,' NOMBRE:

I TELEFONO :

MATRICULA:

CLAVE :

CARRERA :

TRIMESTRE:

' HORAS:

1

1 6 74 37 05 109588 81338594

23.3.54.86

ING. BIOQUIMICA INDUSTRIAL

87- I

30 I

LUGAR : PLANTA PILOTO DE FERMENTACIONES, UAM-I

FECHA DE I N I C I O : 20 DE J U L I O DE 1986

: FECHA DE TERMINACION: 20 DE ENERO DE 1987

i TUTOR INTERNO: M. EN C. MARIAN0 GUTIERREZ ROJAS

.

T ITULO:

ALUMNO :

PROFESOR ASOCIADO, DEPARTAMENTO DE

BIOTECNOLOGIA, UAM-I.

TRODUCCION DE ESPORAS DE A. NIGER

EN PLANTA PILOTO".

/

EMMA GABRIELA RIVERA COTA

TUTOR : !

M . EN c. PARIANO GUTIERREZ ROJAS

. .

1

U n reconocirniernntg muy especia l a mi a s e s o r M. en C . Mariano G u - ti6rrez Rojas y a.1 Pr. E m i l i o A.

. Nassocco, p o r t o d o el a p o y o br'in - d a d o en l a - real izac i6n de e s t e - t r a b a j o .

I N D I C E

.

Introducci6n ................................................. 1 Objetivo ..................................................... 3

1 . Materiales y &todos ..................................... 3

1.1. Microrganismo ........................................:... 3 1.2. Producci6n de in6culos .............................. ..: . 3

1.3. Tkcnica de conteo de esporas ............................ 4

!

1.4. Descripci6n de los esporuladores ........................ 4 1.4.1. Esporulador tipo 'botella ............................... 4

I . 4.2. Esporulador de discos rotatorios ....................... 5 1.4.3. Columna empacada .................................... .. 6 1.5. Diseño experimental ..................................... 7

1.6. Reologia del medio de cultivo ........................... 10 2 . Resultados ............................................... 10 2.1. Efecto del gasto de aire .............................. 5 10 2.2. Diseño factorial para optimizaciijn de fatores físicos . . 11 2.3. Adherencia del medio de cultivo ......................... 11 2.4. Diseño factorial para l a optimizaci6n de la conGentra-

ci6n de sales .......................................... 11 2.5. Esporulador de discos ................................... 12 2.6. Cinkticas de producci6n de esporas en columna .......... 12 3 . Discusi6n ................................................. 24 UXCLUSICNES ...............................:................ 28

Figuras: Dibujo de esporulador de discos ............................. 2 2

Dibujo de columna empacada .................................. 23

Tablas: 1.- Efecto del gasto de aire ........................... , ... 14 2.- Diseño fatorial para optimizaci6n de factores f ís icos ... 15 3.- Diseño factorial para optimizaci6n de conc . de sales .... 18

. . . . . .- . . . . . . . . I_ _" ~ . - .". .. . . . . . . . . . . .

Gr&f icas: la. Efecto del gasto de aire ................................. 13

lb. Cin6tica de'producci6n de esporas ........................ 13

IC. Recuperacih de esporas .................................. 13 Id. Esporas recuperadas ...................................... 13

c

, I N T R O D U C C

i . La derdanda dal de alimentos ha con eí crecimiento de la poblacidn

I O N

ammtado proporcicmalmnte y la escasez de &tos se ha-

ce cala dSa nds crftica, sobre todo en los pafses .del tercer - mundo.

Recienkmente, la habilidad de las espas fungales para llevar a cabo reacciones de transformaci6n quhica coauercialmente va- luables ha recibido considerable atencibn, y ahora se sabe que

las esporas poseen un ccmplejo enzimdtico capaz de la transfor- maci6n de sustratos aparenterrmte no relacionados con su metabo - lisno. Se ha desrrostrado que las esporas de -hongos filamentosos poseen un gran potencial cam agentes catalizadores en l a trans - formacidin de canpuestos org&Iicos. (Bihari et al.; 1984).

Tradicionalnaente se ut i l izan espras de hongos filanentosos pa- ra iniciar f m t a c i m e s en cultivos senisblidos; para la pro-

ducci6n de enzimas uxm alfa-galactosidasa e irnrertasa (Silman; 1980), amilasas (Raimbault; 19861, Ac. cftrico (-aya- na et,al.; 1985), Micotoxinas (Hesseltine; 1972) en e l mique- cimiento de diferentes sustratos cum la yuca (Rdinhdt; 1980), , la paja de trigo (Laukwics e t al. : 1984) , pulpa de cafe (Peñalo - za; 1985).

prcduccidn de: esporas se realiza de dos meras: en cultivo sunergid0 y en cultivo semis jolido. Vezina y colaboradores - - (1985) describen una IScnica sencilla para pruducir esporas a dtivo smergido, indicando que es necesario rea l izar estudios

