rica en proteínas e hidratos de carbono, podría utilizarse como “compost”,

fertilizante o en productos alimenticios. Por fermentación podría obtenerse bioetanol a partir de los hidratos de carbono. La ingeniería

genética permitiría modificar el genoma de las microalgas de modo de aumentar su velocidad de crecimiento, incrementar la cantidad de

aceite producido o incorporar genes para obtener algún principio farmacéutico de alto valor comercial que contribuya a disminuir los

costos del proceso.

24

Tabla 4.1: Comparación de algunas fuentes de biodiesel.

Cultivo Aceite producido (L/há) Terreno necesario

(M/há)

Maíz 172 1540

Soya 446 594

Canola 1190 223

Jatropha 1892 140

Aceite de palma 5950 45

microalga a 136900 2

microalga b 58700 4.5

a: 70% aceite en biomasa (por peso); b: 30% aceite en biomasa (por peso). (Chisti, 2005)

25

2.-Producción de biodiesel

El aceite usado para hacer biodiesel consiste de triglicéridos en el cual tres moléculas de ácidos grasos son esterificados con una

molécula de glicerol. Estos triglicéridos reaccionan con metanol en una reacción conocida como transesterificación o alcoholisis. La

transesterificación produce metil esteres de aceites grasos, que son el biodiesel y glicerol como subproducto.

La producción de biodiesel debería usar este mismo proceso. La producción de metil esteres o biodiesel desde microalgas ya se

ha demostrado (Belarbi y cols., 2000). La biomasa puede ser convertida bioquímicamente a las formas usadas de varias maneras. Las

reacciones de conversión de energía de la biomasa pueden ser clasificadas dentro de conversión bioquímica y conversión termoquímica.

La conversión termoquímica, como la gasificación, pirolisis y licuefacción, es la descomposición termal de los componentes orgánicos de

la biomasa para producir combustible. La conversión bioquímica puede ser además subdividida en fermentación, digestión anaeróbica,

celdas de combustible bioelectroquímicas, y otros procesos para producir combustible usando el metabolismo de los organismos. Las

rutas biológicas para la conversión de la biomasa son generalmente mas eficientes en términos de reciclaje de nutrientes y materia

orgánica.

La transesterificación catalizada por acido es la forma más usada y se realiza en frascos, calenténdose hasta llegar a la

temperatura de reacción en un shaker o un baño de temperatura constante. Una mezcla de reacción estándar consiste de aceite, metanol

y acido sulfúrico concentrado. La mezcla de reacción fue calentada por un periodo específico, enfriada y lista para separarse en dos

capas. La capa superior de aceite (biodiesel) se separa y se lava con éter de petróleo y luego con agua caliente (50ºC) hasta que el lavado

sea neutral. El biodiesel es obtenido evaporando la solución de eter. Se estima el biodiesel producido (%peso) en relación al peso del

aceite microalgal.

26

3.-Obtención de biodiesel desde microalgas

Dependiendo de la especie, las microalgas producen muchos tipos diferentes de lípidos, hidrocarbonos y otros aceites complejos

(Banerjee y cols., 2002; Metzger y Largeau, 2005; Guschina y Harwood, 2006). No todos los aceites algales son buenos para hacer

biodiesel, pero los disponibles son bastante frecuentes. Usando microalgas para producir biodiesel no se compromete la producción de

alimento y otros productos derivados desde cosechas.

Potencialmente, en vez de las microalgas, se podría usar aceite producido desde microorganismos heterotróficos (Ratledge y

Wynn, 2002) creciendo con fuentes naturales de carbono orgánico tales como azúcar; sin embargo, la producción heterotrófica no es tan

eficiente como al usar microalgas fotosintéticas. Esto debido a las fuentes de carbono orgánico renovable requeridas para el crecimiento

de heterótrofos.

27

Tabla 4.2: Contenido de aceite de algunas microalgas.

Microalga Contenido de aceite (% peso seco)

Botryococcus braunii 25-75

Chlorella sp. 28-32

Crypthecodinium cohnii 20

Cylindroteca sp. 16-37

Dunaliella primolecta 23

Isochrysis sp. 25-33

Monallanthus salina >20

Nannochloris sp. 20-35

Nannochloropsis sp. 31-68

Neochloris oleoabundans 35-54

Nitzchia sp. 45-47

Phaedactylum tricornutum 20-30

Schizochytrium sp. 50-77

Tetraselmis suecica 15-23

Tomada de Chisti, 2005

28

Algunas microalgas como Botryococcus braunii, Nannochloropsis sp. y Schizochytrium sp., en determinadas condiciones producen

mas de un 65% de aceite. Su cultivo puede realizarse en estanques o fotobioreactores en zonas geográficas con escasos recursos

naturales. Dunaliella tertiolecta acumula glicerol el que puede ser transformado en biodiesel. Esta microalga puede adaptarse a un rango

extremadamente amplio de salinidades (Ginzburg, 1987). La composición química única de D. tertiolecta otorga beneficios para su

cultivo a gran escala y la tolerancia al stress por sal facilita la mantención de cultivos unialgales outdoor (Tsukahara y Sawayama, 2005).

Además de B. braunii y D. tertiolecta, varias algas tienen características particulares de crecimiento, especialmente con alta tasa

de multiplicación y alto contenido de proteínas. Entre ellas, Chlorella vulgaris es la especie mas común para cultivo de biomasa, y la

información básica de su fisiología en condiciones de cultivo es bien conocida. No obstante, su uso para la producción comercial de

alimento posee un gran potencial para la obtención de combustible.

4.- Producción de biomasa microalgal

La producción de biomasa microalgal es generalmente más costosa que los cultivos agrarios. El crecimiento fotosintético requiere

luz, dióxido de carbono, agua y sales inorgánicas. La temperatura debe permanecer constante generalmente entre 20 a 30ºC. Para

minimizar los costos, la producción de biodiesel debiera descansar en la producción de la luz del sol disponible gratuitamente, a pesar de

las variaciones diarias y estacionales en los niveles de luz.

El medio de crecimiento debe ser provisto de elementos inorgánicos que constituyen la célula algal. Los elementos esenciales

incluyen nitrógeno, fósforo, hierro y en algunos casos silicona. Los requerimientos nutricionales mínimos pueden ser estimados usando

la formula molecular aproximada de la biomasa microalgal que es CO0.48H1.83N0.11P0.01 (Grobbelaar, 2004). Los nutrientes tales como el

fósforo debe ser suplementados en exceso ya que el fosfato agregado forma complejos con los iones metálicos, además no todo el P

29

agregado es biodisponible (Chisti, 2007). Lo más común es el uso de agua de mar suplementada con fertilizantes comerciales a base de

nitrato y fosfato y unos pocos micronutrientes para el crecimiento de microalgas marinas (Molina Grima y cols.., 1999).

