línea de proyecto: establecer las bases para el buen uso
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Liacutenea de ProyectoEstablecer las bases para el buen uso de antibioacuteticos en la
salmonicultura
FINANCIAMIENTO PROGRAMA PARA LA GESTIOacuteN SANITARIA EN LA ACUICULTURA
Investigadora ResponsableDra Betty San Martiacuten (MV PhD)
Profesora Titular Universidad de ChileDirectora de Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET
FINANCIAMIENTO PROGRAMA PARA LA GESTIOacuteN SANITARIA EN LA ACUICULTURA
Liacutenea de Proyecto
Establecer las bases para el buen uso de antibioacuteticos en la salmonicultura
Investigadora Responsable
Dra Betty San Martiacuten (MV PhD)
Profesora Titular Universidad de Chile
Directora de Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET
2
IacuteNDICE
CONTENIDO PAacuteGINA
INDICE 2
MARCO TEOacuteRICO 4 OBJETIVOS 15 MATERIAL Y MEacuteTODOS 16 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 16
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
16
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
18
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
22
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
23
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
23
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
26
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
33
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
40
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
41
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
44
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en distintas pautas horarias
44
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
55
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea alimento
60
3
CONTENIDO PAGINA
RESULTADOS 61 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 61
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
61
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
67
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
75
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
77
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
77
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
82
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
86
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
93
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
96
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
112
CONCLUSIONES 115 RECOMENDACIONES 117 REFERENCIAS 118 ANEXOS 121 Anexo 1 Programa piloto de Prescripciones Meacutedico Veterinarias en liacutenea
para terapias antimicrobianas en agua de mar 121
Anexo 2 Objetivo 1 - CMI obtenida para cada cepa analizada 123
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MARCO TEOacuteRICO
Generalidades
Dentro de las aacutereas prioritarias del Programa de Gestioacuten Sanitaria para la Acuicultura estaacute
considerado Establecer las Bases y estrategias para mejorar el uso de antimicrobianos
Para lograr este fin deben analizarse todos los eslabones involucrados en el uso de antibioacuteticos
Al respecto la OIE sentildeala que deben existir legislaciones nacionales soacutelidas para los animales
acuaacuteticos y terrestres que cubra
La autorizacioacuten de comercializacioacuten fabricacioacuten e importacioacuten
Distribucioacuten (restriccioacuten del libre acceso)
Prescripcioacuten y administracioacuten
Seguimiento de las cantidades que se utilizan en los animales (en este caso centros de
cultivos de salmones)
Supervisioacuten por arte de los Organismos Estatutarios
En el caso particular de la salmonicultura a nivel nacional el mayor porcentaje de terapias con
antibioacuteticos se realiza en la fase de engorda en agua de mar administraacutendose principalmente
por viacutea oral a traveacutes del alimento
La calidad de los alimentos medicados especiacuteficamente relacionada con la cantidad solicitada
por el Meacutedico Veterinario mediante prescripcioacuten y la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento
son de vital importancia para asegurar el eacutexito de una terapia
En relacioacuten a lo sentildealado en el presente estudio se planteoacute evaluar la cantidad declarada y la
homogeneidad del antibioacutetico en el alimento debido a que a la fecha no existen estudios
nacionales que entreguen informacioacuten al respecto Se suma a esto la ausencia de legislaciones
nacionales en el control de los alimentos medicados quedando estos a criterio de las plantas
procesadoras de alimento medicado
En estos uacuteltimos antildeos se ha observado un aumento en la cantidad de antibioacuteticos utilizados por
la industria del salmoacuten atribuyeacutendose fundamentalmente al aumento de las dosis y duracioacuten de
las terapias en relacioacuten a lo recomendado por la industria farmaceacuteutica en el Registro de
medicamentos Asiacute tambieacuten se sabe que pisicrickettsiosis es la principal causa del uso de
antibioacuteticos durante la fase de engorda en mar y que las terapias se realizan principalmente con
alimento medicado de oxitetraclina y florfenicol siendo este uacuteltimo el de mayor uso
Los Meacutedicos Veterinarios encargados de la sanidad de los peces y responsables de realizar las
terapias sentildealan que una de las causas del aumento de la duracioacuten de las terapias es la demora
en llegar el alimento medicado
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Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
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farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
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- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
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Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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toneladas embarcadas Disponible en httpskrettinginformaclterminal-portuario-pargua-
skretting-alcanza-hito-15-millon-toneladas-embarcadas
120
Whitman K A (2004) Finfish and shellfish bacteriology manual techniques and procedures
Iowa State Press
121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
FINANCIAMIENTO PROGRAMA PARA LA GESTIOacuteN SANITARIA EN LA ACUICULTURA
Liacutenea de Proyecto
Establecer las bases para el buen uso de antibioacuteticos en la salmonicultura
Investigadora Responsable
Dra Betty San Martiacuten (MV PhD)
Profesora Titular Universidad de Chile
Directora de Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET
2
IacuteNDICE
CONTENIDO PAacuteGINA
INDICE 2
MARCO TEOacuteRICO 4 OBJETIVOS 15 MATERIAL Y MEacuteTODOS 16 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 16
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
16
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
18
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
22
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
23
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
23
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
26
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
33
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
40
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
41
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
44
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en distintas pautas horarias
44
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
55
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea alimento
60
3
CONTENIDO PAGINA
RESULTADOS 61 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 61
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
61
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
67
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
75
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
77
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
77
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
82
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
86
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
93
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
96
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
112
CONCLUSIONES 115 RECOMENDACIONES 117 REFERENCIAS 118 ANEXOS 121 Anexo 1 Programa piloto de Prescripciones Meacutedico Veterinarias en liacutenea
para terapias antimicrobianas en agua de mar 121
Anexo 2 Objetivo 1 - CMI obtenida para cada cepa analizada 123
4
MARCO TEOacuteRICO
Generalidades
Dentro de las aacutereas prioritarias del Programa de Gestioacuten Sanitaria para la Acuicultura estaacute
considerado Establecer las Bases y estrategias para mejorar el uso de antimicrobianos
Para lograr este fin deben analizarse todos los eslabones involucrados en el uso de antibioacuteticos
Al respecto la OIE sentildeala que deben existir legislaciones nacionales soacutelidas para los animales
acuaacuteticos y terrestres que cubra
La autorizacioacuten de comercializacioacuten fabricacioacuten e importacioacuten
Distribucioacuten (restriccioacuten del libre acceso)
Prescripcioacuten y administracioacuten
Seguimiento de las cantidades que se utilizan en los animales (en este caso centros de
cultivos de salmones)
Supervisioacuten por arte de los Organismos Estatutarios
En el caso particular de la salmonicultura a nivel nacional el mayor porcentaje de terapias con
antibioacuteticos se realiza en la fase de engorda en agua de mar administraacutendose principalmente
por viacutea oral a traveacutes del alimento
La calidad de los alimentos medicados especiacuteficamente relacionada con la cantidad solicitada
por el Meacutedico Veterinario mediante prescripcioacuten y la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento
son de vital importancia para asegurar el eacutexito de una terapia
En relacioacuten a lo sentildealado en el presente estudio se planteoacute evaluar la cantidad declarada y la
homogeneidad del antibioacutetico en el alimento debido a que a la fecha no existen estudios
nacionales que entreguen informacioacuten al respecto Se suma a esto la ausencia de legislaciones
nacionales en el control de los alimentos medicados quedando estos a criterio de las plantas
procesadoras de alimento medicado
En estos uacuteltimos antildeos se ha observado un aumento en la cantidad de antibioacuteticos utilizados por
la industria del salmoacuten atribuyeacutendose fundamentalmente al aumento de las dosis y duracioacuten de
las terapias en relacioacuten a lo recomendado por la industria farmaceacuteutica en el Registro de