.. con diferentes @os ccmplejos m obtener una buena esporda - ci6n. ~espu6s reprtarm que la @mica por cultivo sds6lido

presenta importantes ventajas sobre los n6tdos de cultivo sunergid0

en r6gimen continuo. En c u l t i v o s d s 6 l i d o se han producido espras , por h d d i f i c a c i 6 n de grm (Salas y Burgos; 1972) , en peques pe-i dams de pan blanco autoclaveados e inoculados hcmedos ( S a n s i n g y - C i e g l e r ; 1973) . Otras -cas mds Sfisticadas, con medio de cultiA

vo y coxliciones bXen dainidas, en I&races o en lecho estStico de

mayor tamaño tambi6n han sido utilizadas (Vezina y Shing; 1975, S i l -

man, 1980; Raimbault, 1981). ~ S O S y Raimbault (1985) han diseñado un reactor de discos rotatorios en los- que se expone una gran super-

ficie de contacto, con aire controlado, logrando altas productivida- des. 1 ;

P

La inaustria de fermentaciones que maneja hongos f i lmtosos en cul - tivo suwrgido y semisblido, u t i l iza in6culos masivos de esporas pa- ra e l inicio de sus procesos. La preferencia por esporas y no por mi - cel io se debe a que con esporas la f&taci6n se inicia con a u l a s

de edad hamghea, se evita. la d m a c i b n de micelio, que en la ma- y o r € a de los casos es frdgil , incidiendo en l a productividad global - del proceso, se minimiza la prbbabilidad de acarrear rrretabolitos no - deseables.

-

A nivel de Planta Piloto, la prcducci6n de esporas presenta serios -

.

problemas, tales cum: los altos niveles de p m d k i b n , la recupera" cidn de. esporas, mantenimiento de cordiciones est&iles y sohre t o d a r

I sostener las productividades obtenidas en laboratorio, por lo que se - I

requiere de un estudio que involucre e l pmblana de escdaniento des- I

de e l punto de vista del equipo, es decir, e l diseño del esparuladar misno, su instrumentaci6n, caracterizacidn y condiciones de aperacidn incluyerdo el uso de reactivos gradp eco, diferentes tamanos - de- @ d a y dist intos niveles de aireacih, entre otros,-

I

e -

. -

2

Q B J E T I V O

" D i s e i k y caracterizaci6n del equipo y las condiciones de operacih para la pmducci6n de -ras de Asperqillus .niger en planta piloto"

1.1 Micsoorganisrro: A. niger cepa 10, variedad hmnebeqii, de O f f i

ce de la Recherche Scientifique et Technique Outre M , Paris, Fran - ce. Cortesfa del D r . M. Raimbault. La cepa es conse~~ada en medio - de gelosa con perlodos de resienbra de s e i s mses, (Raimbault; 1981).

l. 2 Pmduccidn de in6culos: Se utilizaron matraces Erlen Meyer de - 250 ml. conteniendo 30 ml. del siguiente medio de cultivo:

Medio de cultivo #1

Harina de yuca 100 g,

Urea 10 g.

Fosfato rJbnapOtdsic0 20 g.

Sulfato de Amonio 40 g.

A v 1000 ml.

LOS matraces conteniendo e l medio de cultivo, fueron esterilizados - en autoclave, 15 minutos a 1 2 l o C , Cada matraz se jnoculd con 10 es- pas y 6e ind durante 7 dfas a tgnperatura ambiente.

6

.

-

- Las esposaS se recuperaron agregando a cada matraz 70 ml. de una s e ! " lucidn est&il de agua con tween 80 a l O. 2%, agitanao durante 15 mi-

nutos con agitador magn6tico. Findlmente la suspensidn de esporas se filtra con gasa es&il.

-

f

1.3 T&nica de con- de espora8 se utili26 e l &todo de menta directa

can &mara de Neubauer.

1.4 Descripcih de los esporuladores: C m el pmp6sito dd escalar l a -L.

producciba? de esporas de lalmratario a planta piloto, se selecciw- ron tres mzdelos carparativos de esporulador cano sustitutos de los matraces en que se produch las esmras en e l laboratorio.. ESMS ,- 1

I

tres mdelos se canpararm en cuanto i a productividad y facilidad de manejo de modo de seleccionar e l mbs -provechoso.

-

as caracterfsticas que se e s s a n del espordador a seleccionar son: que se opere bajo axdiciones bien definidas para poder reproducir re sultados, que sea de manejo prScti&o:; fdcil inoculacidn, mntenjmien-

to y cosecha bajo condiciones esSriles, gran superficie de cor$acto efectiva con e l aire.