La biomasa microalgal contiene aproximadamente el 50% de carbono por peso seco (Sanchez Miron y cols.., 2003). Todo este

carbono es típicamente derivado desde el dióxido de carbono. La producción de 100 T de biomasa microalgal fija alrededor de 183 T de

dióxido de carbono. El dióxido de carbono debe ser agregado continuamente durante las horas de luz solar. La adición controlada en

respuesta a señales desde sensores de pH minimiza la perdida de dióxido de carbono y las variaciones de pH. La producción de biodiesel

podría en el futuro asociarse al uso del dióxido de carbono producido en industrias que queman combustible fósil (Sawayama y cols..,

1995). Este dióxido de carbono puede estar disponible a bajo costo o en forma gratuita. Idealmente, el biodiesel microalgal podría ser

carbono neutral, como toda la energía necesaria para la producción y procesamiento de las algas.

La producción a gran escala de la biomasa microalgal generalmente usa cultivos continuos outdoor utilizando luz natural. En este

método de operación, el medio de cultivo fresco es agregado a una razón constante y la misma cantidad de cultivo microalgal es retirado

constantemente (Molina Grima y cols., 1999). La alimentación cesa durante la noche, pero la agitación del cultivo continúa para prevenir

el asentamiento de la biomasa (Molina Grima y cols., 1999). Tanto como el 25% de la biomasa producida durante el día, puede ser

perdida durante la noche debido a la respiración. La extensión de esta pérdida depende del nivel de luz bajo la cual crece la biomasa, la

temperatura de cultivo y la temperatura en la noche.

El único método práctico para la producción a gran escala de microalgas son los “raceway” (Terry and Raymond, 1985; Molina

Grima, 1999) y los fotobioreactores tubulares (Molina Grima y cols.., 1999; Tredici, 1999; Sanchez Miron y cols.., 1999).

30

Tabla 2.3: Comparación de las propiedades de combustibles.

Propiedades Biodiesel desde

aceite microalgal

Combustible

Diesela

ASTM biodiesel

estándar

Densidad (kg/l)

0.864 0.838 0.86-0.9

Viscosidad (mm2/s, cSt a 40ºC) 5.2 1.9-4.1 3.5-5.0

Punto de Flash (ºC)

115 75 min 100

Punto de solidificación (ºC) -12 -50 a 10 -

Punto de Cold filter plugging (ºC) -11 -3.0 (máx -6.7) máx verano 0;

máx invierno <-

15

Valor ácido (mg KOH/g) 0.374 máx 0.5 máx 0.5

Valor calorífico (MJ/kg) 41 40-45 -

Razón H/C

1.81 1.81 -

Tomada de Miao y Wu, 2006

31

Capítulo V: Biopelículas Microalgales y su uso en la Acuicultura.

1Mario Lody C, 2Claudia D. Infante.

1Unidad de Recirculación y Crecimiento Larval, 2Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovación,

Universidad de Antofagasta

1. Introducción

Las biopelículas microbianas comenzaron a tomar importancia como un componente clave en el desarrollo de comunidades

biológicas en los diferentes ecosistemas acuáticos, a inicios de los años setenta. Actualmente existen muchos laboratorios en el mundo

dedicados al estudio de las biopelículas microbianas los cuales investigan aspectos tan variados como uso de estas en bioremediación,

medicina e ingeniería ambiental (Costerton y cols.., 1995). En el ámbito marino, particularmente en la acuicultura existen antecedentes

básicos que las biopelículas microbianas pueden estimular y/o inhibir el asentamiento larval de invertebrados marinos (Hormstrom &

Kjelleberg 1993). En el ecosistema marino un componente importante de las biopelículas microbianas son las microalgas, ya que estas

proveen de productos extracelulares (EPS) que permiten el establecimiento de comunidades microbianas multi-especificas. Uno de los

problemas para producir biopelículas mixtas (bacterias-microalgas) es la carencia de sistemas apropiados para su producción masiva

32

2. Formación de Biopelículas.

Las biopelículas se definen como poblaciones bacterianas adheridas por una matriz entre ellas y/o entre sustratos o interfaces.

Esta definición incluye agregados microbianos, flóculos y poblaciones adherentes dentro de los espacios de poros o medios porosos.

(Costerton y cols, 1995)La biopelícula bacteriana se forma como resultado de células plantónicas que encontraron una superficie

adecuada para su asentamiento. Las células utilizan polímeros extracelulares pegajosos para adherirse reversiblemente, compuestos

principalmente de fibrillas de polisacáridos de glucosa y fructosa (Abarzúa and Jakubowski, 1995). Las colonias bacterianas cambiarán

su fenotipo desde comportamiento planctónico a un estado metabólico adaptado a la biopelícula, incluyendo una mayor producción de

sustancias poliméricas extracelulares (EPS, según sus siglas en inglés para extracelular polymeric substances,EPS) (Marshall,

2006).Estos cambios dan como resultado una comunidad microbiana multi-especifica altamente estructurada, atrapada en una matriz

polimérica producida por ella misma (Costerton y cols,. 1995, Watnick & Kolter, 2000).

Las biopelículas bacterianas son comunidades organizadas, que forman una arquitectura intrincada con microcolonias de varias

especies distintas, con canales de agua dentro de la matriz para permitir el transporte de nutrientes o metabolitos a través de un flujo

convectivo (Costerton, 1995). Estas comunidades presentan una estructura análoga a los tejidos eucariontes, donde las células logran

una eficiencia fisiológica y un alto nivel de protección de los estímulos nocivos externos.

Las biopelículas son ubicuas en los ambientes acuáticos (Costerton y cols., 1995), particularmente en el mar, donde todas las

superficies son susceptibles de ser colonizadas una vez sumergidas (Krug, 2006). De manera general, las células constituyen alrededor

del 2-5% de la biomasa; el resto de la biopelícula está compuesta por la matriz de EPS (exopolisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos,

glicoproteínas, fosfolípidos y otros surfactantes) que también incluye traza de iones y sustancias húmicas del entorno (Allison, 2003).

33

Durante el proceso de adhesion, las células bacterianas alteran sus fenotipos en respuesta a la proximidad de una superficie. La

adsorción espontánea de macromoléculas y moléculas hidrofóbicas pequeñas alteran la naturaleza química del sustrato,

acondicionándolo bioquímicamente a la adherencia primaria de bacterias. En esta primera etapa, bacterias sésiles se encuentran en una

juxtaposición estable con otras células de la misma especie o de otras, formando microcolonias mixtas o únicas. Estas juxtaposiciones y

la producción de una matriz de exopolisacáridos dentro de la biopelícula en desarrollo, condicionan el microentorno de cada bacteria de

la biopelícula. Diferentes biopelículas responden a condiciones microambientales específicas, con diferentes patrones de crecimiento y el

desarrollo gradual de una biopelícula madura estructuralmente distinta (Wahl, 1989) (Fig. 5.1) La generación de gradientes químicos,

concentración de oxígeno disuelto y variación de pH, favorecen la coexistencia con otras especies bacterianas con distintos estados

metabólicos (Costerton J. W & Stewart P. S., 2001) y en ocasiones coexistiendo con otros grupos de microorganismos como las

microalgas. Finalmente, se produce un desprendimiento de la biopelícula, desde el centro de ésta hacia fuera (Mai-Prochnow y cols.,

2004) donde algunas células vuelven a su estado libre y escapan para formar nuevos biopelículas.

