manual de bcym 2015 - i

Facultad de Ciencias de la Salud Lima Per

2015 - I

CONTENIDO Pg.

Normas para el estudiante del curso de Biologa Celular y Molecular 03

Introduccin 05

Instrucciones para el desarrollo de las prcticas 06

Prctica N 1: Principios de Bioseguridad en el laboratorio 08

Prctica N 2: Fundamento de Microscopa 14

Prctica N 3: Permeabilidad de la Membrana Citoplasmtica. (smosis) 23

Prctica N 4: Permeabilidad de la Membrana Citoplasmtica.

(Difusin y dilisis) 27

Prctica N 5: La clula procarita y eucaritica: reconocimiento de estructuras 30

Prctica N 6: Obtencin y anlisis de fracciones celulares 39

Prctica N 7: Metabolismo Celular: Proceso de respiracin celular 40

Prctica N 8: Extraccin del ADN 42

Prctica N 9: Fundamentos de la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Y uso de enzimas de restriccin. 45

Prctica N 10: Fundamentos de Electroforesis 50

Prctica N 11: Ciclo celular: Mitosis y Meiosis 54

Prctica N 12: Ciclo celular: Mitosis y Meiosis 58

Referencias Bibliogrficas 65

NORMAS PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE

BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

El estudiante debe INGRESAR AL LABORATORIO CON MANDIL LARGO, LIMPIO,

ABOTONADO Y BIEN PLANCHADO mientras dure la prctica. Debe usar pantaln largo, zapatos o

zapatillas y las chicas deben tener el cabello amarrado.

LLEGAR PUNTUAL a las prcticas es seal de respeto hacia los profesores y compaeros. Slo se dar

5 minutos de tolerancia.

Debe entrar NICAMENTE CON LOS MATERIALES NECESARIOS, como cuaderno de trabajo,

lpices, lapiceros, etc. y el material solicitado por el Docente para cada prctica.

ESTUDIAR los conceptos tericos que servirn para el desarrollo de la prctica correspondiente antes

de ingresar al laboratorio. Se tomarn pasos todas las clases de laboratorio que comprendern dos

preguntas de lo desarrollado la prctica anterior y una pregunta de la prctica a realizarse.

Los alimentos, bebidas, maletines y/o mochilas estn prohibidos dentro del laboratorio, siendo los

LABORATORIOS AMBIENTES DE TRABAJO Y ESTUDIO.

El uso de celulares durante las clases distrae e incomoda a los dems, antes de ingresar al laboratorio,

asegrese de apagar su telfono mvil.

Los grupos de laboratorio son de mximo 3 alumnos, todos los integrantes del grupo son responsables

del contenido de los informes, por lo tanto la calificacin es para todo el grupo.

Es indispensable para un correcto anlisis en los informes, el uso de textos y artculos que provean las

bases tericas que fundamenten los temas que se han de tratar. En caso de usar fuentes de Internet el

estudiante debe cerciorarse que sta sea respaldada por instituciones de prestigio que aseguren la

veracidad de la informacin suministrada. Todos los trabajos entregados deben tener sus referencias

citadas segn el sistema Vancouver.

El fraude es el engao por parte del estudiante en el desarrollo de una actividad acadmica o institucional

para obtener un provecho indebido, como copiar trabajos realizados por otras personas (compaeros,

estudiantes de ciclos pasados, autores o documentos bajados de internet), sin indicar de quien provienen;

usar ayudas no autorizadas durante los exmenes, poner su nombre en el trabajo en el que no particip.

Tambin comete falta el estudiante que ayude a otra persona a cometerlo por ejemplo; prestndole un

trabajo ya elaborado para que lo entregue como propio, soplarle las respuestas o ponerle en un trabajo

cuando este no lo ha realizado.

Es responsabilidad de cada grupo traer el material para cada prcticas (revisar la gua), de lo contrario no

podrn realizar el laboratorio y la calificacin se ver afectada.

El alumno ES RESPONSABLE de cualquier accidente que ocurra con el material y/o equipo con el que

trabaje, debiendo reponer dicho material a la brevedad posible. Cualquier accidente con vidrios,

reactivos, cultivos biolgicos y/o similares deber comunicarse al responsable del laboratorio o al

profesor de prcticas a fin de tomar las medidas adecuadas.

El ORDEN Y LA LIMPIEZA son obligatorios en el laboratorio de Biologa Celular y Molecular,

asegrese de aplicarlos durante y despus de la prctica, debiendo dejar el lugar usado como usted lo

encontr.

MANTENGA LOS EQUIPOS EN SU SITIO, moverlos podra daarlos. Salvo indicaciones expresas

del docente de aula, los equipos permanecern en sus respectivos lugares, en caso de observar cualquier

anomala informar al docente inmediatamente. Si al finalizar la prctica se encuentran microscopios con

lminas que debieron ser desechadas con anterioridad, el profesor bajar puntos a la nota de trabajo en el

laboratorio del da a toda la mesa.

Por su seguridad y la de sus compaeros se tienen que cumplir en todas las clases las normas de

BIOSEGURIDAD.

Realizada la prctica ANOTAR Y/O DIBUJAR las experiencias observadas, este proceso le ayudar

para realizar los informes respectivos y para el repaso respectivo.

Los laboratorios SON AMBIENTES DE TRABAJO: Para las demostraciones de sentimientos y juegos

habr otros momentos oportunos.

LA MANIPULACIN DE LOS EQUIPOS SE HAR EXCLUSIVAMENTE POR EL PROFESOR

que solicitar la ayuda del responsable de laboratorio si fuera necesario. Los alumnos slo podrn

manipular los equipos dirigidos por el docente o el responsable de laboratorio

INTRODUCCIN

Todos los seres vivientes estn formados por clulas; y estas a su vez estn formadas por biomolculas; pero

el nmero y la variedad de cada una de estas molculas y clulas difieren grandemente entre los distintos

organismos. Algunos organismos se componen de solamente una clula. Otros como los seres humanos, se

componen de billones de clulas. La Biologa como ciencia, enmarca los principios bsicos del conocimiento

requerido sobre el estudio de los seres vivos. Se trata de una ciencia natural que ha ido forjando, a travs del

tiempo la lucha constante, por conocer y transformar la naturaleza. A travs de su desarrollo, ha surgido una

diversidad de campos especializados dentro de lo que destaca la Biologa Celular y Molecular que se encarga

del estudio de los componentes moleculares de las clulas y su relacin con otras ramas de la Biologa como

la Gentica, con sus estudios del genoma humano, la clonacin de animales, la terapia gnica y la transgnica

como tambin el desarrollo de animales y vegetales transgnicos, avances muy importantes en las Ciencias

de la Salud.

A fin de conocer mejor las complejas y delicadas estructuras de los seres vivos, es necesario el contacto

directo con los muestras que se van a estudiar, por lo que es importante relacionar la teora con la prctica;

para lo cual brindamos el presente Manual de Biologa Celular y Molecular, detallndose las experiencias de

laboratorio con principios muy sencillos y fciles de comprender, para que el estudiante tenga un material

didctico de trabajo que le servir de gua para realizar sus experiencias de laboratorio.

El Manual tiene dos objetivos fundamentales: en primer lugar; introducir al estudiante en el desarrollo de

procedimientos experimentales que le permitan estudiar la clula como unidad estructural, funcional y

reproductiva de los sistemas vivos, as como los procesos metablicos que mantienen y renuevan su

organizacin; y en segundo lugar, desarrollar en el estudiante habilidades para buscar, seleccionar, organizar

e interpretar la informacin experimental; conducindolo a la formulacin de interrogantes sobre una realidad,

con base en la teora ya existente y as alcanzar soluciones a preguntas planteadas en los procesos biolgicos.

Los autores

INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS

PRCTICAS

Lee la gua de prctica previa al desarrollo de la experiencia en el laboratorio.

Investiga previamente sobre los conceptos bsicos del tema a desarrollar en la prctica.

Escucha atentamente las indicaciones de los docentes y sigue las instrucciones del manual de

prcticas.

En caso de que las pruebas experimentales sean individuales realiza todas las pruebas mencionadas

en el manual en forma independiente.

En el caso de las experiencias grupales, trabaja en coordinacin con tu grupo, realizando una

distribucin equitativa de las tareas asignadas, cumpliendo con rapidez y eficiencia, ya que de tu

trabajo depende todo el grupo.

Realiza cuidadosamente tus pruebas experimentales, entendiendo el porqu de los hechos acaecidos.

Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa minuciosamente tus

experimentos y anota y/o esquematiza con claridad los cambios ocurridos (color, volumen,

aumentos observados, emisin de gases, texturas, etc.), as como los resultados finales. Estos

resultados son de forma individual y debern ser entregados a los docentes el da de la prctica para

su revisin y firma, siendo anexados en el informe final.

Discute y analiza con los miembros de tu grupo el porqu de estos resultados y las conclusiones

preliminares, encontrando patrones, explicando sucesos, hechos y construyendo deducciones.

Desarrolla en forma grupal o individual segn las indicaciones de los docentes el informe de prctica,

utilizando fuentes de informacin de nivel universitario que expliquen de forma sustentada tus

resultados y conclusiones desarrolladas que ser entregado al ingresar al laboratorio de la clase

siguiente.

Resuelve los cuestionarios que tienen como objetivo reforzar los conceptos aprendidos en teora y

prctica, porque estas preguntas sern consideradas ara tomar en los pasos al inicio de la prctica.

