manual de bioconversiones

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES INGENIERA BIOTECNOLGICA

PRCTICA 1

Determinacin de actividad enzimtica y efecto de la concentracin de enzima, pH, temperatura y fuerza

Inica en la actividad enzimtica (alfa-amilasa). La Prctica 1 incluye 6 mdulos de iniciacin de tcnicas analticas y manejo de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres ltimas estn enfocadas tema central relativa actividad enzimtica, parte fundamental del desarrollo del curso.

Contenido 1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2 1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. ............ 7 1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de

bioconversiones. ................................................................................................. 13 1.4 Determinacin de crecimiento celular por turbidimetra (D.O.), peso

seco, protena y cuenta directa en cmara de Neubauer. ........................ 14 1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales. ................... 17 1.6 Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas

elegidas. ................................................................................................................. 20 1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos

enzimticos: Amilasas. ...................................................................................... 23 1.8 Efecto de la concentracin de enzima y fuerza inica en la actividad de

la enzima elegida. ................................................................................................ 25 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica. ...................... 27 Cada mdulo se llevar a cabo en una o ms sesiones, las cuales sern determinadas por el profesor, requirindose para toda la prctica un mximo de 9 sesiones (cinco semanas)

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1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio.

USO DE MICROPIPETAS AUTOMTICAS En las prcticas de Bioqumica los volmenes de las soluciones que se necesitan medir son del orden de microlitros (L). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen principalmente del usuario y no de la micropipeta en s, a menos que esta no est bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones: La pipeta debe de mantenerse siempre en posicin vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. Tambin, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posicin vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga lquido succionado. Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado. En stas, no se deben ajustar volmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta. Los modelos que toman volmenes inferiores a 200 L usan puntas amarillas (o blancas), y las micropipetas que toman volmenes superiores a 200 L hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas que manejan volmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 L, pueden usar otro tipo de puntas especficas. La pipeta se agarra como si se tomara una empuadura. La parte superior debe de reposar sobre su dedo ndice (Fig. 1). Todas las pipetas tienen dos topes:

1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.

2) Segundo tope para expulsar de forma ms eficiente el volumen tomado y se usa solo cuando se est expulsando el contenido. .

Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomar un volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para sacar de forma ms eficiente el volumen establecido

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Primer Tope

Segundo Tope

1 2 3 4 Posicin Inicial

Fig. 1 Manera de asir una pipeta automtica y tomar una muestra (presin

del mbolo).

Tanto la presin como la liberacin del mbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alteraran los volmenes; as mismo se podra ensuciar la parte interna de la pipeta. Tambin se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no est bien ajustada a la pipeta. Procedimientos para medir correctamente un volumen con una micropipeta

1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que est dentro del intervalo establecido para la pipeta).

2. El volumen requerido se fija girando el mbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volmenes, para evitar descalibrar las pipetas).

Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado. 3. Colocar una punta desechable en el vstago de la pipeta (Fig. 3);

asegurando que est bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsin y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla.

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Figura 3 Figura 4

4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar hasta el primer tope.

5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la

superficie de lquido, manteniendo la pipeta en posicin vertical (Fig. 4).

6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin con el dedo pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el lquido.

7. Retirar la punta de la muestra.

8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,

colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solucin.

9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope.,

continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del lquido que est en la punta.

10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la

pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.

11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el mbolo suba por s solo).

12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando

de ella, (Fig. 5).

En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.

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Figura 5 Figura 6

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm

TRABAJO PRCTICO

Cada equipo realizar lo siguiente: 1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 L. Seleccionar el

volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada.

2. Tomarla muestra indicada como se indic anteriormente.

3. Transferir el lquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir la muestra, depositar la muestra segn el procedimiento ya indicado.

4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando

encima del recipiente la punta y presionando el pistn ubicado en la parte inferior, atrs del pistn de succin. Cada vez que se agregue un volumen seleccionado, se registrar su peso en la balanza (dependiendo de la sensibilidad de la balanza), cada volumen se har por duplicado.

IMPORTANTE Cuando se vaya a pipetear solvente voltiles, como diclorometano, acetona, cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posicin inicial. Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma. Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrar aire. Esto indica que an no se haba tomado todo el volumen y se debe repetir todo el procedimiento.

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Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas as como cambiar los volmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2:

Tabla 1. Volmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 L 200 L 20 L 600 150 16 200 100 12 100 50 8

4 1

Tabla 2. Volmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 L 200 L 20 L

600 150 20 200 100 10

Practicar con el profesor la toma de muestras voltiles

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1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. Fotometra La fotometra o "medida de la luz" es un mtodo ptico de anlisis dentro del cual se encuentran la colorimetra y la espectrofotometra, que miden la cantidad de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente. La luz es una forma de energa electromagntica, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc. Que es irradiada a partir de una fuente energtica en lneas o rayos virtualmente rectos. Se propaga en el vaco sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria rectilnea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su direccin de desplazamiento y cuya longitud de onda se sita entre 380 y 780 nanmetros. Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm. Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiacin ultravioleta (UV). Las medidas de absorcin de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la ley de Beer. Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. I0 I = I0 10 -K.L log = K L I donde:

I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente K = coeficiente de extincin L = espesor de capa K es el coeficiente de extincin definen cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentracin molar. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentracin de la sustancia absorbente en el medio. I0 I = I0 10 K.C log = K C I donde C = concentracin de la sustancia absorbente

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Sol.Absorbente concentracin C

Rayo incidente Rayo emergenteLuzmonocromtica

Intensidad I0 Intensidad IL

Espesor de la solucin Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromtica a travs de una solucin Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer: I0 I = I0 10-CL log = c L I donde = coeficiente de extincin molar es el coeficiente de extincin cuando la solucin contiene un mol por litro. El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como un porcentaje I - cL I T = =10 %T = x 100 I0 I0 I0 La expresin log se conoce como absorbancia (A) o densidad ptica (DO) I0 A = D.O. = log = c L ; para L=1, A = c I T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFTOMETRO Espectrofotmetros: Los mtodos fotomtricos de anlisis utilizan los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con las molculas. Los aparatos de medicin de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan "espectrofotmetros" y estn constituidos de forma general de (Fig 2): Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces monocromticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable, pasando a travs del mismo slo luz de una determinada longitud de onda. La utilizacin de la luz monocromtica o de un intervalo pequeo de longitudes de onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas condiciones.