34

Figura 5.1. Formación de biopelícula bacteriana

3. Factores que contribuyen a la formación de una Biopelícula.

La superficie suele tener considerable importancia como hábitat para la formación de biopelículas debido a que adsorben

nutrientes. El comportamiento de colonización de algunas bacterias y microalgas varía dependiendo de la hidrofobicidad del sustrato.

Las células, en superficies hidrofóbicas (no polares) forman biopelículas estrechamente compactadas consistiendo de células únicas y

pareadas, en contraste, superficies hidrofílicas son escasamente colonizadas (Donlan RM & Costerton WJ, 2002).

35

La temperatura e irradiación son factores importantes a considerar en el medioambiente (Mac Intyre & Cullen JJ. 1995). En aguas

poco profundas ambas variables cambian en relación a la estacionalidad y mareas, afectando en la actividad béntica bacterial. Estudios

en zonas del intermareal o submareal han demostrado que la temperatura puede ejercer un control sobre la fotosíntesis y una

aclimatación y/o cambio de la comunidad microfitobentonica (Barranguet y cols., 1998).

Los nutrientes son necesarios para la formación de biopelículas considerando a los más esenciales como C; N; P, pero los factores

más importantes que afecta el crecimiento bacterial en el ecosistema acuático es la producción primaria (Bird & Kalff 1984). Debido a

que los productos extracelulares del fitoplancton estimulan la proliferación de bacterias (Riquelme & Ishida, 1988). Demostrado a través

de estudios la relación existente entre la productividad primaria y diversos parámetros del bacterioplancton, relacionando

positivamente la abundancia de bacterias y fitoplancton (Avendaño y cols., 2003; Juhl & Murrell 2005).

36

Figura 5.2. Formación de Biopelículas: A) La adsorción de macromoléculas y moléculas hidrofóbicas acondicionan bioquímicamente el sustrato y

favorecen la adhesión de bacterias sésiles que han formado microcolonias. B) Señales químicas del sustrato y de las microcolonias bacterianas son

sensadas por microalgas, especialmente diatomeas, las que secretan sustancias poliméricas extracelulares (EPS) que les permiten adherirse al sustrato o

alas colonias bacterianas. Esta adhesión es de tipo reversible y se transformará en irreversible, si las condiciones fisicoquímicas y las señales sensadas son

favorables. C) establecida la biopelícula mixta bacteria-microalga, se envían señales de asentamiento para colonizadores secundarios (larvas de

invertebrados, esporas de macroalgas e invertebrados)

A B C

37

Figura 5.3. Factores mediambietales que contribuyen a la formación de

una biopelícula.

Las biopelículas se encuentran en una gran variedad de superficies, incluyendo tejidos vivos, aparatos médicos, tuberías de

sistemas de agua potable y en sistemas acuáticos marinos (Fig 5.4). Son ejemplos comunes de biopelículas la placa dental, la capa

resbaladiza de las rocas de un arroyo, y hasta el limo que inevitablemente se materializa en el fondo de un jarrón de flores al segundo o

tercer día.

38

En algunos lugares pueden llegar a producir efectos indeseables como: entorpecimiento del flujo de agua en las tuberías o de

petróleo en los oleoductos, aceleración en la corrosión de tuberías; degradación de objetos sumergidos como plataformas petroleras,

barcos e instalaciones acuícolas situadas en la costa.

4. Características De Las Biopelículas

Son heterogéneas: pueden estar formadas por bacterias, hongos, microalgas. Se ha visto que cuando los microorganismos son

variados dentro de una biopelícula presentan diferentes microambientes de pH, presión parcial de oxígeno, concentración de iones,

carbono y nitrógeno (Costerton y cols.. 1994; Vroom y cols.. 1999).

La hidrodinámica juega un importante rol en el desarrollo de la biopelícula pues estas agregaciones se forman en una interfase

líquido-sólido donde la velocidad del flujo que las atraviesa influye en el desprendimiento físico de los microorganismos, con sistemas de

canales que les permiten el transporte de nutrientes y desechos (Juhl & Murrell 2005).

La resistencia de las biopelículas a diferentes agentes antimicrobianos. Las hace invencibles y contenidas en el exopolímero

forman una estructura impermeable en donde sólo los microorganismos más superficiales se ven afectados (Betancourth M, 2004).

5. Importancia de las Biopelículas en la Industria Acuícola

Diversas investigaciones muestran que las larvas de moluscos se asientan en respuesta a un tipo específico de biopelícula

formado sobre un sustrato (Wainman y cols., 1996). La presencia de complejas comunidades multi-específicas sobre sustratos es un

39

fenómeno natural y la formación de microambientes sobre superficies limpias es algo inevitable (Cooksey & Wigglesworth-Cooksey,

1995). Los primeros colonizadores y constituyentes principales que conforman las biopelículas en el medio natural son las bacterias y

microalgas (principalmente diatomeas). Estas comunidades multi-específicas podrían generar el asentamiento y metamorfosis de larvas

de invertebrados a través de la estimulación o inhibición de señales químicas (Holmstrom & Kjelleberg 1993, Kavouras & Maki 2000) e

influir en el desarrollo larval por la producción de moléculas solubles, afectando el comportamiento de asentamiento y/o la

metamorfosis larval (Maki J.S 1990). Más aún, la utilización de biopelículas multi-específicas y, fundamentalmente la interacción

bacteria-microalga, puede tener un rol benéfico en procesos digestivos, disminuyendo el crecimiento de algunos agentes nocivos o bien

interactuando para mantener la dinámica de la población bacteriana en los sistemas de cultivo (Nakamura y cols., 1999, Riquelme y cols.,

2001).

En el cultivo del Abalón, por ejemplo, las biopelículas permiten que el asentamiento sea selectivo y específico frente al substrato

(Hahn, 1989). En Haliotis discus hannai se ha observado respuestas de asentamiento diferentes de acuerdo a las especies de diatomeas

presentes en la biopelícula (Kawamura & Kikuchi 1992). En cambio en Haliotis laevigata, la densidad y madurez de la biopelícula son

factores relevantes desde el punto de vista del asentamiento larval, más que el tipo de diatomeas presente en la biopelícula (Daume y

cols.. 1999). En Concbolepas concholepas estudios de quimiotaxis realizados con larvas pre-metamorfoseadas expuestas a distintas

biopelículas (bacterianas, multiespecíficas microalgales y multiespecíficas de bacteria-microalga) y en distintos substratos revelaron

una preferencia significativa por biopelículas multiespecíficas de bacteria-microalga (Rodríguez y cols.., 1995). En el caso de Argopecten

purpuratus, el uso de biopelículas de diatomeas utilizando como sustrato mallas de Netlon favorece el asentamiento de post-larvas en el

laboratorio y en el medio natural, alcanzando asentamientos mayores que colectores sin biologizar o con la biologización tradicional

utilizada en los cultivos de ostión (Avendaño y cols.., 2003). Estas experiencias plantean la potencialidad de utilizar las biopelículas

para mejorar la producción de otras especies cultivables tales como el erizo rojo (Loxechinus albus).