medicamentos Asiacute tambieacuten se sabe que pisicrickettsiosis es la principal causa del uso de
antibioacuteticos durante la fase de engorda en mar y que las terapias se realizan principalmente con
alimento medicado de oxitetraclina y florfenicol siendo este uacuteltimo el de mayor uso
Los Meacutedicos Veterinarios encargados de la sanidad de los peces y responsables de realizar las
terapias sentildealan que una de las causas del aumento de la duracioacuten de las terapias es la demora
en llegar el alimento medicado
5
Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
14
Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
19
Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
20
- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
REFERENCIAS
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
2
IacuteNDICE
CONTENIDO PAacuteGINA
INDICE 2
MARCO TEOacuteRICO 4 OBJETIVOS 15 MATERIAL Y MEacuteTODOS 16 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 16
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
16
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
18
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
22
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
23
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
23
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
26
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
33
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
40
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
41
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
44
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en distintas pautas horarias
44
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
55
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea alimento
60
3
CONTENIDO PAGINA
RESULTADOS 61 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 61
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
61
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
67
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
75
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
77
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
77
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
82
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
86
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
93
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
96
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
112
CONCLUSIONES 115 RECOMENDACIONES 117 REFERENCIAS 118 ANEXOS 121 Anexo 1 Programa piloto de Prescripciones Meacutedico Veterinarias en liacutenea
para terapias antimicrobianas en agua de mar 121
Anexo 2 Objetivo 1 - CMI obtenida para cada cepa analizada 123
4
MARCO TEOacuteRICO
Generalidades
Dentro de las aacutereas prioritarias del Programa de Gestioacuten Sanitaria para la Acuicultura estaacute
considerado Establecer las Bases y estrategias para mejorar el uso de antimicrobianos
Para lograr este fin deben analizarse todos los eslabones involucrados en el uso de antibioacuteticos
Al respecto la OIE sentildeala que deben existir legislaciones nacionales soacutelidas para los animales
acuaacuteticos y terrestres que cubra
La autorizacioacuten de comercializacioacuten fabricacioacuten e importacioacuten
Distribucioacuten (restriccioacuten del libre acceso)
Prescripcioacuten y administracioacuten
Seguimiento de las cantidades que se utilizan en los animales (en este caso centros de
cultivos de salmones)
Supervisioacuten por arte de los Organismos Estatutarios
En el caso particular de la salmonicultura a nivel nacional el mayor porcentaje de terapias con
antibioacuteticos se realiza en la fase de engorda en agua de mar administraacutendose principalmente
por viacutea oral a traveacutes del alimento
La calidad de los alimentos medicados especiacuteficamente relacionada con la cantidad solicitada
por el Meacutedico Veterinario mediante prescripcioacuten y la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento
son de vital importancia para asegurar el eacutexito de una terapia
En relacioacuten a lo sentildealado en el presente estudio se planteoacute evaluar la cantidad declarada y la
homogeneidad del antibioacutetico en el alimento debido a que a la fecha no existen estudios
nacionales que entreguen informacioacuten al respecto Se suma a esto la ausencia de legislaciones
nacionales en el control de los alimentos medicados quedando estos a criterio de las plantas
procesadoras de alimento medicado
En estos uacuteltimos antildeos se ha observado un aumento en la cantidad de antibioacuteticos utilizados por
la industria del salmoacuten atribuyeacutendose fundamentalmente al aumento de las dosis y duracioacuten de
las terapias en relacioacuten a lo recomendado por la industria farmaceacuteutica en el Registro de
medicamentos Asiacute tambieacuten se sabe que pisicrickettsiosis es la principal causa del uso de
antibioacuteticos durante la fase de engorda en mar y que las terapias se realizan principalmente con
alimento medicado de oxitetraclina y florfenicol siendo este uacuteltimo el de mayor uso
Los Meacutedicos Veterinarios encargados de la sanidad de los peces y responsables de realizar las
terapias sentildealan que una de las causas del aumento de la duracioacuten de las terapias es la demora
en llegar el alimento medicado
5
Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
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Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
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embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
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Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
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MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
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Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
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b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
20
- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
3
CONTENIDO PAGINA
RESULTADOS 61 Objetivo 1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (MIC90) de
Oxitetraciclina y Florfenicol frente a P salmonis 61
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
61
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
67
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
75
Objetivo 2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los
alimentos medicados sobre las diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
77
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
77
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las premezclas
82
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en los alimentos medicados
86
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de antimicrobianos
93
Objetivo 3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la
relacioacuten entre la liberacioacuten y disolucioacuten de oxitetraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas de los diferentes alimentos medicados Etapa 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
96
Objetivo 4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y
florfenicol que asegure la eficacia cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD) Etapa 1
112
CONCLUSIONES 115 RECOMENDACIONES 117 REFERENCIAS 118 ANEXOS 121 Anexo 1 Programa piloto de Prescripciones Meacutedico Veterinarias en liacutenea
para terapias antimicrobianas en agua de mar 121
Anexo 2 Objetivo 1 - CMI obtenida para cada cepa analizada 123
4
MARCO TEOacuteRICO
Generalidades
Dentro de las aacutereas prioritarias del Programa de Gestioacuten Sanitaria para la Acuicultura estaacute
considerado Establecer las Bases y estrategias para mejorar el uso de antimicrobianos
Para lograr este fin deben analizarse todos los eslabones involucrados en el uso de antibioacuteticos
Al respecto la OIE sentildeala que deben existir legislaciones nacionales soacutelidas para los animales
acuaacuteticos y terrestres que cubra
La autorizacioacuten de comercializacioacuten fabricacioacuten e importacioacuten
Distribucioacuten (restriccioacuten del libre acceso)
Prescripcioacuten y administracioacuten
Seguimiento de las cantidades que se utilizan en los animales (en este caso centros de
cultivos de salmones)
Supervisioacuten por arte de los Organismos Estatutarios
En el caso particular de la salmonicultura a nivel nacional el mayor porcentaje de terapias con
antibioacuteticos se realiza en la fase de engorda en agua de mar administraacutendose principalmente
por viacutea oral a traveacutes del alimento
La calidad de los alimentos medicados especiacuteficamente relacionada con la cantidad solicitada
por el Meacutedico Veterinario mediante prescripcioacuten y la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento
son de vital importancia para asegurar el eacutexito de una terapia
En relacioacuten a lo sentildealado en el presente estudio se planteoacute evaluar la cantidad declarada y la
homogeneidad del antibioacutetico en el alimento debido a que a la fecha no existen estudios
nacionales que entreguen informacioacuten al respecto Se suma a esto la ausencia de legislaciones
nacionales en el control de los alimentos medicados quedando estos a criterio de las plantas
procesadoras de alimento medicado
En estos uacuteltimos antildeos se ha observado un aumento en la cantidad de antibioacuteticos utilizados por
la industria del salmoacuten atribuyeacutendose fundamentalmente al aumento de las dosis y duracioacuten de
las terapias en relacioacuten a lo recomendado por la industria farmaceacuteutica en el Registro de
medicamentos Asiacute tambieacuten se sabe que pisicrickettsiosis es la principal causa del uso de
antibioacuteticos durante la fase de engorda en mar y que las terapias se realizan principalmente con
alimento medicado de oxitetraclina y florfenicol siendo este uacuteltimo el de mayor uso
Los Meacutedicos Veterinarios encargados de la sanidad de los peces y responsables de realizar las
terapias sentildealan que una de las causas del aumento de la duracioacuten de las terapias es la demora
en llegar el alimento medicado
5
Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
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Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