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La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide sobre el fototubo donde es detectada. La seal se enva a un registrador que convierte la seal a un registro anlogo, digital o grfico. En algunos colormetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a , la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.

FototuboColimador

Celda con muestra

Registro

Fuente de luz

Monocromador

%T 0 100A 0

Figura 2. Esquema de las partes bsicas de un espectrofotmetro Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada. Colormetros: Los mtodos colorimtricos son una aplicacin de la espectroscopa y se basan en la medida de la absorbancia de una solucin coloreada en la regin visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele ser una lmpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimtricamente, mediante reaccin con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la regin visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus posibilidades de utilizacin.

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CAPACITACIN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTMETROS

Actividad en laboratorio: Los maestros de laboratorio indicarn cmo operar y programar los equipos. El alumno deber anotar en su bitcora cada paso y realizar un diagrama de flujo de los pasos, as como las consideraciones que hay que tener en el manejo, mantenimiento y limpieza del equipo. Existen diferentes modelos de espectrofotmetros en los laboratorios de docencia, de investigacin y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio se utilizarn dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno. Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o desechables de plstico, existen de diferentes volmenes de operacin 4, 2 y 1 mL. Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.

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CENTRFUGA BECKMAN J2-MC

Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.

Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL JA-14 para 6 tubos de 250 mL. Asegrese de equilibrar los tubos de centrfuga con la muestra en una balanza. Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua. Para abrir: Mueva el interruptor a la posicin ON. Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)

Para programar: Oprima ROTOR e introduzca el nmero 14 20, dependiendo del tipo de

rotor a usar. Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades

mximas para cada rotor, para esto existe una tabla) Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min). Oprima TEMP y teclee la temperatura ( C) Al terminar la seleccin, oprima ENTER.

Para operar: Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias

(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso Coloque la tapa del rotor. Cierre la centrfuga. Permita que el equipo enfre a la temperatura indicada antes de comenzar

el programa. Oprima el botn START para iniciar el programa. Se puede abortar oprimiendo el botn STOP. NOTAS: La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido. Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cmara

de la centrfuga se deshiele. Asegrese de secar la cmara. Proceda a cerrar el equipo.

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CENTRFUGA HERMLE Z300

Antes de usar, siempre regstrese en la libreta u hoja de control del equipo. Cuenta con tres Rotores para: 24 tubos Eppendorf de 1.5 mL

12 tubos Falcon de 15 mL 6 Tubos Falcon de 50 mL

Para cambiar rotor: Utilice la llave del equipo. La rosca es izquierda. Girar a la derecha para aflojar,

Girar a la izquierda para apretar. Para abrir: Oprima el botn de apertura. El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) est encendido, seal que el rotor se ha detenido y que es posible abrir. Precaucin al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla lentamente. Para programar: Mantener oprimido el botn preset Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla Para operar: Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en

posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos encontrados tengas el mismo peso.

Coloque la tapa del rotor (si ste posee una). Cierre la centrfuga. Oprima el botn start para iniciar el programa. Se puede parar oprimiendo el botn stop. En caso de que, por alguna falla en el suministro elctrico, la pantalla se muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conctelo nuevamente. Proceda con la programacin.

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1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones. Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario. Reactivo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) 1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta obtener un volumen final de mximo 50 mL. 2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada. 3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada. 4. Aforar a 100 mL con agua destilada. 5. Guardar en obscuridad y en frasco mbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de agua a la sal por que dar un volumen mayor) . Solucin de Almidn 1% (p/v) Suspender 1g de almidn en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el cual deber estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en bao de agua a 60 C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidn. Solucin de alfa-amilasa La concentracin de enzima ser indicada por el profesor y ser en mg de protena o enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0. Solucin de antrona Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al 75%. Para preparar el cido al 75%, se debe realizar en la campana de extraccin, en un bao de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el bao e ir agregando lentamente por las paredes el cido. Usar material de seguridad, lentes y guantes.

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1.4 Determinacin de biomasa microbiana por turbidimetra o Densidad ptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cmara de Neubauer. La determinacin biomasa microbiana puede realizarse por varios mtodos tanto directos como indirectos, tres de estos son: 1. Densidad ptica (D.O.) o turbidimetra 2. Peso seco 4. Cuenta en cmara de Neubauer PARTE EXPERIMENTAL 1) Densidad ptica A partir de muestras obtenidas de una cintica de crecimiento, es decir del medio de cultivo a travs del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo concentrado), obtener la densidad ptica de las muestras leyendo a 600 nm. Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; as mismo, ste se debe usar para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1. Se entregar un cultivo microbiano, el cual se leer la DO a 600 nm y a partir de la lectura se establecern 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la densidad ptica vs. dilucin. La DO se puede graficar vs concentracin de protena extracelular, peso seco, numero de clulas, protena celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas 2) Peso seco a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60C por 24

horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar. b) Tomar una alcuota de 10 a 15 mL de la suspensin celular (de cada dilucin

hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrfuga. c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min.

Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar. d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua

destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada. e) Dejar las charolas en una estufa a 60C por 24 h o hasta que la pastilla este

completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola. f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada

charola. g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de clulas/mL.

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3) Cuenta directa en Cmara de Neubauer La cmara de Neubauer es una cmara adaptada para ser utilizada en un microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, con el fondo marcado con una una cuadrcula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 reas de 1mm2 cada una. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie de cada rea y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitros). Las diferencia entre las reas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo que permite en ese orden contar clulas de mayor a menor tamao, contando bacterias y levaduras en el rea 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se observa en 40 o 100X

Se deben contar el nmero de clulas de cuatro o cinco cuadros de un rea, la concentracin en la suspensin celular ser:

Cl/mL = N X 104 X F (ecuacin 1) Donde: N: La media de las clulas contadas (suma de clulas contadas por subdivisin/Nmero de subdivisiones contadas) 25: es el nmero de cuadrados en cada grilla. 104: factor para pasar el nmero de clulas en el cuadrado central (volumen = 0.1mm3 = 0,1L) a nmero de clulas por mL (1000mm3 = 1000L=1 mL) F: factor de dilucin

Figura 1. Grilla de conteo de la cmara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,

2007).

