TEMAN02.2

CINETfCA DE FERMENTACIONES

PROFESORES FERNANOO ACEVEOO BONZI ROLANOO CHAMY MAGGI

JUAN CARLOS GENTINA MORALES

Esc\,~a'dj, Ing*n(erIMllpquJmica. Universldad Cst6lica de ~alPararSO"

. ,'\ ) ' r

CINETICA DE CRECIMIENTO Y PRo'OUCCION

,. CRECIMIENTO MICROBIA NO

1.1 Cuant,flcaci6n del Crec,mlento Para el estudlO cuantllatrvo de La cinetlCa de procesos de letmenlao6n, ., necesano dlspon8t de ~fodos experimentales sencillos para determlnar eI creClrrUen!O de poblaciones microbia-nas. E!tos metodos deben considerar !II. modo de reproduccl6n de las ~Iulas procati6heas y eucari6IICBS de inter6s, .

las c61ulas procarl6tlcas baCleria1)as se reproducen pol" tisi6n bin.ria, proceso que se Inicaa con la rephcacl6n del cromosoma y Culmina con la separao6n de dos c81ulas identitas. sin que sea po!lble dilerenciar una 06lula madr. y una. celuJa hlj8. Pot etIo Is edsd maxima de cads

~ula baCleriana es ellapso campreodldo entre dos replicaCianes suceslvu. OISttnlo es el C'O(lo cepto de edad del cultjyo, q"" en un ,Istema por /o,.S e5 eillempo transcurrido deade la k"Iocu-18ci6n. De ello derNa el haeM que en un culllvo dEl' bacterias no 8JU$ten grandes drf8f'ancias en el estado fislOl6glco de !at di!lI~as Oel~as que 10 componen . .otra caraderislJCa mportame de aSia llpo de poblaci6n .5 que 1,9'C6lulU' se pf'esenlan en forma Individual 0 en asociaCiones d6biles de pocos indlWldu6a, '~diendo 5eI dJsp&ada.l ho~amenle en el medlO Itquldo de cultlvo' I

En el caso de.-Ios hong'~ organismos aucar.f6tlOOS, U debeo dl5tinguir la$ Ievaduras V los hoogos filamem,Os05 0 mOho.. las levaduras sa desarrollan en cflulas indivlCll,lates 'acilmente dlspersabkts, que se reproducen,par .,emact6n en condloones de pleno Q"ecIn)1ento, aunque lamblen poseen un cdc d. reproduc:ct6n mad,sme espates En el caso de yemac,6n se pro-duce una c'lula hip y permaoece viable Ia ceiula madre, por 10 que un Cut!I\IO de levaduras se puede conslder ... .Ntuu"0g6ne9 '11, cuanlo a la edad, Y polio tanto el eslado h!,ol6gIC01 de las c61ulas que 10 comPOf'leQ, Oespues de \.11) derermlnado numero de yemactOOeS la e6lula pierde viab.Udad. EI maximo nUmara' ter~ tie.'.vemacionea esta dado pot ,. (ela0i6n enue eI fttes superfICIal de Ia cillul. 'I eI ilea que oc:upa cada Cicalriz de yemati6n y .5 a!rededor de 100; en

.~ prEa:: =~s-:' =~~~:~,~~~: ~prC:=n(~:'.:n~~~) wuada mediante espolas. Sm ernbargo.en un cultwo ,n condlClOfles de laboratotio 0 Industrra, resulta mas rele vante fa formaCl6it de Mas (cadenas de celulas eon envolver}te celular comun) y su elongacl6n mediante 'a reprOtfuccl6n de las celulas d. los eKlremos ErcrElClfTueotO de las hifas puede ser ramlficado, eXlsll8ndo une comunlcaoon enlre las celulas a nivel de Clloplasma. aun en los casas en que se presentan septas o"divisiones Ifansveraales entre celulas EI conJunto de Mas

:,

-

.;. .."., ....

conslituye el micelio, cuya presencia e i!Jteracq6n con et !agua confiere al conjunlo del cullivo caracterlsticas reol6glcas nctneWlonianas y alIa consislencia. EI micelio puede desarrollarse en forma difusaJdlsuibuido en toda la masa de liquido. 0 bien en forma dlscrela (pellets) adoptando una moriologla1eslerica. Por lodo [0 anterior queda en evidencia que un cullivo de hongos fila mentosos no pueda sat considerado como homog~neo til cktsde el' punlo de vista fisico nj . dasda la perspecliva fiaiol6gica. Situaciones Slmliares se presentan en OttOS tipes de otganis~ mos de crecimienlO miceliar, tales como los actinomiceles. que difieren de los mohos basica-mente por ser procariOles. ~ - . ~'.'fT" -) ,~

Oada la diversidad de caracteristicas que presenlaplos-dislinfos cullivos. en las que inHuyen tambien en forma impol!8nte las prbpiedadeS'y compostci6n del rriedio de cullivo, se han desa-rroUado una varia'8a gaina de metodos de cuantificaci6n del creclmiento, los que aparecen resumido's en la Tabla 1. los' f8sultados-S,8 .axptesao;en unida:.des-de concenuaci6n. ya sea en base a numere de calulas o 'm~~ celulqr $egun sea at metodo utiGzado.

l~LAl "

Ga. ';"'o ~'~~ra,'awantillcaclon del creclmiento ~&:.J,2' ,: .. , t'6ti}":'l ~blacionltS microbian as (a) ,&(' Y~J~ ;l,Y. 'g ': .~!lL').

