SWI@UCMEN BUSCA DE NUEVOS MICROORGANISMOS

PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS DE HÁBITATS NATURALES

Un proyecto de Aprendizaje-Servicio y Ciencia Ciudadana integrado en el proyecto internacional Small World Initiative

para el descubrimiento de antibióticos

Guía básica de laboratorio para estudiantesTraducción y adaptación parcial por el equipo SWI@UCM a partir del material original en inglés

(©Simon Hernandez, Tiffany Tsang & Jo Handelsman)

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Introducción a Small World Initiative™

“Menos del 40% de   los   jóvenes   interesados   en   realizar   sus   estudios  universitarios   en   Grados   en   los   campos   de   Ciencias   Experimentales,  Tecnología, Ingeniería y Matemáticas (STEM en inglés, de Science, Technology,  Engineering and Mathematics) acaban cursando dichos estudios… [alegando  muchos   de   ellos]  la falta de cursos introductorios realmente motivadores  como un factor decisivo a la hora de cambiar su orientación.”

Comité de asesores sobre Ciencia y Tecnología del Presidente de los EEUU

“La   resistencia  microbiana  a   los   antibióticos   es   potencialmente  el desafío medico más importante al que se enfrenta la humanidad en el s. XXI. Si no se  toman iniciativas al respecto, entre hoy y el año 2050 el coste de la resistencia a antibióticos  podría superar  los  100.000 millones de dólares y suponer la muerte prematura de 300 millones de personas.”

Organización Mundial de la Salud

Este manual es parte de los materiales oficiales utilizados en el marco de la Small World Initiative™ (SWI). Concebida en la Universidad de Yale (EEUU) en 2012 por la autora, Jo Handelsman, SWI es un programa innovador diseñado para motivar a los estudiantes hacia la elección un grado en Ciencias Experimentales, al tiempo que aborda una amenaza para la salud a nivel global: la reducida disponibilidad de antibióticos eficaces. El programa SWI se centra sobre la idea de un curso de Biología básica basada en el descubrimiento, en el cual estudiantes de todo el mundo llevan a cabo trabajo de campo e investigación en el laboratorio sobre muestras de suelo en busca de nuevos antibióticos. Este aspecto es particularmente relevante, puesto que dos tercios de los antibióticos disponibles proceden de bacterias u hongos aislados de los suelos.

En contraste con los cursos tradicionales, SWI proporciona una plataforma de aprendizaje en biología que integra una aproximación real a la investigación en lugar de un programa de prácticas de laboratorio con resultados predeterminados y sin un objetivo concreto. A través de una serie de experimentos diseñados por los propios estudiantes, ellos mismos recolectarán muestras de suelo, aislarán diversas bacterias, y ensayarán su actividad frente a microorganismos de relevancia clínica, caracterizando aquellos que muestren actividad. La estrategia de SWI también proporciona una plataforma para el descubrimiento de nuevos antibióticos basada en la participación de la comunidad, integrando así el potencial intelectual de múltiples actores que de manera simultánea abordan este desafío global generando candidatos para el desarrollo de nuevos fármacos. Esta estrategia participativa utiliza las técnicas del aprendizaje activo para conseguir de manera simultánea objetivos educativos y científicos.

En los últimos cuatro años, SWI ha crecido rápidamente hasta incluir 150 centros educativos en 35 estados de EEUU, Puerto Rico y otros 12 países. El programa pretende inspirar a una próxima generación de coordinadores y colaboradores que contribuyan a la misión global de

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SWI de transformar la educación en ciencias y promover el descubrimiento de nuevos antibióticos a través de la curiosidad y creatividad de científicos jóvenes de todo el mundo. Los docentes que colaboran con SWI están comprometidos a promover mejoras significativas y apreciables en el panorama educativo y en la apertura de oportunidades para sus estudiantes, al tiempo que se enfrentan a un desafío real de la investigación biomédica. Si estás interesado en saber más visita la página matriz en www.smallworldinitiative.org.

Formar parte de SWI supone múltiples beneficios para los docentes, las instituciones participantes y los estudiantes implicados en la investigación, incluyendo ser miembros de una comunidad activa y comprometida, así como el acceso a materiales, aprendizaje, asesoramiento y ayuda, oportunidades para los estudiantes y sus tutores y herramientas on line.

La comunidad Small World Initiative™ El carácter colectivo de SWI se constituye como columna vertebral de este proyecto colaborativo. Animamos a nuestros estudiantes y docentes a participar en la comunidad SWI global y aprovechar esta oportunidad única.

Redes Sociales y BlogEstos medios son excelentes para conectar con la comunidad SWI en todo el mundo y estar atentos a las oportunidades que surjan.

El Grupo de Facebook “The Small World Initiative: Global Community” (en inglés) es la forma de contacto más popular entre los estudiantes y docentes para estar en contacto y al día en cuanto a actividades de la comunidad SWI. Se trata de un grupo privado y coordinado.

Twitter – @Team_SWI

Instagram – team_swi

YouTube – Small World Initiative. Aquí encontraras vídeos muy útiles.