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MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
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Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
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b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
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- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
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-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
4
MARCO TEOacuteRICO
Generalidades
Dentro de las aacutereas prioritarias del Programa de Gestioacuten Sanitaria para la Acuicultura estaacute
considerado Establecer las Bases y estrategias para mejorar el uso de antimicrobianos
Para lograr este fin deben analizarse todos los eslabones involucrados en el uso de antibioacuteticos
Al respecto la OIE sentildeala que deben existir legislaciones nacionales soacutelidas para los animales
acuaacuteticos y terrestres que cubra
La autorizacioacuten de comercializacioacuten fabricacioacuten e importacioacuten
Distribucioacuten (restriccioacuten del libre acceso)
Prescripcioacuten y administracioacuten
Seguimiento de las cantidades que se utilizan en los animales (en este caso centros de
cultivos de salmones)
Supervisioacuten por arte de los Organismos Estatutarios
En el caso particular de la salmonicultura a nivel nacional el mayor porcentaje de terapias con
antibioacuteticos se realiza en la fase de engorda en agua de mar administraacutendose principalmente
por viacutea oral a traveacutes del alimento
La calidad de los alimentos medicados especiacuteficamente relacionada con la cantidad solicitada
por el Meacutedico Veterinario mediante prescripcioacuten y la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento
son de vital importancia para asegurar el eacutexito de una terapia
En relacioacuten a lo sentildealado en el presente estudio se planteoacute evaluar la cantidad declarada y la
homogeneidad del antibioacutetico en el alimento debido a que a la fecha no existen estudios
nacionales que entreguen informacioacuten al respecto Se suma a esto la ausencia de legislaciones
nacionales en el control de los alimentos medicados quedando estos a criterio de las plantas
procesadoras de alimento medicado
En estos uacuteltimos antildeos se ha observado un aumento en la cantidad de antibioacuteticos utilizados por
la industria del salmoacuten atribuyeacutendose fundamentalmente al aumento de las dosis y duracioacuten de
las terapias en relacioacuten a lo recomendado por la industria farmaceacuteutica en el Registro de
medicamentos Asiacute tambieacuten se sabe que pisicrickettsiosis es la principal causa del uso de
antibioacuteticos durante la fase de engorda en mar y que las terapias se realizan principalmente con
alimento medicado de oxitetraclina y florfenicol siendo este uacuteltimo el de mayor uso
Los Meacutedicos Veterinarios encargados de la sanidad de los peces y responsables de realizar las
terapias sentildealan que una de las causas del aumento de la duracioacuten de las terapias es la demora
en llegar el alimento medicado
5
Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
19
Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
20
- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
REFERENCIAS
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
5
Factores que influyen en el proceso de absorcioacuten de un faacutermaco
El proceso de absorcioacuten de un API liberado desde una forma farmaceacuteutica puede verse afectado
por caracteriacutesticas propias del faacutermaco de la forma farmaceacuteutica y del sitio de administracioacuten
Caracteriacutesticas propias del faacutermaco
Entre las caracteriacutesticas relevantes para la disolucioacuten se encuentran el tamantildeo de partiacutecula la
presencia de polimorfos fiacutesicos sus caracteriacutesticas de aacutecido o base deacutebil o la ausencia de ellas
si estaacute en forma de aacutecido base o sal todas caracteriacutesticas que pueden influir en su solubilidad
yo la velocidad del proceso El Sistema de Clasificacioacuten Biofarmaceacuteutica (BCS por su sigla en
ingleacutes) puso en contexto los 2 atributos que definen la posibilidad de que un faacutermaco soacutelido pueda
finalmente absorberse la solubilidad de la maacutexima dosis administrada como dosis unitaria y la
permeabilidad (Amidon et al 1995) Puede ocurrir que un faacutermaco sea altamente soluble y
altamente permeable de forma que todo el API que vaya disolvieacutendose seraacute raacutepidamente retirado
por la circulacioacuten desde el sitio donde debe verificarse la absorcioacuten creando una condicioacuten
llamada sink donde la fuerza motriz del proceso de disolucioacuten -dada por la diferencia de
concentracioacuten entre la capa de solucioacuten saturada que recubre la partiacutecula soacutelida y el seno de la
solucioacuten- se mantiene a favor del paso desde el estado soacutelido al soluble Sin embargo una
moleacutecula de alta solubilidad y poco permeable puede generar transitoriamente una alta
concentracioacuten en el sitio de disolucioacuten con lo que tenderiacutea a frenar el proceso de disolucioacuten al
disminuir la diferencia de concentracioacuten entre la superficie del soacutelido y la solucioacuten generando un
proceso llamado non sink Ambas situaciones son factibles de encontrar in vivo dependiendo de
las caracteriacutesticas del API
Los faacutermacos de intereacutes en este proyecto florfenicol y oxitetraciclina formulados en alimentos
medicados para peces presentan las siguientes caracteriacutesticas
Los fenicoles- cloranfenicol tiamfenicol y florfenicol son compuestos derivados del aacutecido
tricloroaceacutetico cuya accioacuten bacteriostaacutetica se basa en la inhibicioacuten de la siacutentesis proteica de la
ceacutelula bacteriana Para uso veterinario en Chile estaacute autorizado el florfenicol Florfenicol es una
moleacutecula neutra no posee grupos ionizables en un rango de pH de 3 a 9 Es soluble en solventes
polares orgaacutenicos y ligeramente soluble en agua Su coeficiente de particioacuten octanolagua log
Pow es de 236 posee relativamente una elevada solubilidad lipiacutedica facilitando su amplia
distribucioacuten tisular En estado soacutelido es estable a la luz al calor y a la humedad y no es
higroscoacutepico (Schering Plough 2007 Nuflor Gold) Sus caracteriacutesticas de no ionizable hacen
poco probable que su disolucioacuten sea afectada por las condiciones de pH considerando que el
rango de pH en el estoacutemago del pez es entre 25 y 5 aunque este uacuteltimo puede tener un rol
mayoritario en el comportamiento de disolucioacuten de los faacutermacos por el tiempo que permanece
ese valor de pH despueacutes de la ingesta de alimentos Debido a su alta solubilidad lipiacutedica su
solubilidad en medios acuosos puede verse disminuida en medios con una fuerza ioacutenica alta
como el agua de mar que dejan menos agua libre disponible para el proceso de disolucioacuten Los
datos de disolucioacuten disponibles estaacuten a temperaturas en el rango de 20-25degC desconocieacutendose
la magnitud del cambio en su solubilidad cuando la temperatura es maacutes baja Estudios
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
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- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
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Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
6
farmacocineacuteticos se han llevado a cabo con florfenicol tras una administracioacuten oral uacutenica de 10
mgkg peso vivo a truchas arcoiacuteris a 10ordmC y 16ordmC Tras la administracioacuten oral de pienso medicado
conteniendo florfenicol se alcanzaron concentraciones plasmaacuteticas maacuteximas de 30 y 37 μgml
a las 137 y 109 horas respectivamente tras la administracioacuten a 10ordmC y 16ordmC El florfenicol tiene
una biodisponibilidad oral del 739 a 10ordmC y del 663 a 16ordmC (Florocol Aqua 2013)
La Oxitetraciclina es una sustancia cristalina ligeramente amarilla sin olor y levemente amarga
es anfoacutetera ya que en solucioacuten acuosa forma sales tanto con aacutecidos como con bases Es estable
en forma de polvo pero no en solucioacuten acuosa siendo particularmente inestable a pH superiores
a 7 Se destruye con soluciones aacutecidas de pH inferiores a 2 En un pH aacutecido es poco soluble
pero puede combinarse con sodio o formar el clorhidrato lo que la hace maacutes estable (USP 2003)
La oxitetraciclina clorhidrato es un faacutermaco con constantes de disociacioacuten (pKa) de 33 73 y 91
y por lo tanto se encuentra ionizada en todo el intervalo de pH fisioloacutegico existiendo en forma
catioacutenica a valores de pH aacutecidos anioacutenico a pH alcalino y en forma zwitterionica a pH neutro
(Guimeraacute et al 1992) Su peso molecular es 46044 grmol Su solubilidad en agua es de 313
mgL a 25 degC (Oxytetracycline Drug Bank) Su biodisponibilidad en el ser humano es
relativamente baja alrededor del 40-55 producto de su baja permeabilidad Su solubilidad y
biodisponibilidad estaacuten dentro del mismo rango que la tetraciclina compuesto de la misma familia
que estaacute clasificado como Clase 1 seguacuten el BCS lo que significa que presenta una alta
solubilidad y una baja permeabilidad Resultados en trucha arcoiacuteris muestran una
biodisponibilidad muy inferior al 10 (USP 2003) que puede deberse a la posibilidad de
quelacioacuten con cationes bi y trivalentes presentes en el agua de mar (Lunestad BT amp Goksoslashyr
J 1990) Un trabajo de tesis de grado de la Universidad Austral demostroacute una biodisponibilidad
inferior al 1 cuando los peces fueron alimentados al 14 de su peso vivo durante 28 diacuteas Los
primeros 21 diacuteas los peces fueron alimentados con alimento medicado vertido en el agua el que
conteniacutea 100 mg de oxitetraciclinaKg de biomasa cada 24 horas y los otros 7 diacuteas soacutelo con el
alimento (Benavente J2013) Biodisponibilidades mayores se obtuvieron en trabajos donde el
alimento medicado fue envasado en una caacutepsula y depositado directamente en el estoacutemago del
pez (Miller et al 2012) De acuerdo a las caracteriacutesticas previamente expuestas la solubilidad
de la oxitetraciclina deberiacutea mantenerse dentro de niveles altos en las diferentes condiciones de