Mlttodos ':' .J ... bf!!~dampnto~; L Observaciones

Aecuento de celda

Aecuento de placa

Nefelomelfla N.M.P.

Pesoseco

- Turbidlmetr!a Volumen empacado

Fisico, y quimlcos

... Balance de masa ' lnstrumentates

CoIU:!~eGtClde-N ~~~~I: ruiJero de dolon;lIs. , Oispersi6n1de t~z , ESladlstieo. I Medt6rt-.direc't'- /

lran~~etu~/ Cenl tv ' f'KUlcultivo VariaClci. lndlrecw.

eons~lVacio{l d, masa. Varia 0 , t

1 -

Requiere dlutas Indivlduales y medio limpio Supone celulas individuates. lnlluencia condiciones de incubaci6n Aequiere culllvo homogl!neo y traalucido. Aaquiere celulas Indlviduales y medio IImpio. No admite componentes insolubles en el medlo, Itabajoso. Aequiere clItulas indivlduales y medlo hmplo. No admite presencia de solldos. Cambios de viscosidad pH Analisls de un componente celular Requlere varlados analisls. UtilizadoJ solos 0 en conJunlo con balance de ~"..~e.!!{rOlio.

_ v I. ~ (.) Mayor Informacion en Coo~~.!J~ t] Y 'llmia y. ~eif (1,1il.~5).;.: f ;J

Los metodos qere delerminan numero de celulas SOIl2flCl gNle/al preterldos en traba/os de eCletAtfP.der~y~Ia[~

f')~ ~q"'-

(1966 Y 19B6a) ha presentado y discutido con gran daridad los objetivos y metodologias de la clnetlca de fermentaciones. Basta por ahora cori"establecer que el adecuado conocimie'1to de la cine.lca de un cultivo permite la predicci6n del transcurso de !a fermentaci6n, la e~a!uaci6n de velocidades, rendimientos y productividades y entfega informaci6n Util para estable,per estrate-glas de producci6n y optimizaci6n del proceso. '

EI componamiento cinlnico de una poblaci6n eS!3 "determinado por un compfejo conjunto de factores gen~ticos y ambient ales, Entre estos ultimos destacan las Uamadas condiciones de opera06n (composici6n del medio, temperatura, pH y olras) y la ,modalidad de cultivo, enlre las que dl511ngUlmos el cuttivo por 10les (liamado tambian por cargas a tandas), e~Cultlvo continuo y el cufTivo pot 10les alimenlados a semicontinuo. .' . ' .'~' - .

Se puede delinir el cuilivo por Ioles como aque! que se realiza ~sin lntefcambio de materia con los alrededores, salvo 10 felefente a los gases (aireaci6n, producci6n~ae CO;y ottOS gases) que se suminiSlran y retiran del sistema en forma continua. E'n esta modalidad de CUitlVO se cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocula con una determinada canlidad de cajulas vlables Se Inlcia asi el cuhivo, et que tfanscurre de una forma caracteristica, dada por la Hamada cUiva de crecimienlo, hasta que algun evento, tal .como el agotamienlo de un nutriente 10 dellene

La Figura 1 esquematiza la curva de crecimienlo. La formaC""que-se 'aprecia se da siempre que se cumplan cienas condiciones: el cultivo se realiza por lOtes, todas las celulas que COtTY ponen la poblaci6n se reproducen a inlerva/os regulares, no existen en el media de cuhivo sus-tanClas Inhlbldoras del crecimiento y su composici6n es simple,''l especial en relacf6n a las fuentes de carbona y nilf6geno.

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TtE M'po-; t .', * Fig. I . Curva de creoimienlo en CIJUivo Por loles ,''t' "

La curva presenla vatlas zonas 0 fases, a saber! ~ . _. . -- Fase de lalenda (a); se produce Inmedlatamente cfespJis de inoc~;do el cullivo. Durante ella no hay iniciaci6n de replicaci6n de DNA nl separaci6.{d"e n""'uevas celulas. Se reproduce el reacomodo de 18 composlci6r1 mcacromolecular a~ f)~evo autbJente -81) que. se encuentran las calulas inoculadas, - .:.,. ',. , . ~,

Fase de crecifTllenlO e)l;pooencial 0 logaHfmicO (l:1)~ laS" calulas se encuentran en plena reproducci6n a una velocidad que'es la maximti para el jueg~ de Q;l:ndloones ~iSI~ntea-, por no existir hmltacion de nUlnentes. ,I . :". '

celulas hsadas proporciona tos nutrientes requeridos para el crecimiento, Es poslble distinguir tambien conas lases de aceleraci6n y desaceleraci6n del crecimiento_ La tase estacionaria puede presentar una leve pendiente positiva si el nutriente agotado es,

per StSmplo, la 'uente de nitr6geno, En ese caso el catabolismo de la fuenle de carbono y energia puede contlnuar por algun tiempo, con acumulaci6n de compuestos de reserva y sub-secuenle eumenlo de la biomasa,

51 18 curva se construye utilizando numero de celulas en vez de biomasa, tambien apatece ran algunas dilerencias. Durante la lase de latencia no habra aurnento alguno y bien puede haber una clerta disminuci6n en el recuento de ceJulas viables, En cuanlo a la lase estacionaria, no se apreclara el aumento discutido en el parrato anterior en caso de lirnitaci6n por nitr6geno.

La fOlma de la curva de crecirniento se altera en el caso de otganlsrnos filamentosos que no presentan una lase propiamenle exponenciat, en especial cuando et Cfecimienlo es en forma de mesilio dlfuso,

EI crecimiento de una poblaci6n bacteriana puede set represenlado por.