Cita tus referencias segn el sistema Vancouver.

Las resultados prcticas desarrolladas por uno o un grupo de ESTUDIANTES NO PUEDEN SER

TRANSFERIBLES A OTROS.

FICHA DE EVALUACIN DE LA PRCTICA:

N .

Nombre del Estudiante:.

Mesa:Fecha:

COMPETENCIAS A EVALUAR 0 1 2

1. Llega con puntualidad / tarde / no asiste a la prctica (F y

T)

2. Ingresa al laboratorio debidamente presentado y entrega el

informe desarrollado de la prctica anterior.

3. Trae todos los materiales que requiere para el desarrollo de

la prctica

4. Participa activamente en el desarrollo de los conceptos

tericos que se brindan en la primera parte de la sesin.

5. Trabaja en equipo cumpliendo con eficiencia el rol que le

toca en la experiencia.

6. Participa activamente en el desarrollo de la experiencia

demostrando inters, habilidad y destreza en las

preparaciones experimentales.

7. Muestra Inters por su aprendizaje y sobre todo en relacin

a la prctica desarrollada.

8. Esquematiza y toma nota de sus resultados

9. Participa activamente en el anlisis de los resultados

obtenidos

10. Tiene confianza en s mismo, tiene adecuada presentacin

y muestra respeto a las opiniones de sus docentes y/o

compaeros de trabajo

NOTA

CRITERIOS QUE SE TOMARN EN CUENTA PARA

LA EVALUACIN DE LOS INFORMES DE

PRCTICA

ITEMS A EVALUAR PUNTOS

1. Cartula y presentacin

1

2. Introduccin (marco terico y objetivos

de la prctica)

1

3. Procedimiento experimental (materiales y

mtodos usados)

1

4. Resultados.

5

5. Anlisis y discusin de los resultados

5

6. Conclusiones

5

7. Referencias usadas en la preparacin del

informe (citadas segn sistema

Vancouver)

2

NOTA

PRCTICA N 1

PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD EN EL

LABORATORIO

En cualquier laboratorio, se deben de seguir normas y procedimientos para que las personas que

laboran en dicho ambiente no pongan en riesgo su salud y la de la comunidad que lo rodea. Dicho

conjunto de medidas especficas a seguir es lo que se conoce como Bioseguridad.

Por tanto, podemos definir bioseguridad como el conjunto de medidas preventivas orientadas a

mantener, controlar y reducir factores de riesgo laborables procedentes de agentes de riesgo

(biolgicos, fsicos o qumicos) con el objetivo de proteger la salud y la seguridad del personal que

labora en un determinado establecimiento de salud, laboratorio de diagnstico o de enseanza

universitaria.

PRINCIPIOS BSICOS DE BIOSEGURIDAD

Se debe tener presente que la sangre humana y los fluidos corporales debern ser tratados como si

estuvieran potencialmente contaminados con patgenos transmisibles por sangre como el VIH y

VHB. Se asume que cualquier contacto directo con estos fluidos puede resultar en infeccin y por lo

tanto se requiere que cada trabajador utilice su equipo de proteccin personal.

Con el fin de evitar accidentes laborales se den tener en cuenta los siguientes principios:

1. Universalidad. Se debe asumir como potencialmente infectante, todo paciente o residuo

biolgico.

2. Uso de barreras para la proteccin personal y disminuir los riesgos, para ello se usan guantes,

lentes protectores, mandil, etc.

3. Lavado de manos.

4. Manejo seguro de los residuos slidos, con el fin de eliminar los residuos biocontaminados

y lograr una buena segregacin de la basura.

AGENTES DE RIESGO

Durante el desarrollo de su trabajo en el laboratorio, dependiendo del tipo de laboratorio y del tipo

de actividad que en este se realiza, el personal puede enfrentarse a diversas situaciones de peligro

que ocasionen efectos adversos a la salud. Estas situaciones de peligro se deben a la exposicin a

ciertos agentes causantes de daos fsicos o enfermedades que pueden ser transmitidas. Estos agentes

de riesgo pueden ser agrupados en tres categoras, en relacin a su naturaleza y caractersticas:

Principio Universal: TODO PACIENTE DEBE SER ASUMIDO COMO PORTADOR

DE UN AGENTE INFECCIOSO

Agentes de riesgo biolgicos

Consiste en la presencia de un organismo, o la sustancia derivada de un organismo, que provoca una

amenaza a la salud humana. Esto puede incluir transmisin por ingestin, inhalacin, inoculacin, o

por contacto directo a travs de piel o mucosas. Entre estos agentes de riesgo se incluyen bacterias,

hongos, parsitos, virus, priones, como tambin, tejidos y fluidos de organismos vivientes que porten

o puedan portar ese material, que pueden resultar patgenos.

Agentes de riesgos fsicos y mecnicos

Son estados energticos con un efecto nocivo, de acuerdo a la intensidad y el tiempo de exposicin

a los mismos, para la salud humana. Entre los cuales encontramos, temperaturas extremas (altas y

bajas) que pueden ser capaces de ocasionar quemaduras, las radiaciones (ionizantes y no ionizantes),

objetos punzo-cortantes (vidrios resquebrajados de recipientes daados o tubos rotos, hojas de

bistur, navajas, etc.), electricidad, el ruido producido por aparatos que ocasiona disminucin de la

audicin, mala iluminacin, carga fsica, vibracin, uso de muebles de trabajo inadecuados.

Agentes de riesgo qumicos

Es aquel riesgo susceptible de ser producido por una exposicin no controlada a productos qumicos,

la cual puede producir efectos locales y sistmicos segn la naturaleza del producto, la va de entrada

en el organismo, el tiempo de exposicin, etc. Los agentes de riesgo qumicos pueden a su vez ser

clasificados de acuerdo a sus caractersticas y su modo de accin:

Corrosivos que causan destruccin o alteracin a los tejidos

Txicos, cuyos efectos se manifiestan segn la va de exposicin, por inhalacin, ingestin

o contacto directo con piel o mucosas

Carcinognicos o mutagnicos

Inflamables y explosivos

Etc.

La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) teniendo en cuenta los peligros relativos asociados a

los organismos patgenos que son manipulados en los laboratorios ha realizado una clasificacin de

los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo en 4 grupos. Los factores utilizados para

agruparlos se basan en: (a) patogenicidad, (b) dosis infectiva, (c) modo de transmisin, (d) rango de

hospedero, (e) disponibilidad de medidas de prevencin efectivas y, (f) disponibilidad de tratamiento

efectivo.

Y teniendo en cuenta esta clasificacin, los laboratorios son divididos en 4 niveles de bioseguridad

o de contencin, que consisten en la combinacin de tres elementos: tcnica microbiolgica, equipo

de seguridad y diseo de la instalacin. Cada nivel de bioseguridad tiene barreras establecidas para

ofrecer proteccin contra los microorganismos, las cuales aumentan con cada nivel. Los laboratorios

de nivel de bioseguridad 1 trabajan con agentes menos peligrosos y requieren de menos precauciones,

mientras los laboratorios de bioseguridad nivel 4 tienen los mtodos ms estrictos.

En la tabla N1 se detalla los diferentes niveles de bioseguridad de un laboratorio y algunos aspectos

relacionados con cada uno de ellos.

M a n u a l d e P r c t i c a d e B i o l o g a C e l u l a r y M o l e c u l a r

10

Tabla N 1: Niveles de bioseguridad

Nivel de

bioseguridad

(BSL)

Grupo de riesgo

(GR) Agentes de riesgo biolgico Tipo de laboratorio Medidas de bioseguridad

BSL-1 (Bsico)

GR1, riesgo

individual y

poblacional nulo o

bajo

Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, ciertas cepas de E.

colino patognicas

Enseanza bsica,

investigacin

Precauciones universales, se trabaja en la mesa de

laboratorio al descubierto

BSL-2 (Bsico)

GR2, riesgo

individual

moderado,

poblacional bajo

Campylobacter jejuni, Helicobacter

pylori, Neisseria gonorrhoeae,

Blastomyces dermatitidis, Coccidia,

Toxoplasma gondii, Adenovirus,

Papovavirus

Servicios de atencin

primaria, diagnstico,

investigacin

Piletas de lavado de manos, instalaciones de

descontaminacin de desechos, acceso restringido,

seales de advertencia. Personal vacunado,

capacitado y bajo vigilancia mdica. El riesgo

primario del personal est relacionado con

exposiciones accidentales a sangre, fluidos

corporales, etc., que pueden contener un agente

infeccioso.

BSL-3

(Contencin)

GR3, riesgo

individual elevado,

poblacional bajo

Coxiella burnetii, Mycobacterium

tuberculosis, VIH, bacterias

multirresistentes como

Staphylococcusa ureus resistente a

meticilina (MRSA) y Streptococcus

pyogenes resistente a eritromicina

(SPRE).

Diagnstico especial,

investigacin

Acceso restringido al laboratorio, personal

altamente capacitado en el manejo de agentes (con

potencial de transmisin respiratoria),

descontaminacin de todos los desechos, cambio de

ropas de proteccin de laboratorio y su

descontaminacin antes de ser lavadas. Pre-

cmaras, puertas dobles de ingreso, flujo de aire

negativo.

BSL-4

(Contencin

mxima)

GR4, riesgo

individual y

poblacional alto

Virus del Ebola, virus Marburg,

virus Lassa, virus Junn.