pH y bajo la influencia de sustancias tensoactivas Especial precaucioacuten se deberaacute tener en la
formulacioacuten de los medios de disolucioacuten los que deberaacuten reflejar certeramente la composicioacuten
del agua de mar por la posibilidad de que algunos de los cationes presentes puedan
eventualmente formar complejos insolubles con el API
Caracteriacutesticas propias de la forma farmaceacuteutica
La composicioacuten de los excipientes que pueden eventualmente interactuar con el API asiacute como
las caracteriacutesticas fiacutesicas del producto farmaceacuteutico dadas por los procesos de manufactura
pueden crear condiciones que hacen que diferentes formulaciones presenten patrones diferentes
de liberacioacuten de faacutermaco Estas caracteriacutesticas diferenciadoras quedan en evidencia cuando se
realizan controles al producto como dureza friabilidad tiempos de desintegracioacuten y de
disolucioacuten En el caso de los alimentos medicados para peces el sistema que soporta al API es
un alimento matriz de caraacutecter complejo que dependiendo de las variaciones en su
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
14
Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
19
Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
20
- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
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Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
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Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
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Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
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este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
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Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
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Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
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b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
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Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
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Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
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Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
7
composicioacuten puede generar diferentes patrones de liberacioacuten de los faacutermacos Tambieacuten la
composicioacuten del alimento tiene una fuerte influencia en el tiempo de traacutensito gastrointestinal
como se veraacute posteriormente
Respecto a los excipientes los alimentos medicados para uso en acuicultura suelen ser matrices
complejas cuyas posibilidades de interaccioacuten con los APIs pueden ser de variada iacutendole
dependiendo de las caracteriacutesticas del faacutermaco involucrado Es ampliamente conocida la
interaccioacuten de las tetraciclinas con cationes bi y trivalentes que si bien es una interaccioacuten
importante para su paso a traveacutes de membranas especiacuteficamente con Mg +2 a nivel del proceso
de liberacioacuten del API desde la matriz de excipientes puede resultar en una modificacioacuten
importante de la disponibilidad del faacutermaco para ser absorbido
Las foacutermulas usadas en Chile en alimentos pelletizados y extruidos (Castro 1992) se
caracterizan por un alto contenido proteico y graso seguacuten muestra la tabla
Ingrediente Dieta pelletizada () Dieta extruida ()
Harina de pescado 60 60
Subproductos del trigo 13 23
Trigo entero molido 10 -
Premezcla vitamiacutenica 2 2
Premezcla de minerales 01 01
Cloruro de colina (60) 05 05
Aacutecido ascoacuterbico 05 05
Aglutinante 2 0
Aceite de pescado 10 ndash 11 14
Anaacutelisis proximal
Humedad 8 8
Proteiacutena cruda 45 46
Extracto eteacutereo 14 ndash 15 18
Estos pellets son proporcionados a los salmones lanzaacutendolos al agua dentro de jaulas o balsas
marinas donde entran en contacto con el agua de mar cuyas caracteriacutesticas abioacuteticas (tomando
como referencia el sector de Chiloeacute) son temperaturas aproximadas de 105ordmC salinidades de
326 000 y un pH aproximado de 74 a 10 metros de profundidad (Fishing Partners Ltda 2006)
Estos pellets una vez que estaacuten en el agua de mar son ingeridos por los peces llegando
praacutecticamente intactos a su estoacutemago Posteriormente se produce la digestioacuten del pellet al entrar
en contacto con los jugos gaacutestricos del salmoacuten en un medio cuyo pH gaacutestrico variaraacute entre 25
a 40 dependiendo de la cantidad de agua ingerida con la comida (Seki 1969) Luego el alimento
sigue su digestioacuten normal con un tiempo de vaciamiento gaacutestrico aproximado de 284 y 181 h a
114 y 137deg C respectivamente (Brodeur y Pearcy 1978) En estas condiciones los salmones
crecen y se desarrollan para alcanzar el peso y tamantildeo adecuado para su posterior faenamiento
y comercializacioacuten (Valenzuela 2005)
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
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Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
14
Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
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MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
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Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
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b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
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- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
8
Caracteriacutesticas propias del sitio de administracioacuten
El planteamiento de ensayos de disolucioacuten tiene que considerar lo que se denomina
caracteriacutesticas biofarmaceacuteuticas de la viacutea de administracioacuten que considera cuaacuteles caracteriacutesticas
anatoacutemicas yo fisioloacutegicas pueden tener influencia sobre el proceso de liberacioacuten del API desde
la forma farmaceacuteutica Factores importantes son la irrigacioacuten sanguiacutenea permeabilidad celular
presencia de enzimas biotransformadoras de transportadores de eflujo ademaacutes de las
referentes a las estructuras mismas que componen el sistema digestivo Algunas de estas
caracteriacutesticas pueden influir en la disolucioacuten de medicamentos y se hace lo posible por emularlas
y otras no tienen relacioacuten con el proceso
La morfologiacutea del tracto gastrointestinal de los peces variacutea seguacuten las especies haacutebitat y dietas
Pero en general es esencialmente un tracto muscular lineal cubierto por una membrana mucosa
que exhibe variacioacuten en sus estructuras lo que le otorga las diferencias funcionales El tracto
digestivo puede dividirse principalmente en 3 importantes segmentos o tramos (en la mayoriacutea de
los peces) estos son estoacutemago ciegos piloacutericos e intestino El primer tramo el estoacutemago posee
un revestimiento celular distintivo formado por ceacutelulas que secretan aacutecido al lumen este aacutecido
es generalmente secretado en conjunto con algunas enzimas digestivas como la pepsina El
alimento en el estoacutemago se desmenuza realmente por accioacuten de aacutecidos enzimas digestivas
(como la pepsina que digiere en parte las proteiacutenas) y por accioacuten trituradora de las paredes del
estoacutemago El pH de este oacutergano variacutea entre 30 y 45 Los ciegos piloacutericos se extienden desde
donde termina el estoacutemago hasta donde comienza el intestino su funcioacuten es incrementar la
superficie de absorcioacuten digestiva y presenta un pH de 70 El uacuteltimo segmento del tracto digestivo
el intestino posee un pH de 74 y se caracteriza por ser un oacutergano complejo y multifuncional En
adicioacuten a su funcioacuten digestiva y absortiva el intestino tambieacuten cumple funciones en el balance
de electrolitos regulacioacuten endocrina de digestioacuten y metabolismo e inmunidad Estudios sentildealan
que el intestino se divide a su vez en dos zonas una zona proximal que limita con los ciegos
piloacutericos donde se centra la hidroacutelisis de macromoleacuteculas mediadas por enzimas liacuteticas y la
absorcioacuten de nutrientes de bajo peso molecular y una zona distal en la cual se sentildeala como
funcioacuten principal la endocitosis de macromoleacuteculas y proteiacutenas intactas en teleoacutesteos (Mancini
M 2002 Ringoslash et al 2016)
En el 2009 Yendo y Wood observaron el efecto del alimento en el pH del estoacutemago Los autores
alimentaron a la trucha arco iris (peso promedio 350 g) con un alimento acuiacutecola comercial para
trucha que poseiacutea una proteiacutena cruda del 41 en una sola comida (racioacuten al 2 del peso
corporal) y monitorearon el pH resultante en el estoacutemago Justo antes de suministrar el alimento
el pH del estoacutemago fue de asymp 27 mientras que una hora despueacutes de ingerido el alimento el pH
fue significativamente superior (49) Permanecioacute alliacute durante al menos 8 horas estando muy por
encima del nivel oacuteptimo para la actividad de la pepsina El quimo se liberoacute en el duodeno 8 horas
despueacutes de suministrado el alimento por lo que los niveles de pH fueron demasiado altos Los
autores especularon que la capacidad de amortiguacioacuten del alimento fue el principal elemento
que influyoacute en el aumento del pH de los fluidos gaacutestricos A los peces le tomoacute maacutes de 24 horas
llegar al bajo pH inicial del estoacutemago Estos antecedentes deben ser tomados en consideracioacuten
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
11
Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
12
embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
13
Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
14
Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
15
OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
16
MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
17
Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
18
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
19
Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
20
- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
21
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
22
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
23
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