(1)

La velocidad especifica de erecimiento, ee, es constante durante la lase de crecimiento exponenclal y en la Figura I corresponde a la pendiente de ese grafico semitogaritmico en la lase exponencial, ya que:

,< , A.=_'_~=-~ )(. dt dt (2)

Durante la lase eXpo1)encial es posible Integrar la ecuacI6n (1l entre limltes adecuados resuhando: '. -

~/,' ", In _x_ .'-~ (

x. ,J' ,

o bien'

X-Xoe(;t.t ? (4) EI parametro ,ol.\, es de especial relevancia en el estudio de cinetica de fermentaciones. 5i se

examinan sus dimensiones basicas, eslas resuJtan de liempo-l, por 10 que se Je expresa en h' l comunmente, 0 bien en min,1 0 st '

Relacionado con.M,. exlste olro pa(amelrO cuya interpretacl6n !lslca puede aparecer como mas dlteCla: el ttempo de duplicaci6n I , delinido como el intervalo de tiempo entre dos duPJica-dones suces~vas. Si imponemos esos 1'miles para inte9~ar la_ecuacl6n (1), resulta;

102 'd"-,...--

La Tabla 2 enlfega rangos de vaJores caraCleristlc,?s de 1

Tipode celule

Baclali.s Levaduras Hongos lilamentosos Microalgas

TABLA 2

Tiempos de dupllc8ci6n car8ClefiSIlCOS

Cjlulas animales In viliO

0.3-2.0 1.0-4_0 2.0-7.0 18- 35 20- 40

0.3 Z.13 /.0-10

~o- q.o

Los valores dados como pauta general en la Tabla 2 no son minimos nj milximos, sino que cilrastipicas.

Las ecuaciones presentadas en los parralos precedentes. estricamente validas para el caso de fisi6n bin aria, se emplean tambien con bastanle seguridad en el case de levaduras y con reservas para organismos filamenlosos, pala los cuales se han propu9SIO e)(presiones dlsMlas (Koch, 1975). 1.3. lnfluencia de los Factofes Ambientales La velocidad especifica de crecimiento depende del microorganismo en cue5ti6n y de todOs los !actores que delerminan el ambienle en que se desarroUa la poblaci6n. Entre estos casos cabe mencionar la composici6n del media de cul,ivo, las caracteristicas reol6gicas del cullhlO, la lem peralura, pH, eH y actividad lermodinamica del agua.

En el e!ecto de la composici6n del media, se puede disllnguir un aspecto cualitallVO y uno cuantitalivo. Es aSt como la calidad 0 naturaleza de los nUlrientes influyen en eJ valor de~. Ello es especialmente cierto para el caso de Jas luentes de nitr6geno y carbono y anorgla. Normal-mente la glucosa resulta ser mejor" fuente de cal bono y energia que OlrOS sustratos, relle)an-dose ello en un mayor valor de,l.(, . Sin embargo, para cienos mlCfoorgaOismos eXlsten meJores suslratos que la glucosa.

EI aspecto cuanlitalivo del electo de la !uente de carbona y energla en "'" lue eSludiado pOi Monad (1949), quien observ6 experimentalmenle la relac:6n de la Figura 2 y propuso la siguiente ecuaci6n:

(6)

La aplicaci6n de eSla ecuaci6n 58 ha extendido a las fuentes de OIros nutnentes, ademas de la de carbono.

Los valores de la constante de saturaci6n, Ks' son del orden de las unidades 0 decenas de partes por mill6n (Tabla 3), por 10 que cuando' la concenlraci6n de susllato es de! orden de los gramos par Iltro, M.. se hace igual a..c.L para ios eleelos practiCOs. Debido a ello, el valor de la pendienle en la lase exponencial de la ~igu(a 1 es M.M

La relaci6n de Monod se aplica al caso de creclmlento no inhlbido. SIO embargo as cornun que el CU111vO se yea afectado por concentl3ciones lelalivamente altas de sustrato 0 productOs (\ler Fig. 2). Para esos casos se debe modifiesr la ecuaCl6n (6), adoplimdose relaciones lales

~ = 1-1 .. -("'K,--'-' 0;5),,5"(1 .,.., "'5" vKJ"'-- (7)

03- -z..3 01. _o.ry

0 ' 1_ o}

(8)

!I( CONe . SUSTRATO , 5

Fig. 2. Dependencia de 14 velOCidad especrtica de crecimienlo con la eoncenlfacl6n de IUSlfalO

TABLA 3

Valeras seleccionados de la constante de saturaci6n (a)

Sustralo

Glucosa Glucosa Glucosa Glucosa Lactosa Melanol Fosfato Magnesia Arglnina Tript6fano

(a) Datos de Pin (1975), p. 12

Organismo

Escherichia Aspergillus Saccharomyces Candida Escherichia Pseudomonas Escherichia Klebsief/s Aspergillus Escherichia

KS (mg/l)

0.07 2.0 5.0

25.0 4.5

20.0 0.7 1.6 0.56 0.50

5.0)(10.4 _1.0)(10'3

Un faClor ambiental que liene una decisiva inlluencia en e! valor de "",es la temperatura de cuttivo. La Figura 3 enlrega la forma tipica de la dependencia de estes parametros.

Fig. 3.lnlluencia de la temperatura en la velOCidad;espedlica de crecimienlO.