40

6.- Interacción Bacteria-Microalgas en el medio ambiente acuático

La relación entre el fitoplancton (incluyendo a las diatomeas) y el medio ambiente acuático juega un rol crucial en importantes

procesos tales como flujo de carbono y regeneración de nutrientes (Azam, 1998). Variados estudios han demostrado fenómenos de

estimulación e inhibición de crecimiento en microalgas y/o bacterias (Kogure y cols., 1979). Incrementando las bacterias el crecimiento

microalgal (Berland y cols.., 1970) mediante la producción de algunas vitaminas y factores de crecimiento (Haines & Guillard, 1974). Por

otro lado, las substancias orgánicas derivadas del fitoplancton en ecosistemas naturales son utilizadas por las bacterias como substrato

de crecimiento (Ohara y cols.., 1993). Transformando los compuestos más complejos en formas más fáciles de utilizar por otros

organismos heterotróficos, dando una continuidad al flujo del carbono en el ambiente acuático (Malone & Durklow. 1990). Estudios más

recientes empleando modernas técnicas moleculares demostraron que el desarrollo de un “bloom” de diatomeas depende de la dinámica

de la comunidad bacteriana y las partículas asociadas a estas (Riemann y cols..2000). No obstante, algunos componentes de las

comunidades bacterianas actúan también como antagonistas de algas (Safferman & Morris1962, Blasco 1965, Shilo 1970) e incluso en

aguas costeras son capaces de lisar células microalgales, denominándose “bacterias asesinas” (Baker & Herson 1978, Ishio y cols..

1989,Sakata 1990, Imai y cols.. 1993, 1995, Yoshinaga.y cols.. 1997). Por lo tanto, las interacciones que se producen entre bacteria-

fitoplancton son recíprocas y están determinadas principalmente por la utilización y producción de carbono orgánico disuelto, por

células algales y su efecto en el crecimiento bacteriano (Fogg 1983, Jones & Cannon 1986). Además, se ha evidenciado que en

ecosistemas acuáticos las interacciones bacteria-fitoplancton son específicas (especie-especie), provocando un efecto positivo

(simbiosis) o negativo (antagonismo), dependiendo de las condiciones del ecosistema. Figura 8. Uso de las biopelículas en la acuicultura

41

En los cultivos comerciales de invertebrados marinos, generalmente se provee de sustratos artificiales con biopelículas

microbianas inespecíficas para el asentamiento larval, especialmente en el cultivo del Ostión del Norte, uno de los moluscos de mayor

interés comercial en Chile. Los cultivadores utilizan como substrato mallas de polietileno denominados “netlón®”, los cuales son

sumergidos durante varios días en agua de mar circulante, para permitir la formación de biopelículas sobre su superficie. La

composición microbiológica de estas biopelículas es completamente desconocida, ya que no se tiene certeza de los microorganismos que

colonizan el netlón, variando dichos componentes y su dominancia de acuerdos a los factores estacionales existentes.

La aplicación e implementación de biopelículas específicas (bacteria-microalga) deriva del consenso de diversos estudios que

sustentan que biopelículas microbianas específicas pueden influenciar favorablemente el asentamiento larval (Davies y cols. 1998,

Holmstrom & Kjelleberg 1999, Avendaño y cols.., 2003). Más aún estudios tanto en Argopecten purpuratus 5.7(Avendaño y cols.., 2003)

como en otros moluscos Concholepas concholepas (Rodríguez y cols.., 1995), Crassostrea gigas (Weiner y cols.., 1989), C. virginica (Young

and Mitchell 1973; Weiner y cols.., 1985) han demostrado que utilizando sustratos artificiales con biopelículas bacterianas, microalgales

en experiencias in situ y/o bacteria-microalga 5.8las que contribuyen a atraer las larvas al sustrato y de estas forma mejorar el

asentamiento larval de invertebrados marinos.

42

Figura 5.6. Asentamiento de semillas de A. purpuratus en colectores

biologizados con microalgas.Ct s/b (Control), Natural, Nv (Navicula

veneta), Fp (Niztschia sp) Las líneas verticales corresponden a la

desviación estándar.

43

Figura 5.7. Retorno de semillas de Argopecten purpuratus desde experiencias de fijación con Amphora sp (NV).

44

Capitulo VI: Sistemas de Cultivo Fotobioreactores

Claudia Sepúlveda V,Yery Luza P.

Unidad de Microbiología Aplicada, Facultad de Recursos del Mar & Centro de Bioinnovación, Universidad de Antofagasta

1. Introduccion

En la década de 1950 se postuló por primera vez que el empleo de luz solar y agua marina para obtener cultivos masivos de

microalgas ricas en proteína de alta calidad, podría ser una buena alternativa para obtener alimento para el ser humano (Becker,

1994).Sin embargo, el cultivo a gran escala de microalgas y el uso práctico de esta biomasa como un recurso de bioproductos fue

considerado seriamente por primera vez durante la Segunda Guerra Mundial (Harder & Von Witsch, 1942; Abalde, 1995; Becker, 1994).

Aún cuando existe una gran diversidad de microorganismos fotosintéticos con elevado potencial para la industria acuícola,

cosmética, farmacéutica, agrícola y acuícola, tan sólo un pequeño porcentaje de estos ha visto potencializado su aprovechamiento,

debido principalmente a la carencia de sistemas de cultivos que permitan explotarlos adecuadamente.

Las microalgas son cultivadas a nivel de laboratorio e industrial, y las características esenciales que debe poseer un sistema de

producción debe incluir la disponibilidad de luz solar o artificial y un medio de cultivo que proporcionen los nutrientes apropiados para

el crecimiento de las microalgas.

La diversidad de los sistemas empleados para producir la biomasa microalgal también es muy amplia, aunque podrían incluirse

en dos grandes grupos: sistemas abiertos de gran extensión y baja complejidad técnica, para el cultivo, en condiciones muy específicas,

45

de muy pocas especies (Spirulina sp, Dunaliella sp.), y sistemas cerrados, con condiciones de crecimiento muy controladas pero de mayor

complejidad tecnológica (Gudin, 2002).

La mayoría de los sistemas de producción industrial de biomasa de microalgas construidos antes de los años 90 fueron

esencialmente sistemas abiertos tipo carrusel, los que permiten alcanzar densidades celulares de hasta 0,7 g/L en base seca (Contreras-

Flores, 2003)

La creciente demanda de biomasa microlagalha incentivado en los científicos y técnicos a iniciar programas para cultivarlas,

especialmente aquellas que se utilizan para el consumo humano. En algunos países como Japón y China, el cultivo de las microalgas

representa una industria que se encuentra en expansión y en distintas partes del mundo se está trabajando intensamente para lograr

cultivarlas tanto con fines alimenticios como industriales.