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El conteo con la cmara se lleva a cabo de la siguiente forma:

a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cmara de Neubauer. b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura

1. c) Agitar la suspensin celular para tener una muestra homognea. d) Con ayuda de una pipeta serolgica de 1 mL o con una pipeta

automtica de 100 L, tomar 0.1 mL de la suspensin y colocar la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se forman burbujas se debe repetir la operacin, lavando y secando la cmara previamente.

e) Colocar la cmara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x.

f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrcula de 25 cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar el nmero de clulas de 4 o ms subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma clula u omitir alguna.

g) En caso de que el nmero de clulas sea muy elevado y se dificulte su conteo, ser necesario diluir la suspensin en una proporcin conocida, la que deber ser tenida en cuenta en la estimacin final.

h) Calcular el nmero de clulas con la ecuacin 1 Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).

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1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales.

1) Azcares reductores

Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf, posteriormente adicionar 0.1, de la solucin problema. Se puede homogeneizar con la punta.

Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran durante la ebullicin.

Poner a bao mara (ebullicin) por 5 min. Llevarlo despus a hielo por 10 min. Aadir a 1mL de agua destilada. Agitar en el vortex y dejar hasta que est a temperatura ambiente,

posteriormente: Leer la absorbencia a 540nm.

1.1 Curva tipo de maltosa. La curva patrn se realiza con maltosa en un rango de concentracin de 0 a 2.0 g/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de acuerdo a la tcnica de azcares reductores.

Tabla 1. Diluciones para la curva patrn de maltosa.

Tubo

Concentracin de maltosa en la

muestra (g/L)

Volumen de la solucin de

maltosa de 2 g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.00 1.00 2 0.2 0.1 0.9 3 0.4 0.2 0.8 4 0.6 0.3 0.7 5 0.8 0.4 0.6 6 1.0 0.5 0.5 7 1.2 0.6 0.4 8 1.4 0.7 0.3 9 1.6 0.8 0.2 10 1.8 0.9 0.1 11 2.0 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.

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Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas (ejey) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de maltosa determinada en g/L.

Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b

En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm. x representa la concentracin de maltosa determinada en g/L.

La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.

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2) Azcares Totales por el mtodo de Antrona

Solucin de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100 Ml con H2SO4 al 75%. (ver prctica 1.3)

Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente

adicionar lentamente 1 mL de solucin de antrona, agregar la antrona lentamente, es una reaccin exotrmica. Cuando este mtodo se realiza con volmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en frio (en bao de hielo porque es muy exotrmica)

Agitar en Vortex y luego llevar a ebullicin en bao Maria durante 10 min (cuidado de que no se abras los tubos, es muy cido, se recomienda sellar las tapas con una tira de Egapack).

Enfriar en hielo (para detener la reaccin). Posteriormente sacar del hielo y dejar a temperatura ambiente

Leer a 650 nm (cuando la muestra ya est a temperatura ambiente). 2.2 Curva tipo de sacarosa.

La curva patrn se realiza con sacarosa en un rango de concentracin de 0 a 100 mg/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de acuerdo a la tcnica de antrona.

Tabla 2. Diluciones para la curva patrn de sacarosa.

Tubo

Concentracin de sacarosa en la

muestra (mg/L)

Volumen de la solucin de sacarosa

100 m g/L (mL)

Volumen de agua destilada

(mL)

1. (Blanco) 0.0 0.0 1.0 2 10 0.1 0.9 3 20 0.2 0.8 4 30 0.3 0.7 5 40 0.4 0.6 6 50 0.5 0.5 7 60 0.6 0.4 8 70 0.7 0.3 9 80 0.8 0.2 10 90 0.9 0.1 11 100 1.0 0.0

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.

Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b

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1.6 Determinacin de protena. Objetivo Determinar la concentracin de protena de una solucin enzimtica con el mtodo de Bradford. Introduccin La determinacin de la concentracin de protenas puede realizarse por varios mtodos, entre ellos: 1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su 280 [g-1L

cm-1], por ejemplo para la albmina de suero bovino (BSA) su 280 [g-1L cm-1] es de 0.667. *280: coeficiente de extincin a 280 nm (en la regin Ultravioleta del espectro de luz)

Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albmina de suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3: Tabla 3. Curva patrn de BSA para lectura en 280 nm.

Sol. de BSA 1000 g/mL

(mL) 0.0 0.10 0.2 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.0

Agua destilada (mL) 1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.0

Concentracin de BSA ( g/mL)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a 280 nm ajustando el equipo con un blanco de reactivos (el que no contiene protena). Con los datos graficar, realizar una regresin lineal y obtener la ecuacin de la recta, con la que se calcular la concentracin de la protena problema.

20



2. Mtodo de Bradford: El mtodo de Bradford involucra la unin del azul brillante de Coomassie G-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en el mximo de absorcin de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que permite la cuantificacin. Dicha unin es independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. La concentracin de protena se determina por medio de una curva tipo con Seroalbmina Bovina (BSA) y el reactivo de Bradford. Desarrollo experimental Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 g/mL, a partir de una solucin de 200 g/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4 para obtener un volumen final de .02 mL de muetra Tabla 4. Curva Tipo de albmina de suero bovino (BSA), para determinacin de protena por Bradford

(BSA) 200 g/mL (mL) 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25

Agua destilada (mL) 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0

Concentracin de BSA (g/mL)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el blanco de reactivos o agua (el que no contiene protena) La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando en la ecuacin obtenida con la curva tipo de seroalbmina bovina a diferentes concentraciones. PROBLEMA: Determinar la concentracin de una solucin de tripsina por espectrofotometra a 280 nm. .

A partir de una solucin que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada) hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5 mL de la solucin de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua respectivamente) y leerlas a 280 nm.

Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva, tomar tres de ellas para hacer la determinacin de la concentracin por el mtodo de Bradford, considerando la sensibilidad de este mtodo.

21



Informe 1. Establecer la curva patrn de protena con Bradford y otra por espectrofotometra a 280 nm. 2. Calcular la concentracin de protena de la solucin de tripsina usando los dos mtodos de determinacin de protena. 2. Discutir los resultados obtenidos. Cuestionario 1. En qu se basa el mtodo de Bradford? 2. En qu tiempo hay que leer la muestra en el mtodo Bradford y por qu? 3. Cul es la ventaja del mtodo de Bradford? 4. Qu otros mtodos de determinacin de protena existen, en que se basan

y su intervalo de sensibilidad?

Referencia.

Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

22



INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA 1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos enzimticos: Amilasas. OBJETIVO Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa y calcular las unidades de actividad enzimtica. DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Preparar una solucin de almidn: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidn en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se desnaturaliza por calor en un bao de agua a 60 C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidn. Reactivos:

Almidn 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS -amilasa Reactivo de Bradford 2. Realizar curva tipo de maltosa por el mtodo de azcares reductores DNS.

Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por mtodo de DNS

(prctica 1.5) 3. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6)

a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6.

4. Cintica de hidrlisis del almidn: Tener antes de iniciar un el bao de agua en ebullicin y otro de hielo. 1) Para cada muestra a la que se determinar actividad, tener listo un tubo

eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos). 2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solucin

de almidn 1% a 20C.. 3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al

testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente

23



0.1 mL de la mezcla de reaccin (otra persona), transferirlo rpidamente a un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (ste ser el testigo). Realizar: un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones 0.1 mL de solucin de almidn.

4) Dejar que la reaccin se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos) 0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reaccin a uno de los tubo que ya contiene 0.1 mL del reactivo DNS.

5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo segn la tcnica de DNS: Poner en bao de agua a ebullicin durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no entre agua a los tubos.

6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un bao de agua fra durante 10 min.

7) Posteriormente aadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solucin. 8) Se homogeniza la solucin invirtiendo con la mano los tubos. 9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,

determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y 6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reaccin enzimtica. .

10) Se utiliza la curva patrn de DNS realizada con maltosa para determinar la concentracin de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL de la muestra.

11) Expresar la actividad enzimtica en unidades de actividad de alfa amilasa/mL. Considerar la siguiente definicin de una unidad de actividad alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de almidn despus de 1 min de reaccin con la enzima a 20C y pH 6.9

III. INFORME:

1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentracin de maltosa y determinar la ecuacin de la regresin lineal.

2. Calcular la actividad enzimtica en unidades de actividad enzimtica (U) y actividad especfica (Uesp). [ ] [ ]

tproductoproductoU tt 01 = [ ] [ ]( )[ ]protenat

productoproductoU ttesp 01=

3. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de

reaccin. 4. Cules son los productos de esta reaccin? 5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay

diferencias.

24




UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA 1.8 Efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica de una amilasa. OBJETIVO Determinar el efecto de la concentracin de enzima en la actividad denzimtica. DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparacin del sustrato: Almidn al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M preparado como se indic anteriormente. Reactivos:

Almidn 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS -amilasa Reactivo de Bradford

1. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin

enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6.

2. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de la reaccin

enzimtica. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6,

adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes concentraciones.

b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin

c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reaccin) en un bao o termomixer a 25C.

d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.

25



e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la prctica 1.5 y 1.7.

La reaccin se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reaccin y tempertaura constante, siendo la nica variable la concentracin de enzima .

Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentracin de la

enzima en la actividad enzimtica .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Soluciones de Amilasa (mg/mL)

*

0.25

0.5

1.0

2.0

3.0

Volumen de Sol. Sustrato

(mL) 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95

Vol. de sol. de enzima en PO4 pH 7.0, 0.1M

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

* 3P, significa 3 tubos Problema *Para cada concentracin de enzima se hace un testigo, para lo cual

inmediatamente despus de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo con DNS.

Realizar el blanco con sol de almidn Procedimiento: A INFORME: 1. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs concentracin de

enzima. 2. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por todos

los equipos del grupo.

26




UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica. OBJETIVO Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica de una enzima: -amilasa.

1. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin

enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 2. Efecto de la temperatura en la actividad cataltica de las enzimas.

a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 7, adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidn al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada ponindolos en un bao mara.

Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la

temperatura en la actividad enzimtica .

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

Temperatura de reaccin

(C)

Uno por cada temperatura

25

35

45

55

65

Sol. de Almidn 1.0 %

(mL) 0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

*Sol. de Enzima en regulador PO4 pH 7.0

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

*-Amilasa: 1.0 mg/mL 3P, significa 3 tubos Problema

27




c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reaccin) en un bao a cada temperatura.



La reaccin se llevara cabo a tiempo constante de reaccin y concentracin de enzima constante, siendo la nica variable la temperatura de reaccin. 3. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin

enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a cada solucin de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 4 Efecto del pH en la actividad cataltica de las Enzimas Reactivos: Almidn 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH Regulador de Acetatos pH 5.0 Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0 Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el

profesor. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 8,

adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidn al 1%).


c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reaccin).



28



29

Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto del pH en la actividad enzimtica.

Tubo

Testigo*

3P1

3P2

3P3

3P4

3P5

3P6

3P7

pH

5.0

6.0

7.0

7.5

8.0

9.0

10.0

Sol. de almidn al 1.0

% (mL)

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

0.95

Enzima + regulador al pH indicado

(mL)

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

3P, significa 3 tubos Problema. * Para cada pH se hace un testigo. Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la concentracin de enzima. INFORME:

1. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de reaccin.

2. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la reaccin.

3. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por todos los equipos del grupo.

1UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

Academia de Biotecnologa. Asignaturas:

Profesores: Luis C. Fernndez Linares, Mara del Carmen Oliver Salvador,

Determinacin de constantes cinticas, Km y Vmax y medicin de la actividadenzimtica de la invertasa

El objetivo de la prctica es determinar el efecto de la concentracin del sustrato en lavelocidad las reacciones enzimticas, determinando las constantes cinticas, Km y Vmax, dela invertasa.