Como se aprecia en la Figura 3, existe una derta t~mperatura denominada temperatura 6ptima de crecimiento, a la cual el valor de M..es maximo. I La rama Izquierda de 1a curva puede ser modelada por una expresi6n de tipo Arrhenius: '

(9)

No se dispone aun de una ecuaci6n simple que modele adecuadamente loda la curva. Los valores de la energia de activaci6n varia en el rango de 826 kca1jmol, dependiendo del

microorganismo en cuesli6n y de la composid6n del medio de cultivo. La ubicacibn de la lemperatura 6plima determina la clasificaci6n del microorganismo en

sicr~:I~~I::~:r:~u~~~~r:~:IOp~ ';s ~l~~:rs~i~ ~~~~~r~!~ !~~~~~~oo (~~~ s~ ;!~~nta un pH 6ptimo. Sin embargo la forma exacta de 1a curva es mas vanada y no se ha lormulado un modelo malematico simple y general para representarla. Aun quftlexisten numerosas excepcio nes, como regia general el pH 6plimo para bacterias eSla ubicado en elrango de 6 a 7.5, el de levaduras entre 3.5 y 5.5 Y el de los nohos se extiende, segun sea la cepa considerada, de 3 a 7. EI polencial redox, eH, del culllYO liene importancia ya que posibdlla la ocurrencia de las reac clones de oXldaci6n del sustralo y es especialmente relevante para organismos quimioaut6tro-fos que uti1izan una reacci6n quimica inorgfmica como fuente de energia.

Finalmente, entre los parametros ambienlaJes que influyen en ~ cabe consignar la actwidad termodinamica de ag12a. los microorganlsmos requieren de ciertos niveles minlmos de activ;" dad de agua que posibihte el transporte de rtutrienles y productos y la manlenci6n de 1a compo-sici6n interna de la calula. La mayoria de los microorganismos (equiere actividades mayores de 0.8, aunque existen mohos y levaduras osmofilicas que pueden crecer a actividades de agua tan bajas como 0.6. Este factor adquiere especial relevancia en el deterioro microbiano de alimen-lOS de humedad intermedia y en los procesos de fermentaci6n en sustralO s6!ido (Nickerson y r 1\ 1 S;n,key, 1972, T,ng .. dy, 1985). P.N~ oawo.o Co" [0' '''. It , ~ cr, f'. "'~ ) \ ",odolo .... I"'" ~

2. MEDIOS DE CULTIVO

2. ,. Requerimiemos Nulriciona/es . EI proceso de reproducci6n celular puede represenlarse esquematlcameme en la forma que

muestra la FIgura 4a. S! la sltuaCl6n se examlna desde una perspeCl!va cuantilaliva, se debera conduir que para que la representaci6n a) sea posible, se debera cumptir con 10 formulado en

b), de manera de no vi olar los principi os de conseNaei6n de masa y energia y poder sinlelizar una nueva eelula igual a la anterior.

o -, o )

o

bl ENERGIA MATERI. 3 [CElUlAS

INFOR MACION L ____ J PRODUCTOS

Fig. 4. ReplOduccl6n celular a) Formaci6n de una nueva c6lula b) Requerlmienlos cuanU\ativos.

La informaci6n requerida para la eonstrueci6n de la nueva eeluta eSla conlenlda en el ero-mosoma y es Iransmitida de generaeion en ganaraei6n sin faquetir auxilio exlerno. La materia debe ser suminislrada exlernamente a Iraves de los componentes del medlo de cuitivo que son ealabolizadas a un conjunto de compuestos inlermedios que siNen de punto de pan ida para la sinlesis de macromoleculas. La energia la obliene la celula a Iravi!s de reacciones bioquimicas adecuadas en base a uno 0 mas componentes del medio de cuhivo lIamados fuentes de ener gia 0 bien directamenle de la radiaci6n solar en el ca90 de organlsmos fOlosinteticos.

Mediante eSle enfoque es posible represenJar el crecimienlo microbiano como una ecuaci6n quimica (0 mas propiamente bioquimica, par se catalizada por enzimas) que se rige por los principlos eSlequimelricos y cineticos.

1 C.H,,oc + mNHJ + ... + n01 ---> q C"H.O,N, + r CO, + tHP + u C~I"IPIN. (1q (celulas) (producto)

La biomasa se representa mediante una f6rmula basada en su composiCi6n elemental De ella es posible calcular un peso molecular promedlo aparenls, que es un submultlplo de 10 que saria eJ verdadero peso molecular promedio calculado en base a la composrci6n molecular de la celula. Para efectos de calculo, 10 que inleresa es que la masa celular eSla correctamente represent ada por el produClo del peso molecular por eJ coeficiente eSlequiomelrico respectivo

Para su desarrollo y reproducci6n la celula neceslla de cienos nulrienles en eJ medio. ESlos nUlrlenles deben, a 10 menos, aportar los elemenlos de los que squella eSla compuesta. En la Tabla 4 aparecen las composiciones lipicas de baClerias. levaduras y mohos.

TABLA 4

Composici6n quimica de dlulas mlcrobianas

"" en peso, base seca Elemenlo

bacteria! levaduras mohos

Carbono 4652 4652 45 55 Hidr6geno 812 8,'2 812 Oxlgeno 1824 1824 1824 Nitr6geno 1014 5-. 3-7 Magneslo 0.10,5 0.1 0 .5 0.10.3 F6sloro 2.03.0 0.80.25 0.44.5 Azulre 0.1 1.0 Om0.25 0.10.5 Calclo 0.01- 1.0 0.1 0.3 0 .1 1.4 Potsllo 1.04.5 1.0-4.0 0.22.5 Hi.no 0.020.2 0 .010.5 0.1 0.2 OUOI < 0.01

Los medias de cuttivo complejos son formulados en base a desechos 0 subproductos y extraClos nalurales, tales como melaza, licor de maceraci6n de maiz, extracto de levadura, peplona y olros. Por ello su composici6n quimica es compleja y variable, existiendo en ellos varias fuentes de cada elemento. Estos medio requleren muchas veces ser suplementados con compuestos que proprocionen cantidades adicionales de algunos elementos tales como N, Mg Y P. Los medios complejos 'son extensamenle ulilizados en microbiologia basica (Iaxonomia. fisiologia, genetica), microbiologia analihca, microblologia de aguas y allmentos y en fermenta ciones induslriales.