En función de las distintas aplicaciones consideradas en capítulos anteriores, actualmente se reconoce la importancia comercial

de distintas especies de microalgas; sin embargo, el desarrollo industrial en biotecnología microalgal es escaso, debido

fundamentalmente a los elevados costos de producción; para que la tecnología microalgal alcance su potencial final estos deberán ser

reducidos significativamente, incrementando los rendimientos para aumentar la rentabilidad (Richmond, 2004) o disminuyendo los

costos de construcción y mantencion. Para llevar a cabo la producción masiva de microalgas es imprescindible seleccionar

adecuadamente el diseño de reactor que se va a utilizar. Para ello se deben tener en cuenta una serie de parámetros en función del

microorganismo que se va a emplear, como condiciones óptimas de crecimiento y resistencia a variaciones ambientales, así como

parámetros económicos, tales como valor del producto obtenido, capital inmovilizado necesario, costos de operación estimados, etc. De

esta forma, el diseño de reactores que permitan alcanzar altas productividades a unos costes moderados es una de las líneas de trabajo

más importantes en el campo de la biotecnología, y sin cuyo avance será imposible una expansión mundial de esta industria.

46

Los productos derivados de microalgas son también una importante fuente de compuestos para la industria alimenticia y

farmacéutica. En la primera son utilizados como colorantes, antioxidantes y aditivos y en la segunda como vitaminas, provitaminas,

inmunotrazadores y antioxidantes”.

“Aunque es difícil precisar el mercado mundial de los productos nutracéuticos, entre los que se encuentran las microalgas y productos

derivados, se estima que éste asciende a más de 2 billones de dólares, con un crecimiento promedio anual del 7% (Freedonia Group

Inc.2000), debido a los beneficios que científicamente se están comprobando respecto de su consumo”.

2. Sistemas De Cultivos Abiertos

En el diseño de estanques y piscinas se deben considerar los costos de inversión con respecto a las ganancias esperadas, por lo

que estos sistemas de cultivo deben tener en cuenta distintos factores como por ejemplo: la profundidad, la calidad del material de

revestimiento y la agitación del cultivo. Es sabido que la profundidad de los estanques ha sido una limitante en la expansión de este

sistema de cultivo, ya que este factor es limitante al momento de la penetración de luz al sistema. La agitación es uno de los puntos más

importantes, esta debe ser capaz de mezclar los nutrientes suministrados y facilitar la exposición celular de las microalgas a la luz solar

para la realización de la fotosíntesis, logrando el máximo potencial de crecimiento celular. El material utilizado en la construcción de

estos sistemas es de un costo elevado, es por ello que actualmente son poco utilizados.

Los distintos tipos de estanques y piscinas (Fig 6.1) han sido evaluados en forma extendida por distintos autores Becker 1994;

Abalde 1995, considerando los distintos aspectos relevantes para el éxito de un cultivo masivo de microalgas. Finalmente en la

actualidad aun son utilizadas las piscinas tipo raceways, su utilización es limitada debido a problemas de contaminación, suciedad y

47

evaporación, perjudicando la obtención de biomasa final. El funcionamiento de estos sistemas de cultivos raceways es muy simple ya

que consta de una estructura de soporte, además de un sistema de paletas rotatorias encargadas de recircular y agitar el medio en forma

homogénea y continua, estas paletas son impulsadas por una bomba. En el mundo se ha trabajado con distintos materiales para su

construcción, ya sea de concreto, membranas de PVC, geomembranas, policarbonatos, etc.

Figura 6.1: Sistemas de cultivos en piscinas circulares, utilizadas en

Brasil.

Este tipo de sistema se encuentra restringido solo para algunos tipos de microalgas como lo son la Spirulina, la cual posee

características muy adecuadas para un cultivo a gran escala, obteniendo biomasa rica en proteína, crece a pH muy elevados y

condiciones muy extremas de cultivo obteniendo un alto nivel industrial (Molina, 2003). Para las especies Dunaliella salina y

Haematococcus pluvialis, el proceso de cultivo en raceways ha sido desarrollado en distintos lugares del mundo, debido a que por las

48

características de estas microalgas el estar en condiciones extremas de luminosidad y salinidad favorecen sus procesos metabólicos,

obteniendo asi beta-caroteno de alta calidad.

Algunos de los países que han desarrollado sistemas de cultivos tipo raceways son: China, Singapur, Taiwán, Israel, Sudáfrica,

India, Tailandia, Perú y Chile.

Los principales productores de Spirulina a nivel mundial se localizan en Estados Unidos, Japón, Israel y Australia, abasteciendo a

sus propios mercados y a otros como Comunidad Europea y Canadá. Por otra parte, China e India constituyen importantes productores

al sumarse la biomasa de cultivos de pequeña a mediana escala, que realizan agrupaciones comunitarias para consumo interno,

principalmente.

En Chile existen cinco empresas dedicadas a la producción de microalgas (principalmente Spirulina), todas ubicadas en la zona

norte del país, la que presenta condiciones ambientales muy favorables para los cultivos de Spirulina y otras microalgas: abundante luz

solar durante todo el año, temperatura ambiental promedioentre 5ºC y 33ºC-, abundantes napas subterráneas de agua dulce de

excelente calidad, agua de mar que se puede desalinizar -dependiendo de la microalga- y grandes depósitos naturales de salitre, base del

medio de crecimiento de cualquier microalga (Fig 6.2 y 6.3). El año 2003 se exportaron 13 toneladas de microalgas que corresponden a

US$129.751, un alza de 68% respecto al 2002. Las empresas nacionales involucradas en el cultivo de estas microalgas desarrollan sus

cultivos exclusivamente en sistemas tipo raceways, el cual genera limitantes para la elaboración de productos de mayor valor agregado.

El desarrollo de la fase elaboradora es aún incipiente, siendo necesario para esta industria la incorporación de tecnología tanto en fase

de cultivo como en procesamiento (Proyecto fondef UNAP).

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Figura 6.2. Estanque raceways ubicado en el Norte de Chile, en la

localidad de Pica al interior, corresponde a la empresa ASTAX Chile.

2007 (Gentileza Proyecto Explora CONICYT, Universidad de

Antofagasta)

Figura 6.3. Proyecto Haematococcus pluviales, ubicado al Norte de Chile,

2007 (Gentileza fotografía Ernesto Retamales).

50

3. Sistemas De Cultivos Cerrados

El perfeccionamiento de la tecnología de cultivo de los sistemas raceways hace tiempo llegó a su limite, quedando restringido sólo

para cierto tipo de microalgas, dificultando el desarrollo biotecnológico del cultivo microalgal. La baja densidad celular obtenida en estos

sistemas para algunas especies de microalgas, origina varios inconvenientes, incluyendo baja productividad, fácil contaminación, costosa

recuperación del producto desde medios diluídos y dificultad para el control de la temperatura.