-

1.4.1. Esporulador tipo botella: bote1la;rectangular en posici6n horizon- tal, de 35 an. X.14 cm. X 11 an.. A i a botella se l e adapt6 un taph

de algodbn con un tubo de vidrio por !:el cual se airea el medio, que - llega hasta el centro sin tocar e l medio de cultivo. E l aire es suni-

nistrado por una bcmba de & e r a pasando par un rot&netro para cantro_ lar e l flujo y por un filtro de algod6n para conservar las condiciones estSriles. ( D i bu j o I.J

-

El medio usado en &te esporulador es e l sig. :

* Medio de cultivo # 2

H. de yuca Sulfato de Amnio , 20 g.

Urea 5 i

Fosfato Manapotdsico 10 g. A w 500 d. 5

250 g.

I i

i . . .. *. . ."__,*_._ """"ll.".. .. - - . .. II ~ .' .. ". . .

as botellas se cargan con 1000 ml. de ste medio de cultivo y - se esterilizan en autoclave a 121OC dur ate 15 minutos.

una vez enfriadas, se inoc~lan con l o 9 . spras en - te 20 ml. de suspensibn.

m &te modelo el ti- de incubacibn es de siete dfas, am su ministro de aire a p a r t i r del -o &.a c u a n d o ' el micelio ha crecido.

m -pas recuperadas adicionando un litro de una soluci6n

de a- con tween 80 al O. 2%, c m agitacibn manual. vigorosa y -+ f i l e d la suspensi6n a traves de gas:-.

1.4.2 Esprulador de discos: Cilindro de ac3lico de 30 cm. de largo

y 15 cm. de didrmetro, con flecha de nylon que tiene adapta+

dos 19 discos de acrflico poros0 rugoso con didmetso de 13 un. cada uno, separado con tubos de almin5~. La flecha se conecta a

un mtor impulsor que hace girar los discos, y asf, e l sisterna - de aireacih, consistente en un tubo cc: 1 orificios de salida a - todo lo largo del esporulador , es m% eficiente.

En &te modelo, el aire es smiinístradc por una bcmba de pecera que pasa por un filtro de a l w n y f20ntrO~adO con un r- tro. La esterilizaci6n se lleva a cabo con una so!Luci6n de h i p -

clorito de sodio y d d s se lava con agua e s e i l caliente has - ta eliminarlo totalmente. Posteriarmwte, se carga coz 600 d. -

9 - ~ de medio de cultivo previamente esterilizado e inoculado con 10

-ras en 20 d. de suspensibn. Se hacen g i r a r los discos para que se adhiera el medio de cultivo a ellos. El exceso de medio -

- se drena. aire es- sministrado al d e e s del segundo d€a =

"

de incubacibn. -

C

1

El tiempo de incubacih es de siete d f a s l , desp&s de los cuales se procede a suspender las esporas producidas.

I

~a recuperacidn de las esporas se lleva a cabo adicionando al - esporulador un l i t ro de la soluci6n 6 80 a l 0.2%. Posterior mte, se hacen girar los discos para que las esporas se dew- dan de elrlos y queden suspmlidas en la'solucih de tween 80. La

rmspensi6n'de esporas asf obtenida, se drena y se hace pasar a - trm& de gasa e s e i l para liberarla de los resid- de'micelio y medio de-cultivo. ( 8 i b u h 2)

- . ,

L 4 . 3 . COP- enpaczda: Ca-siste t a un cilindro de vidrlo de seis - cm. de dk&tro interno y 45 cm. de altura, provisto de una cha-

queta por dode circula agua y que sirve cano dispositivo de m-

f riamiento. La columna ess gnpacada . c o n anillos rashig de vi- i.

drio de 0;75 un. de d i h t r o por 0.75 an. de altura, respetando l a g m t r z a recanendada (Dcol. /Demp.=8) . El sistepM de airea-

ci6n de la columna consta de esferas de vidrio en e l fondo de l a colmma que funcionan cam difusores. El aire es s a s t r a d o -- por una banba de pecera pasando por un filtro de al-n, desde e l fondo de la colmma y ;eS controlado por un rot&netro.

-

El agua de la chaqueta regula la tanperatma en el Seno de l a co

lunna durante l a incubacih ya gue cuenta con un regulador de - teqeratura "(3J-OFT" que se calibra de manera que esta se man- ga constante durante e l proceso.

-

- - -

La columa se opera de l a siguiente forma: se esteriliza 'haciendo pasar vapor de agua durante media hora a trav15s de ella. Una vez esterilizada, se llena la chqueta hasfa que l a tgoperatura se - non-nad!e. agua de l a chaqueta .~ circula " por comeCdi6n natural -

manteniendo e l seno de la colupllna a tgnperatura constante. cuando "

-

-6 ~

se operan dos oolmmas en serie, e l aire circula de una chaqueta a ,

otra, pero l a comrecci6n natural ya no es suficiente por lo que es

necesario adaptar una n e d t i c a para que aylde a l a circula-.l. I

c ih , con un flujo de aire muy pequeño y en un tramo pequeño del - I

sistana. i

, .