Las invertasa hidroliza la unin glicosdica de la sacarosa. La sacarosa es un disacridocompuesto de una molcula de -D-glucosa y una molcula de -D-fructosa, ligadas por unenlace -1,4-glicosdico. Cuando este enlace es roto en una reaccin de hidrlisis, segenera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa.

Sacarosa + H2O ---> glucosa + fructosa

El nombre oficial de la invertasa es beta-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26), lo que implica quela reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis del grupo terminal no reductor de lasacarosa. La invertasa es utilizada principalmente en confitera, donde la industria dealimentos prefiere ms a la fructosa que a la sacarosa, debido a que es mucho ms dulce yno cristaliza tan fcilmente.

La invertasa es producida por una amplia gama de microorganismos que pueden utilizar lasacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada principalmente porcepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Inclusodentro del mismo cultivo de levadura, la invertasa existe en ms de una forma. Por ejemplo,la invertasa intracelular tiene un peso molecular de 135,000 Da, mientras que la variedadextracelular tiene un peso molecular de 270,000 Da.

A diferencia de la mayora de otras enzimas, la invertasa exhibe una actividad relativamentealta en un amplio intervalo de pH (3.5-5.5), con el ptimo cercano a pH 5.0; por otro lado latemperatura ptima es de aproximadamente 55 C.

Parte experimental:Preparacin de reactivos:

Sustrato: preparar sacarosa (30.0 g/L), disolver el sustrato en agua, la mitad del volumenque se vaya a preparar y se afora con regulador de acetatos 0.05M pH 5.0. Preparar 50 mLde sustrato.Enzima: invertasa 0.4 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0.

Diluciones de sutrato:Obtencin de concentraciones de sacarosa: Realizar diluciones con regulador de acetatos

0.025 M de 0 a 30 g/L

2Tabla 1. Preparacin de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L)(mL)

Acetatos 0.025M(pH 5.0)(mL)

Concentracin finalde sacarosa (g/L)

0 10 0.01 9 3.03 7 9.04 6 12.05 5 15.08 2 24.010 0 30.0

Preparar 10 ml de cada concentracin por grupo, dividir las soluciones por equipos.

Procedimiento:

La prueba se realizar por triplicado con un blanco para toda la prueba y un testigo paracada concentracin.

1. Colocar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin y de acuerdo a la tabla 2, en untubo eppendorfd, se deja equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.

2. Agregar 0.05 mL de la enzima y agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder lareaccin durante 5 min.

Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en C(temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar elexperimento).3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (5 min), tomar un alcuota de 0.1 mL ytransferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrlisis enzimtica).*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reaccin e inmediatamente el reactivode DNS4. Los tubos se calientan a ebullicin en bao Mara durante 5 min. Se enfran en bao dehielo, adiciona 1.0 mL de agua y se leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra unblanco de reactivos (0.1 mL de regulador de acetatos 0.25 M pH 5.0 + 0.1 de DNS + 1 mLde agua).5. Tomar la lecturas de Abs (tabla 2) del mtodo de azucares reductores y determinar laconcentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en laboratorio o seproporcionar en funcin del tiempo).

6. Determinar la concentracin de protena de la solucin de invertasa por el Mtodo deBradford

Tabla 2. Efecto de la concentracin de la sacarosa en la velocidad de reaccin de lainvertasa.Sacarosa

(g/L)Sacarosa

(g/L)(mL)

Invertasa(0.6 mg/mL)

(mL)

Acetatos0.025M, pH

5.0(mL)

Absorbancia(540 nm)

0.0 (blanco) 0.0 0 1.03.0 0.95 0.05 --9.0 0.95 0.05 --

12.0 0.95 0.05 --15.0 0.95 0.05 --24.0 0.95 0.05 --30.0 0.95 0.05 --

3Los valores de A540nm netos son: (A540nm Problema)- (A540nm Testigo) = A540nm Neto

La velocidad se determinar para cada concentracin de sustrato, sern reportadasen mmoles o moles de producto formado / min; as mismo determinar la actividadespecfica de la enzima para concentracin de sustrato.

Determinacin de las constantes cinticas de una enzima.La magnitud de Km y Vmax vara segn el tipo de enzima y la naturaleza del sustrato. Estambin una funcin de la temperatura y del pH. Se determinarn las constantes cinticasKm y kcat de la invertasa utilizando como sustrato sacarosa con las velocidades iniciales delas reacciones a cada concentracin de sustrato, determinadas con los datos de susexperimentos antes descritos. El clculo de las constantes se har en forma comparativausando tres mtodos grficos que estn basados en las formas lineales de la ecuacinMichaelis-Menten. Estos son:

Lineaweaver-Burk: 1/vo versus 1/[S] o

Agustinsson: [S]/vo versus [S] o

Eadie Hofstee: vo versus v/ [S] o

Nota: Considerar la concentracin real o final de la sacarosa que se utiliza en la reaccin.

INFORME:1. Hacer la grfica de velocidad vs concentracin de sustrato.

2. Hacer las grficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y Calcule Km yVmax,

3. Determinar la constantes catalticas de la invertasa para estas condiciones dereaccin

4. Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.

Referencia.

maxmax

1VKmS

VVS

maxVSVKmV

maxmax

1][

11VSV

KmV



1

PRCTICA 3 INMOVILIZACIN DE ENZIMAS.

OBJETIVOS 1. Inmovilizar una enzima por atrapamiento en alginato. 2. Determinar la actividad enzimtica y cinticas enzimticas de la invertasa libre e inmovilizada. 3. Determinar el rendimiento o porciento de inmovilizacin INTRODUCCIN. Tcnicas de inmovilizacin. La inmovilizacin se define como el proceso por el cual el movimiento en el espacio de las clulas, enzimas, orgnulos, etc. se ve restringido total o parcialmente por medio de un soporte o una matriz. En la industria se usan frecuentemente enzimas o clulas inmovilizadas debido a que stas se pueden rehusar o usar en procesos continuos. Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son: 1. El aumento de la estabilidad de la enzima; 2. La reutilizacin de la enzima, por lo que disminuyen los costos del proceso. 3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son: 1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 2. No hay heterogeneidad en la distribucin de la enzima en el soporte. 3. Prdida de actividad de la enzima inmovilizada. 4. Mayor costo en relacin a la enzima libre. En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes categoras: Retencin fsica y Unin qumica. Mtodos de inmovilizacin de enzimas por retencin fsica Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros entrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen



2

ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena. Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos: Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos Reactores de membrana: Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos: 1. Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.)