Unidad de patgenos

peligrosos

Personal altamente capacitado, acceso ms

restringido, duchas qumicas, uso de trajes

especiales, cambio de ropa. Laboratorios en zonas

aislados.


11

MANEJO DE RESIDUOS SOLIDOS DE ESTABLECIMIENTOS DE SALUD

Para hacer un correcto manejo sanitario de los residuos slidos es necesario, en primer lugar, realizar

una adecuada clasificacin/segregacin previa de los mismos. Dicha clasificacin permite la separacin

de residuos contaminados con agentes patgenos o txicos del resto de residuos. La clasificacin se basa

en la naturaleza y los riesgos asociados, y se divide en tres categoras: Clase A (Residuo

Biocontaminado), clase B (Residuo especial) y Clase C (Residuo Comn) (Tabla N2).

Tabla N2: Clasificacin de residuos slidos sanitarios

Clase Ejemplo Color de Bolsa

A

Aquellos generados en el

proceso de atencin e

investigacin mdica

Cultivos, vacunas vencidas o

inutilizadas. Muestras de sangre,

suero, tejidos, rganos. Residuos

quirrgicos y patolgicos. Material

punzocortante que estuvieron en

contacto con pacientes o agentes

infecciosos. Animales

contaminados. Residuos

contaminados provenientes de la

atencin al paciente.

Rojo.

B

Aquellos con potencial

peligro por lo corrosivo,

inflamable, txico,

explosivo y reactivo para

la persona expuesta.

Residuos qumicos peligrosos.

Residuos farmacuticos (vencidos,

desactualizados, no utilizados).

Residuos radioactivos.

Amarilla

C

Todo material que no

puede clasificarse en las

categoras A y B.

Residuos generados por

administracin, limpieza de

jardines, patios, reas pblicas,

restos de la preparacin de

alimentos.

Negra

Bolsas rojas: reas

biocontaminadas

Bolsas amarillas: reas

especiales

Bolsas negras: residuos

comunes

unescontaminadas


12

Joyce del Pino, Rafael Alvis, Danae Liviac, Gisella Guilln

La segregacin de los residuos en las diferentes categoras es considerada una etapa fundamental para

las siguientes etapas del ciclo de manejo de residuos: segregacin y almacenamiento primario,

almacenamiento intermedio, transporte interno, almacenamiento final, tratamiento, recoleccin final y

por ltimo, disposicin final (Figura N1).

Figura N1: Ciclo del manejo de residuos slidos hospitalarios

FUENTE: MINSA Norma tcnica: Procedimientos para el manejo de residuos slidos hospitalarios

(R.M. N217-2004/MINSA)

PRECAUCIONES UNIVERSALES

1. Lavarse siempre las manos con abundante agua y jabn.

2. Usar barreras de proteccin como guardapolvo largo, guantes, mascarilla, etc. y de ser posible llevar

el cabello recogido.

3. Evitar lesiones por agujas, bisturs y otros instrumentos cortantes durante los procedimientos y

limpieza del material utilizado.

4. Desinfectar, esterilizar y descartar adecuadamente los instrumentos despus de usarlos.


13


COMPETENCIAS

Desarrolla actitudes responsables en el trabajo en el laboratorio.

Define las normas que se deben adoptar dentro de los laboratorios de la Universidad Cientfica

del Sur para prevenir accidentes.

Analiza cules son los riesgos a los que puede estar expuesto durante el aprendizaje en el

laboratorio.


14


PRCTICA N 2

FUNDAMENTOS DE MICROSCOPA

El ojo humano con una visin en ptimas condiciones solo puede observar elementos cuyo tamao

sean mayores a 0,1 mm Para poder visualizar y catalogar las dimensiones por debajo de dicho

tamao, surgi la necesidad de crear instrumentos y tcnicas adecuadas que permitan explorar el

campo de la Biologa Celular. Por esta razn, aparecen en primer lugar las lupas y los microscopios

simples, muy tiles para el estudio de estructuras macroscpicas pero insuficientes para poder

realizar un estudio de estructuras celulares. Para cumplir con este fin, aparece el microscopio ptico

comn o microscopio compuesto. El microscopio ptico compuesto no es ms que un sistema ptico

de lentes convergentes que cumplen la funcin de aumentar la imagen de un objeto.

Fuente: LABORATORIODE BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR, UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL

SURhttp://www.cientifica.edu.pe


15


Fuente: GENOMA SUR INTRODUCCIN A LA CLULA http://www.genomasur.com/lecturas/Guia01.htm

EL MICROSCOPIO PTICO

Parte mecnico y sus componentes:

Pie o base: se encuentra en la parte inferior del aparato, proporcionndole estabilidad.

Columna o brazo: estructura metlica que sostiene a las dems piezas del microscopio.

Platina: placa horizontal donde se coloca el portaobjetos con la muestra y es sujetada por un

sistema de pinzas que permiten deslizar el portaobjetos en dos sentidos perpendiculares. Adems

posee una perforacin central para el paso de los rayos de luz.

Diafragma: Est asociado a la platina ubicado entre la fuente de luz y el condensador. Es una

membrana metlica que se abre o cierra, cuya funcin es regular la intensidad de luz que

atraviesa el objeto y eliminar los rayos perifricos que distorsionan las imgenes.

Tornillos macro y micromtrico: son las que desplazan la platina en un sentido vertical

posibilitando el enfoque. El tornillo macromtrico es el que da un ajuste grueso, con

movimientos amplios de la platina (cm, mm). El micromtrico permite un ajuste fino, casi

imperceptible (m) para lograr una imagen ntida de la muestra a observar.

Revolver: sitio donde se montan los objetivos.

Cabezal: soporta el revlver y los oculares. Pueden ser mono, binocular o trinocular. Los

cabezales trinoculares son poseen una adaptador para una cmara fotogrfica.

Parte ptico y sus componentes:

Condensador: Lente o sistema de lentes de forma cnica que posee un sistema de dos lentes

convergentes que utilizan para hacer eficiente la iluminacin, de manera que la mayor parte de

los rayos luminosos de la fuente atraviesen el preparado y entren en el sistema ptico del

microscopio.

Ocular: es la lente o sistema de lentes ms cercana al ojo del observador, montada en un tubo

monocular o en dos tubos binocular. Las lentes llevan impreso el nmero de aumentos: 6X, 10X

y 15X; El ms comn es el de 10X. (X se lee por).

Objetivo: es la lente ms cercana al objeto a observar. En el revlver existen cuatro o cinco

objetivos montados de distintos aumentos. Estos llevan escrito el aumento que puede alcanzarse

con ellos, usualmente son de 4X, 10X, 40X, y 100X. Los cuatro primeros se denominan lentes

secos y la ltima, lente hmedo o de inmersin, ya que debe sumergirse en aceite de origen

sinttico cuyo ndice de refraccin sea prximo al del vidrio.

*Fuente de luz o lmpara. Los haces de luz pueden ser natural o artificial, cuando es natural (solar)

un espejo situado en la base del microscopio recoge la luz del medio y la refleja a travs del objeto

y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un foco de luz halgena

ubicado en el microscopio y conectado a un circuito elctrico de bajo voltaje (6 a 12V).


16


CONCEPTOS BSICOS

Aumento total (AT): es la imagen obtenida de un objeto que se obtiene al multiplicar el aumento de

la lente objetivo utilizada por el aumento de la lente ocular.

AT= Aumento objetivo (4x, 10x, 40x y 100x) X el aumento del ocular (10X).

Poder de resolucin (PR): es la capacidad de un instrumento ptico, en este caso el microscopio,

para visualizar los detalles de un objeto; es decir, es la capacidad de poder distinguir dos puntos muy

prximos como separados desde una distancia determinada.

ENFOQUE

Asegrese primero de que el microscopio est sobre una base slida y se encuentre conectado a

una toma de corriente elctrica.

Utilice siempre el objetivo de menor aumento (4X), para el primer enfoque de una muestra.

Encienda la fuente de luz, lleve el condensador a una distancia de 1 a 2 mm de la platina

Verifique que el diafragma est abierto y el objetivo perpendicular a la platina.

Coloque una de las lminas preparadas sobre la platina y asegrela con las pinzas del sistema de

desplazamiento que tiene la platina.

Procure que la muestra que va a ser observada se encuentre en el centro del orificio de la platina.

Gire el tornillo macromtrico hasta obtener una distancia de 1 a 2 cm entre el objetivo y la lmina

preparada. ESTA OPERACIN DEBE HACERLA SIN COLOCAR SUS OJOS SOBRE EL

OCULAR.

Ahora coloque los ojos sobre los oculares y mantngalos abiertos, ajuste el sistema de binoculares

a su distancia ocular, de modo que observe un solo y gran campo de luz.

Siga moviendo la platina hacia arriba utilizando el tornillo macromtrico hasta que visualice la

muestra en la lmina que prepar. Este enfoque se llama ENFOQUE GRUESO.

Empiece a girar, con los dedos pulgar e ndice de ambas manos, el tornillo micromtrico hasta

que pueda observar ntidamente la muestra, esto es el ENFOQUE FINO, que se ajusta a la visin

de cada observador.

Rote el revlver para cambiar de objetivo.

Manipule el tornillo micromtrico y enfoque nuevamente la muestra que est observando.

En el caso de que use el objetivo de inmersin, una vez que haya enfocado su muestra con el

objetivo de 40X, previo al cambio con el objetivo de 100X, se agrega una gota de aceite de cedro,

se ubica el objetivo y se enfoca la muestra usando el tornillo micromtrico con mucho cuidado.