El medio de cultivo s e i 1 se imcüla a 45Oe ;con una suspensidn - de 10 esporas en aprax-te 10 d. de : suspensi6n, despu& - de lo cual, se vacfa por l a parte de arriba de l a colmma y e m - rre hasta &ir todo e l anpaque. El tignpo d e incubaci6n es de -

9 - .

siete dfas. \

as esporas se recuperan haciado pasar una solucidn es-il de a- \ ;

gua con tween 8D al 0.2% can la ayuda de una bmba perisrntica. - Las esporas suspendidas en las burbujas de la soluci6n salen par - una salida lateral en l a parte alta de &a colynm, no es necedio filtrar pues quedan libres de medio de cultivd y rnicelio.

1.5 Diseño experimental.- El todo do utilizado f& el diseño factorial L l I

j de Box y W i l q o n , que es un experbto en e l :.que se estudia simul - theamen- e l efecto de un cierto rdiaero de variables. ~

I El d t d o consiste en probar todas las canbinaciones posibles entre - 1 las variables a optimizar. La experimmtacibn sigue un orden secuen - 1 cial en el cual, los resultados de un experimento deteminan el si- I quiente. La serie de expesimentos enpieza cuando probamos todas las oxnbinaciones posibles entre 'k" variables, lo que hace un nCmer0 - de 2 -+tos. Se f i j a un medio base {m) y URa miidad de va- riacidn ( w ) tal que al variar el medio base en esa unidad, pueda -

b

- -.

k ~.

. . . . . . , . .. . . . . .. . . * "̂ l̂l."-. I

distinguirse un efecstp en e l parSmet~0 de respuesta, en Qste caso, el nCHner0 de esporas a l final de la incubaci6n.

.

!

Las variaciones se h a b amentardo y disninuyd UM unidad de - variacitk, e l valor de cada wariable alrededor del d o base y ha - ciendo todas las canbjnaciaraes posibles.

LOS resultados se tabdm separando en diferentes columnas los re- sultados obtenidos por variaci6n positiva o negativa de cada varia - ble . A continuacidn se calculan los praosdio de nas (cada colunma representa u" variable) asigndndoles el signo correspondiente, con coeficientes de la ecuacidn de la variable e l siguiente experimento.

cada una de las calm"

de resultados obtenidos objeto de calcular los de respuesta y p1,mea.r

~a ecuaci6n de la variable de respuesta es:

Y = b x + b x + . 1 1 2 2 . . . . .

donde 6 variables xi ; i= (1,2, . . . . k) , se expresan en W y Ins -

coeficientes se definen cuno:

donde: + xi = promedio de los resultados de las varia-- ciones.positivas en xi

- -. - - - X1 = promedio de los resultados de las varia-- ciones ~ negativas" en xi. "

-

8

los coeficientes de la variable de respuesta son parSmetms que

indican la rapidez de caanbio de la respuesta con respecto a cada variable, es decir:

a($)= % (b.X. 1 1 + . . . . . + b.X. + . . .+. %S) = bi 1 1

!

por lo tanto, al acercarse a cero fica que la respuesta se acerca a respecto a la i-bsim variable.

Para planear el siguiente experimento, se escogerd un valor ca- tral nuevo para cada variable (nuevo MB) , qe@ado de la mag- nitud de su coeficiente; es decir, el valor central de la i-bsi- ma variable se inmementarpa si SU coeficiente es positivo y d i s

minuirS si es negativo para mer esperar un efecto positivo en la respuesta.

f

-

r:

Cuando e l valor de bi se aproxime a cero, puede considerarse que

la respuesta s i acerca a un mdxim~. ES posible que no se obtenga un valor exad de cero durante la &imentaci6n por lo que p ~ k de fijarse'un rango del cual se mnsidere'que la respuesta SS-- lo suficientmente cerca del valor mbcimo.

I

Puede ser que algunos coeficientes se acerquen a cero mbs rbpicia- m t e que otros, de manera que en los siguientes e x p e r h ~ s m ser& necesario incluir todas las variables, puesto que para a3gu-

nas, ya se habrS alcanzado el mbzh, simplificdndose el trabajo-

I'ambi6n pw=de suceder que el: valor nunkico de la variable de res puesta sea rucho mayor que el valor de lasivariables a optimizar, por lo que al planear e l siguiente.experhen* no se pueden incre - mentar o dihuir las variables en la mediida que lo indique el - coeficiente; por este mtivo en rmxhos casos es necesario n0-i - zar la variable de respuesta de rnodo que adapte valores al -S

del misno oxden de magnitud que las variables a optimizar. h s -

-

9

I

"

ten varios dtcdos para nonnaliiar variables, uno m y sencillo COR

siste en dividir e l valor de l a variable de respuesta entre un mG1

tip10 de 10 (diganros 10 1 de modo que su valor c o n d e con e l va lor de l&.variahles a optimizar.