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2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc) protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc). Adsorcin En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. Reticulado Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas (7). El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en: 1. Aplicaciones analticas: biosensores 2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas 3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.



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MATERIAL Y EQUIPO. Materiales: Agitadores magnticos Coladores de acero inoxidable Cristalizador Esptula Matraces Erlenmeyer Vasos de precipitados Agitador magntico Jeringa desechable de 20 mL

Equipos: Balanza Espectrofotmetro Potencimetro Vrtex Soporte universal Parrilla

Seccin experimental. Inmovilizacin de enzimas por atrapamiento con alginato de sodio. Soluciones (Preparar soluciones por grupo): 1) 5 mL de solucin de invertasa de levadura (X mg/mL) en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 2) 15 mL de alginato de sodio al 2% (p/v) en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 3) 100 mL Cloruro de calcio 1.0% 4) 20 mL Citrato de sodio 0.5 M o fosfato de sodio sodio monobsico 0.5 M 5) Sacarosa al 3% en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0 Parte experimental Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad). 1. En un vaso de precipitado de 50 ml mezclar 5 mL de enzima concentrada con 15 mL de sol. de alginato 2% que se encuentre a 40 C. Agita la mezcla alginato-enzima para homogenizar y lograr una temperatura homognea, de unos 40C. 2. Montar un sistema de inmovilizacin (Fig.1), que tenga con una jeringa con aguja con punta roma (sujeta al soporte universal para mantener la altura, entre la aguja y la sol de CaCl2, constante) y un vaso con solucin de CaCl2, 1%; a temperatura ambiente; con agitacin constante y suave, por medio de una barra magntica. 3. Llenar la jeringa (quitar la aguja y succionar la solucin alginato-enzima tirando del mbolo y poner de nuevo la aguja), fijarla al sistema, a un centmetro de distancia del CaCl2, e ir descendiendo, de forma constante, el embolo para obtener gotas homogneas, las cuales se irn depositando en la solucin e CaCl2. Contar el nmero de perlas de alginato formadas por cada mL y sacar un promedio final.



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El goteo debe realizarse a la altura precisa (alrededor de 1cm), de lo contrario se formar lentejas al golpear con la superficie lquida (con un goteo desde una distancia mayor) o se formarn esferas con una protuberancia (con un goteo desde una distancia muy corta que no permita que se logre la esfericidad)

5. Dejar estabilizar el gel durante 20 min, sin agitacin y a temperatura ambiente. 6. Pasar las perlas y un poco de CaCl2 a un tubo falcon, etiquetar y conservar en refrigeracin.

Figura 1. Sistema para inmovilizacin de enzimas por atrapamiento.

NOTA IMPORTANTE. Se debe contar con la suficiente enzima libre e inmovilizada para realizar esta prctica y la prctica 4: Determinacin de Vmax y Km de una enzima libre e inmovilizada. Liberacin de la enzima del soporte de inmovilizacin, para determinar concentracin de la misma. Tomando en consideracin la cantidad de esferas que se obtuvieron por mL, se toma ese nmero de esferas, entre 50 y 60 esferas que correspondan al mililitro. Se homogenizan las esferas en 4 mL de una solucin de citrato de sodio 0.5 M, durante 1 min con ayuda de un agitador vrtex (Durn, 1997). A la solucin resultante se le determinar protena por Bradfor, realizar el blanco con la solucin que se utiliz para disolver las esferas de alginato. (Si en la



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determinacin de Bradford se solidifica el alginato se puede retirar cuidadosamente

con una aguja). NOTA: Se requiere conocer la actividad (y la concentracin de protena) de la solucin enzimtica, por lo que se necesita preparar una cantidad extra. Se debe de la concentracin de protena de la solucin de cloruro de calcio, para poder saber la cantidad de enzima que no qued inmovilizada por diferencia. Posteriormente, se debe determinar la Actividad enzimtica y Actividad enzimtica especfica y constantes cinticas, de la enzima libre e inmovilizada (prctica 2) y comparar los resultados de enzima libre y enzima inmovilizada. Consideracin: Esta segunda parte, que es inicio de la Prctica 4, puede dejarse pendiente, si no es posible realizarlo en las 3 horas que dura la sesin. Determinacin de Actividad enzimtica y constantes cinticas (tiempo cero de estabilidad, parte inicial de la prctica 4): Actividad enzimtica de la invertasa libre con sacarosa al 3.0 %, a temperatura Ambiente, tiempo 5 min, por triplicado y testigos. (0.05 mL de enzima + 0.95 mL de solucin de sacarosa) Actividad enzimtica de la invertasa inmovilizada sacarosa al 3.0 %, a temperatura ambiente, tiempo 5 min, Para la enzima inmovilizada seguir el mismo protocolo de la libre y sustituir los 0.05 mL de enzima por lo equivalente en nmero de perlas (de acuerdo a los resultados de nmero de perlas formadas por mL). Determinar la concentracin de protena, por el mtodo de Bradford y por triplicado. de: a) invertasa libre, b) enzima inmovilizada (la enzima liberada) y c) de la solucin de cloruro de calcio residual, Usar como blanco buffer, sol de citratos y sol. de cloruro de calcio, respectivamente Guardar la enzima libre e inmovilizada en refrigeracin, con stas se determinar nuevamente la actividad a diferentes tiempos, y se compararn los tiempos el inicial (primera sesin) y los otros tiempos, para determinar el efecto de la inmovilizacin en la estabilidad de la enzima (Prctica 4). Procedimiento para determinar la actividad enzimtica y constantes cinticas: Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las diferentes concentraciones de sustrato.