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Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
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Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
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Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
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Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
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b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
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Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
9
cuando se evaluacutee el efecto del pH en la liberacioacuten de los faacutermacos considerando que los
alimentos que sirven de base para la administracioacuten de los faacutermacos tienen un porcentaje de
proteiacutenas de 45-46) (httpwwwaquaclwp-contentuploadssites3201504Acidificacion-en-
Peces-Monogastricospdf)
A nivel del intestino las enzimas desdoblan las grasas proteiacutenas y azuacutecares que luego de
atravesar la pared intestinal son llevados al hiacutegado El resto de alimentos se evacuan junto con
las heces El alimento utilizado en la forma de balanceado comercial tiene alta cantidad de
proteiacutena (en algunos casos superior al 40) y alta cantidad de energiacutea (dada principalmente por
liacutepidos) El exceso de grasa es utilizado como energiacutea y se almacena principalmente en muacutesculo
El tiempo que tarda en recorrer el alimento el tubo digestivo puede variar desde unas pocas horas
hasta diacuteas dependiendo de los distintos procesos metaboacutelicos que estaacuten dados principalmente
por la temperatura ya que a mayor temperatura se aceleran (Mancini M 2002)
El hiacutegado es la principal faacutebrica del organismo interviniendo en distintos procesos metaboacutelicos
Es blando de color pardo rojizo y muy voluminoso presentando en ocasiones de color rosa ndash
crema situacioacuten que no siempre indica un cuadro patoloacutegico La vesiacutecula biliar estaacute bien
desarrollada El coleacutedoco vierte en la primera porcioacuten del intestino delgado la bilis que emulsiona
las grasas para que sean faacutecilmente atacadas por las lipasas pancreaacuteticas Por su parte el
paacutencreas segrega amilasas tripsina y quimiotripsina El conducto pancreaacutetico vierte casi siempre
en el coleacutedoco (Mancini M 2002)
De todas estas caracteriacutesticas previamente mencionadas desde el punto de vista
biofarmaceacuteutico las condiciones fisicoquiacutemicas del medio fisioloacutegico maacutes importantes a evaluar
en el proceso de disolucioacuten lo constituyen el pH la fuerza ioacutenica la tensioacuten superficial dada por
la presencia fisioloacutegica de sales biliares y los tiempos de permanencia del faacutermaco en estoacutemago
e intestino
Adicionalmente considerando que los peces son poiquilotermos y que en consecuencia su
temperatura corporal variacutea seguacuten la del medio ambiente la disolucioacuten de los APIs podriacutea verse
alterada seguacuten la variacioacuten estacional de la temperatura Seguacuten el registro de temperaturas del
agua de mar del antildeo 2016 las temperaturas extremas fueron 10 y 15degC en la zona de Chiloeacute La
influencia de la fuerza ioacutenica no seriacutea una variable sino una condicioacuten que debe incluirse en
todos los medios para acercarse maacutes a la caracterizacioacuten de la disolucioacuten in vivo
10
Los equipos de disolucioacuten y condiciones sink y non sink
Para realizar los ensayos de disolucioacuten desde productos farmaceacuteuticos existen varios equipos
oficiales descritos en las farmacopeas De ellos los maacutes utilizados son los Aparatos 1 y 2 de la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP 39) El primero corresponde a un canastillo y suele
recomendarse para productos que tienen a flotar y el segundo es un sistema de paleta que se
recomienda usar para productos soacutelidos que no flotan Existen otros equipos que intentan
acercarse a la condicioacuten fisioloacutegica retirando del sistema el faacutermaco que se va disolviendo como
el Aparato 4 de la USP o aparato de flujo continuo que fue disentildeado bajo el concepto de que in
vivo el API que se disuelve no queda en el medio de disolucioacuten sino que es retirado por la
circulacioacuten condicioacuten sink No es un equipo de amplio uso y su aplicacioacuten ha estado focalizada
en los sistemas de liberacioacuten controlada Todos los equipos mencionados tienen alguacuten tipo de
receptaacuteculo de geometriacutea muy especiacutefica donde se introduce el medio de disolucioacuten un sistema
que agita o hace circular el medio y en el caso de productos para uso humano la temperatura
del sistema se fija en 37degC En los primeros 2 equipos mencionados al no retirar el faacutermaco
disuelto la condicioacuten podriacutea ser non sink Sin embargo la condicioacuten sink se consigue trabajando
con una cantidad disuelta maacutexima no superior al 20 de la solubilidad del faacutermaco Estos equipos
admiten una amplitud de medios de disolucioacuten velocidades de agitacioacuten y tiempos de muestreo
por lo que se pueden explorar abundantes condiciones experimentales
Modelos para describir el proceso de disolucioacuten
Los correspondientes modelos cineacuteticos destinados a describir la liberacioacuten desde formas de
dosificacioacuten inmediata o modificada se pueden agrupar en los denominados modelos
matemaacuteticos mecanicistas o reales en los que los paraacutemetros que la constituyen surgen o se
explican como resultado de un anaacutelisis teoacuterico Entre ellos se encuentran los denominados de
orden cero orden uno modelo de la raiacutez cuadrada o de Higuchi y de la raiacutez cuacutebica o de Hixson-
Crowell El modelo conocido como ldquoLey de la Potenciardquo o modelo de Peppas asiacute como las
modificaciones posteriores de este modelo son en esencia modelos empiacutericos aun cuando en
determinadas ocasiones puedan dar una explicacioacuten mecanicista de liberacioacuten (Costa y Sousa
2001 Yuksel et al 2001)
Independientemente de cuaacutel sea el modelo que describe al proceso existe un tratamiento
estadiacutestico modelo independiente que se aplica en la comparacioacuten de perfiles de disolucioacuten y
que mide las diferencias absolutas que se producen entre perfiles de disolucioacuten promedio cuyo
paraacutemetro es denominado factor de similitud f2 que obedece a la siguiente expresioacuten
f2= 50 log (1 + (1n) Σ(1-n) (Tti-Rti) 2) -12 100
Donde
n = Nuacutemero de tomas de muestra durante el ensayo de disolucioacuten
Rti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten de referencia
Tti = Promedio del disuelto acumulado de la formulacioacuten a ensayar
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Este factor de similitud permite establecer si las diferencias observadas tienen alguacuten significado
real ya que la condicioacuten para declarar diferentes a 2 situaciones es que en promedio las curvas
se diferencien en maacutes de un 10 Variaciones menores al 10 suelen encontrarse entre los
lotes de una misma formulacioacuten Como compara situaciones promedio tiene requerimientos de
variabilidad y de nuacutemero de experimentos Para cada situacioacuten deben ensayarse 12 unidades y
el coeficiente de variacioacuten para los tiempos de disolucioacuten tempranos no puede exceder el 20 y
para los tiempos posteriores el 15 (Liu J et al 1997)
Teniendo en consideracioacuten lo anteriormente expuesto resulta importante la caracterizacioacuten de
la disolucioacuten de los API de intereacutes desde las matrices de alimentos en que son formulados para
su administracioacuten a peces tanto para evaluar la cesioacuten de faacutermaco desde las formulaciones
emulando las condiciones in vivo en que ello ocurre como para tener los antecedentes que
permitan correlacionar los datos que se obtengan en esta etapa con los que se obtengan de
experimentos posteriores de farmacocineacutetica en peces
Efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados
En los antibioacuteticos pueden existir ligeros cambios quiacutemicos que se traducen en peacuterdida de
actividad antimicrobiana o perdida de potencia microbioloacutegica la cual no puede demostrarse por
meacutetodos quiacutemicos Para valorar la potencia se utilizan meacutetodos de difusioacuten en agar y meacutetodos
en medios de cultivo liacutequidos La potencia se calcula comparando el grado de inhibicioacuten de un
microorganismo especiacutefico sensible frente a un antibioacutetico de referencia con el grado de
inhibicioacuten frente a una muestra (pre-mezcla de antibioacutetico) tratadas en las mismas condiciones
En los meacutetodos que utilizan medios de cultivo liacutequido al adicionar concentraciones crecientes
del antibioacutetico se inhibe el crecimiento bacteriano en forma proporcional a la concentracioacuten de
antibioacutetico adicionado El crecimiento del microorganismo de prueba se mide
espectrofotomeacutetricamente (absorbancia) Para evaluar la potencia de cada premezcla se deben
preparar soluciones stock equivalentes del antibioacutetico de referencia y de las premezclas A partir
de ellas se preparan diferentes concentraciones de trabajo
Efecto en la biodisponibilidad de acuerdo a la relacioacuten entre liberacioacuten y disolucioacuten
La administracioacuten de faacutermacos a un organismo vivo es realizada a traveacutes de una forma
farmaceacuteutica entendieacutendose por tal a un sistema fisicoquiacutemico que es disentildeado para entregar la
dosis a una velocidad y cantidad que sea apropiada para tratar la patologiacutea Para transformar el
faacutermaco en un producto farmaceacuteutico se requiere del uso de excipientes los que si bien son
farmacoloacutegicamente inertes no lo son desde un punto de vista fisicoquiacutemico ya que son los
encargados de modular la entrega del principio activo (API por su sigla en ingleacutes)
Es sabido desde hace mucho tiempo que salvo mecanismos excepcionales el API debe
encontrarse disuelto en los medios fisioloacutegicos para ser absorbido llegar a la circulacioacuten
sisteacutemica y mediante el proceso de distribucioacuten llegar al sitio donde ejerceraacute su accioacuten Sin
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embargo no fue hasta la deacutecada del 60 del siglo pasado que este fenoacutemeno fue puesto de