Los medios definidos se formulan en base a compuestos puros, tales como glucosa, sulfato de amonio, metionina, fosfato monoacido de pot asia, etc. Oebido a ello su composici6n qui--mica es conocida y reproducible y usualmente contlenen una sola fuente de cada elemento, ademas de los nutriemes esenciates que pueden ser requeridos. ESle tfpo de medio es usado preferentemente en invesTigaci6n basics y aplicada y en desarrollo de procesos de fermenla-ci6n. En el campo industrial. se percibe un creciente fnteres y utllizaci6n de medio delinidos.

Una ctase especial de medio definido es eillamado medio mlnimo, que podemos caracteri--zar como aquel formada sola menta par una luente de cada elemenTo. EI tipico medio minima esla compuesto por glucosa, sullalo de amonio y olras sales miner ales.

En la Tabla 5 se entrega un listado parcial de componentes de medios complejos industria-les y en la Tabla 6 se dan ejemplos de medias definidos, donde se puede apreciar que estos pueden Uegar a ser basTame complicados en su formulaci6n, pero siempre conservan su caraCleristica basica de ser quimicamente definidos. .

Componenle

Me!aza UCOI de maceraci6n de marz Ucor de sulfito Permeado de suelO VinaZAS

Harinas de soya y pescado Hid/oliudo y .xl/acto de

TABLA 5

Componemes dll medic complejos Induslliales

Ofigen

Induslriaazuc81111a SubploduCIC del procesamlenlo de malz. Oesecho de la indu$IfJa da pulpa y papal. SUbprodueto del plocesamiento del SUBIO de tache. Subproducto de la Ploduccl6n de elanol POI felmeOlaci6n. IndustriaJizacl6n de soya y pescado. Industlia produelora de leva dura levadu,a fOllaJera ydepanificaci6n

Cada tipo de medio presenta caraClerislica favorables, asr como lamblen algunas desventa jas. Los medias compleJos son preferidos a nlvel industrial fundamental mente por ser mas baralOs, pero tam bien porque en cienos casas se abllenen can elias mejores rendimientas y produClividades.

-

0 . -:1. .05/1 Can,vet de lar} ) , _ '''' g/I (w",,,,,-kdo . d:, lob

It) SO 9/1 ( ,,.v:J,...,J-,;a / . lcO- 1-SO ':1/1 Clb """"'~)

L" II "",k ",6r ~co 10 '\ ~ ~,c...or, cek.>lor C -Jc,b\a.3' .

: fUeu1e r!e ~odc el~i i Rer.dJ"""",-lu y~ IS

t:JemplQ5 tn. l,n,",1H,I~ V'l!"'" ...... :.

Glucose 18.0gl Glucosa so.og/l

~HS*S04 3.2 :~~~4 6.0 7H2O 03. 0.' ~~~~~4 0.66 K2HP04 1.2 0.008 N." 0.02 FeSO" 7H2O 0.002 ~~:?C~~O 0.02 CuS04 5H2O 0001 40.0 2IIS04 7H2O 0003 15aminoacidos 01'().6 CeCI2 0028 4nucle61idos 2JtlO~~03 COC12 6H2O 0.0002 10\lItaminas " B,

media minima caJculado pafa 6 gil, eon (NH,'2S0. como nUlfiente I1mitante y biomasa de 7.5'" N. .. medio pafa ensayo de lisina. Dilco Labofatories Inc.

Ena es debida a que al contener una variedad de moleculas orgfmicas evila a la celula ellra-balo de sinlelizarlas a panit de glucosa y compuestos inorganicos. Par otro lade los medIa definidos, si bien son mas onerosos, permlten un mejor control de las conchclones ambienlales de crecimienlo y producci6n, res!Jltando lacil excluir sustancias t6xicas 0 inhibidoras e incluir precursores e inductores en los niveles adecuados. Par ello eienas lermentaciones que requie-ren un control ambiental estricto resultan mas ptoductivas cuando utilizan un medio definido que un medio complejo.

2.3. Rendimiento de un Nutriente en Ce/ul8$ Para la formulaci6n de medias de cuilivo y para el eSludio cuantJ!alivo de los procesos de lel-menlaci6n, resulta-convenienle definir un patamef(o denominado rendimiento de un nutriente en celulas, Y XIS' como la masa eelular obtenida par unidad de nUlfiente consumido.

X blt1TlaSa celular produclda y ~ = ~ = nutnenle consumldo (11)

L------=t'2) ('3)

EI papel del oxigeno molecular en el melabolismo aerobio (ecuacl6n 10) no es proplamente el de nutriente. Se sabe que ese oxigeno no se incorpora a la biomasa sino que al agua produ-cida y que su rol es aCtuar como aceptor final de electrones en la cadena de Iranspone de elec-tmnes V fosfofilaci6n oxidaliva de ADP. Sin embargo por convenieneia se define un rendlmlenlo de oxigeno en celulas, Y 02' de manera similar al rendimlento Y x S'

En un cultivo par lotes, Y s se puede considefar consla~te, pero estrictamente el rendi-mlenlO de la luente de earborf6 y energia depende de la velocidad espedflca de crecimlento.