Blog – El blog SWI es la página más visitada de nuestro portal on line. Cualquier contribución de nuestros docecentes y estudiantes es bienvenida y también se vincularán artículos en los que SWI se menciona siempre que tengamos permiso para ello.

Recopilación de datosLos gestores de SWI recopilan datos de diversa índole para estudiar el impacto de SWI, así como para monitorizar la consecución de objetivos científicos y educativos. Esta información será compartida con los investigadores pertenecientes a SWI que así lo soliciten. Las aplicaciones y herramientas para la recolección de datos estarán disponibles en la página web SWI. En particular, les pedimos a los estudiantes que suban información sobre sus muestras de suelo a nuestra “base de datos de muestras de suelo” (SWI Soil Sample Database). Los

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estudiantes deberían incluir información detallada sobre sus muestras. Estos datos podrían ser usados con fines de investigación por laboratorios, docentes o estudiantes asociados a SWI.

Simposio anualTodos los años los docentes y estudiantes vinculados con SWI son convocados a presentar sus resultados en nuestro Simposio anual. Hasta ahora, estos simposios se han desarrollado de forma simultánea a los congresos y reuniones de ASM Microbe y ASMCUE en EEUU, proporcionando una oportunidad para establecer relaciones entre los miembros de la comunidad SWI, presentar trabajos investigación científica y pedagógica a colegas y expertos y explorar oportunidades profesionales.

PremiosCada año otorgamos premios diseñados para estimular los objetivos educativos y científicos de SWI, abriendo una solicitud para nominaciones cada año tanto entre los estudiantes como entre los docentes.

Se incluyen:

● Premio a la Excelencia en la Vocación Científica (estudiante)● Premio Joseph P. Caruso a la Excelencia Docente (docente)● Premio al Mejor Póster (estudiante)● Persona de Apoyo a SWI del año● Premio de Excelencia en Innovación Pedagógica (docente)● Premio de Excelencia en el Descubrimiento CientíficoExcellent in Scientific Discovery

Award (estudiante/docente)● Premio de Excelencia en Liderazgo (estudiante)● Premio al Apoyo Externo

Periódicamente otorgamos también ayudas de viaje para atender al Simposio anual SWI y organizamos otros concursos. Rogamos tengan en cuenta que pueden nominar a sus maestros y colegas para estos premios.

Portal de OportunidadesGestionamos una base de datos de oportunidades específica para los docentes y estudiantes asociados a SWI en nuestra página web. Se incluyen conferencias relevantes, oportunidades para realizar presentaciones de manera oral o escrita, becas, plazas y trabajos. Palabra clave: “treats4swi”. Puesto que cambiamos la palabra clave de acceso anualmente, recomendamos suscribirse para recibir un resumen de la información sobre oportunidades.

Otros Eventos AnualesCada año animamos a los docentes y estudiantes a acercarse a sus comunidades para difundir el problema de la crisis de antibióticos u otros problemas de ciencia y salud relacionados. Por ejemplo, durante la Semana de Internacional de Concienciación sobre los Antibióticos

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(Antibiotic Awareness Week) en noviembre, pedimos a las instituciones educativas que organicen un evento que puede implicar cualquier tipo de actividad, desde la proyección de una película a un laboratorio abierto o un panel de discusión sobre temas relacionados con antibióticos. Rogamos consideren cómo participar u organizar este tipo de iniciativas.

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Small World Initiative™ en EspañaEn el curso 2016-17, desde la Universidad Complutense de Madrid acercamos SWI por primera vez a la comunidad educativa española. Un grupo de más de 20 docentes e investigadores del área de la Microbiología de tres facultades de la UCM (Biología, Veterinaria y Farmacia) colaboramos en un proyecto de Innovación y Mejora de la Calidad Docente (programa INNOVA-Docencia UCM) con el objetivo de implementar SWI mediante una novedosa estrategia de Aprendizaje-Servicio (ApS). Dicha estrategia consiste en la integración de diversos niveles educativos, de modo que los estudiantes de Grado y Máster que deseen participar de manera voluntaria en el proyecto para mejorar su formación y obtener créditos complementarios, se integrarán en equipos de trabajo que se encargaran de organizar e impartir los talleres en Institutos de Bachillerato y Enseñanza Secundaria que lo soliciten. De este modo se acerca a la sociedad el problema de la resistencia a antibióticos y se integra a los estudiantes en un motivador proyecto real de investigación de ámbito internacional. El proyecto está amparado por el Grupo Especializado en Docencia y Difusión de la Sociedad Española de Microbiología (D+D SEM), desde el cual se aspira a coordinar en el futura la expansión de SWI a otras Universidades y Comunidades Autónomas de España. Esperamos que SWI tenga éxito en educar en ciencia y en transmitir una cultura científica crítica junto al mensaje concreto de la resistencia microbiana a la sociedad, al tiempo que exploramos la riqueza de la diversidad de nuestros hábitats.

Redes Sociales y Blog en EspañaAdemás de las redes sociales y web internacionales de SWI, hemos inaugurado una serie de herramientas con la etiqueta SWI@Spain como subsidiarias de ésta con el objeto de que la comunidad hispanoparlante se acerque a la iniciativa con mayor facilidad.