- 8

-

i

1.6 Fteolog~a del medio de cultivo.- Se realizaron pruebas de adhemn-

cia m e una superficie de vidrio vertical, p-0 diferentes - concentraciones de agar y de harina de yuca con e l fin' de encontrar las concentraciones que =jar adhenmcia y espesor de pelfcula p r e

porcionen a l medio.

2. HEsuLp1DoG ?

2. l. Efecto del gasto de aire. - Experimentos preliminares demstraron que a l -liar la superficie de contacto, la espnhci6n 110 se - produce, acln curdo el :micelio sf crece, a m31zos que se suminis-

tre aire a l esporulador. Este carp?ortmniento se present6 inclusive en e l esprulador tipo botella que es e l de menor area de contacto de los tres modelos seleccionados. Eh experimentos posteriores se encontr6 que si el aire se suministra a partir del segundo dSa de

. incubaci@, cuando el micelio ya ha crecido, los rerdimientos: :au- mentan.

Para encontrar - e l gasto de aire 6pti.m se utili26 e l esporulador - tipo botella, cuya descripcidn y operacih fueran descritos en l a secci6n anterior. & u t i l i 2 6 e l medio de ' C U f t k i m # 2, des

crito anteriormente. se pr~baran diferentes gastos de aire;.desde . O a 150 l/hr.

observar un mbcimo de r-enb en esporas por mililitro cuando se sunhistran 75 1. de a i r e h . 6 0.1380 1. de aire/an 2 -hr. (GRAFICA la),

-

10

I

1

I

El gas- de aire ass enmatrado se mantuvo en los tres modelos SeleCCiOMdOS.

I '

2.2. Diseño faclDrid para aptimiz&i& de factores ffsicos.- Se rea- lizaran una serie de experimn-s factoriales (seccibn l. 5) por - duplicado en matra& de 250 ml., se utili& e l medio de cultivo #I y la mtodologfa descrita en la seccih 1.2. ..

I

m s resultadps de l a secuencia de experimntos se 'inuestran en l a tabla #2 de dande su pueden extraer los siguientes datos corres-- pondientes a los 6gtimos encontrados:

\, -1

-temperatura de- incubacidn 34.5OC I'

-tanperatma de es ter i l izac i6n 121OC -m inicial 5 -ti- de es&ilizacibn 15 min.

2.3. 'Ádherencia del medio de cultiva. - Se enamtr8 que l a r m a y a r adhe

rencia a la superficie resulta cuando la ccmcentracidn de harina de yuca es de. 45 g/l. de agua y l a concentracidn de agar es de - 15 g/l..

2.4 . Di& factorial de l a optimizacidpl de l a co'ncm&rnidn de sales.- l a misma forma gue en la semi& 2.2 se realid e l ais- exp- .

rimntal utilizando m medio base -el medio de 'cultivo #1, incorPo_ rando a l medio cloruro de Calcio, ya que se ha d&strado que

menta l a prodicci6n de esporas (Fbussos; 1986) . Se taMlron en-.cuen-

ta los factores ffsicos ya optimizado asl cam incoxporar agar a l - d o de cultivo y disminuir la concentracidn de harina de yuca.

-1 amcentracibn de Urea 10 g/1 - cancentracidn de Sulfato de Anrani0 4Og/l - cmcmtracibn de Fosfatn bnopot&ia 2Og/l - mncentracibn de Cloruro de Calcio 5 g/1 !

I i

2.5 Espordador de discos.- Se realizaron varias f-tadrknes

&I &te mdelo de -, encantrbdOSe una produccibn - de 1 X 10l1 esporas totales. Se-enmntr6 tambit% que en el es podador se wntamjna con mucha facilidad.

-

?

tes grtificas mestran varias cMticas realizadas en el e- dador tip colmma enpacada. Estas grdficas correspanden a las cin6ticas de producci6n de esporas respecto al tignpo, es - poras recuperables y esporas residuales respecto al ti- y

esporas recuperables a diferentes tignpos de incubacidn con- tra volm de suspensibn.

~e Bstas grsficas deducinros que e l tignpo de incubacibn +ti- mo para la colmma anpaddda es de siete dl=. ' (Ver discusibn) .

12

&I

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4 . . . . . . . . / . . .

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!

TABLA NUM. 1

I

J

13 !

1

2

3

4

5

6

7

a

9

10

11

.12

O

11.13

20

40

47.61

48

49.24

56 38

75

85 '

115

- 0

O. 0206

i, ; 0.0370

O. 0740

1

O. O881

0.0888

o. o911

0.1044

O. 1380

O . 1570

O. 2129

141 O. 2611

3.4 x lo8 8.3% l o 7

3,95x l o 8

4.72x l o 8

4 . 4 ~ l o 9

7.07X lo7 6.07X lo7

1.15X IO8

4.17X l o 8

6.4W l o 8

5.7% 10 . 7

-

. . .