-F 11 _/0 ",,"'e~~ '/. & 4 CfI"'/al/ 1

----------------- -----

Para encontrar 18 relaOOn entre ambas S8 puede recurm a f n balaQI18 de masa de la tuenla de carbona y 8n8rgia: Jo,.f'""t4 :-cv): (t A'!'l

t'" ..,o".r ~'" 65T - 6.Sc; + 6,SM + 6,Sp t: (14)

En Ia ecuaci6n (14) S8 expresa que al tOiai de IU5ttato consumldo S8 utlhza para creci-mlenlo, mantencl6n y produccl6n de 81gun metabollto ex1racelular.

El termino de crecimienlo engloba 81 suslrato consumido desllnado a format parte de la biomasa y 81 utitizado para generar la energia necesana para la biosinlesis; esta ultima porci6n aparece como CO

2 en la ecuaci6n (10): Ellermlno de mantenci6n S8 reriere al sustralo utllizado

para generar energia para tunoones dlSMlas at creclmlenlo, como son 81 transporte de nulnen-tes, la rota06n de proteinas. el equilibno osm611co y ottas (Pu't. 1965). Elt6rmino de proclucto puede 0 no estar presents a&Qun 81 mlroorganismo consIder ado y las condiciones de cultivo .

..l:::. Oividlendo la ecoaci6n (1 4) par 6 t y lIevandoallimlfe cuando 1-> O.

~'~I'~I'(:~I T c M P

('~

SI se consIder a que ~.....Qducci6n de metabolllo extracelular y se reemplaza cada ler mino en funci6n de parAmetros del CUItIVO,

~.~ .~.mx 1 ' , , -- --.- .. m (-) YM Y M ~ J ('6) ('~ de ;~:~~~~~~~~~:i=s~n~'~;: ~;:~~~:n7: e6~~~~:e;~~ ~~ b~:a~~=e~~I:::: ~~";;:. mente ya que no es poslble dlscnmlnar por anallsls quimlco la po~t~n del Iota! de sustralo con ~~~~:n~~see ~rd:!~~~~:6~:eCC:~~I~'muEe:t::~~~d F~~{f 5e~, ~:eli:,ebi:=m~~e~~~~ el valOf del coeficlente de mantenci6n m

La Tabla 7 enlrega algunos valores de m, paramello que depende del mlClOO1ganlsmo y de las condiciones de CUlhvO.

= b..dra"" rdvvdo. s.,sJ.,,;1o Cou~~d. "'"' ""ev"'fQU~

' 2

LactobaciJtuscasei Aerobacta r cloacae Saccharomyces carevisiae

~nici'hvm chrysogenum CandIda vlrlls Alobac,ervinalandll KlabSlalla a"ogenes

101

TABLA 7

Valores seleccionados del coelieiente de mantenci6n l"Y"\

(mgluenle energia/geelulallh)

0.135 0.094 0.036 0.022 0.170 0.15 0.04

I bl

Fig 5 Relaei6n de Y XI S con pala laluante de carbono Venergia. a) Relacl6n hiperb6lica entre ambos. b) Unealizaci6n de ec.(17) en Ie que II pendian,a as m V at intercepto en II OIdenldl es IfY~/s'

En los casos que se considere producci6n de metabolito extracelular, la grafica de recipro cos seran lambien recta 51 la productividad especifica, qp, es constanta en el rango de.u..consl' derado.

mas~o:~a~o~e~e~:r~Mi!ou~~I:~~I~te;~~v~d~::~il~e;~I~le~~eSI~~~~'~~~u~:~~r:~e;~~ ~:!~~ segun se determine pOr anaHs!s. En cullivo por loles aliment ados se debe considerar las masa y no las concenlraciones, Va que el volumen de culhvo es var.able con eillempo. En culhvO con.-

;~n~~e~~n~~~~~:!~~~ :~:n~~a~i~~:~ :t~~~~~;~o d:X~ff~:n~~~ii~~eyd~~i~~~~:o al valor de X por Cuando no se dispone del dalo experimenlal, se puede recurrir a un melodo de calculo 0

eSllmaci6n. Un balance de los contenldos de un elemento en la calula y en el respectivo nutrlente lIeva a:

(18)

La ecuaci6n (18) conSldera que lodo el nUllienle se utihza en creciml9nto y par 10 tanto supone nulo 0 despreclable el nutneme ullhzado para manteno6n (en el caso de la luenle de carbono y energia) y producci6n.

13

En el caso de la fuenle de carbono se debe lamar en cuenla que no lodo el carbono mela bolrzado aparace an la biomasa, sino que una ciena po/cion forma pane de los productos de oJCldaCl6n (C0

2 y moleculas organicas pequenas en el caso de melabolismo anaeroblo). Para

este caso se Ilene que:

(I!!

En metabolismo aerobio f eSla comprendido entre 0.5 y O.B, mienlras que para el creci-mlenlO anaerobio f es aproximadamenle O. I .

Para la eSllmaci6n de Y para la 'uente de carbono y energia se han propueslos dlversos metodos basados en los ~~ceptos de elect/ones disponibles y reduG1ancia (Abbot, 1973; Enckson y col., 1978; Eroshin y Minkevich, 1982; Bell, 1972).

La Tabla 8 entrega valores de Y xIS determinados experimental mente y pot di'lersos meto-dos.

TABlA!