El Grupo de Facebook “SWI@Spain: Small World Initiative en España” es un grupo público coordinado por los docentes SWI@UCM en el que pueden participar activamente tanto los estudiantes del programa como sus tutores.

Twitter – @SWISpain

Blog – swispain.blogspot.com.es. Cualquier contribución de nuestros docentes y estudiantes es bienvenida, para lo cual puedes ponerte en contacto con el coordinador SWI en la UCM (email: vicjcid@ucm.es) o con el docente universitario responsable de tu equipo SWI.

Recopilación de datos y gestión de las cepas productoras en EspañaLos tutores y estudiantes de los centros docentes receptores proporcionarán a los docentes SWI una serie de datos de índole científica que acompañarán siempre a las cepas que resulten positivas en el estudio. Independientemente, se podrá solicitar información para estudiar el impacto de SWI, así como para monitorizar la consecución de objetivos científicos y educativos. Esta información será compartida con los investigadores pertenecientes a SWI que así lo soliciten. Las cepas microbianas aisladas se conservarán en las instalaciones apropiadas de la UCM o entidades asociadas a la SEM, como la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)

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o la Fundación MEDINA. Los investigadores que las utilicen en lo sucesivo con el fin de descubrir las sustancias químicas responsables de los fenómenos de antibiosis para su posterior uso o explotación, deberán reconocer siempre el origen de dichas cepas en el marco del proyecto SWI a cargo de los estudiantes y tutores implicados y así constará por escrito. La SEM y SWI son entidades sin ánimo de lucro para la promoción de la ciencia y la educación científica de la sociedad.

Condiciones de Uso y Responsabilidad LegalRogamos tengan en cuenta que trabajamos para que SWI se implemente en todo el mundo, por lo que en aras de la seguridad, cuestiones legales y control de calidad, así como para reforzar la comunidad SWI, quienes deseen participar en SWI deben recibir la aprobación tras cursar el entrenamiento oficial que les acredita como docentes SWI “SWI Partner Instructors” y les faculta para impartirla. Sólo aquellas personas con el consentimiento expreso del Presidente de SWI o persona delegada pueden los candidatos acceder al curso de instrucción, tras el cual trabajarán en contacto con un colega con más experiencia que actuará como su mentor.

Aquellas personas que hayan solicitado el curso de instrucción pero no lo hayan realizado no tienen permiso para enseñar SWI y no son SWI   Partner   Instructors. Cualquier uso no autorizado de SWI o materiales para los docentes o estudiantes generados por SWI, o de la marca registrada Small World Initiative están estrictamente prohibidos. Cualquier persona que infrinja esta prohibición utilizando material SWI o entrenado a segundas personas sin autorización violando las normas de SWI será total y personalmente responsable de las consecuencias legales derivadas de tales actos.

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INTRODUCCIÓN¿Hay antibióticos en el suelo? Ecología y diversidad microbiana

Los antibióticos son sustancias químicas de origen natural que tienen actividad antimicrobiana y, por tanto, sirven para tratar infecciones en los animales y en los seres humanos. Desde el descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming han salvado millones de vidas humanas. El mundo que conocemos no sería igual sin los antibióticos. Fleming observó que cuando el hongo Penicillium aparecía en sus cultivos de bacterias, el crecimiento de éstas se inhibía a su alrededor. El éxito de la penicilina promovió la búsqueda y el descubrimiento de muchos otros antibióticos. La mayoría de los que conocemos y usamos son productos microbianos.

Los microorganismos son el objeto de estudio de la Microbiología. El término se refiere a cualquier organismo que no se puede observar a simple vista, es decir, necesitamos un microscopio para estudiarlo. Los microorganismos son los seres más abundantes y diversos de la naturaleza, capaces de adaptarse a las condiciones de vida más duras de nuestro planeta incluyen a las Bacterias y Arqueas (los Procariotas, células sin núcleo), pero también muy diversos Eucariotas microscópicos, como levaduras, mohos, protistas y algas unicelulares. Los virus también se agrupan en la categoría general de microorganismos, pero no tienen naturaleza celular: requieren infectar a una célula viva para reproducirse.

Los microorganismos colonizan todos los hábitats de la Biosfera: desde tu piel y tu intestino hasta los fondos marinos o los hielos antárticos. Su diversidad es inabarcable y los científicos solo estamos empezando a conocerla gracias a las técnicas más avanzadas de análisis molecular. Los antibióticos son “armas químicas” que muchas bacterias y hongos producen y secretan al entorno de manera natural para eliminar a otros microorganismos competidores y colonizar el hábitat de manera más eficiente. Por supuesto, los productores de antibióticos poseen un “antídoto” que hace que el antibiótico que secretan no sea tóxico para ellos. Es decir, la naturaleza nos brinda los antibióticos, pero también los mecanismos de resistencia que, si los adquieren las bacterias patógenas, las convertirán en resistentes. Las bacterias se adaptan y evolucionan muy deprisa, mutando e intercambiando genes entre distintas especies. Setenta años después de la introducción de la penicilina en la clínica, casi todas las bacterias que causan infecciones graves son ya resistentes a este fármaco. El sueño de vencer a la infección que se formuló en los años 50 y 60 del pasado siglo, la “Edad de Oro de los Antibióticos”, se ha desvanecido. La Organización Mundial de la Salud (OMS) nos advierte que, mientras las bacterias continúan desarrollando resistencias, en las últimas décadas no hemos descubierto casi ningún antibiótico nuevo. Sin embargo, los antibióticos están más cerca de lo que pensamos: en nuestro propio cuerpo, producidos por los microorganismos que nos habitan (nuestro microbioma) y en el suelo que pisamos.