COMPETENCIAS

1. Identifica las partes del microscopio ptico.

2. Reconoce los diferentes componentes del microscopio.

3. Conoce las caractersticas del microscopio ptico.

4. Efecta el enfoque fino y observar el detalle de la muestra.

5. Realiza preparaciones en el laboratorio.


17


MATERIALES

MATERIALES DEL LABORATORIO

Microscopios pticos

Papel lente

Goteros

Navaja

Tijeras

Lminas porta objeto y laminillas

cubre objeto.

MATERIALES DEL ESTUDIANTE

Corcho natural Hoja de diario

PROCEDIMIENTOS

Preparacin de muestras:

Tome una lmina portaobjeto limpia, estas lminas y los cubreobjetos siempre debe tomarlos

por los bordes usando los dedos pulgar e ndice.

Con una navaja corte una lmina delgada de corcho, colquelo en el centro de la lmina

portaobjeto. Enfoque a 40X, 100X y 400X. Esquematice a 400X.

Repita la misma operacin en otra lmina y coloque esta vez la letra e minscula recortada de

un diario cualquiera. Asegrese de colocar la letra como usted la lee (e). Enfoque a 40X, 100X

y 400X. Esquematice a 40 y 100X

.


18


TIPOS DE MICROSCOPA (continuacin)

COMPETENCIAS

1. Reconoce la importancia delos diferentes tipos de microscopio.

2. Conoce las caractersticas del microscopio de campo oscuro, contraste de fases,

fluorescencia y microscopios electrnicos, en el estudio de los sistemas biolgicos.

3. Reconoce el impacto que produjo en el estudio de los sistemas biolgicos el desarrollo de la

microscopia electrnica.

MARCO TERICO

El uso de determinados componentes colocados en el condensador o en los objetivos se interponen

al haz luminoso emitidos por la lmpara, filtrando u obstaculizando la luz y dan lugar a los distintos

tipos de microscopa ptica como la de campo claro, campo oscuro y contraste de fases. Estos tipos

de dispositivos en un microscopio de contraste de fases manipulan fsicamente los haces luminosos

seleccionando parte de las ondas de las que se compone dicho haz, lo que provoca una imagen

contrastada de la muestra sin necesidad de teirla. En el caso de la microscopia de fluorescencia, se

utiliza una lmpara que emite un haz luminoso fuera del rango de la luz visible y se aprovecha esta

propiedad de filtrar los haces de luz para poder manejar la longitud de onda que incide y emite una

muestra determinada mediante filtros. Actualmente, el microscopio de fluorescencia ms utilizado

es el de epifluorescencia, que simplemente indica que la luz filtrada no atraviesa la muestra sino que

incide sobre ella a travs de la lente objetivo, y esta misma lente es la encargada de recoger la luz

que emite la muestra excitada.

Otro tipo de microscopa es la Microscopa Electrnica, cuya principal virtud radica en la potencia

amplificadora que no posee un microscopio ptico, debido a que la microscopia ptica est limitada

por la longitud de onda de la luz visible (alrededor de 4000 ngstroms). En cambio un microscopio

electrnico utiliza electrones para iluminar un objeto, siendo la longitud de onda de un electrn de

0,5 ngstroms; razn por la cual en un microscopio electrnico se puede mostrar estructuras mucho

ms pequeas. La imagen que se produce es por la dispersin de los electrones, mientras que en el

microscopio ptico la imagen que se produce es por absorcin de los fotones. Es decir, la imagen

que se puede observar se debe a la diferente absorcin de la luz por las distintas estructuras de la

muestra, mientras que en el microscopio electrnico la formacin de la imagen est en funcin de la

dispersin y, por consiguiente, perdida de los electrones. Existen dos tipos bsicos de microscopios

electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM)

y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM).

En el microscopio electrnico de transmisin (MET), la observacin de una muestra biolgica se

necesita realizar cortes histolgicos ultrafinos. Los haces de electrones se dirigen hacia el muestra

que se desea aumentar y uno de estos electrones que es emitido por la lmpara rebota o es absorbido

por el objeto y otros la atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra en estudio. Los

microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

En un microscopio electrnico de barrido (MEB), las imgenes que se crean es una imagen ampliada

de la superficie de un objeto a observar. En este tipo de microscopio la ventaja que se tiene es que

no necesario realizar un corte del objeto en capas para poder observarlo, sino que se puede colocar


19


un fragmento o la muestra completa dependiendo del tamao con muy pocos preparativos. La MEB

explora la superficie de la muestra a evaluar y provee una imagen punto por punto, al contrario de

que ofrece la MET, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa

en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones. Los microscopios electrnicos de

barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIO UTILIDAD

ptico de campo claro Para observar muestras teidas.

ptico de campo oscuro

Para la observacin de microorganismos

vivos, invisibles a la microscopia de campo

claro debido a que no se tien con facilidad,

porque se distorsiona su visualizacin.

ptico de Contraste de fases Para facilitar la visualizacin de estructuras

internas de muestras vivas no teidas

ptico de Fluorescencia

Observar estructuras internas especficas

mediante la utilizacin de fluorocromos o

anticuerpos marcados.

Electrnico de transmisin

Examinar virus o la ultraestructura interna de

cortes delgados de clulas (aumento de 10000

- 100000X)

Electrnico de barrido Estudiar las caractersticas de las superficies

externas de organismos, clulas y virus.

Fuente: Comunicacin personal.

MATERIALES

Placas fotografas usando los diferentes tipos de microscopio ptico y electrnico.

PROCEDIMIENTOS

Teniendo en cuenta la informacin presente en la explicacin del docente, analice las

siguientes fotografas de muestras observadas mediante microscopa.


20


Tipo de microscopia utilizada

.

Tipo de microscopio utilizado

.

Fuente: Angiognesis en tumores de clulas germinales testiculares

http://www.conganat.org/3congreso/cvhap/comunicaciones/059/index.htm


...


.

Fuente: Microscopio virtual http://www.biologia.edu.ar/microscopia/meb.htm


21



.


..

Fuente: Microscopio virtual

http://www.biologia.edu.ar/microscopia/meb.htm


.


..




22



.


.




.


.




23


PRCTICA N 3

PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA

CITOPLASMTICA. (SMOSIS)

Fuente: http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=Cell_Membranes_and_Compartments

La membrana celular es una estructura supramolecular que est presente en todos los tipos celulares.

Est constituida bsicamente por una bicapa fosfolpidica, en donde se insertan protenas (perifricas

o integrales). Algunas clulas pueden presentar carbohidratos asociados a lpidos y/o protenas,

encontrndoselas en la monocapa externa y en menor porcentaje.

La membrana celular rodea a las clulas dndole una individualidad, debido a que separa dos medios

acuosos: la regin intracelular llamada citoplasma y la externa o regin extracelular. Esta membrana

es un filtro, altamente selectivo, que controla la entrada de nutrientes y la salida de los productos

residuales, debido a esta propiedad es considerada como semipermeable.

En la actualidad se considera al modelo de Mosaico Fluido (Singer y Nicholson, 1972) como la

estructura bsica de las membranas. Este modelo propone que los lpidos se disponen formando una

verdadera bicapa que permite desplazamientos, donde las protenas integrales se insertan tomando

contacto con la superficie extra e intracelular. Uno de los conceptos bsicos de este modelo es que la

bicapa permite desplazamientos considerables de sus componentes. Por lo tanto, la doble capa no es

esttica, sino que es capaz de permitir y propiciar un movimiento a lo largo del plano estructural de

la membrana. Una de las caractersticas ms relevantes de la organizacin molecular de las

membranas es la asimetra de todos sus componentes, lo cual significa que en ambas mitades de la

bicapa los componentes se distribuyen de diferente manera.

Las funciones de la membrana son de transporte (el intercambio de materia entre el interior de la

clula y su medio externo), reconocimiento y comunicacin (gracias a molculas situadas en la parte

externa de la membrana, que actan como receptoras de sustancias.


24


SMOSIS Y PRESIN OSMTICA

El componente principal de la clula es el agua, que acta como solvente de solutos orgnicos e

inorgnicos. El movimiento de agua a travs de una membrana semipermeable se llama smosis

(difusin de agua) y sucede siempre del rea de mayor concentracin de agua (y por tanto, con menor

concentracin de soluto) al rea de menor concentracin de agua (y con mayor concentracin de

soluto). El proceso de smosis involucra necesariamente la presencia de una membrana

semipermeable que separa dos zonas con concentraciones diferentes (Figura 2).

El movimiento del agua a travs de las membranas biolgicas es siempre pasivo (sin gasto de

energa), la fuerza que dirige este movimiento se conoce como presin osmtica.

Fuentes: http://keepinapbiologyreal.wikispaces.com/Osmosis

Figura 2. Proceso de smosis

Cuando la clula se encuentra en una solucin cuya concentracin de solutos es menor que la del

medio interno de la clula, se dice que la clula est en una solucin hipotnica y como

consecuencia, el agua entra a la clula causando que se expanda. Si la concentracin de solutos es

mayor fuera de la clula, se dice que la clula est en una solucin hipertnica; provocando que la

clula pierda agua y pierda tamao. Si las concentraciones de soluto son iguales en ambos lados de

la membrana, se dice que la clula est en una solucin isotnica, donde el movimiento neto es cero.