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Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada (nmero de perlas necesarias para igualar la concentracin de invertasa libre) Diluciones de sustrato: Tabla 1. Preparacin de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L)

(mL)

Acetatos 0.025 M,

pH 5.0 (mL)

Concentracin de sacarosa

(g/L) 0 10 0.0 1 9 3.0 3 7 9.0 4 6 12.0 5 5 15.0 8 2 24.0

10 0 30.0 La prueba se realizar por triplicado con un blanco y un testigo para cada concentracin de sustrato. 1. Colocar en 4 tubos eppendorf el nmero de perlas correspondiente a 0.05mL de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco por concentracin de sustrato (Tabla 1). 2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin (tabla 1), agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la reaccin durante 5 min. Excepto el testigo que es tiempo cero. Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el experimento). 3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (0 o 5 min), tomar un alcuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrlisis enzimtica). *testigo se adiciona la enzima e inmediatamente se transfiere 0.1 mL al reactivo de

DNS

4. Los tubos sellados con pelcula plstica, se calientan a ebullicin en bao Mara durante 5 min. Se enfran en bao de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra cada blanco (solucin de sacarosa en buffer de acetatos)



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5. Tomar las lecturas de Abs del mtodo de azcares reductores y determinar la concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en laboratorio o se proporcionar en funcin del tiempo). Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes tiempos con grficos y cuadros adecuados. Informe:

1) Calcular la actividad enzimtica de la enzima libre y de la enzima inmovilizada en el da 1.

2) Determinar el % de inmovilizacin de la enzima (la enzima que no se inmoviliza se queda en la solucin de cloruro de potasio).

3) Determinar la estabilidad de la enzima libre e inmovilizada a los dos tiempos en das.

4) Calcular las constantes cinticas de la enzima libre e inmovilizada. 5) Incluir en el informe una Introduccin, el fundamento y el objetivo de esta

prctica. 6) Comparar los parmetros cinticos de la enzima inmovilizada contra la

libre.



PRCTICA 4

Estabilidad de una enzima inmovilizada y libre, determinacin de

Vmax y Km. OBJETIVOS

1. Establecer el efecto de la inmovilizacin en la estabilidad de una enzima. 2. Determinar el efecto de la inmovilizacin en la constante de Michaelis-

Menten (Km) y la velocidad mxima (Vmax.) y su relacin con la estabilidad.

INTRODUCCIN La inmovilizacin puede altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del microentorno. Efectos en la estabilidad Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones: 1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a soportes activados. La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima. 2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autolisis. 3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio. 4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxgeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa

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zona que en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto tampn o buffer de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, la hidrofilia del soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformacin activa. Efectos en la actividad enzimtica Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que:

1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio activo est impedido,

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del sitio activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima,

3. La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin de la enzima.

Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios (disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a efectos difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno. 1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo externo e interno.

a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria (capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las proximidades de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el resto de la disolucin, puesto que existe un gradiente de concentracin a travs de la zona de difusin. Por tanto, los valores de km para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (km); b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.

2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en disolucin.

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3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto estrico se puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzima-soporte ms largo 4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendr en su microentorno una concentracin mayor de iones hidrgeno que en el medio de reaccin. Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente. MATERIALES

Materiales: o Esptulas de acero inoxidable. o Matraces Erlenmeyer. o Flotadores o Gradillas para microtubos o Termmetro o Tubos eppendorf 1.5 mL

Equipos: o Espectrofotmetro. o Refrigerador comercial. o Vrtex. o Parrillas con agitacin o Pipetas de 100, 200 y 1000 L

PARTE EXPERIMENTAL: Se realizar en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la prctica 3, en al cual se inmoviliz y se conserv la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima inmovilizada. Determinacin de Actividad enzimtica y constantes cinticas: Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las diferentes concentraciones de sustrato. Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada (nmero de perlas necesarias para igualar la concentracin de invertasa libre)

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Diluciones de sustrato: Tabla 1. Preparacin de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L) (mL) Acetatos 0.025 M, pH 5.0 (mL)

Concentracin de sacarosa (g/L)

1 9 3.0 3 7 9.0 4 6 12.0 5 5 15.0 8 2 24.0 10 0 30.0

La prueba se realizar por triplicado con un blanco y un testigo para cada concentracin de sustrato. 1. Colocar en 4 tubos eppendorf el nmero de perlas correspondiente a 0.05mL de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco por concentracin de sustrato (Tabla 1). 2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin (tabla 1), agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la reaccin durante 5 min. Excepto el testigo que es tiempo cero. Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el experimento). 3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (0 o 5 min), tomar un alcuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrlisis enzimtica). *testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reaccin e inmediatamente el reactivo de DNS 4. Los tubos sellados con pelcula plstica, se calientan a ebullicin en bao Mara durante 5 min. Se enfran en bao de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra cada blanco (solucin de sacarosa en buffer de acetatos) 5. Tomar las lecturas de Abs del mtodo de azcares reductores y determinar la concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en laboratorio o se proporcionar en funcin del tiempo). Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes tiempos con grficos y cuadros adecuados.

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ANLISIS DE RESULTADOS

a) Calcular la actividad enzimtica de la enzima libre y de la enzima inmovilizada en el da 2 y 10.

b) Determinar los parmetros cinticos de la enzima inmovilizada y la enzima libre dos y diez das despus de la inmovilizacin.

c) Determinar la actividad enzimtica de la enzima inmovilizada contra la libre dos y diez das despus de la inmovilizacin

d) Comparar los parmetros cinticos y actividad enzimtica de la enzima inmovilizada contra la libre el primer da (practica 3), a las 48 horas y a los 10 das.

15. Adiestramiento en la operacin de un biorreactor de laboratorio.5.1Manejo de un biorreactor5.2 Preparacin y esterilizacin de medio de cultivo en el biorreactor.5.3 Preparacin de de Inculo e inoculacin del medio en biorreactor.

5.1. Manejo de un Biorreactor

OBJETIVO.

Adquirir los conocimientos prcticos para reconocer las partes de un biorreactor delaboratorio, las funciones de cada parte constituyente del biorreactor, as como elmontaje de stas y el funcionamiento del biorreactor y su mdulo de control.

MARCO TERICO.