La Ecología Microbiana es el estudio de las interacciones microbianas entre sí y con sus respectivos entornos. Los microorganismos son parte de ecosistemas complejos y en los que cientos de especies se comunican entre sí, estableciendo relaciones simbióticas, unas veces

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positivas y otras antagónicas. Dos de los principales temas que estudia la ecología microbiana som la Biodiversidad y Bioactividad que están presentes en los ecosistemas. Estos términos se refieren a los distintos tipos de organismos presentes en un ecosistema y la actividad metabólica resultante de sus interacciones, respectivamente.

Small World Initiative implica a la comunidad de forma activa en la búsqueda de nuevos antibióticos. Aunque sólo los grandes centros de investigación y la industria farmacéutica tienen la capacidad de estudiar, desarrollar y explotar la química compleja que resulta de la bioactividad microbiana, los investigadores no tienen la oportunidad de recolectar cientos o miles de muestras en lugares muy diversos y ensayar la actividad de los microorganismos que se encuentran en ellos. SWI propone que seamos esta vez los estudiantes los que demos el primer paso para iniciar la cadena del descubrimiento, a la vez que aprendemos biología, ecología y química. En cualquier suelo que elijamos podemos encontrar microorganismos únicos, con capacidades químicas todavía inexploradas.

Las preguntas que los experimentos de Small World Initiative pretenden dar respuesta son las siguientes:

• ¿Cuántas especies de bacterias presentes en nuestras muestras de suelo podemos cultivar?

• ¿Cómo distinguir a unas de otras?• ¿Son distintas las bacterias en distintos ambientes?• ¿Podemos detectar actividades microbianas?• ¿Son estos microorganismos ambientales capaces de inhibir a las “superbacterias” más 

temidas en nuestros hospitales?

Diseñaremos y realizaremos experimentos para responder a estas preguntas y a otras que se te ocurran sobre la marcha. Probaremos hipótesis, y desarrollaremos nuevos conocimientos sobre el mundo microbiano. Incluso podemos descubrir especies nuevas. Como microbiólogos, podemos recurrir a muchas disciplinas de las ciencias naturales, que van desde la biología celular a la bioquímica a la química analítica a la genética. Nuestro desafío es desarrollar el pensamiento crítico para interpretar las interacciones y funciones microbianas aplicarlas a mejorar el bienestar humano.

Buenas Prácticas y Normas de Bioseguridad en un laboratorio de Microbiología

Los microorganismos que SWI utiliza como testigos para evaluar la actividad antimicrobiana de los aislamientos del ambiente son similares biológicamente a las “superbacterias” que causan infecciones en el ser humano, si bien totalmente inofensivas, carentes de las características patogénicas de éstas. Sin embargo, el cultivo de bacterias, incluso las no virulentas, requiere precauciones y cuidados, que se resumen en la aplicación de “técnicas asépticas”, que debemos observar escrupulosamente. Además, los microorganismos aislados de las muestras de suelo son desconocidos para nosotros y, por tanto, no podemos descartar que alguno de

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ellos potencialmente sea patógeno, de manera excepcional. Tú eres responsable de tu seguridad y la de tus compañeros en el laboratorio. Por tanto, es necesario seguir unas normas de trabajo estrictas en el laboratorio de Microbiología:

1. Los objetos personales (chaquetas y otras prendas de ropa, mochilas, etc.) no deben cuenca estar en la zona de trabajo, para evitar que se contaminen con bacterias. Los teléfonos móviles pueden estar en la zona de trabajo siempre que estén protegidos en una bolsa de plástico.

2. Está prohibido comer, beber, mascar chicle o llevarse nada a la boca (dedos, bolígrafos…) en el laboratorio de Microbiología ¡Podríamos ingerir bacterias involuntariamente! Tampoco debemos tocarnos jamás con las manos la nariz ni los ojos.

3. Informa a tu profesor si padeces algún problema de inmunodepresión o inmunosupresión.

4. Para trabajar es imprescindible usar una bata de laboratorio, que protegerá tu ropa de posibles contaminaciones. Es aconsejable usar guantes y gafas protectoras. Los guantes de látex o vinilo son especialmente importantes para evitar contaminar tus cultivos con la microbiota de tu piel y a la vez proteger tus manos de posibles contaminaciones. (Excepción: ¡si trabajas frente a un mechero Bunsen no uses guantes!). Se debe evitar llevar zapatos abiertos y faldas o pantalones cortos, para que si se derrama algún reactivo no entre en contacto con la piel en las extremidades. Si tienes el pelo largo, recógetelo.

5. Cuando manipules cultivos microbianos mantenlos siempre cerrados (tapados) salvo en el momento de inocular y sembrar, e intenta que esta operación sea lo más corta posible.