Las clulas animales y vegetales funcionan ptimamente en ambientes isotnicos. Las clulas

vegetales cuando se les coloca en una solucin hipotnica, la vacuola se llena de agua y ocurre un

fenmeno llamado turgencia, mientras que en las clulas animales el agua tiende a entrar,

provocando que las clulas se hinchen y lleguen incluso a estallar, fenmeno llamado lisis. Por otra

parte, si la clula vegetal se le coloca en una solucin hipertnica, pierde agua y la clula sufre el

fenmeno denominado plasmlisis al separarse la membrana celular de la pared celular, lo cual suele

ser letal; mientras, la clula animal pasara por un fenmeno de crenacin (Figura 3).


25


En Clula Vegetal

Fuente: http://bio1100.nicerweb.com/Locked/media/ch04/tonicp.html

En Clula Animal

Fuente: http://catalog.flatworldknowledge.com/bookhub/4309?e=averill_1.0-ch13_s05

Figura 3: Efecto de diferentes concentraciones de solucin salina en clulas animales y clulas

vegetales

COMPETENCIAS

1. Identifica la caracterstica de permeabilidad de la membrana celular.

2. Reconoce e identificar soluciones hipotnicas, isotnicas e hipertnicas.

3. Diferencia las respuestas celulares a diferentes concentraciones salinas.

4. Deduce como la pared celular afecta el comportamiento osmtico de la clula.

5. Desarrolla habilidades en el trabajo de laboratorio

MATERIALES


Goteros

Solucin NaCl 0.2% (0.015M)

Solucin NaCl 0.8% (0.15M)

Solucin NaCl 0.9%

Solucin NaCl 5% (0.3M)

3 beaker de 100 ml

Sacabocado

Balanza

Lanceta

Alcohol yodado


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Algodn

Lminas portaobjetos

Laminas cubreobjetos


1 papa mediana

Hojas de Elodea sp

Hoja de afeitar

Plumn marcador

PROCEDIMIENTOS

1. Efecto de soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas en clulas vegetales (Elodea sp):

Colocar una hoja de Elodea sp sobre una lmina portaobjeto, colocar una gota de solucin salina

al 0.2%, rotular la lmina con el marcador y cubrir la muestra con una laminilla. Observar al

microscopio a 40X, 100X y 400X. Esquematice sus observaciones a 400X. Repetir el

procedimiento con las soluciones al 0.8 % y 5%. Esquematizar sus observaciones.

2. Efecto de soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas en clulas animales (glbulos

rojos). Limpiar y desinfectar con alcohol la pulpa del dedo anular. Punzar con la lanceta estril

y colocar en cada lmina portaobjeto una gota de sangre. A cada lmina agregar 1 gota de

solucin de NaCl: a la primera NaCl 0.9%; a la segunda, NaCl 0.2% y a la tercera, NaCl 5%.

Marcar cada uno de los preparados. Observar al microscopio y esquematizar a 400X.

3. Osmolaridad en las clulas vegetales: Se observar como los diferentes tipos de soluciones

afectan el equilibrio y el funcionamiento de las clulas vegetales. La osmolaridad se expresa

como moles de soluto por litro de solucin; mientras ms alta es la osmolaridad, mayor es la

concentracin de soluto.

Preparar 3 beakers de 40 mL rotulados para cada solucin. Usar un cortador cilndrico para sacar

1 cilindro de la papa de 5cm de largo. Cortar de cada cilindro 9 rueditas uniformes de

aproximadamente 5mm de grosor, separarlas en tres grupos y pesar cada grupo por separado y

tocar la textura inicial. Anotar los datos. Transferir a los vasos rotulados con las soluciones de

NaCl 0.015, 0.15 y 0.30M y anotar el tiempo en que se inicia Incubar por 30 minutos a

temperatura ambiente. Retirar cada grupo de rueditas de las soluciones en que estn sumergidas

a una hoja de papel secante. Anotar si hubo cambios en textura y pesarlas nuevamente. Analizar

y discutir los resultados.


27


PRCTICA N 4

PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA

CITOPLASMTICA

(DIFUSIN Y DILISIS)

DIFUSIN

Es el movimiento de molculas de una regin de alta concentracin a otra de menor concentracin

producido por la energa cintica de las molculas. Todas las molculas de gases y lquidos tienden

a moverse o difundirse en todas direcciones hasta que se encuentran distribuidas regularmente por

todo el espacio disponible.

La difusin no requiere gasto de energa por parte de la clula y por lo tanto es un movimiento pasivo.

La velocidad de difusin depende del tamao de las molculas y de la temperatura, la causa de la

difusin es el movimiento trmico de las molculas. Con el crecimiento de la temperatura de la

solucin, la velocidad de difusin, por lo comn, aumenta.

Fuente: http://en.wikipedia.org/wiki/Diffusion

Fuente: http://www.tutorvista.com/content/biology/biology-iii/biomembranes/physical-processes.php

Fig. 4. En la difusin, las molculas tienden a esparcirse y separarse lentamente con el tiempo. Las

molculas se mueven a favor del gradiente de concentracin.


28


DILISIS

Es la difusin de molculas de bajo peso molecular a travs de una membrana semipermeable, stas

se desplazan desde la solucin ms concentrada a la ms diluida. (Figura 5). Es el fundamento de la

hemodilisis que intenta sustituir la filtracin renal deteriorada.

Fuentes: The purification of proteins is an essential first step in understanding their function

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=stryer&part=A438

Fig. 5. En el proceso de dilisis, las molculas de bajo peso molecular son capaces de atravesar la

membrana semipermeable, movindose a favor del gradiente de concentracin.

COMPETENCIAS

1. Identifica la caracterstica de permeabilidad de la membrana celular.

2. Describe los mecanismos de difusin y dilisis a nivel molecular.

3. Enumera factores que afectan la velocidad de difusin.

4. Desarrolla habilidades en el trabajo de laboratorio

MATERIALES


40 ml de agua helada

40 ml de agua caliente

Reactivo de Biuret

Colorante Azul de Metileno

Nitrato de plata

Solucin de Lugol

40 ml de solucin de albmina 1.5%

40 ml de solucin de Cloruro de Sodio

al 30%

40 ml de solucin de almidn al 1%

Agua destilada

3 Beakers 100 ml

2 Beaker 500 ml

2 tubos de ensayo

Embudo


Pabilo

2 Palitos de anticucho

1 huevo

Navaja de afeitar

2 buches limpios de pollo


29


PROCEDIMIENTO.

1. Difusin# 1(factor temperatura): En este experimento, se estudiar el movimiento browniano

de las molculas y el efecto de la temperatura. Colocar en un beaker, 40 ml de agua a temperatura

ambiente; en otro, 40 mL de agua helada y un tercero, 40 mL de agua caliente. Aadir

simultneamente a cada uno de ellos una gota de colorante azul de metileno (sin mover

demasiado el agua) y observar el comportamiento de la gota en el agua. Anotar sus

observaciones.

2. Dilisis #1 (de afuera hacia adentro): Atar con pabilo un extremo del buche y por el otro

extremo aadir, usando un embudo, 40 mL de solucin de almidn al 1%. Cerrar el orificio del

buche que qued abierto con pabilo y con ayuda de un palito de anticucho, colocar en un beaker

que contenga 150 mL de agua con varias gotas de solucin de Lugol hasta tener un color dorado.

Dejar actuar durante 30 minutos. Retirar del beaker y anotar los cambios de color dentro del

buche.

3. Dilisis #2 (de adentro hacia afuera): Atar con pabilo un extremo del buche, por el otro extremo

aadir, usando un embudo, 40 mL de solucin de Cloruro de Sodio al 30% y 40 mL de solucin

de albmina al 0.5%. Cerrar con pabilo el extremo que qued abierto, mezclar y con ayuda del

palito de madera, colocar en un beaker que contenga 150 mL de agua destilada. Dejar actuar por

30 minutos. Retirar del beaker y proceder a verter 6 ml de la mezcla de dentro del buche a un

tubo de ensayo y adicionar 4 gotas de reactivo de Biuret. Repetir el procedimiento con la solucin

del beaker. Anotar los cambios de color en cada uno de los tubos. Adems, a la solucin del

beaker aadir cinco gotas de solucin de nitrato de plata (AgNO3) y anotar los cambios de color.


30


PRCTICA N 5

LA CLULA EUCARITICA Y PROCARIOTA:

RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS

La Teora Celular establece que todos los seres vivos estn constituidos por clulas, que todos los

seres vivos son la expresin de cada una de las clulas que lo constituyen, que una clula slo

proviene de una ya existente y que la clula es la unidad bsica de todo ser vivo. Se han identificado

hasta el momento dos tipos celulares: la clula procariota (que se caracteriza principalmente por que

el material gentico constituido por ADN desnudo y que se encuentra libre en el citoplasma celular),

y la clula eucariota (que se caracteriza porque el material gentico formado de ADN asociado a

protenas se encuentra separado del citoplasma por una membrana denominada membrana nuclear),

pero ambos tipos celulares comparten estructuras en comn: la membrana celular, el citosol o

hialoplasma, el citoesqueleto, los ribosomas y el material gentico.

La clula eucariota presenta mayor tamao y organizacin que la clula procariota y en su citoplasma

se encuentran estructuras celulares que van a cumplir diversas funciones que se conocen con el

nombre de organelas celulares, inclusiones citoplasmticas, sustancias ergsticas y/u otras

estructuras.