relevancia por Campagna en un trabajo claacutesico de la Biofarmacia donde demostroacute la importancia
del proceso de disolucioacuten para el efecto farmacoloacutegico de comprimidos de prednisona
(Campagna et al 1963) En el caso de los medicamentos de uso humano a partir de este trabajo
se produjo en pocos antildeos un aumento exponencial de ensayos de disolucioacuten hasta llegar a un
acuerdo respecto del disentildeo y estandarizacioacuten de los equipos que permitiriacutean medir el fenoacutemeno
haciendo las mediciones repetibles y comparables entre distintos laboratorios En la actualidad
para la mayoriacutea de los medicamentos orales soacutelidos de uso humano existe un ensayo de
disolucioacuten descrito en los compendios oficiales como la USP (United States Pharmacopeia USP
39 2016)
Efecto de la pureza declarada en las premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
Las premezclas de antibioacutetico en este caso oxitetraciclina y florfenicol son consideradas
medicamentos veterinarios preparados con vista a la fabricacioacuten de alimentos medicado para
animales Son de naturaleza soacutelida incorporaacutendose al alimento durante su elaboracioacuten en
proporciones no inferiores al 2
Como todo medicamento veterinario deben estar autorizadas por las autoridades reguladoras
que en el caso de Chile es el Servicio Agriacutecola Ganadero (SAG) Estos organismos son
responsables de controlar los requerimientos de calidad seguridad y eficacia antes y despueacutes
de su comercializacioacuten
Por otro lado toda premezcla medicamentosa debe incorporar en el etiquetado las
caracteriacutesticas cualitativas y cuantitativas de los principios activos dentro de las cuales la
estabilidad y pureza son respectivamente las maacutes importantes
La pureza se refiere al porcentaje efectivo del principio activo puro en la masa total (en este caso
los antibioacuteticos) Tiene relacioacuten directa con la eficacia de una terapia con alimento medicado ya
que la cantidad de antibioacutetico incorporado en el alimento depende de la dosis calculada por el
Meacutedico Veterinario Para el caacutelculo de la dosis se debe considerar la pureza del antibioacutetico
declarado en la etiqueta de la premezcla
Los rangos de aceptabilidad de la pureza de una premezcla de antibioacutetico son de un 5 con
respecto al valor declarado Valores menores al declarado pueden ser causa de fracaso
terapeacuteutico en todas las especies animales y en el caso particular de la salmonicultura valores
mayores a los declarados favorecen ademaacutes el impacto negativo sobre el medio ambiente
acuaacutetico (por perdida de alimento medicado no ingerido por los peces)
Estabilidad del alimento medicado
Los estudios de estabilidad suministran la evidencia necesaria de como la calidad de un
medicamento variacutea con el tiempo por la influencia de diferentes factores ambientes como la
temperatura la luz y la humedad entre otros
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Estos estudios permiten definir la fecha de caducidad de un medicamento es decir el periacuteodo
de tiempo durante el cual el medicamento mantiene un miacutenimo del 90 del principio activo (pa)
sin que se aprecien peacuterdidas en su calidad Son solicitados por los organismos reguladores
correspondientes antes de autorizar su comercializacioacuten En el caso de los piensos medicados
para animales incluido las especies acuaacuteticas estos estudios no son solicitados ya que no estaacuten
considerados como medicamentos
Debido a lo mencionado se hace necesario realizar estudios de estabilidad en los piensos
medicados con oxitetraciclina y florfenicol destinados a los centros de cultivo en etapa de engorda
en agua de mar Esto permitiraacute tener una orientacioacuten de su vida uacutetil post venta en relacioacuten a las
condiciones de almacenamiento Dentro de estos estudios la estabilidad quiacutemica (degradacioacuten
del antibioacutetico) en diferentes condiciones de humedad y temperatura es la maacutes importante de
evaluar
Existen estudios de estabilidad acelerada y a tiempo real
En este caso se realizaraacuten estudios de estabilidad acelerada ya que estos se realizan en
condiciones extremas de almacenamiento con el fin de acelerar la degradacioacuten quiacutemica y los
cambios fiacutesicos El objetivo es predecir el periacuteodo de validez en condiciones normales
reduciendo el tiempo de ensayo
Modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
El eacutexito de una terapia antimicrobiana depende de que a una dosis determinada del antibioacutetico
en el animal o biomasa a tratar se produzca una adecuada relacioacuten entre los paraacutemetros
farmacocineacuteticos y la sensibilidad in vitro de la bacteria (Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria - CMI)
Dentro de este contexto el desarrollo de modelos farmacocineacuteticosfarmacodinaacutemicos (PKPD)
han contribuido a mejorar la eficiencia de uso de los antibioacuteticos Para poder evaluar la relacioacuten
entre estas dos variables se establecieron los Iacutendices de Eficacia de los antibioacuteticos a traveacutes de
los cuales objetivamente se puede predecir el eacutexito de una terapia antimicrobiana
Los modelos PKPD relacionan las concentraciones de un faacutermaco en el plasma y otros tejidos
con la informacioacuten farmacodinaacutemica (sensibilidad del microorganismo patoacutegeno frente al
antibioacutetico) Los estudios de Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) describen la sensibilidad de
una bacteria frente a un determinado antibioacutetico y los estudios poblacionales permiten definir los
puntos de corte de la CMI cliacutenica (Sensibles o Resistentes) necesarios para realizar los estudios
PKPD En estos uacuteltimos antildeos ha habido cambios en la definicioacuten de los puntos de corte de un
antibioacutetico Los puntos de corte epidemioloacutegico (ECV) son criterios interpretativos agente
protocolo y especie especiacuteficos Su objetivo es facilitar la categorizacioacuten de un aislado como
miembro totalmente susceptible de su especie o manifestando susceptibilidad reducida Estos
ECV son utilizados para determinar la dosis oacuteptima y el punto de corte cliacutenico (Canut et al 2015)
En el caso particular de Chile florfenicol es el principal antibioacutetico utilizado en los centros de
cultivo durante la etapa de engorda en agua de mar debido a sus propiedades farmacocineacuteticas
y farmacodinaacutemicas Ademaacutes sus caracteriacutesticas de liposolubilidad y baja unioacuten a proteiacutenas
plasmaacuteticas le permite actuar sobre bacterias intracelulares como Piscirickettsia salmonis Los
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Iacutendices de Eficacia a evaluar en este antibioacutetico son ABCCMI y t gt CIM los cuales en una terapia
adecuada deben ser ge 125 h y gt al 50 del intervalo de dosificacioacuten respectivamente
A nivel nacional no existe una definicioacuten de la CMI cliacutenica de Piscirickettsia salmonis frente a
oxitetraciclina y florfenicol antibioacuteticos de mayor uso en los centros de cultivo en etapa de
engorda en agua de mar Por otro lado en las declaraciones realizadas estos uacuteltimos 5 antildeos en
el SIFA (Sistema de Informacioacuten para la Fiscalizacioacuten de Acuicultura - SERNAPESCA) alrededor
del 80 de los Meacutedicos Veterinarios declaran utilizar dosis 2 veces mayor a la registrada y un
porcentaje cercano al 8 dosis 3 a 4 veces mayores a la registrada Debido a que uno de los
objetivos de este proyecto es optimizar el uso de antimicrobianos en la salmonicultura se hace
necesario realizar estudios PKPD para definir las dosis maacutes adecuadas de oxitetraciclina y
florfenicol frente a P salmonis Para estos estudios previamente se necesita conocer la CMI
cliacutenica de esta bacteria frente a los antibioacuteticos sentildealados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen uso
de antimicrobianos en la salmoniculturardquo ya que la industria del salmoacuten ha sido
permanentemente cuestionada por la cantidad de antibioacutetico utilizado afectando la imagen
internacional del sector en este trabajo evaluoacute la eficacia de productos antimicrobianos con la
finalidad de obtener informacioacuten relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la
acuicultura considerando diferentes aspectos como la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de
oxitetraciclina y florfenicol los antibioacuteticos maacutes utilizados a nivel nacional contra Piscirickettsia
salmonis la elaboracioacuten de los alimentos medicados con estos antibioacuteticos determinar la
liberacioacuten de estos antibioacuteticos desde los alimentos medicados y verificar la dosis y el ritmo
horario de estos mismos utilizando modelos PKPD
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluacioacuten de la eficacia de productos antimicrobianos con la finalidad de obtener informacioacuten
relevante para el registro de faacutermacos utilizados en la acuicultura primera etapa
Objetivos especiacuteficos
1 Definir la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria 90 (CMI90) de oxitetraciclina y florfenicol frente a
P salmonis
2 Evaluacioacuten del efecto del proceso de elaboracioacuten de los alimentos medicados sobre las
diferentes premezclas de oxitetraciclina y florfenicol
3 Comparar y evaluar mediante estudios de biodisponibilidad la relacioacuten entre la liberacioacuten y
disolucioacuten de oxitraciclina y florfenicol a nivel intestinal con las concentraciones plasmaacuteticas
de los diferentes alimentos medicados ETAPA 1 Determinacioacuten de la liberacioacuten de florfenicol
y oxitetraciclina desde alimentos medicados para peces
4 Verificacioacuten de las dosis y ritmo horario de oxitetraciclina y florfenicol que asegure la eficacia
cliacutenica de estos faacutermacos utilizando el modelo farmacocineacuteticofarmacodinaacutemico (PKPD)
ETAPA 1
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MATERIAL Y MEacuteTODOS
1 OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACIOacuteN MIacuteNIMA INHIBITORIA (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Unidad Ejecutora Centro de Investigaciones Bioloacutegicas Aplicadas (CIBA)
Aislados
Los aislados de Piscirickettsia salmonis utilizados para el establecimiento de la coleccioacuten en el