6. Rotula bien con rotulador permanente el material. En los cultivos, debe rotularse la base de la placa Petri. Debes rotular los cultivos con la fecha y con tu nombre, junto a la información necesaria para reconocer o interpretar el cultivo tras su incubación. No te fíes nunca de un cultivo microbiológico que no está adecuadamente rotulado.

7. Si ocurre un accidente o un vertido informa inmediatamente al responsable del laboratorio. NO INTENTES LIMPIARLO TÚ Y MUCHO MENOS OCULTARLO. Los accidentes en el laboratorio son comunes: debe mantenerse la calma y aplicarse un protocolo de desinfección correcto.

8. Desecha todo el material usado en los contenedores adecuados, marcados con el símbolo de “desechos biológicos” (biohazardous). Los objetos cortantes y punzantes en contenedores amarillos y los cultivos en agar en las bolsas de color naranja. Ante cualquier duda, pregunta a tus tutores.

9. Al acabar el trabajo hay que desinfectar la superficie de trabajo limpiándola con alcohol al 70%. Al quitarte los guantes y la bata intenta no tocar con tu piel la parte exterior. Antes de abandonar el laboratorio de microbiología hay que lavarse las manos escrupulosamente con jabón antibacteriano.

10. Está prohibido sacar material del laboratorio, pues podría contaminarse el medio ambiente o los lugares a donde se lleve dicho material.

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Cómo registrar datos científicos: el cuaderno de laboratorioLa investigación científica no tiene sentido si no puede comunicarse y para ello debe registrarse cada aspecto de la experimentación, de modo que sea reproducible en cualquier laboratorio del mundo. Para ello es esencial anotar todos los datos, hipótesis, protocolos y resultados detalladamente en un cuaderno de laboratorio. En un proyecto como SWI, en el que participan estudiantes de lugares muy diversos en el mundo y se aislan cientos de microorganismos, este aspecto es especialmente importante.

Algunos consejos para gestionar un buen cuaderno de laboratorio

Las notas en el cuaderno deber organizarse por fecha, siguiendo un orden cronológico.

Nada debe borrarse. Si crees que hay un error, táchalo con una raya vertical y escribe a continuación el dato correcto.

Cada experimento debe ir encabezado por el objetivo que se persigue según la hipótesis de trabajo.

Anota todos los materiales que utilices en el experimento.

Anota con detalle los métodos y protocolos que utilices. Si no lo haces, nadie (ni siquiera tú mismo) podrá reproducir con exactitud el experimento.

Anota todos los resultados y datos observables. Si puedes documentarlo con fotografías, tablas de datos, gráficas o esquemas, tanto mejor.

Anota también los resultados negativos. A veces se aprende más de los resultados negativos que de los positivos. Muchos científicos antes que Fleming tiraron a la basura sus cultivos contaminados con Penicillium sin reparar en lo que estaba ocurriendo.

Una vez obtenidos todos los datos, evalúa e interprétalos. Escribe las conclusiones que puedes deducir del experimento.

Comunica tus resultados a tus compañeros, usa las redes sociales y preséntalos en forma de presentaciones de PowerPoint o pósters en clase o, si tienes la oportunidad, en foros científicos (simposios y congresos).

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EXPERIMENTO 1. Toma de muestra de suelo en condiciones asépticasEl objetivo de este experimento es seleccionar con criterios propios una muestra de suelo de forma estéril y transportarla sin que se contamine con microorganismos no autóctonos al laboratorio.

¿Qué muestra de suelo debo elegir?El objetivo último de SWI es aislar nuevos productores de antibióticos, pero para ello primero debemos estudiar la diversidad microbiana en el suelo. Cuanto más inexplorado y único sea el suelo que escojamos, más posibilidades de éxito tendremos de encontrar microorganismos nuevos. Por tanto, este proceso es creativo y depende de tu criterio personal de elección. Los microorganismos más interesantes pueden estar en los lugares más inesperados, pero es lógico pensar que si exploramos un entorno local con características únicas tengamos más probabilidades de encontrar microorganismos desconocidos. Evita zonas muy contaminadas o a las que se hayan aplicado tratamientos severos (suelo agrícola con herbicidas o zonas cercanas a acuíferos con contaminación química industrial). Busca ecosistemas y entornos naturales particulares y autóctonos de tu región. Pueden ser suelos arenosos o arcillosos, secos o húmedos, e incluso fondos u orillas de arroyos, ríos, pantanos o lagos, y puedes tomar muestras superficiales o profundas, con restos vegetales o sin ellos.

No olvides registrar todos los datos: los estudiantes SWI recogen muestras en otras regiones del globo, a veces muy remotas, mientras tú lo haces en tu tierra. La riqueza del proyecto SWI consiste en la recopilación de muestras a una escala y con una diversidad que nunca se ha logrado antes. Recuerda documentar rigurosamente la toma de muestra. Sin información sobre su origen perderá su valor.