Las técnicas de sistemas de cultivos cerrados de producción de microorganismos fotoautotroficos son denominados

fotobiorreactores (PBR). Estos sistemas pueden ser evaluados en sus varios conceptos de configuración respecto su potencial productivo

y factibilidad económica (Pulz 2001). Los primeros fotobiorreactores fueron propuestos por Pirt y cols., 1983 y Gudin y Thepenier,

1986). El cultivo intensivo de microalgas ha sido posible en gran medida gracias al diseño de fotobiorreactores (Contreras y cols. 2003).

En la ultima década los fotobiorreactores tubulares y de placas planas han recibido, entre otros, mucha atención, ya que permiten

establecer cultivos de alta densidad celular: 3 o más veces que los sistemas de cultivos tipo raceways; además, no restringe el tipo de

microalga a cultivar. Estos sistemas de cultivos presentan las siguientes ventajas:

1. Facilidad para cosechar la biomasa.

2. Mantenimiento del cultivo sin contaminación.

3. Mejor control de las condiciones de cultivo.

4. Menor inversión de capital en el fotobioreactor.

51

Los fotobioreactores para monocultivos de microalgas a gran escala han sido convencionalmente diseñados como dispositivos

con grandes proporciones superficie/volumen. Varios tipos de fotobioreactores tubulares son ejemplo de este enfoque (Lee, 1992;

Borowitzka, 1996). Los fotobiorreactores cerrados pueden ser localizados en interior o exterior, pero la ubicación en exteriores es mas

común debido a que puede hacer libre uso de la luz solar (Acien y cols., 2003). Los fotobioreactores cerrados se han utilizado para

minimizar la introducción de contaminantes e incrementar el control del sistema (Rusch, 2003). Muchos de estos sistemas cerrados

consisten en fotobiorreactores tubulares diseñados con tubos de diferentes diámetros y longitud así como de materiales transparentes

(Tredici, 1999).

4. Recomendaciones Para El Diseño De Fotobioreactores

Según lo discutido en trabajo realizado por Contreras-Flores 2003 titulado “Avances en el diseño conceptual de fotobiorreactores

para el cultivo de microalgas”

1. la trayectoria de la luz debe ser pequeña (2,5 cm).

2. Mantener una alta densidad celular (>8-15g/L).

3. Un mezclado vigoroso para asegurar ciclos de luz/oscuridad de alta frecuencia.

4. Usar tramos cortos de tuberías (20 – 30 m) para evitar inhibición del crecimiento por acumulación de CO2.

5. Evitar acumulación de sustancias inhibitorias

6. Mantener temperaturas y pH óptimos.

52

Diseños de Fotobioreactores

En el mundo se han realizado un sin numero de investigación con respecto a la optimización del proceso de cultivo de microalgas,

basados en la producción de biomasa microalgal a través de fotobioreactores cerrados, variando en su forma, funcionamiento y material

de construcción. En distintos trabajos y revisiones bibliograficas se encuentra variada información de acuerdo a su productividad de

biomasa, principal objetivo de estos sistemas para poder llegar a producir microalgas a nivel industrial de manera económicamente

viable.

53

Tabla 6.1: Sistemática de equipamientos de cultivo para sistemas abiertos y cerrados

Tipo básico Variables técnicas

1. Sistemas abiertos

Contenedor Material plásticos o vidrios

Aguas naturales Desarrollo de turbulencia (bombeo y

agitación)

Estanques Raceways Dirección de flujo (horizontal o vertical)

superficie inclinada Superficie para el volumen

2. Sistemas cerrados

Fundas plásticas Mayor remoción de O2 y menor entrada

de CO2

Estanques fermentadores Tipo y duración de iluminación

Fotobioreactor tubular Control de temperatura

O Esterilización

Fuente: O. Pulls, 2001. Photo bioreactors: Production systems for phototropic Microorganisms.

54

En la Universidad de Almería, España, han trabajado con distintos tipos de fotobioreactores, los cuales han sido diseñados en base

a la influencia de las condiciones ambientales, fluido-dinámicas del crecimiento y productividad de cada especie. Estos estudios son

realizados primeramente a nivel de laboratorio y en condiciones internas, para ello trabajan con fermentadores de 2 a 5 Litros (Fig. 6.4

A), en los cuales controlan todas las variables de operación. Posteriormente los resultados son verificados y generalizados en

fotobioreactores a nivel de planta piloto. Los sistemas de cultivos utilizados por el grupo de investigación constan de sistemas cerrados

de fotobioreactores tubulares y columnas verticales (Fig 6.4 B y C), los cuales permiten un mejor control en la operaciones y disminución

de contaminantes para la producción de un cultivo monoalgal.

55

Figura 6.4: Fermentador utilizado a nivel de laboratorio (A), Fotobioreactor columnas verticales (B) y fotobioreactores tubulares (C).

Los fotobiorreactores tubulares horizontales utilizados consisten en un desgasificador vertical conectado a un lazo horizontal

sumergido en un baño termostatizado, a través de dos tubos provistos de diferentes válvulas para toma de muestras e inyección de CO2.

Se dispone además de dos depósitos de 0,50 m3 de capacidad, así como bombas dosificadoras para trabajo en continuo y una bomba de

caudal superior para adiciones rápidas de medio. Cada fotobiorreactor está provisto de una sonda de temperatura, así como electrodos

de pH y oxígeno disuelto. Posee además, una entrada de aire estéril en uno de los conductos verticales, para producir la circulación del

cultivo, y una doble entrada de gases para inyección de CO2, estando todo el sistema controlado mediante una unidad de control. El

56

sistema se encuentra orientado al sur para maximizar la captación de energía solar durante el día. En el desgasificador se encuentran los

electrodos y sonda de temperatura, así como un reservorio para trabajo continuo, y conducciones de entrada de medio en continuo,

entrada rápida de medio y salida de gases. Todas estas conexiones están aisladas del exterior para evitar posibles contaminaciones. El

tanque de cosechado, por el que salen al exterior las corrientes gaseosas de cada reactor, se encuentra provisto de filtros de

esterilización Millipore de 0,2 µm de diámetro de poro.

La circulación del cultivo se induce mediante burbujeo de aire en uno de los conductos verticales (conducto de ascenso). La

mezcla entre el cultivo y el aire burbujeado produce una disminución de la densidad del fluido en dicho conducto, que por diferencia

produce la circulación del cultivo. Por tanto, para modificar la velocidad de circulación se pueden modificar dos factores: la altura del

desgasificador y el caudal de aire aportado al conducto ascendente. Durante la experimentación, ninguna de las dos variables se ha

modificado por lo que la velocidad de circulación se ha mantenido constante e igual en ambos reactores, con un valor de 0,35 m·s-1.