- -.

I

14

TABLA NUM. 2

I

i

- ~frnites de las Variables:

Tine

Test

*st

I

pH0

(+I MB

37 33.5

121 . ( m i n e 1 20 ' 15

7 .5 5.7

10

4

w

3.5

5

1.7

!

"

I

-.

15

. . . , ..

.

I

- Resultados: I '

1

i

,' 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16 -

Nh. P d O de Esp./ml.

2.00

2.20

O. 54 1.90

1.40

3.00

2.40

1.80

1.10

1. u0 1.40

1.20

u. 63 1.40

o. 73 O. 75

-

"

i

Ilc;m= &st Test pH0

:+I S. 00

2.20

0.54

1.90

1.40

3.00

-2.40

1.80

15.20 -

(- 1 3.10 1.00

1.40

4.20

O: 68

1.40

0.73

0.75

8.25

"

-

(+I '

2.00

2.20

O. 54 1.90

1.10

1.00

1.40

1.20

11.20 -

(-1 1.40

3 .-O0

2.40

1.80

O L68 1.40

O. 73 O. 75 12.16 -

(+I (-1 (+I (-1 2.00 0.54 2.00 2.20

2.20 1.90 0.54 1.90

1.40 2.40 1.40 3.00

3.00 1.80 2.40 1.80

1.10 1.40 1.10 1.00

1.00 1.20 1.40 ,1.20

0.68 0.73 0.68 1.40

1.40 0.75 0.73 '0.75

12.80 10.72 10.40 13.20 "

- Coeficientes:

T..inc.:

15.20 8 8

- - - 8025 = 0.873

O est.:

11.20 12.16 8 8 - - - = -.0.103

T est.:

12.80 10.72 ” - = 8 O. 257 8 -

PHo:

10.40 13.20 8 8

” - = 0.375

.

**Todos los resultados han sido mnnalizados dividi- la variable de respuesta entre 108

- 1.7

'.

- Lfmites de las variables:

U r b 1 15 10 . 5 5

Sulfato de Amnia 50 40 30 10

Fosfato mopotSsic0 25 20 15 5

Clo+ de Calcio 6 4.5 3 1.5

~ - "" O

!

1

2

3 4

5

6

7 ,8

9

10

11

12

13 14 15

16

UREA

+ + + + + + + + -

+ + + + - -

m. P r n . ESPORAS

1.12

1.98

1.30

2.77 1.69 ~

1.06 1

2.02

1.23

2.97

1.13

.l. 51

0.95

2.94 0.78

2.82

2.08

19

I

I

I

1

I

UREA ! m2*4 C a 2 a

(+I (-1 C+) (-1 (+ 1 (-1 (+ 1 (-1 i

1.12 2.97 1.12 1.69 1.12 1.3 1.12 1.98

1.98 1'13 1.98 1.06 1.98 2.77 1.30 2.77

1.30 1.51 1.30 2.02 1.69 2.02 1.69 1.06

2.77 0.95 2.77 1.23 , 1.06 1.23 2.02 1.23

1.69 2.94 2.97 2.94 2.97 1.51 2.97 1.13

1.06 0.78 1.13 O. 78 1.13 0.95

c

. . .

8

- Coefecientes:

Urea :

13.18 15.20 - -0.25 ""

- 8 8

Sulfato de Amonio:

Fosfato Fío~opot8sico:

13.69 14.69 - ~0.12 - r . . .. - a 8

- -. -

Clnruro de Calcio: "

16.39 11.99 - 0,-54 "" "

8 8

**Todos éstos resultados tian sido r--ormal izados 6ividién dolos entre 108.

20

. . . .. . .. , . . . ,. .-. 11" , ~ " - "

'I " U n A I _""" _"" -------

, : :iscos de a c r i l i c o li . j ado

/

- I

! '

I

tubos de aluminio

c

c

* . . . , . ..

!

I 80 1

i 60 I

r" I Í

Q I

DRENAJE

ENTRADA -k

3 77 I I I I

"""""I

-

A I k E

3. DISCUSION

En l a Planta Piloto de l a UAM-I, donde se real ize es te t raba jo , , se I

estS desarrollando u n proceso de enriquecimiento proteico de yuca en medio sblido, por l o que el f in de este trabajc consiste en di- señar el reactor que satisfaga l a demanda de esporas necesarias pa ra el inic io de esta fermentacidn. Para inocular cada 'gramo de yu-

ca que va a ser enriquecido proteicamente se requieren 2 X 10 es- pora s.

i I

I - -

7

Aún cuando l o s medios de cultivo y Gastos de a i r e en los esporula- dores utilizados son diferentes, es v d l i d a l'.¡a comparación entre e- l l o s , ya que para los f ines propuestos, 1 0 realmente importante es seleccionar u n reactor sencillo para que pueda ser escalado a mayo - res niveles de producción, que sea de manejo práctico y que ofrez- ca una a l t a productividad.