Material

- Hoja de datos y bolígrafo

- Regla para medir la profundidad

- Alcohol o antiséptico y papel (papel de cocina o kleenex) para desinfectar el material si fuese necesario

- Móvil o cámara para tomar las coordenadas geográficas y tomar fotografías del lugar elegido y del proceso de toma de muestra

Kit de recogida de muestra (en bolsa sellada):

Tubo estéril de plástico de 50 ml para recoger la muestra.

Espátula estéril para toma de muestra (cuchillo o cuchara de plástico desechable esterilizada previamente en autoclave)

Guantes de vinilo

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Sólo es necesario 1 g de muestra, pero conviene recoger en exceso por si se desea estudiar en el laboratorio otros aspectos de la muestra (contenido en agua, contenido en materia orgánica, pH, composición geológica, textura, compacidad, etc.)

Procedimiento

1. Selecciona el lugar donde vas a tomar la muestra.

2. Anota todos los datos en la hoja de toma de muestra (características del suelo, coordenadas geográficas, profundidad, etc).

3. Ponte los guantes para no contaminar la muestra con la microbiota de tu piel.

4. Desenvuelve la espátula, cuchillo u cuchara estéril que hay en el kit, sacándola del envoltorio de papel de aluminio que la protege. Utilízala para excavar a la profundidad deseada. Es probable que las capas más superficiales, más ricas en materia orgánica, contengan más diversidad de bacterias cultivables. Mide con la regla la profundidad aproximada a la que decidas recoger tu muestra.

5. Abre el tubo de plástico y toma una muestra de suelo. Cierra el tubo inmediatamente después de la toma. En el caso de que tu suelo sea de un lecho acuático, puedes añadir un poco de agua para que no se reseque.

6. Quítate los guantes, recoge todo (no dejes ningún resto en el medio ambiente) y rotula el tubo con tu nombre y un número clave que deberá figurar también en la hoja de datos.

7. Guarda el tubo con la muestra protegido de la luz solar a una temperatura similar a la del hábitat de estudio hasta llevarlo al laboratorio.

Muestras etiquetadas en tubos estériles de 15 y 50 mL(soilmicrolab.blogspot.com).

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EXPERIMENTO 2. Cultivando la biodiversidad: Siembra de diluciones seriadas en medios de cultivo microbiológicos

La mayoría de los microorganismos del suelo (bacterias, hongos, algas y protozoos) no son cultivables en los medios de cultivo de que disponemos el laboratorio. Se estima que sólo podríamos cultivar en el laboratorio el 0,3% de la diversidad microbiana de los suelos, puesto que aún no hemos sido capaces de diseñar medios de cultivo que permitan crecer a la inmensa mayoría de microorganismos presentes en la Biosfera. Por tanto, no vamos a ser capaces de estudiarlos mediante las técnicas microbiológicas clásicas ni será fácil estudiar su bioactividad. Sin embargo, podemos conocer su existencia gracias técnicas “independientes de cultivo”, como la secuenciación en masa del ADN extraído de su hábitat, lo que se conoce como tecnología metagenómica.

Sin embargo, merece la pena explorar esta “punta de iceberg” que suponen los pocos microorganismos cultivables, muchos de los cuales serán desconocidos y exclusivos del hábitat elegido. El medio de cultivo que utilicemos y las condiciones de incubación condicionarán notablemente los microorganismos que puedan crecer. Idealmente deberíamos utilizar medios de cultivo microbiológico de composición compleja, para que todos los nutrientes y factores necesarios para el crecimiento (fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, sales minerales, etc.) estén disponibles. Sin embargo, no es aconsejable utilizar medios muy ricos, pues muchos de los microorganismos medioambientales están adaptados a ambientes oligotróficos (pobres en nutrientes). También sería aconsejable utilizar medios con un pH similar al del suelo. Es importante incubar los cultivos a temperaturas similares a las del ambiente del cual proceden, que serán las óptimas para el crecimiento de estos microorganismos, nunca a 36-37 ºC, que restringirían el crecimiento de bacterias ambientales y seleccionarían potenciales patógenos para animales de sangre caliente (como nosotros). De la misma manera, si se pretende aislar microorganismos de ambientes salinos (suelos costeros o marinos) será aconsejable formular los medios de cultivo con una concentración salina adecuada. Los “cazamicrobios” profesionales preparan a menudo sus medios de cultivo con un filtrado del suelo que van a estudiar previamente esterilizado en lugar de utilizar agua destilada, lo que facilita el cultivo de microorganismos que de otra manera no serían capaces de detectar.

En el proyecto SWI vamos a utilizar sencillos medios generales de cultivo bacteriológico a pH neutro, para facilitar el aislamiento de la mayor diversidad posible de bacterias. Estos medios están suplementados con cicloheximida (25 μg/mL) para inhibir el crecimiento de hongos y mohos. Si bien sería interesante aislar hongos, pues pueden ser interesantes como productores de antibióticos, su manejo es más peligroso por el riesgo para la salud que supone la inhalación de esporas y, además, desarrollan colonias tan grandes que nos impedirían estudiar la diversidad bacteriana. Los medios de cultivo que permiten el aislamiento de microorganismos en cultivo puro son sólidos, de aspecto gelatinoso, y se incluyen en una especie de bandejas redondas con tapa denominadas placas de Petri. La solidificación del medio se consigue mediante la adición de 15 g/L de agar, un polímero gelificante de origen natural que se extrae de ciertas algas rojas marinas. Por supuesto, los medios de cultivo se esterilizan en un autoclave tras su preparación, de manera que nos aseguremos de que, si las

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placas Petri no se han abierto en ningún momento durante su transporte, estarán perfectamente estériles en el momento de usarse. Los medios que SWI aconseja utilizar son los siguientes:

Medio Composición Uso típico

LB (Luria Broth) 10 g/L triptona; 5 g/L extracto de levadura; 10 g/L NaCl

Medio rico para el crecimiento de Escherichia coli, la bacteria que se utiliza para obtener ADN en biología molecular.