1) CLASIFICACIN DE LOS BIORREACTORES.

La mayora de las compaas industriales de fermentacin tienen al menos unaseccin dedicada a los laboratorios de fermentacin, los cuales usan parainvestigacin pura de nuevos productos, seleccin de nuevos cultivos defermentacin, desarrollo de nuevas materias primas, condiciones de proceso yescalamiento, por ejemplo: en la industria farmacutica se aplica para el desarrollode nuevos antibiticos. En la industria de la cervecera y de los alimentos dondecontinuamente se desarrollan sustitutos de protena.

En estas reas de investigacin y desarrollo el tipo de biorreactor puede variardesde un matraz de 10 0mL, hasta un fermentador de acero inoxidable de 100litros (L). En un rea grande de desarrollo se pueden encontrar varios tamaos debiorreactores, desde uno de 5 L. pasando por uno de escala de entre 20 y 50 L, yfinalmente uno de escala piloto que podra ser de 100 a 1000 L. El nmero debiorreactores generalmente lo rigen los costos y la disponibilidad de mano de obra.

Un biorreactor es un contenedor fsico en donde se efectan reacciones biolgicascatalizadas por microorganismos o partes de ellos. Las fronteras del biorreactorestn bien delimitadas. El biorreactor cuenta con espacios fsicos que permiten poruna parte controlar las condiciones de reaccin y por otra parte el monitoreo de lareaccin biolgica por medio de electrodos especiales.

Los nombres que se le han adjudicado a los biorreactores de laboratorio sonvariables a saber: biorreactores de mesa, propiamente de laboratorio, losbiorreactores de planta piloto y los biorreactores industriales.

Una definicin aceptable de los tipos anteriores de biorreactores podra quedarcomo sigue:

2Biorreactores de Mesa o Bench-Top (Biorreactores de laboratorio): Poseenvolmenes de trabajo de 0.5 a 10 L, el vaso puede ser de acero inoxidable, vidrioo una combinacin de ambos y no son esterilizables in situ, su esterilizacinrequiere la introduccin del biorreactor dentro de una autoclave.

Biorreactores de planta piloto: Su desarrollo ha permitido encontrar formassofisticadas capaces de esterilizarse en diferentes tipos de fermentacin; loscuales incluyen biorreactores de tanque agitado, air-lift, tipo torre, de camafluidificada y de disco rotario. Por lo general el material utilizado en suconstruccin es el acero inoxidable. Los volmenes utilizados varan de 15 hasta100 L

Biorreactores industriales: Se construyen invariablemente con acero inoxidable. Elvolumen del biorreactor puede variar de 150 hasta 10000 L. Los biorreactoresindustriales se esterilizan forzosamente in situ.

2) VARIABLES DE CONTROL EN BIORREACTORES.

Por lo general, cualquier tipo de biorreactor posee caractersticas de diseo quepermiten, por medio de un mdulo de control y electrodos, controlar al menos seisvariables bsicas que definen el medio ambiente en donde los microorganismosse desarrollan, stas son: la agitacin, la temperatura, el pH del cultivo, laaireacin del medio, la concentracin de oxgeno disuelto, y el nivel de espumaexistente en el biorreactor.

2.1) Agitacin.

La agitacin del medio de cultivo permite mantener condiciones homogneasdentro del biorreactor. La agitacin se realiza, por lo general, por medio de unmotor acoplado a un eje que contiene impulsores de diversos tipos (de paleta tipoRushton, turbina hlice marina, etc.) Los impulsores definirn el patrn de flujo y lahidrodinmica que existir en el reactor. La eleccin del tipo de impulsor dependede la reologa del cultivo y del tipo de microorganismo que se utiliza en lafermentacin teniendo especial cuidado en no daar a las clulas que se estncultivando. La agitacin vigorosa en un biorreactor provoca la creacin de unvrtice que no permite una completa homogenizacin del medio de cultivo; as losbiorreactores cuentan con bafles que impiden la formacin del vrtice.

Los reactores tipo air-liftson agitados mediante la inyeccin de aire; el flujo deaire permite una adecuada agitacin y aumenta la transferencia de oxgeno almedio de cultivo.

2.2) Temperatura

La temperatura representa una variable importante de control de unafermentacin. La temperatura afecta el crecimiento microbiano de manera notable,debido a que los microorganismos de una especie determinada slo pueden

3crecer en un rango restringido de temperaturas. As los microorganismos sepueden clasificar en funcin de la temperatura de crecimiento: losmicroorganismos psicrfilos presentan un rango de temperatura de crecimiento de5 a 15C; los mesfilos de 25 a 40C y los termfilos de 45 a 60 C, sin mebargose han reportado casos de crecimiento de hasta 94C.

Para el control de la temperatura en los biorreactores, stos a menudo cuentancon chaquetas por donde fluye agua fra o caliente y que funcionan comointercambiadores de calor. Tambin los biorreactores cuentan con termoparesadaptados al cuerpo del biorreactor que de forma continua determina latemperatura del cultivo, con la ayuda del mdulo de control. As, continuamente elmdulo de control determina si hay que aumentar o disminuir la temperatura delcultivo de acuerdo a un valor de temperatura de fermentacin preestablecido.

2.3) pH

El pH de una fermentacin expresa la concentracin de iones hidrgeno presentesen el medio de cultivo. Al igual que la temperatura de fermentacin, el pHdetermina de forma importante la velocidad de crecimiento de losmicroorganismos y el rendimiento de bioconversin. El pH de crecimiento para unaespecie de microorganismo representa generalmente un mximo denominado pHptimo. Debido a que durante las bioconversiones que se presentan, causadas porel desarrollo microbiano, el pH del medio de cultivo vara continuamente durante eltranscurso de una fermentacin. As, es necesario compensar dichas variacionesdel pH mediante la adicin de soluciones cidas o bsicas que permiten mantenerun pH ptimo de crecimiento. Para ello, es necesario contar con un electrodo depH adaptado al biorreactor que provea continamente de lecturas instantneas dela concentracin de iones hidrgeno en el medio de cultivo. Los electrodos de pHutilizados en los bi

manual de bioconversiones

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