Los reactores tipo columna de burbujeo con recirculación consisten esencialmente en un tanque de líquido dividido en dos zonas

interconectadas, de las cuales sólo una es burbujeada con un gas. La diferencia de gas retenido entre la zona gasificada y no gasificada

origina una diferencia de densidad del fluido que produce la circulación en el reactor.

La parte de reactor en la que se inyecta el gas y se produce la impulsión del fluido se denomina conducto ascendente, mientras

que la parte por la que desciende dicho fluido se denomina bajante, o conducto descendente

En teoría, las columnas de burbujeo con recirculación se pueden emplear para cualquier sistema gas-líquido. De esta forma, se ha

establecido la técnica y el desarrollo económico para utilizar este tipo de unidades en numerosos procesos, siendo cada vez más

frecuentes en fermentaciones aeróbicas, tratamiento de aguas residuales y otras operaciones similares. La simplicidad de su diseño y

construcción, la mejor definición de los flujos (Merchuk, 1986) y los comparativamente bajos consumos de potencia para las velocidades

de transporte alcanzadas, hacen de ellos unos reactores muy atractivos desde el punto de vista industrial (Chisti, 1989). Así, la

57

producción continua de cerveza, vinagre, ácido cítrico y biomasa de levaduras, bacterias y hongos, se lleva a cabo en columnas de

burbujeo con recirculación a diferentes capacidades de trabajo. En Rusia y Europa del Este se han empleado estos reactores para la

obtención de proteínas mediante cultivo de levaduras (Blakerbrough y col., 1967) y en Inglaterra la compañía ICI ha trabajado con un

fermentador tipo columna de burbujeo de 1500 m3 para el proceso PRUTEEN (Westlake, 1986).

Se estima que la utilización de estos reactores reduce en un 50% los consumos de potencia, lo cual repercute en una reducción de

un 50% en los costos de la biomasa producida. La diferencia de productividad observada respecto a los reactores race-ways se atribuye

al hecho de que en los últimos los coeficientes de transferencia de materia son mucho menores, además de que la agitación mecánica

puede producir daños en las células debido a las fuerzas de corte que introducen.

En cuanto a la clasificación de estos reactores, se ha investigado una amplia variedad de ellos, los cuales a menudo se confunden

en bibliografía. Básicamente se pueden distinguir dos tipos;

(a) la columna de burbujeo con recirculación interna, que básicamente podría consistir en una columna de burbujeo en la que

se coloca una entrada inferior de aire y unos paneles para separar las dos zonas de circulación, y

(b) la columna de burbujeo con recirculación externa, donde las zonas de ascenso y descenso están separadas y se conectan

horizontalmente por el extremo superior e inferior. Estos tipos básicos se pueden subdividir más atendiendo a los diseños particulares

de cada uno.

El último aspecto en el que se está trabajando en el grupo es en la relación entre la frecuencia de exposición de las células a la luz

y su productividad. Para ello se ha trabajado con una técnica muy usual en el campo de los catalizadores y la circulación de fluidos por

sistemas complejos, como es el CARPT (Computer Assisted Radiactive Particle Tracking). La técnica consiste en insertar una partícula

radioactiva en el sistema y registrar, mediante detectores adecuados situados en diversas posiciones, como es la trayectoria de estas

58

partículas. La información obtenida se analiza y de ella se obtiene el campo de velocidades, de trayectorias, e incluso los tiempos de

residencia en cada zona del reactor.

Existen diversos trabajos publicados por el grupo del Departamento de Química de la Universidad de Almería en revistas

científicos muy importantes en el mundo. Durante el año 1999 se realizo un trabajo titulado “Photobioreactors: light regime, mass

transfer, and scaleup”, publicado en la revista Journal of Biotechnology, en donde se emplea un modelo matemático de transferencia de

masa, para evaluar distintos diseños de fotobioreactores tubulares out door, en donde la productividad de cultivo esta siempre

controlada por la disponibilidad de luz, sobre todo cuando la escala de producción aumenta. Finalmente después de analizar distintos

tipos de fotobioreactores cerrados propuestos, el fotobioreactor tubular es el que presenta mayores ventajas de escalamiento aun asi

considerando que su funcionamiento es mucho más complejo que los sistemas de cultivos abiertos. Problemas de irradiancia,

suplemento de dióxido de carbono son más bien problemas fáciles de resolver. Las dificultades más bien se presentan al momento de

escalar los volúmenes y diámetros de las tuberías, incrementando asi la zona de luz y oscuridad a la cual se encuentra expuesta la

microalga. El presente trabajo recomienda no utilizar diámetros superiores a 0,1 m y longitud de tubos no superiores a 80 m con una

velocidad de flujo de 0.3 – 0.5 m s -1.

En otro ensayo realizado en el año 1999 titulado “Use of concentric-tube airlift photobioreactors for microalgal outdoor

mass cultures” publicado en la revista Enzyme and Microbial Technology por el mismo grupo de trabajo se analizaron dos sistemas de

cultivos: un fotobioreactor airlift vertical outdoor (ALP) y un segundo sistema denominado fotobioreactor tubular horizontal de tuberías

(HLTP) ubicados en el mismo lugar, usado para cultivar Phaeodactylum tricornutm UTEX 640. La productividad de biomasa máxima fue

similar en ambos, a pesar de la alta viabilidad de luz en HLTP. La eficiencia fotosintética fue mayor en ALP. Este comportamiento fue

atribuido a la fotoinhibición en HLTP y al efecto negativo de un inapropiado ciclo de luz y oscuridad.

59

5. Características Físico Químicas Del Funcionamiento De Un Fotobiorreactor

a) Luz

La luz es el parámetro más importante en el diseño y construcción de un fotobioreactor. A pesar de su importancia, la luz puede ser una

entrada muy complicada de medir en lo que se refiere a la determinación de la eficiencia del fotobioreactor (Janssen y cols.. 2002). Puede

ser suplementada continuamente o a través de ciclos de luz y oscuridad. Como las concentraciones celulares varían, los requerimientos

de luz también cambian. El crecimiento algal esta limitado cuando la luz es escasa y cuando es abundante. La tasa de fotosíntesis celular

(capacidad de captación de fotones) depende de la energía luminosa que reciben las células. La curva dosis respuesta que describe esta

relación representa una respuesta típica del crecimiento respecto a la disponibilidad de sustrato (Richmond, 2000). A bajos niveles de

intensidad luminosa la rapidez de la fotosíntesis aumenta con la intensidad de luz, pero a niveles de energía incidentes superiores a un

cierto valor (constante específica Ek) inducen sólo pequeños cambios en F. La constante específica Ek, característica para cada

organismo, indica el nivel de energía luminosa al que comienza a saturarse el fotosistema de un organismo. La energía incidente puede

llegar a niveles que causan inhibición de los fotosistemas celulares, lo cual puede deteriorar el cultivo y causar incluso un daño

irreversible a las células microalgales.