TSA (Agar Triptona-Soja)

17 g/L caseína (digerido tríptico)3 g/L de soja (digerido tríptico)2,5 g/L glucosa5 g/L NaCl2,5 g/L K2HPO4

Medio general para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Lo usamos diluido 10 veces (1/10) para seleccionar microorganismos típicos de ambientes oligotróficos.

PDA (Agar Patata-Dextrosa)

4 g/L almidón de patata 20 g/ L glucosa

Medio típico para aislar hongos si se ajusta el pH a 5. Si se deja un pH neutro es útil para aislar gran diversidad de bacterias.

AN (Agar Nutritivo)

20 g/L peptona 3 g/L extracto de carne 3 g/L extracto de levadura 3 g/L extracto de malta 5 g/L glucosa 0,2 g/L ácido ascórbico

Medio rico de uso general

R2A 0,5 g/L extracto de levadura 0,5 g/L digerido ácido de caseína 0,25 g/L digerido tríptico de caseína 0,25 g/L digerido ácido de tejido animal 0,5 g/L glucosa 0,5 g/L almidón soluble 0,5 g/L piruvato sódico 0,3 g/L K2HPO4

0,024 g/L MgSO4

Medio pobre en nutrientes muy utilizado en aislamiento de microorganismos de ambientes acuáticos

BHI (Infusión de Cerebro y Corazón)

6 g/L infusión de corazón y cerebro 6 g/L digerido ácido de tejido animal 5 g/L NaCl3 g/L glucosa 2,5 g/L Na2HPO4

Médio rico para el cultivo de microorganismos exigentes, como los estreptococos.

Material

Cinco placas Petri iguales de medio de cultivo con agar Tubo con la muestra de suelo y un tubo idéntico vacío

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Una balanza Agua o solución salina estéril Un agitador mecánico (“vórtex”) Cinco tubos eppendorf (1,5 mL) estériles Pipeta automática (P100-1000) y puntas estériles. Cayado de siembra o bolas de vidrio estériles.

Procedimiento

1. Rotula la batería de cinco placas con agar y la batería de tubos estériles de manera ordenada con las diluciones a realizar (10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5)

2. Ponte los guantes y pesa 1 g de muestra en la balanza. Para evitar contaminaciones, hazlo pesando un tubo vacío idéntico al que contiene la muestra y eliminando muestra de tu tubo hasta que te dé un peso que corresponda al peso de tu tubo vacío + 1 g.

3. Añade 9 mL de agua (o solución salina isotónica) estéril al tubo que contiene 1 g de muestra de suelo. Agítalo en el vórtex durante al menos 30 segundos.

4. Transfiere con la pipeta automática 100 μL de la muestra bien homogeneizada al primer tubo (marcado 10-1), que ha de contener 900 μL de agua (o solución salina) y mézclalo bien.

5. Repite el proceso con cuidado hasta realizar las cinco diluciones 1/10 seriadas (10 -1, 10-

2, 10-3, 10-4 y 10-5 respecto a la muestra original).6. Empezando por la más diluida, toma 100 μL de cada muestra y extiéndelas en la

superficie del agar de las placas correspondientes con la ayuda del cayado o de las bolas de vidrio estériles. Recuerda abrir las placas Petri lo mínimo y sólo el tiempo estrictamente necesario para dispensar la muestra.

7. Los monitores llevarán las placas a incubar a una estufa a 20-24 ºC durante varios días hasta que aparezcan colonias visibles en la superficie del agar.

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Resultados: Observación de colonias microbianasTranscurridos unos días tras la siembra del medio de cultivo con las diluciones de la muestra comenzarán a aparecer colonias visibles, de distinto tamaño y aspecto. Cada colonia procede de una célula que inicialmente sembramos en ese medio y se ha dividido vegetativamente hasta generar millones y millones de células. Una colonia aislada es por tanto un clon: todas las células que la integran son genéticamente idénticos a esa célula inicial. La observación macroscópica de la morfología colonial es sólo uno entre decenas de rasgos importantes para la identificación de las bacterias: morfologías parecidas no indican necesariamente que se trate de bacterias relacionadas entre sí. No obstante, en nuestro caso, nos ayudará a discernir distintos tipos de bacterias cultivables que colonizan el suelo analizado y será nuestro principal criterio para elegir especies microbianas diferentes.

Los rasgos que podemos observar en una colonia microbiana son: Tamaño (grandes o pequeñas): las células con más capacidad de aprovechar

los nutrientes del medio para generar biomasa o de desplazarse por su superficie para acceder a más nutrientes crecerán o se diseminarán más deprisa y formarán colonias más grandes.