Las clulas procariotas son por lo general muy pequeas, con una estructura interna relativamente

muy simple. Casi todas las clulas procariotas estn rodeadas por una pared relativamente dura

llamada peptidoglucano. Son cosmopolitas. El citoplasma de la mayor parte de procariotas es en

apariencia relativamente homogneo. En general, el ADN est enrollado, adherido a la membrana

plasmtica y concentrada en una regin de la clula, llamada nucleoide. Los procariotas incluyen los

reinos Monera (simple bacterias) y Archaea. Carecen de las caractersticas "organelas" envueltas en

membrana subcelular de los eucariotas, pero pueden contener sistemas de membrana dentro de la

pared celular. Las clulas procariticas pueden tener pigmentos fotosintticos tales como los

encontrados en las cianobacterias ("bacterias azules"). Algunas clulas procariotas tienen flagelos

externos en forma de ltigo para la locomocin o pili como pelos para adherirse. Las clulas

procariotas tienen mltiples formas: cocos (redonda), bacilos (bastones), y espiralada o espiroquetas

(clulas helicoidales).

En la clula eucariota se pueden distinguir dos tipos de clulas, la clula eucariota animal y la clula

eucariota vegetal. Estas clulas tienen estructuras en comn como: la membrana celular, citosol,

citoesqueleto, retculo endoplasmtico, aparato de Golgi, mitocondrias y ncleo; pero tambin tienen

estructuras propias que las caracterizan, por ejemplo: la clula eucariota animal presenta centriolos

y estructuras locomotoras como los cilios y flagelos, mientras que las clulas vegetales se

caracterizan por la presencia de una pared celular compuesta principalmente carbohidratos y

plastidios que pueden tener o no pigmentos.

Todas las organelas celulares trabajan coordinadamente para el funcionamiento general y preciso de

la clula, muchas veces resulta difcil entender este proceso de forma dinmica y con todos las

estructuras celulares trabajando a la vez y en estrecha colaboracin logrando que la clula se

convierta en una mquina biolgica perfecta que cumple sus funciones vitales de forma precisa y

constante, convirtindose en la pieza base de los organismos multicelulares.


31


La membrana celular delimita el territorio celular y como se ha observado en prcticas anteriores es

la puerta de entrada y salida celular, la pared celular presente en las clulas vegetales es una estructura

de sostn y proteccin. El citoplasma celular est formado por el hialoplasma, citoesqueleto y

organelas celulares. El hialoplasma es un medio acuoso, con un 85% de agua en el cual esta disuelta

gran cantidad de molculas formando una solucin coloidal; prtidos (aminocidos, enzimas,

protenas estructurales), lpidos, glcidos (polisacridos, metabolitos), cidos nucleicos (nucletidos,

nuclesidos, ADN, ARN, ARNt, ARNr) sales e iones.

El movimiento ciliar est adaptado al medio lquido y es cumplido por pequeos apndices

especialmente diferenciados. Se trata de filamentos contrctiles variables en nmero y tamao, que

reciben el nombre de flagelos, si son escasos y largos y cilios, si son cortos y numerosos. En los

protozoarios, hay centenares o miles de pequeos cilios cuyo movimiento permite al organismo

desplazarse con rapidez en el medio lquido. En algunos protozoarios especiales los cilios se fusionan

y forman apndices cnicos ms gruesos denominados cirros.

En Protozoarios, toda la clase flagelados se caracteriza por la presencia de flagelos. Entre los

metazoarios, solo los espermatozoides tienen la propiedad de desplazarse como clulas aisladas por

medio de esos apndices.

Las mitocondrias son organelas proveedoras de energa y los plastidios con pigmento cumplen la

funcin de dar color a las estructuras vegetales adems de la fotosntesis (cloroplastos), mientras que

los plastidios sin pigmento llamados tambin leucoplastos guardan los productos obtenidos durante

la fotosntesis.

COMPETENCIAS

1. Reconoce e identificar una clula procariota

2. Identifica y reconocer clulas eucariotas.

3. Diferencia una clula procaritica de una clula eucaritica.

4. Identifica las estructuras celulares en las clulas eucariotas.

5. Identifica y diferenciar las clulas eucariotas animales y vegetales.

6. Identifica las estructuras propias de las clulas eucariotas animales y vegetales.

7. Maneja el material biolgico siguiendo las normas de bioseguridad.

8. Diferencia los distintos tipos de microscopa en el reconocimiento de estructuras celulares.

9. Maneja muestras biolgicas hmedas y coloreadas para su observacin microscpica.

MATERIALES


Microscopio de campo claro

Goteros

Lminas y laminillas

Hojas de bistur u hojas de afeitar

Lminas fijadas de espermatozoides

Colorante verde de Janus

Solucin de rojo neutro

Aceite de inmersin

Papel lente

Lugol

Pinzas de punta fina


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Bacilo Gram-

Coco Gram+


Agua del pantano

Una cebolla

Una rama de Elodeasp

Plumn marcador

PROCEDIMIENTO

1. OBSERVACIN DE ESTRUCTURAS DE CLULAS PROCARIOTAS

Clulas Procariticas. Se observarn lminas fijadas de bacterias coloreadas con coloracin

Gram al microscopio ptico con el objetivo de inmersin (100X). Observe la forma y tamao

de las clulas. Esquematice.

Fuente: Laboratorio de Biologa. Universidad Cientfica del Sur

2. OBSERVACIN DE ESTRUCTURAS DE CLULAS VEGETALES

Ncleo, Nuclolo y pared celular: En una lmina portaobjeto coloque una gota de safranina o

azul de metileno y sobre ella un fragmento de catafilo de cebolla extrado con una pinza. El

fragmento tomado debe ser transparente y debe colocarse completamente extendido sobre la

lmina. Ponga una lmina cubreobjetos y sin aplicar presin elimine cuidadosamente el exceso

de lquido con ayuda de un papel secante. Observe al microscopio y esquematice sus

observaciones a 100X y 400X.

1000 X


33


Observacin de plastidios y ciclosis: Coloque una hoja de Elodeasp en una lmina, aadir una

gota de agua y observa al microscopio. Esquematice a 400X.


3. OBSERVACIN DE ESTRUCTURAS DE CLULAS ANIMALES:

Ncleo, citoplasma y mitocondrias: Con un hisopo estril haga un raspado de epitelio bucal y

estire la muestra en una lmina porta objeto y djelo secar a medio ambiente durante tres minutos.

Cubra la muestra con Verde de Janus y djelo reposar cinco minutos luego elimine el exceso de

colorante. Observe el citoplasma claro, limitado por la membrana, el ncleo ms teido y las

mitocondrias pueden ser observadas de color azul-verdoso. Esta coloracin se debe al sistema

citocromo-oxidasa, en cambio en el citoplasma el colorante es reducido a su leucobase.

Esquematice a 400X.

400 X

400 X

Nuclelo

Pared celular

Ncleo

Cloroplastos (clorifila) en Elodea sp.

Clula de catafilo de cebolla Allium cepa

400 X

400 X


34



Cilios y flagelos:

Observacin de cilios en Protozoarios: Coloca una gota del cultivo de Protozoarios sobre una

lmina portaobjeto y cbrala con una laminilla. Observe el movimiento de los cilios.


Mitocondria

Ncleo

Citoplasma

CLULAS DE EPITELIO BUCAL

Cilios

CILIADO Loxophyllum sp.

1000 X

1000 X


35


Observacin de flagelos: Coloque una lmina fijada de espermatozoides en el microscopio y

obsrvela a 1000x. Esquematice.


ESPERMATOZOIDE HUMANO

Flagelo

1000 X


36


PRCTICA N 6

OBTENCIN Y ANLISIS DE FRACCIONES

CELULARES

Fuente: Separacin de mezclas

http://quimicalibre.com/separacion-de-mezclas-cromatografia-y-centrifugacion/

Las diferentes metodologas utilizadas para el estudio de la composicin celular, entre ellas las

tcnicas bioqumicas, fisiolgicas y citolgicas. Permiten analizar en gran medida la anatoma y

localizacin de las estructuras y organelas celulares. Sin embargo, si se desea profundizar en la

funcionabilidad de cada componente celular se deben realizar ensayos bioqumicos y fisiolgicos.

Generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas con las distintas estructuras u

organelas.

Una de las tcnicas ms utilizadas para obtener dichas fracciones es el Fraccionamiento Celular, el

cual es un conjunto de procedimientos que tienen como principal objetivo obtener fracciones puras

o enriquecidas de un determinado componente celular, ya sea ste una organela como el ncleo,

mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, etc. Y dependiendo del estudio que se desee elaborar la

fraccin celular tambin puede estar compuesta por restos de membrana celular o por complejos

multiproteicos como el citoesqueleto de actina, microtbulos y poros nucleares.

Todo proceso de Fraccionamiento Celular tiene tres etapas:


37


HOMOGENIZADO

Ruptura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular), de tal modo que se liberen

sus componentes, en particular sus organelas, sin que estos sufran mayores daos y que se encuentren

en condiciones adecuadas para su purificacin. Para el caso de la ruptura celular, tambin existen

diversas alternativas como es; el mtodo mecnico, donde se hace uso de instrumentos como el

mortero, pinzas, homogeneizadores y ultrasonido que permiten la disgregacin y lisis celular. Pero

si se desea partir de un cultivo celular, no es necesario separar las clulas y se pasa directamente a la

lisis celular. En el caso del mtodo qumico, el uso de detergentes, enzimas y el shock osmtico.