La influencia del a i r e en l a esporulacidn; no ,se conoce con exacti - t u d ; se cree que puede deberse a requerimientos de O2 de l a cepa o para l a remocidn be coz. LO cierto es Que exisre un gasto Bptimo - de a i r e como se muestra en l a grdfica #1 calculado en el esporula- der tipo botella y extrapolado a los otros dos podelos de reactor-. Esta extrapolacidn se hico con el f in de- simplificar el trabajo, - aunque puede no ser correcta, ya que el gasto de a i r e dptimo varía con l a eficienc.i.a del sistema de aireación, dependiendo de la dis - tribucidn de este en el reactor.

r

Se creía que el uso de reactivos técnicos pudiera a l terar l a espo- rulacidn devido a l a menor pureza de éstos en comparación ton los reactivos de laboratorio; sin embargo, comoise puede ver en l a ta- bla #3 , solo el cloruro de calcio tiene un cambio en su concentra- cidn respecto a l medio base que fué utilizado en laboratorio. A és - t e medio se le adicionó agar ademds de disminuir 1 a concentración - y el tamaño de partícula de l a harina de yuca, con el fin de lo--

-23

grar l a reología adecuada; es decir , que se adhiera a los discos en el reactor de discos rotatorios en caso de l a columna empacada, que ofreciera el grosor adecuado para que no bloqueara 1 os ani1 1 os ra- shig utilizados con@ empaque y permitiera el flujo de aire.

! ’

!

En l a optimizaciSn,de las condiciones de ester i l izaciSn, no solo se trataba de que el medio de cultivo estuviera libre de rnicroorganis- mos contaminantes, sino tambign que el grado de gelatinizaci6n de - l a yuca fuera tal que el sustrato fuera disponible para el mivroor- ganismo y l a reologra del medio fuera l a adecuada. Se encontró que l a temperatura y el tiempo de esteri l izaci6n no cambian respecto a las condiciones de laboratorio.

Como-primer pardmetro en la e lecc ión del esporulador, se hizo una - comparación de las dreas de esporulación y 1 as áreas vol umétricas - en cada reactor.

I

El 8rea volumétrica es importante para fines de escalamiento ya que cualndo es grande indica que el reactor cuenta con una gran superfi - tie de contacto en muy poco volumen de reactor por l o que peste ocu par3 un espacio reducido en l a planta donde se u t i l i ce .

-

-

La siguiente tabla muestra l a comparaci6n de áreas de los diferentes ’ model os de esporul ador:

-

MODELO AREA DE ESP.(cm2) AREA VOLUM. (cm /cm ) 2 3

Matraz Erlen Meyer 250 m1 . 50 o. 22 Esp. tipo botella 504 o. 1 Esp. de discos rcTatorios - 4297 0.9

Columna .. empacada - . 7688 - 10

En la tabla anter ior puede observarse que l a columna empacada, ademds de s e r l a que tiene mayor drea de esporulaci6n, es también l a de ma--

.

1 ’

Otras ventajas dela columna empacada son: es esteri l izable " in s i tu" en comparacih con el esporulador tipo bote1 l a que debe ser trans-- portado a un autoclave y el esporulador de discos que debido a su ma_ t e r i a l , solo puede ser es ter i l izado con reactivos qu!ímicos , que no - es una manera muy e f i c iente , trayendo como consecuencia l a presencia de microorganismos contaminantes; además l a recuperacibR de esporas al f inal rk l a incubac ih , es mas sencil la en l a columna - empacada por no requerir agitacidn manual.

Para s e r mds d.lustrativa l a comparación de produciivjdad de los espo- ruladores, se hizo el cdlculo de l a cantidad de reactores necesaria (T

para imocular 500 kg. de yuca para el proceso de enriquecimiento pro- r

te ico tomando en cuenta l a productividad promedio unitaria para cada tipo de esporulador. C

3

MODELO PRODUCTIVIDAD EFICIENCIA , , U N . NECES. PARA I - (esporas totl/reactor) Y RECUPERAC. NOCULAR 500kg DE -

YUCA.

Matraz EM 250 ml. 3 x 1o1O

Esp. tipo botella 1 x lo1* . (10%;) LOD

Esp. de discos 1 X lo1' (30%) : 33q Col umna empacada 1 x loll ( 75%) Is.\

En la tabla anterior puede observarse que el esporulador t i p o botella es el modelo que requiere de menso unidades. Sin embargo, s i tomamos - en cuenta l o imprbctico.que resulta el manejo de éste t i p o de esporula - dor desde la es ter i l ización hasta 'la recuperación de esporas y tomando en cuenta también el espacio que ocuparían todas ! las unidades, encon- traríamos que difícilmente podría recuperarse ésta opción, aún a una -- capacidad de planta de 500 k g . , mucho menos a niveles mayores.