Color: la mayoría de los microorganismos producen colonias blanquecinas o transparentes, pero ocasionalmente podemos observar distintos matices por producción de pigmentos: colonias amarillentas, anaranjadas, rosadas, incluso violáceas. También el grado de transparencia u opacidad y el brillo pueden delatar especies distintas.

Consistencia de la superficie: aspecto mucoso o seco, compacto, algodonoso, arrugado, agrietado.

Forma de los bordes: hay colonias lisas, onduladas, lobuladas, con los bordes filamentosos, estrelladas. etc.

Perfil y elevación: planas, convexas, con forma de “huevo frito”, como el cráter de un volcán, engrosadas en los bordes…

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Ejemplos de descripciones de la morfología colonial

Según la forma:Granuladas, puntiformes

Redondas, lisasRizoides

IrregularesFilamentosas

Según el perfil:Planas

ConvexasElevadas

Umbonadas, campaniformes…

Si tienes la oportunidad de incubar las placas durante un periodo largo (5-7 días) observa las placas con más diversidad y crecimiento: es posible que detectes fenómenos de interacción entre distintos microorganismos, como zonas de inhibición de colonias grandes en torno a colonias pequeñas. Esto te puede indicar que colonias son buenas candidatas para estudiar como posibles productoras de antibióticos.

8.

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EXPERIMENTO 3. Ensayo de antibiosis sobre microorganismos testigo relacionados con bacterias multirresistentes del grupo ESKAPE

¿Alguno de los microorganismos presentes en la muestra de tierra puede ser capaz de producir sustancias antibióticas que inhiban el crecimiento de bacterias patógenas para el ser humano? Una vez que hemos identificado diversas posibles especies microbianas en los cultivos de las diluciones de las muestras de suelo, vamos a realizar el ensayo de antibiosis. Para ello, podemos tomar tantos microorganismos como tipos distintos de colonias hayamos sido capaces de identificar, y enfrentarlos a bacterias patógenas en el laboratorio En SWI no utilizamos los patógenos que más comúnmente desarrollan resistencia a los antibióticos, precisamente aquellos contra los que necesitamos nuevas terapias, por su enorme peligrosidad. Pero disponemos de otras bacterias relacionadas con ellas carentes de virulencia. Los seis géneros bacterianos responsables de infecciones muy difíciles de tratar en la clínica, puesto que han acumulado resistencia a casi todos los antibióticos que tenemos, son Enterococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas y Escherichia (ESKAPE). Nosotros no vamos a utilizar los patógenos, por supuesto, sino otros relacionados, pero seguros.

Patógeno ESKAPE Bacteria segura relacionada Medio de cultivo óptimo

Enterococcus faecium

Enterococcus raffinosus BHI

(Gram-positivas) Bacillus subtilis LB

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis BHI, TSA

Klebsiella spp.

(y otras Gram negativas)

Escherichia coli AN

Acinetobacter baumanii

Acinetobacter baylyi BHI

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas putida LB

Enterobacter spp. Enterobacter aerogenes TSA

Material

Placas Petri con medios de cultivo que permitan el crecimiento del microorganismo testigo.

Una tubo con suspensión del microorganismo testigo en caldo de cultivo.

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Una torunda de algodón estéril. Palillos de dientes estériles.

Procedimiento

1. Equípate con guantes y la bata; moja con cuidado la torunda de algodón en la suspensión del microorganismo testigo, escúrrela en las paredes interiores del tubo para que no gotee e inmediatamente utilízala para extender el microorganismo por toda la superficie de la placa estéril de forma homogénea. Pasa la torunda en todas direcciones para asegurarte de que toda la superficie del agar va a quedar colonizada por el microorganismo. Haz esto con tantas placas como microorganismos testigo vayas a ensayar.

2. Con ayuda de los palillos estériles, siembra de uno en uno todos tus microorganismos distintos del suelo, numerándolos y consignando sus características de colonia. Incluye adicionalmente en cada placa un control positivo, es decir, un microorganismo conocido productor de antibiótico que te proporcionará el profesor.

3. Incuba las placas a 30 ºC durante 48 h.

Foto: F. Navarro

Resultados

Tras la incubación deberíamos ser capaces de observar crecimiento del microorganismo testigo por toda la superficie de la placa y, sobre éste, crecimiento de nuestros microorganismos en las respectivas zonas de contacto donde realizamos las siembras de manera ordenada. Observa si en torno a alguno de tus microorganismos existe una zona de inhibición, que se manifestará como un halo más claro en torno a él. En el control positivo debes observar este fenómeno.

Si tienes algún microorganismo positivo, debemos aislarlo mediante la técnica de estría en superficie para obtener colonias aisladas que guardaremos para su posterior identificación mediante técnicas microscópicas, bioquímicas y moleculares en la Universidad. Si ninguno de tus microorganismos parece producir antibióticos, no desesperes: los experimentos nunca salen a la primera. Comparte información con tus compañeros y busca si alguien de tu clase o de tu grupo ha encontrado algún microorganismo positivo.

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