Laboratorio de Farmacologiacutea de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias ndash Universidad
de Chile fueron recuperados de la coleccioacuten de patoacutegenos mantenidos por el Laboratorio
ETECMA y Laboratorio CIBA provenientes de casos de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea
(SRS) que afectaron a cultivos de salmoacutenidos entre los antildeos 2014 a 2016 Adicionalmente se
implementoacute un programa de aislamiento de aislados durante los antildeos 2016 y 2017 Se incluye
de forma complementaria en el programa una cepa del antildeo 2012 y una del antildeo 2013
Recuperacioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis
Los aislados de P salmonis fueron mantenidos en crioviales congelados a una temperatura de -
80 degC Para la recuperacioacuten de los aislados los crioviales fueron abiertos en un gabinete de
bioseguridad de acuerdo a los protocolos establecidos por el laboratorio Utilizando una pinza o
asa se removeraacute entre una a cuatro perlas de cada criovial las cuaacuteles seraacuten inoculadas sobre la
superficie de una placa de Agar CHAB (caldo infusioacuten corazoacuten 25 gL glucosa 10gL L-cisteiacutena
1 gL agar 15gL hemoglobina 2 gL suplementado con 5 de sangre de ovino) para su
posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a 12 diacuteas (Mikalsen et al 2008) En caso que la cepa no
pueda ser recuperada en el primer intento se procederaacute a realizar el mismo procedimiento en la
eventualidad que la cepa no pueda ser recuperada despueacutes de 5 intentos se procederaacute a
reemplazar por una aislado de campo
Aislamiento en campo aislados 2016 ndash 2017
El aislamiento de P salmonis se realizaraacute a partir en centros de cultivo de salmoacutenidos que cursen
con un cuadro cliacutenico de Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) y que no se encuentren en
terapia antibacteriana El diagnoacutestico cliacutenico seraacute reportado por un Meacutedico Veterinario y
confirmado mediante la aplicacioacuten de la reaccioacuten de la polimerasa en cadena (PCR) yo
inmunofluorescencia indirecta (IFAT) para Piscirickettsia salmonis
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Se procederaacute a seleccionar peces letaacutergicos capturados utilizando una quecha o mortalidad
fresca recuperada a traveacutes del buceo o lift up Sera considerada mortalidad fresca aquella que
sea extraiacuteda en un plazo no superior a 24 horas
Los peces seraacuten dispuestos en una superficie limpia para proceder a realizar la necropsia Para
el cultivo microbioloacutegico se procederaacute a mantener un asa de platino en la llama de un mechero
hasta que se haya puesto al rojo vivo posteriormente seraacute insertada en los tejidos a eleccioacuten de
preferencia aquellos que presentan signologiacutea macroscoacutepica consistente con Septicemia
Rickettsial Salmoniacutedea (SRS) Entre los signos cliacutenicos a considerar se encuentran lesiones
nodulares hiacutegado vesiacuteculas en la piel bullas uacutelceras cavernas musculares esplenomegalia
hepatomegalia enteritis congestiva entre otros (Branson and Diacuteaz-Muntildeoz 1991 Birrel et
al2003 Cusack et al 2002 Lannan and Fryer 1993 Larenas et al 1995 Olsen et al 1997)
Finalmente la muestra seraacute inoculadas mediante el meacutetodo de estriacuteas sobre la superficie de una
placa de Agar Piscirickettsia salmonis (APS) para su posterior incubacioacuten a 16 degC durante 7 a
12 diacuteas (ETECMA-PT-BA-07)
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b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Introduccioacuten
La concentracioacuten miacutenima inhibitoria o CIM es la concentracioacuten maacutes baja de un antibioacutetico que es
capaz de inhibir el crecimiento de una cepa bacteriana que no posee mecanismos de resistencia
La CIM se obtiene realizando un estudio estandarizado siguiendo un documento de referencia
Los documentos que pueden ser utilizados normas ISO (este uacuteltimo es el que sigue oficialmente
EUCAST) o el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)
Previo al procedimiento se realizaron las siguientes actividades
Crecimiento de las cepas en caldo ADL-PBS Esto se evaluoacute mediante absorbancia por
espectrometriacutea utilizando una OD600
Adaptacioacuten de la Cepa control Escherichia coli (ATCCreg 25922trade) al caldo
Se realizoacute una curva estaacutendar de crecimiento en caldo para E coli ATCC 25922 y para
P salmonis L89
Metodologiacutea
Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los resultados fue espectrofotomeacutetrica
(absorbancia)
a) Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
b) Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquoy la norma ISO
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Materiales e insumos
Antimicrobianos como droga pura a) Oxitetraciclina potencia 86046 ugmg (86) b)
Florfenicol potencia 98703 ugmg (987) ambos antibioacuteticos Marca Dr Ehrenstorfer
Gmbn
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Solucioacuten stock de antimicrobianos
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 25922
Instrumentos y equipos
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 0125-025-05-1-2 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 05-1-2- 4 ndash 8- 16 microgml
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- Control de estabilidad de antibioacuteticos Se realizoacute por meacutetodo microbioloacutegico y por meacutetodo
cromatograacutefico
Meacutetodo Microbioloacutegico A un tubo con caldo se le agrega una concentracioacuten de
oxitetraciclina igual a 2ugml otro tubo con caldo se agrega una concentracioacuten de
florfenicol de 4 microgml Ambos tubos se deja sin inocular y se incuba por 14 diacuteas Al diacutea 14
se inoculoacute la cepa E coli ATCC a una concentracioacuten de 05 de Mc Farland y se observoacute
si se inhibe el crecimiento 18 horas despueacutes
Meacutetodo cromatograacutefico En paralelo se observoacute si oxitetraciclina mantiene su
concentracioacuten constante en el tiempo en las condiciones de cultivo para ello se utiliza la
metodologiacutea de cromatografiacutea HPLC acoplada a un detector con arreglo de diodos o DAD
Se proboacute de forma independiente la expresioacuten cromatograacutefica de oxitetraciclina mediante
el aacuterea del peak cromatograacutefico utilizando un estaacutendar certificado analiacuteticamente
(estaacutendar puro) La concentracioacuten de la solucioacuten stock fue de 4 ppm (4 mgKg) Se
fortificaron los mismos medios a una concentracioacuten de 128 microgml para probar su
estabilidad durante 14 diacuteas Los medios fortificados se mantuvieron entre 18 y 21degC en
agitacioacuten y una aliacutecuota fue tomada cada 2 diacuteas (48 hrs) para hacer la determinacioacuten
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol a una
concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o pureza
Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
Ya que no existen puntos de corte oficiales para P salmonis se trabajoacute con las siguientes
concentraciones para ambos antibioacuteticos 00125-003-006-0125-025-05-1-2-4-8-16-32-64-
128 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
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-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para las cepas de P salmonis
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
-Lectura de los resultados
La CIM para cada aislado y antimicrobiano se determinoacute visualmente por turbidez y se confirmoacute
por absorbancia Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten se determinoacute la CIM la cual corresponde a
la menor concentracioacuten de antibioacutetico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en el tubo o en
la policubeta En el caso de la teacutecnica de macrodilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
visualmente por turbidez comparaacutendola con el tubo control negativo y se confirmoacute por
absorbancia la cual fue igual a 00 En el caso de microdilucioacuten esta concentracioacuten se determinoacute
soacutelo por absorbancia siendo esta igual a 00
Cepas utilizadas en el estudio
Cepas donadas por el INTA
bull CRG1
bull CRG2
bull INTA
bull LF-89 light
Cepas donadas por la Pontificia Universidad Catoacutelica de Valparaiacuteso
bull EM-90
bull TGIM-11
bull SGIM-12
L89
Cepa donada por el Laboratorio de Vacunas Veterinarias de FAVET
L89 LVV
Las cepas donadas por el INTA se sentildeala coacutedigo y link para acceder a su genoma en las que
estaacute disponible
CRG01 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=262491
CRG02 httpwwwncbinlmnihgovgenome11769genome_assembly_id=263622
LF-89 (referencia comprada en ATCC) httpwwwncbinlmnihgovnuccore965557290
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c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados De
P salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) y Laboratorio de
Inocuidad de los Alimentos (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile
Los aislados e identificacioacuten bacteriana de Piscirickettsia salmonis fueron realizados por el
Laboratorio CIBA tal como fue sentildealado en el informe entregable del antildeo 2016
Las Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias fueron realizadas en el Laboratorio de Inocuidad
Alimentaria (LIA) de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile
mediante el meacutetodo de macrodilucioacuten cuya validacioacuten fue sentildealada anteriormente
Aislamiento bacteriano Se aislaron 87 cepas En resultados se muestra la distribucioacuten geograacutefica
de los centros de cultivo de donde se obtuvieron las cepas
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OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Unidad Ejecutora Laboratorio de Inocuidad Alimentaria (LIA) Facultad de Cs Veterinarias y
Pecuarias Universidad de Chile
Se evaluoacute la potencia microbioloacutegica de 13 premezclas de antibioacuteticos (3 de oxitetraciclina y 10
de florfenicol) frente a P salmonis Se utilizaron dos meacutetodos de dilucioacuten y la medicioacuten de los
resultados fue espectrofotomeacutetrica (absorbancia)
I Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo la cual se realizoacute por duplicado
II Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo la cual se hizo por triplicado
En ambos casos se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) para animales acuaacuteticos M49-A ldquoMethods for Broth Dilution Susceptibility testing