Tambin cumplen con la funcin de romper y lisar la membrana celular.

FILTRADO

Proceso que consiste en la separacin de componentes no deseados presentes en la suspensin celular

mediante un medio poroso, que retiene slidos y permite el pasaje del lquido. Dependiendo de la

naturaleza del contaminante, esto puede ser tan simple como verter el homogeneizado a travs de

una gasa y recoger el filtrado en el otro lado.

CENTRIFUGADO (purificacin)

Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en fracciones,

es decir, realizar su fraccionamiento y el mtodo ms utilizado para este fin es la centrifugacin de

gradiente de densidad o tambin el de centrifugacin diferencial; cuando los diferentes componentes

celulares se encuentran suspendidos en un lquido, tienden a sedimentar hacia el fondo por el efecto

de la gravedad. Para acelerar este proceso, se puede colocar a un tubo conteniendo esta suspensin

en un rotor giratorio, de forma de someter a las partculas a una fuerza centrfuga.

COMPETENCIAS

1. Identifica las fracciones celulares a partir de hgado de pollo.

2. Deduce el rendimiento y pureza de cada fraccin.

3. Conoce la tcnica de fraccionamiento celular para el estudio de las organelas celulares.

4. Usa colorantes que identifiquen organelas especficas celulares.

5. Distingue los tipos de microscopa de campo claro y fluorescencia en las muestras preparadas.

MATERIALES:


Mortero

Gasa

Tubos ependorf de 1,5mL

2 beaker de 100 ml

Verde de Janus

Cubetas con hielo

1 beaker de 50 ml

Buffer Tris 10 mM pH 7,5

Colorante Hoechst 33258

Mytotracker

Lminas y laminillas

Microscopio de campo

claro y de fluorescencia.


38



10 gr. de hgado de pollo

PROCEDIMIENTO

1. Colocar el hgado en el mortero, asegrese de moler bien y de extraer los ligamentos

conjuntamente con la grasa. Realice una pasta uniforme del hgado y seguidamente adicione

20 ml de la solucin Tris 10 mM pH 7,5. Con una gasa filtre en un beaker limpio.

2. Transvasar 250 l del extracto a 2 tubos eppendorf y agregue 500 l de la solucin de buffer

Tris 10 mM pH 7,5. Rotulndose con la palabra ncleo. Centrifugue a 3000 rpm durante 3

minutos. (El pellet que ha quedado se denomina fraccin nuclear y resuspender en 200 l de

Tris 10 mM pH 7,5).

3. Coloque el sobrenadante del proceso anterior a 2 ependorf nuevos y mrquelos con la palabra

mitocondrias. Centrifugar a 10000 rpm durante 8 minutos. (El pellet que ha quedado se

denomina fraccin mitocondrial, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l

de buffer Tris 10 mM pH 7,5).

4. Ahora observaremos la fraccin nuclear. Para ello colocamos 10 l del resuspendido del

tubo marcado como ncleo, en una lmina porta objeto y le adicionamos una gota de Azul

de metileno y cubrir con una lmina cubreobjeto. Hacer las observaciones en el microscopio

de campo claro y realice sus esquemas. En otra lmina adicionar 10 l del colorante Hoechst

33258 y cubrir con una lmina cubreobjeto., dejar reposar por 2 min. Observe en el

microscopio de fluorescencia y realice sus esquemas.

5. Observacin de mitocondrias. Tomar el tubo marcado como mitocondrias y en un ependorf

de 0,5 ml adicione 5 l del resuspendido y 5 l del colorante mytotracker dejndolo incubar

por 10 min a 37C. En otro ependorf de 0,5 l realice la misma operacin y adicione 5 l del

colorante verde de Janus. Realice un frotis y observe al microscopio de fluorescencia y de

campo claro. Esquematizar a 400X


39


PRCTICA N 7

METABOLISMO CELULAR: PROCESO DE

RESPIRACIN CELULAR

Posteriormente a los mecanismos de nutricin y digestin celular, las clulas usan las molculas

producto de estos procesos como fuente para la elaboracin de energa que es necesaria para la

actividad celular, para lo cual pasan procesos como la desaminacin de los aminocidos, la beta-

oxidacin de los cidos grasos y la gluclisis que tienen como objetivo la formacin de cido pirvico

y otras molculas necesarias para los proceso de respiracin celular. El cido pirvico obtenido de

estos procesos, principalmente de la gluclisis, puede dependiendo del individuo y del medio en el

cual se encuentra ir a dos rutas metablicas:

La ruta aerbica denominada tambin catabolismo aerobio degradndose completamente hasta CO2

y agua, este mecanismo se realiza en las mitocondrias que actan como centrales energticas de la

clula y sintetizan ATP producto de esta degradacin.

La otra ruta mencionada es el proceso anaerbico llamada tambin catabolismo anaerbico, que en

ausencia de oxgeno transforma el cido pirvico en otras molculas degradndose parcialmente, esta

ruta tiene dos procesos ms estudiados: el catabolismo lctico que por accin de la lactato

deshidrogenasa se transforma en cido lctico y la va alcohlica donde el cido pirvico se

descarboxila formando un acetaldehdo y este es reducido por accin del NADH a alcohol etlico.

Este ltimo tipo de fermentacin la realizan algunas especies de levaduras como la Saccharomyces

cerevisae que son utilizadas en la industria de la panificacin y en la industria cervecera, estas

levaduras tienen la capacidad de poder realizar los dos tipos de respiracin dependiendo de la

abundancia de nutrientes en el medio, cuando se encuentran en un medio rico en carbohidratos

escogen la ruta anaerbica.

En la presente prctica, utilizando un respirmetro artesanal, se observar la accin de diferentes

carbohidratos como facilitadores en el proceso de respiracin celular anaerbica y la accin de un

antimetabolito que interferir en el proceso de respiracin celular inhibiendo una de las etapas de la

gluclisis.

La accin del inhibidor sobre la respiracin celular: La enzima enolasa cataliza la reaccin que

convierte el 2 fosfoglicerato (2PG) en fosfoenolpiruvato (PEP), la enolasa para reaccionar requiere

de la presencia de iones de magnesio que mantiene su estructura y de iones manganeso como

cofactor. En el siguiente experimento se usar el flor para precipitar los iones magnesio y as inhibir

la reaccin. Esta inhibicin se puede detectar como una disminucin en la velocidad del proceso

respiratorio, (disminucin en la produccin del CO2) en las clulas de levadura. Debido a que los

fluoruros son extremadamente venenosos para los humanos, maneje las soluciones con sumo cuidado

en este ejercicio y asegrese de lavarse las manos tan pronto como termine.


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COMPETENCIAS

1. Comprende los procesos de respiracin celular

2. Investiga el efecto de un antimetabolito en la respiracin celular

3. Demuestra la accin de algunos carbohidratos como facilitadores de la respiracin

anaerbica

MATERIALES:


9 Tubos de ensayo pequeos

9 Tubos de base grandes

Agua destilada

Solucin de glucosa al 5%

Solucin de fructosa al 5%

Solucin de sacarosa al 5%

Solucin de almidn al 5%

3 mL de NaF 0.01 molar

3 mL de NaF 0.10 molar

Pipetas

Gradilla

Varilla de vidrio

Plumn marcador para vidrio

Incubadora a 37C


Levaduras seca

Regla milimetrada

PROCEDIMIENTO

Fabricacin de un Respirmetro artesanal

Para construir un respirmetro simple, siga las siguientes instrucciones: llene con agua uno de los

pequeos tubos de ensayo (en el experimento se usa la suspensin de levaduras y las otras sustancias

en lugar de agua). Invierta el tubo de ensayo sobre el tubo de base plana. Hgalo rpidamente, de tal

manera que se derrame la menor cantidad posible de lquido del tubo de ensayo. Si hay burbuja de

aire, se mide con la regla graduada en milmetros; si ste contiene clulas de levadura respirando, el

dixido de carbono tender a acumularse desplazando as ms lquido. Despus de un rato, el

volumen de la cmara de aire constituye una medida de la cantidad de respiracin que haya tenido

lugar.

Preparacin de las muestras experimentales

1. Preparacin de muestras utilizando diferentes carbohidratos

Rotule los tubos de ensayo numerndolos del 1 al 5 por el lado curvo, mantngalos boca abajo

mientras inscribe el nmero. Llnelos como se indica en la siguiente tabla:

REACTIVO 1 2 3 4 5

Levadura 3 mL 3mL 3 mL 3 mL 3mL

Agua destilada 5 mL

Glucosa 5 mL

Fructosa 5 mL

Almidn 5 mL

Sacarosa 5 mL


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2. Preparacin de muestras utilizando antimetabolitos

Rotule los tubos de ensayo numerndolos del 1 al 5 por el lado curvo, mantngalos boca abajo

mientras inscribe el nmero. Llnelos como se indica en la siguiente tabla:

REACTIVO 1 2 3 4

Levadura 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL

Agua destilada 5 mL

Glucosa 5 mL 2 mL 2 mL

NaF (0,01 M) 3mL

NaF (0,10 M) 3 mL

*Llenar el tubo hasta el borde

Invierta cada tubo de ensayo dentro de un tubo de base plana para armar el respirmetro. Mida

la cmara de aire formada y anote sus resultados en la tabla de esta pgina como lectura inicial.