Comparaci6n da eSlimacionas de Y XIS (a)

NutHenle

(11 {21 (31 ('1

0.045 0'8 042 Glucose 0.44 0.42 048 042 Fructosa 044 0.45 047 0.48 Ghc"ol 0.43 0.40 045 0.59 Melanol 0.41 0.046 051 0.44 Mallosa 0.46 0.32 0.48 0.42 Acetato 0.44

la) Acevedo (1987) (1) Datos e)(pe/imenlales, (2) Calculadosde ec.(t9), (3) Calculados en base a electrones dl!Oponi

blu, (4) Calculados en base a 1.1 9 de biomasa POf gramo de carbono en el nutrlen.e

Encuanto a Y 02' se puede estimar en base a un balance de C, H, Y N en la ecuaCl6n (10) suponlando que no hay formaci6n de producto eXlracelular, resullando la expresi6n de MateJes (1971);

-& =- ~:+~~:6c + a .Olf. O.0267d' + 0.01714 g' . a .cae' ~

2.4. Diseno de Medios de Cultivo Para la formulaci6n de med,os de cuhlvo se requlere eSlablecerla concenlracI6n celular que se desea alcanzat, la composici6n elemental de la biomasa (normalmente de datos generaJlzados como los de la Tab!a 4 0 los entregados POf Bailey y Ollis 1977 y Atkinson y Mavltuna, 1983) y

14

las fuenles de cada efemento que se ulihlaran como nulrienles, ademas de los requerlmientos de lactores de crecimienlO. Los langos de concentlaciones celulares mas uhhzados apalecen en fa Tabla 9.

TABLA 9

Velores tipieos de concenllaciones celulalillS

InvesUgaci6n,malfaces Investigaci6n, fermentedoles hasta 20 I Producci6n, rango usual Producci6n, rango allo Conlrol computarizado, lecirculaci6n de celul.

SO=SI+~

0 .52.0 g/l 18 gIl

1025 g/l 30-50 g/l

120250 g/1

(21)

EI valor de S, se supone cero en primera instancia. luego los valores de S obtenidos son multiplicados por 1.5-2.0, a excepcl6n del caso del nutriente que se quiere sea eFlim,tante.

3. CINETICA DE FORMACION DE PRODUCTOS

3.1. Rendimientos y Productiyidades Se han definido rendimientos de sustralO en produC1o en forrtla analoga a los rendimlenlos celulares.

__ ,_ = _-.-'_ + (m+ ~)(.2-) Yx.s Y M Y P/$ It (2')

Una forma allernallva de abordar la eSlimaci6n del Y , que resulla de gran utihdad, es la determinaCIon del rendlmlento te611co de un metabolitoP/~ . Este parametro entrega una eSlimaci6n delllalor maximo que se podria alcanzar en c~nye%f6n del sustralO a produclO, balO la condlci6n ideal que no hubiera consumo de sustrato para crecimienlo ni manlenCi6n. De

15

:~:~~~UI~t~S.ecuaci6n (14) Y PIS coincide plenamente con Y PIS en 81 casc de m81abolilos los valores de Y s pueden set Ullhzados como referencia para evaluar 81 componam,ento

de una determinada f~,men,aci6n y adopt8r declslones soble aceiones a seguir. Asi, un Y PIS muy alelado de Y P 5 es un ind,ce que ese proceso podria set malorado ,nwtiendo recurSOs adlclonales en su intssligaci6n y desarrollo. Contrariamenle, "alOf8s de Y ~/S cercanos al limite

mflx~7:~S~:~:: ~~~~~: :~e~~:~~:~;~:'~~al~;=~~A~~~~~~Q(!n~~~~~~~:~us. Irala a producto y e~ sencillo para 81 caso de prodUdOS cuyas rutas b,osin,e,.C8s sean SImples y conocidas. Para los metabolitos cuya biosinlesis es muy comple,8 0 no del lodo elucidada, 81

~:~sr:~~:~:!: ~~=:~~y algo incleno. La Tabla 10 resume algunos valores de Y PIS cal-

TABLA 10

Ellimaeiones de rendlmienlos \ebflcos de melabolilos ta)

Sustrato ProduelO Y~/S (gIg) glucose etanol 051 secarosa etanol 0 .. glucosa lislna 051069 aeetalo lisma 0 .... - 060 glucose GMP 527 glucose XMP 535 glucosa IMP 5.12 glucosa penicilina 066 - 1.10 glucosa 'c citriCO 1.07 glucose estrep.omlcina 010 - 0.75

t} Datos de Acevedo (1981) Un enloque alternatlvo aJ cilculo del rend.mlento de produC!o se basa en consideradones

energ6tlC8s y utihza el concepto de eleC1r6n dlsponible para eShmar la energia acumulada en el sustrato (Eroshln y Mlskevich, 1982). Por eSle procedlmlento se obllenen valotes limltes supe-

:~~~o:ne~:~:~~~sY PI S ' ya que no considera las verdaderas rutas btOslntellcas y sus r~uen.

mln~:J~~ei~!:r~r:=~:st~:lb~~::~t~~~~~~!:!~J ~u:& :'Sf~~~~oe~ :~g~I~;e~fl~, d;~~ tenCl6n y producci6n. AI (eahzar eSle calculo se observa que una mayoflta/la porci6n del sus-trato se utlhza en generar energia de manlenci6n, slendo menor el sustrato destlnado a la pro-ducct6n del metabolJto de Inlerb, como se aprecla en la Tabla 11.

16

ProduCIO

Panlcilina Penlcillna IMP IMP IMP

(') (2) (3) (') (5)

l'

0)1 = ~~ :c X - Xp (26) ~+~ ++~ ~o i1 0 tI2!J....=.