.. . I . . . ... . . . "_ . . - 1..

g

La dificultad de ,escalar un modelo de esporul ador CON el de tipo bo- t e l l a , a menos que este escalamiento fuese lineal; es decir, a mayor capacidad de produccidn, mayor número de unidades, j u n t o con l o im-e prdctico de su manej.0, nos condujo a pensar que l a columna empacada - podr'ía ser el pronotipo con 116s probabilidades de ser usado.

e

La columna empacada no ha sido totalmente optimizada; fa l tar fa aún en - centrar la a l tura y d i amétro de reactor mdximos, 1 0 cual podr'ía condu - c i r a aumentar de manera considerable l a productividad de &te reac-- tor sin aumentar demasiado el %rea volumetrica de éste.

Las cineticas real izadas en el esporul ador tipo columna empacada mues tran que con el tiempo l a producción de esporas no decrece. Esto se - probd hasta wrun tiempo de incubación de ocho dias. Sin embargo, u n a l t o porcentaje de el la quedaba retenida en el empaque, es decir , no es recuperable el 100% de las esporas que se producen, como se mues-- t ra en l a grdfica número 3. Se observa también que es al 7" día de in cubaci6n cuando un mayor porcentaje de las esporas producidas es tam= bien recuperable. Por éste motivo se tomó como bueno el tiempo de in- cubacidn de 7 días.

-

-

E l hecho de que u n alto porcentaje de esporas sea retenido en la co-- 1 umna empacada después de 1 a recuperación, puede no ser considerado -

, como una desventaja, sino al contrario. Si pensamos que l a columna -- puede convertirse en un reactor de producción de esporas en .regimen - semi-continuo, .$Sta retención de esporas en el empaque se convertir5a en una ventaja ya que solamGnte ser ia necesarioi:añadir mas medio de - cultivo al reactor para in ic iar un nuevo proceso de produccibn, usan- do como indculo las mismas esporas retenidas en el empaque.

Esta opcidn aún no ha sido próbada pero creemos que seria una buena - manera de incrementar l a productividad facilitando aún mas l a opera-- ci6n. -

- -. -

26 ,.- . , . "

I

CONCLUSIONES

Durante l a primera parte de este trabajo, donde se trataron de deter7 minar l a s condiciones Bptimas de esporulacidn de A . niger, se encon-i t r 6 que:

l .

- E l uso de reactivos grado técnico no' afecta considerablemente la es - porulacidn, excepto el 'caso del Cloruro de Calcio del cual se requie- re una concentracih mayor cuando se uti 1 izan reacti vos grado tQnico.

* ,

- Las condiciones de esteri l ización son de 15 minutos a 121°C en auto - clave para el medio de cultivo. i ;

I'

- La temperatura de incubación es de 35°C.

- El pH inicial es de 5 . 2 P

2 - El gasto de a i re óptimo e5 de 0.1380"l. de aire/cm hora.

De los t res modelos comparados, el esporulador tipo columna empacada, es el que cuenta

-

- Presenta mayor I

con mas ventajas , entre el las :

drea vol umétri ca .

- Es de f á c i l operación, mantenimiento y cosecha. "

- Es ester i l izable " in s i tu" , manteniendo las condiciones estériles a 1 0 largo de la esporulacih.

- -.

- Las esporas que se obtienen quedd libres de medio-,de cultivo. ..

- Las condiciones de operacidn son fdcilmente controladas durante l a - incubacidn. -

2J

.. . .I.. . . . . . . . - . . . "

I- Debido a su geometrfa, cuenta con mayores posib i l idades de ser

escalado exitosamente a n i v e l e s mayores de produccibn.

! i

I

I

28

RESUMEN

La produccidn masiva de esporas de hongos t i e n e cada d'ia mayor importancia debido a su , c r e c i e n t e u s o en r e a c c i o - nes c a t a l i z a d a s p o r e s t a s , y p o r l a s v e n t a j a s que presen t a sobre el micel io vegetativo. como in6culo en l a s f e r - i ,

mentaciones industr ia les .

-

Es p o r é s t e motivo que s e diseñaron, construyeron y ensa yaron dos r e a c t o r e s a escala pi lota , cuyas product ivida- des s e compararon con el f in de s e l , e c c i o n a r / e l m b s ade-- cuado. I

-

También se optimizaron: la coaposicidn de medio de c u i t j - v o y las condic iones de e s t e r i l i z a c i d n e incubacidn p o r - medio del diseño factorial de Box-Wilson.

I

. . , . . . .

B I B L I O G R A F I A

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