Lleve los respirmetros a incubadora a 37C durante una hora. Vuelva a medir la cmara de gas

de cada tubo y anote los resultados bajo la columna lectura final en la misma tabla.

RESULTADOS

TABLA DE RESULTADOS MUESTRA 1

TUBO Longitud Inicial

(mm)

Longitud Final

(mm)

( L. Final L. Inicial)

(Produccin de CO2)

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

TABLA DE RESULTADOS MUESTRA 2

TUBO Longitud

Inicial (mm)

Longitud Final

(mm)

( L. Final L. Inicial

(Produccin de CO2)

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4


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PRCTICA N 8

EXTRACCIN DE ADN

Fuente: AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit

http://bioneer.com.au/Products/DNA-RNA-Preparation-Kits/Single-Spin-Column-type-Nucleic-Acid-Extraction-Ki/Genomic-DNA-

Extraction-Kits-(1)/Genomic-DNA-Extraction-Kits.aspx

La biologa molecular es una de las herramientas ms tiles de las que se vale hoy en da la ciencia

y la medicina moderna, la extraccin de ADN es un tipo de metodologa que mediante la

manipulacin del material gentico ha permitido, entre otras cosas, el desarrollo de la clonacin de

secuencias de ADN para el estudio de mutaciones que estn involucradas en las diferentes patologas

humanas, mapeo y secuenciacin de genes con fines teraputicos. Con este conocimiento se logra el

desarrollo de la terapia gentica, el anlisis de diversidad molecular de especies, anlisis forenses y

de paternidad.

COMPETENCIAS

1. Extrae ADN a partir de muestras biolgicas.

2. Conoce las diferentes tcnicas de aislamiento de ADN.

3. Analiza cada proceso de la tcnica de aislamiento de ADN.


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MATERIALES

Extraccin del ADN

Kit de extraccin de ADN

Micropipetas de 20 100, 100 - 1000

l.

Puntas de 10 -100 l y de

100 -1 000 l

Tubos ependorf de 1,5 mL

Microcentrfuga16000 rpm

Vortex.

PROCEDIMIENTO

Extraccin de ADN usando kit de extraccin Purelink-genomic (Invitrogen)

Extraccion de ADN de sangre Total.

1. A un tubo ependorff, adicionar una muestra de 20 l de sangre fresca o congelada.

2. Transferir 20 l de clulas o sangre a un tubo que contiene 20 l proteinasa K.

3. Aadir 20 l de RNasa a la muestra. Someter a vrtex por 15 segundos e incubar a temperatura

ambiente durante 2 min.

4. Aadir 100 l de Buffer lisis y homogenizar utilizando vrtex por 15 segundos.

5. Incubar a 55 C durante 10 min.

6. Aadir 100 l de etanol 96-100%. Mezclar en el vrtex por 15 segundos.

7. Incubar la lisis por 5 min a temperatura ambiente.

Proceso de purificacin:

1. Colocar la lisis (260 l) en la columna de extraccin.

2. Centrifugar la columna a 8500 rpm por 1 min, descartar el filtrado por la columna y colocar la

columna en un nuevo tubo de lavado.

3. Lavar la columna con 200ul de buffer de lavado, centrifugar a 8500 rpm por 1 min y eliminar el

filtrado.

4. Colocar la columna en un nuevo tubo de lavado, adicionar 200ul de buffer de lavado y centrifugar

la columna a velocidad mxima por 3 min para poder filtrar cualquier residuo del buffer de lavado.

5. Colocar la columna en un nuevo tubo de recoleccin (1,5ml).

6. Aadir 100 l de Buffer de elucin a la columna.

7. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar la columna a velocidad mxima

durante 1 min a temperatura ambiente.

8. Para recuperar ms ADN, realizar una segunda etapa de elucin utilizando el mismo volumen de

buffer de elucin (opcional)

9. Incubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar a velocidad mxima por 1 min (opcional)

10. El tubo contiene ADN genmico purificado.

11. Almacenar el ADN purificado a -80C para otras aplicaciones.


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EXTRACCIN DE ADN (continuacin)

Cuantificacin de cidos nucleicos (Qubit)

Para la cuantificacin de cidos nucleicos existen diferentes metodologas, como es el caso de la

espectrofotometra que nos permite medir el ADN en microgramos, y la fluorometra de mayor

sensibilidad que nos permite medir pequeas cantidades de ADN expresando los resultados en

nanogramos.

MATERIALES

Extraccin del ADN

Qubit Kit (cuantificacin de ADN)


l.

Puntas de 10 -100 l y de 100 -1 000

l

Tubos de PCR (250 l)

Vortex

PROCEDIMIENTO

1. En un tubo ependorf de PCR colocar 1 l de la muestra en 199 l de buffer.

2. Calibrar el Qubit segn se indique el manual.

3. Medir las todas las muestras y anotar los resultados y comparar los resultados.


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PRCTICA N 9

FUNDAMENTOS DE LA REACCIN EN CADENA

DE LA POLIMERASA (PCR)

Y

USO ENZIMAS DE RESTRICCIN

La reaccin en cadena de la polimerasa, cuyas siglas en ingles son PCR (Polymerase Chain Reaction)

es una tcnica muy usada en el campo de la biologa molecular, la cual fue desarrollada por Kary

Mullis en 1986. El objetivo de esta tcnica es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de

ADN particular mediante una amplificacin in vitro. Es una tcnica de amplificacin selectiva, la

cual se basa en la capacidad de la enzima ADN polimerasa en fabricar una cadena de ADN

complementaria a una ya existente.

Para realizar la tcnica de PCR se necesita de:

Desoxinucleotidostrifosfato (dNTPs), mezcla de los cuatro Desoxinucleotidos que son el

sustrato para la sntesis del nuevo ADN.

Cebadores (primers),oligonucletidos complementarios a una de las hebras del ADN,

delimitando la zona de ADN que se quiere amplificar.

ADN polimerasa, enzima termoestable (Taq polimerasa) que se encarga de la sntesis de la

cadena de ADN.

ADN molde, molcula que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Solucin tampn o buffer, solucin que permite el adecuado funcionamiento de la ADN

polimerasa.

Iones divalente (Mg++)

Cada ciclo de PCR consiste en tres etapas: la primera, donde el ADN molde es incubado a altas

temperaturas para desnaturalizarlo y de esta manera permitir el fcil acceso de los cebadores al ADN

molde; la segunda o etapa de alineamiento, donde los cebadores hibridan con sus secuencias

complementarias del ADN molde y por ltimo, la etapa de elongacin en la cual la ADN polimerasa

sintetiza de los fragmentos de ADN a partir de los cebadores que ya se han alienado. La deteccin del

producto de una PCR se realiza normalmente mediante una corrida electrofortica.

Es por eso que el PCR es una herramienta que se ha desarrollado para ofrecer una alternativa para el

estudio del ADN. Debido al impacto dentro de la comunidad cientfica porque ofrece las siguientes

cualidades.

Sensibilidad: hace referencia a la mnima cantidad de ADN que es necesario para que se

produzca la amplificacin.

Especificidad: solo se obtiene un solo producto amplificado.

Eficiencia: amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero determinado de ciclos.

Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin.


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PROCESO DEL PCR

Fuente: Fundamentos de PCR

http://pseudomonas-syringae.org/outreach/Module_3_Home.htm/

Dentro de las aplicaciones de esta tcnica se pueden mencionar el diagnstico de enfermedades

infecciosas, en el diagnstico prenatal de enfermedades genticas, diagnstico de cncer, en tcnicas

de clonaje y secuenciacin de ADN genmico, los anlisis forenses, identificacin de sospechosos

con pequeas muestras de sangre, semen o pelo, identificacin de padres en litigios de paternidad,

microbiologa ambiental,


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COMPETENCIAS

1. Conoce los fundamentos en lo que se basa la tcnica de PCR.

2. Conoce la importancia del uso de la tcnica de PCR para el diagnstico de enfermedades en los

seres humanos.

3. Explica cmo se genera un fragmento especifico de ADN genmico humano utilizando la

tcnica de PCR.

MATERIALES


l.

Puntas de 10 -100 l y de

100 -1 000 l

Tubos ependorf de 1,5 mL

Microcentrfuga16000 rpm

Tubos ependorf

Termociclador

Agua estril

Muestras de ADN

Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs,

primer, Mg, agua)

Primers Alfa tubiluna y Beta actina.

PROCEDIMIENTO

1. En un tubo de PCR colocar 25 l de solucin de reaccin final (mix de PCR):

Componente Concentracin a la que se

conserva

Concentracin final en la

reaccin

Volumen a

aadir (l)

Agua ------ ------- 12

Tampn 10X 1X 7,5

MgCl2 25 mM 1 mM 1

Primers R 10 M 0,4 M 1

Primers F 10 M 0,4 M 1

dNTPS 10 mM 0,4 mM 1

Taq 5 unidades/l 1 unidad/25 l 0,5

ADN ------ ------ 1

Concentracin final de la reaccin 25

2. Centrifugar brevemente para mezclar bien los componentes.

3. Colocar los ependorf con la solucin de mix de PCR en el termociclador, el cual ya debe tener

programado las condiciones de amplificacin.

Desnaturalizacin Hibridacin Elongacin N de ciclos Mantener a

94C por 1 min 52C por 1 min 72C 30 seg 30 4C

4. Finalizada el proceso de amplificacin

manual de bcym 2015 - i

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