Ooode t, es el tiempo de latencia. ~ Cuando el objetivo es evaluar 0 comparar la capacldad de dlver5~ cepas j?!fa produClf un

determinado meta bolito, resulta mas adecuado utilizar Itroauctiviaa especifica: .

1 dp q, =X- dt

3.2. C/asificaciones Cinetic8s EI primer intenlo exitoso de clasilicar las lermemaciones en grupos de componamlenlo same-jame, lue reaJizado por Gadan (1959). En eSle eSludio claslCO se PfopuSleron Ifes llpos genera-les de lermentaciones, de acuerdo a sus patrones cinehcos en cutllVo por 101es, como se apre-cia en la Figura 7.

18

z o U ; e

TtEMPO It

II

III

Fig 7 Ctasihcaci6n de Gaden de la prodUCCI6n de metabolitos en cultlvo pOI lotes

Los metabolitos tipo I 0 asociados al crecimienlo son aqueuos que se praOucsn UUICllIltl III periodo de crecimienlo exponenclal del cultillo. EI hpo III 0 no asoclado al crecimlenlo cOr/es-ponde a lOs melabolitos producidos durante la lase eSlacionaria, mientras que el tipo II reprs-senta una siluaci6n inlermedia, en la que la pfOducci6n empieza en la fase lardia de crecimlento y confinua en fase estacionaria.

Es necesario recalcar que eSla es una clasificaci6n sstriclamente clniltlca y aphcableen rigor solo a CUllilios por lotes. Resulta interesante discUlir las semejanzas y dlferenclas de estos con-ceplos con los de metabolito primario y secunda rio, que se basan en consideraclones fisiol6gi-

3.3. Mode/os Esttucturados y no Estructurados Luego de eSlablecida la clasificaci6n de Gaden, se di6 un nuevo paso en direcci6n al progreso en cinetica de fermentaciones a traves de la lormulaci6n y utilizaci6n de modelos matemalicos que representan el componamienlo de eSlos procesos.

Los modelos permiten predecir componamientos y simular el efecto de variar las condicio-nes de operaci6n denlro de su rango de validez. Eslo ultimo es imponants, porque la fOfmula-ci6n del modelo exige la clara definicion de lodos los lactores que condicionan su aplicacion, no siendo legilimas las extrapolaciones.

La formulaci6n del modelo puede tener una base experimental, leo rica 0 mlxts. En la actua lidad se lavorecen los modelos de origen leonco, ya que muchas veces los modelos experi-mentales Ilenen un limite de vahdez muy e51recho y sus conSlanles carecen de significado fislco o biotoglco. Sin embargo convlene recordar queel modelo de Monod (ecuacion 6), lal vez el mas ampliamenle usado en cinelica de fermentaciones. luvO un origen netamente empirico.

Se disllnguen dos lipos de modelos dneticos: los lIamados modelos eSlructurados y los no estructurados.

Los mOdelos no estrUClurados fueron los que se desarrol1aron primero y representan el componamienlo promedio de poblaciones de celulas a Iraves de la cuanlificacioo de propieda-des del cultivo, mas que de cada celula individual: concentracion de biomasa, produClo y sus-tralo, lIelocidad de crecimienlo Y producci6n. Por su pane los modelos estructurados constde ran el funcionamiento interno de la calula, la cual se supone intemameme companamentaUzada o estruCfufada segun las diversas funciones a complir~ Estos modelos suelen inclulf la sfntesis de proleinas y acidos nudeicos y lOS mecanismos de regulaci6n melab6hca.

Los modelos no eSlruClurados SOIl matemill1lcameme mas Slmp[es y extgen la evaluaclon de un numero menor de conslames y POf 10 lanlO se les utlftza siempre como prrmera alternatilla. Sin embargo en ocasiones eSle lipo de modele no es capaz de entregar ta informacion reque dda, 0 no puede representar adecuadamenle una ciena situaci6n de interes, justameme por estar formulados sin considerar los mecanismos celulares internos. En esos casos se hace indispensable recurrir a [a modelaci6n eSlructurada.

EXlsten casl tantos modelos no estrudurados como aulores han trabajado en ellema, pero son pacos los que cumplen a cabalidad los dos requerimientos basicos de un buen modelo: s[mpleza y generalidact Entre eUos deslaca el modelo que Luedeking y Piret (1959) propusleron para la produccion por lotes de aCldo ladlCO: )()(lo..iio uJ. h;

~~{J~"

~ = u ~ + B X Cae fcd,cD) dt dt tl'l' ill-JCICtt1o (\ .

:..e.UI)A.I~ o 10 que es 10 mismo:

{311

q~=+---f-=u~.B (32) ~Ch ..... k.(I.~i ... (C

ESle modelo ha sido aplicado eXllosameme a numerosas lermentaciones muy distlnlas a aqueila para [a cual lue dellvado: melabohtos primeros y secundallos, cultlvosbaclenanos y

19

micellales, sistemas por Ioles y continuo. lal vez la clave oe su generalloau r~~IUi:l till '-I"''' '-'VI 1-liene un termino asociado al crecimiento (

rendlmlenlo de U2 en celUlas rendimiento de un nutriente en producto rendimiento maximo de un nutriente en producto rendimiento te6rico de un nLJtrienle en producto constanles en modelo de l uedeking y Pilet, ecs.(31)y(32) velocidad especifica de crecimiento velocidad especifica maxima de crecimiento

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21

RE FERENCIAS ADICIONALE S

22

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