60

Figura 6.5. Sala de cultivos provista de iluminación natural, Unidad de

Microbiologia Aplicada, Facultad de Recursos del Mar, Universidad de

Antofagasta.

b) Circulación

La circulación es importante para asegurar varias condiciones claves en los cultivos de microalgas, entre ellas mantener un

adecuado intercambio gaseoso, óptimos niveles de iluminación de las algas, la temperatura y mantener cierto control del pH al interior

del cultivo. Los fotobiorreactores pueden ser bombeados con aire, pero la baja concentración de CO2 en el aire (0,033%) a menudo limita

el crecimiento fototrópico. Con un flujo de aire de 1L·min-1, asumiendo que todo el dióxido de carbono es usado y la biomasa es 50% de

carbón, hay suficiente para soportar 3.54x10-4 gramos de biomasa · min-1; esto es una muy baja productividad. El principio de “airlift” en

el cual la circulación se logra creando diferencias en la densidad del agua en diferentes regiones del fotobiorreactor. Este principio es

61

común en fermentadores y ha sido implementado a los fotobiorreactores en la Unidad de Microbiología Aplicada de la Universidad de

Antofagasta (figura 2). Estos fotobiorreactores usan una columna de burbujeo de PVC de 1 metro de largo con circulación interna de

agua, la incorporación de gases a se ejecuta a través de una manguera hasta la mitad del fotobioreactor produciéndose la diferencia de

densidad la cual origina la circulación ascendente del medio de cultivo (Fig. 6.6). esta agitación es uno de los más importantes factores en

el cultivo de microalgas masivas y en la obtención de altos rendimientos de biomasa. La agitación implica una combinación de varios

efectos, por ejemplo, la dispersión uniforme del alga asegura la frecuente exposición a la luz, evade el asentamiento del alga en el fondo

del cultivo, permite una adecuada distribución de los nutrientes, mejor utilización del dióxido de carbono y previene la estratificación

termal. Si la velocidad de mezcla es muy lenta, las células muertas y otras formas de desechos orgánicos se acumularan en el fondo,

especialmente donde la turbulencia es mala. Este hecho incrementa las zonas de condiciones anaeróbicas, disminuyendo la calidad de la

biomasa. En sistemas abiertos como piscinas (raceways) el flujo turbulento es esencial para la producción de microalgas, previniendo el

asentamiento de células, se evade la estratificación termal y oxigénica del cultivo.

62

Figura 6.6. Fotobiorreactor “Air-Lift” para microalgas bentónicas

diseñado en la Unidad de Microbiología Aplicada, Universidad de

Antofagasta. La inyección de aire suministrada a través de una columna

vertical la cual permite la diferencia de densidades logrando una

circulación ascendente de flujo de agua del fondo del tubo.

63

c) Suministro de CO2

Cómo suplementar CO2 al cultivo algal tiene una consideración de ingeniería clave. Cuando se habla de transferencia de CO2 desde

el aire al cultivo hay que tener en cuenta: el régimen de mezcla, la concentración de CO2 en el cultivo (del cual dependen el pH y la

alcalinidad) y el efecto causado por la reacción del CO2 disuelto con OH- para producir bicarbonato.

Entre las técnicas más sobresalientes de distribución de CO2 en el cultivo y eficientes en la distribución en términos de utilización por el

alga son:

a) Transferencia activa de gas a través de dispersión de pequeñas burbujas en el medio o rociando el liquido a través de la fase

gaseosa; y

b) Transferencia pasiva por creación de grandes áreas de contacto entre el CO2 atmosférico y la superficie del medio de cultivo.

El O2 atmosférico requiere de atención también en el cultivo, ya que en un experimento con diferencias de O2 en el medio de cultivo

demuestran que la eficiencia fotosintetica es incrementada al 14% sin presencia de O2, pero se reduce cerca del 35% cuando el medio es

saturado con el 100% de O2.

64

Figura 6.7. Flujómetro utilizado para suministrar dosis hasta 200

ml/min (PTFE)

c) Temperatura

La temperatura influencia la respiración y la fotorespiración más fuertemente que la misma fotosíntesis. Cuando la luz o el CO2 es

limitante para la fotosíntesis, la influencia de la temperatura es insignificante. Con un incremento en la temperatura, la respiración se

eleva significativamente, pero el flujo en ciclo de Calvin incrementa sólo marginalmente. Así, la eficiencia neta de fotosíntesis declina a

altas temperaturas. Este efecto puede empeorar en cultivos suspendidos por las diferencias en la baja solubilidad de CO2 y O2 al elevar la

temperatura.

65

Figura 6.8. Monitoreo de temperatura ambiental en sala de reactores.

d) Valor de pH, Salinidad y nutrientes

La desviación de óptimos pH, condiciones osmóticas y salinidad causarían reacciones fisiologicas a las microalgas y problemas de

productividad asociados. Estas condiciones son fácilmente controlables en un fotobiorreactor manteniendo promedios óptimos en cada

cultivo. La fuente de carbono parece ser la fuente más importante para algunos mixotrófico (uso de una fuente de carbono orgánico y

energía luminosa como fuente de electrones) o incluso microalgas heterotróficas (fuente de carbono orgánico en la oscuridad) sometidas

a sistemas de producción de biomasa.las fuentes de carbóno orgánico más comúnmente citadas son el etanol, el acetato y la glucosa. Un

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suficiente suministro de nutrientes para las microalgas es una precondición para una óptima fotosíntesis. El pH del medio de cultivo es

un factor importante en el cultivo algal y esta determinado por la solubilidad del dióxido de carbono y minerales en el medio. El valor de

pH influencia directa e indirectamente el metabolismo del alga, exhibiendo una clara dependencia del pH en el medio de crecimiento,

diferentes especies de algas varían según la respuesta al pH. Cyanidum por ejemplo, tiene un óptimo crecimiento a pH 2, mientras que

Spirulina crece bien a pH 9 y 11.

Figura 6.9. Sensor de pH, DO y Temperatura de tipo inalámbrico

usado en la Unidad de Microbiología Aplicada.

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e) Estrategias operacionales

Con adecuados monitoreos de parámetros de cultivo básicos de luz, CO2, O2, pH, y temperatura, es posible optimizar estos

parámetros hasta alcanzar el deseado producto final desde los fotobiorreactores. El producto final los fija el alga, el cual guía las

condiciones generales de crecimiento. El rendimiento y la productividad son términos que requieren cuidadosa definición. El

Rendimiento es la producción de masa por unidad de volumen, y se expresa en términos de gramos · Litro-1. La productividad es el

rendimiento por unidad de tiempo y se expresa en terminos de gramos · Litro-1 · hora-1 o gramos · Litro-1 · dia-1. Las condiciones que

producen máximo rendimiento son raramente las mismas condiciones que producen la máxima productividad. Optimizar los parámetros

metódicamente y controlar sus interacciones con el medio de cultivo para cada condición de cultivo algal es clave para alcanzar maximo

rendimiento y/o productividad. Un punto importante radica en esto, ya que permite identificar aquellos parámetros que no son

importantes para los máximos búscados, y así eliminar la necesidad redundante de experimentación.