of Bacteria Isolated from Aquatic Animals Appoved Guidelinerdquo
Materiales e insumos
Antibioacuteticos de referencia con potencia conocida a) Oxitetraciclina con potencia de
86046 microg (86) b) Florfenicol con potencia de 98703 microg (987) ambos antibioacuteticos
Marca Dr Ehrenstorfer Gmbnreg
Solventes Metanol HPLC (Merck) Etanol 95 HPLC (Merck)
Diluyentes Agua HPLC (Merck)
Caldo ADL-PBS comercial (Lab-Diagnostic)
Cepas ATCC E coli 22925
Cepa P salmonis L89
Pre-mezclas de antibioacuteticos
Instrumentos o equipos y accesorios
Espectrofotoacutemetro Pharo 300 (WPA Biowave reg) calibrado a una longitud de onda de 600
nm
Microscopio Invertido OPTIKAreg XDS-2
Caacutemara de Neubauer IMPROVEDreg
Balanza analiacutetica DENVER Instrumentreg
Laacutempara de luz clara
Campana de flujo laminar JSCB-900 SBreg
24
Incubadora Shaker LABWITreg ZWYR-240
Estufas de cultivo MEMMERTreg
Controles de los meacutetodos de anaacutelisis
- Control positivo para verificar el medio de cultivo a las 24 horas y 14 diacuteas de incubacioacuten
Control positivo a las 24 horas medio inoculado con E coli ATCC 25922
Control positivo a los 14 diacuteas medio inoculado con P salmonis L89
- Control negativo caldo sin antibioacuteticos y bacterias para comparar la concentracioacuten miacutenima
inhibitoria (CIM) cuya absorbancia debe ser igual a 000
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a las 24 horas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de oxitetraciclina 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de E coli ATCC 25922 equivalente a 05 Mc Farland con
las siguientes concentraciones de florfenicol 006-0125-0250-05- 1- 2 -4 microgml
- Controles para evaluar las diferentes concentraciones de antimicrobiano a los 14 diacuteas
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con las
siguientes concentraciones de oxitetraciclina 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-1
microgml
Medios de cultivo con Inoacuteculos de P salmonis L89 equivalente a 05 Mc Farland con la
con las siguientes concentraciones de florfenicol 00125- 003- 006 0125- 0250- 05-
1 microgml
- Verificacioacuten de la concentracioacuten bacteriana equivalente al 05 de Mc Farland
Para P Salmonis L89 se realizoacute en la caacutemara de Neubauer verificando el recuento de las
unidades formadoras de colonias (UFC) que debe ser equivalente a 1-2 x 106 Para el caso de
E coli la verificacioacuten de las UFC se realizoacute en placa de cultivo y el recuento se realiza bajo lupa
- Preparacioacuten de las soluciones stock de antimicrobianos de referencia y de las
premezclas
Se prepararon soluciones stock de los estaacutendares de oxitetraciclina y florfenicol y de las
premezclas correspondientes a una concentracioacuten inicial de 1280 microgml las que se conservaron
a -80degC hasta su anaacutelisis
De acuerdo al CLSI para la preparacioacuten de la solucioacuten stock se utilizoacute la siguiente foacutermula
Peso del antibioacutetico (mg) = volumen (ml) x concentracioacuten (gml)
Potencia (gmg) o porcentaje
25
En el caso de las premezclas se consideroacute el porcentaje de pureza descrito por el fabricante
-Preparacioacuten de las soluciones seriadas de antimicrobianos
A partir de las soluciones de las drogas de referencia y de las premezclas se prepararon las
siguientes concentraciones decrecientes 003- 006-0125-025-05-1 microgml
-Meacutetodo de Macrodilucioacuten en caldo para P salmonis L89
Se utilizoacute el caldo ADL-PBS En tubos de vidrio esteacuteriles se agregoacute 8 ml de caldo 1 mL del inoacuteculo
bacteriano ajustado a la concentracioacuten 05 Mc Farland y 1 mL de cada concentracioacuten del
antimicrobiano de referencia o de cada premezcla seguacuten corresponda Para cada caso cada
tubo se realizoacute por duplicado
Los tubos se incubaron a 18degC por 14 diacuteas con agitacioacuten constante
-Meacutetodo de Microdilucioacuten en caldo para P salmonis L89
La prueba se realiza en policubetas de plaacutestico de fondo redondo esteacuteriles en cada pocillo se
colocoacute 155 microl de caldo ADL-PBS 20 microl de inoacuteculo bacteriano equivalente al 05 Mc Farland y 25
microl de cada concentracioacuten de antibioacutetico de referencia o de las premezclas llegando a un total de
02 ml por pocillo El ensayo se realizoacute por triplicado para cada caso
Las placas fueron incubadas en agitacioacuten constante a 18degC por 14 diacuteas Para evitar la desecacioacuten
se selloacute cada policubeta con su tapa plaacutestica
Lectura de los resultados
Despueacutes de 14 diacuteas de incubacioacuten para P salmonis L89 y de 18 horas en el caso de E coli
ATCC 25922 se determinoacute la absorbancia para cada concentracioacuten de antibioacuteticos de referencia
y para las premezclas
26
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en
las premezclas
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
g Insertos desechables para viales (250 uL)
h Micropipeta 100-1000 uL
Reactivos y Soluciones
i Agua HPLC
j Acetonitrilo HPLC
k Aacutecido Oxaacutelico grado PA
l Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
27
Estaacutendares
a Procedencia
- Oxitetraciclina hydrocloride (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 plusmn 1
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 1
a Preparacioacuten de la solucioacuten de trabajo 1 mgml
Para preparar la solucioacuten de trabajo se utilizoacute la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Doacutende Peso (mg) = Cantidad de estaacutendar certificado a pesar Concentracioacuten mgml = 1mgml como valor constante Volumen de Aforo=10 ml como valor constante Pureza= de pureza declarada para cada estaacutendar puro certificado Se preparoacute una solucioacuten de trabajo de 40 mg40 ml de metanol Se agitoacute durante 10 minutos y
se sonicoacute 20 minutos Se tomaron 300 microl con micropipeta calibrada y se traspasaron a un vial de
inyeccioacuten para HPLC
Anaacutelisis Instrumental
b Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
28
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 100 microL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco reactivo sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
29
Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de blancos reactivos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se analizan 20 muestras de estaacutendar puro certificado a la cual se
presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos 31 El Coeficiente de Variacioacuten no
debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de estaacutendar puro
analizadas previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en estaacutendar
certificado con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
estaacutendar certificado con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
8 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
30
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
475 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
30 ngg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
37 ngg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000071 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
30 ngg 135 60 ngg 173 90 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
30 ngg 151 60 ngg 164 90 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 30 ngg 191 60 ngg 110 90 ngg 85
Menor a un 35
31
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
5790 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
10 ngg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
13 ngg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000079 (mgKg)
DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
10 ngg 135 20 ngg 173 30 ngg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
10 ngg 151 20 ngg 164 30 ngg 52
1-10microgKg CV le 35 100microgKg CV 23 1000microgKg CV 16
8
ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 00000003 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U
10 ngg 217 20 ngg 143 30 ngg 79
Menor a un 35
32
Obtencioacuten de las muestras
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de la
industria farmaceacuteutica
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes De cada lote se tomaron
20 g y se envasaron en bolsas de polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea
con su identificacioacuten de lote nombre del antibioacutetico correspondiente y pureza declarada
Se omitioacute el nombre de la industria farmaceacuteutica con el fin de no sesgar los resultados del
estudio
Las muestras fueron almacenadas en una sala a temperatura ambiente fresca y seca
Soacutelo estas muestras fueron guardadas en dicho lugar para evitar cualquier tipo de
contaminacioacuten cruzada
Las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) utilizando HPLC acoplado a un detector de arreglo de diodos Las
metodologiacuteas analiacuteticas validadas para verificar la pureza del antibioacutetico fueron las
sentildealadas anteriormente
Nuacutemero de muestras
Florfenicol 20
Oxitetraciclina 8
Cada muestra fue analizada por triplicado
Nuacutemero de anaacutelisis 84
Tratamiento de la muestra Para cada premezcla se prepararon concentraciones de 1mgml
utilizando como solvente metanol Para calcular la cantidad necesaria de premezcla se
consideroacute el porcentaje de pureza declarada utilizando la siguiente foacutermula
119875119890119904119900 (119898119892) = 119862119900119899119888119890119899119905119903119886119888119894119900119899119898119892
119898119871lowast 119881119900119897119906119898119890119899 119889119890 119886119891119900119903119900 (119898119871) (
119875119906119903119890119911119886
100)
Donde
Peso (mg) = Cantidad de Premezcla o estaacutendar certificado a pesar
Concentracioacuten mgmL = 1 mgmL como valor constante
Volumen de Aforo= 001 L como valor constante
Pureza= de pureza declarada para cada Premezcla o estaacutendar certificado
En forma paralela se trabajoacute con el estaacutendar certificado Tanto las pre mezclas como los
estaacutendares se analizaron por triplicado de forma independiente
33
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
1 DESCRIPCION DEL METODO ANALITICO
11 Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
12 Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 um
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 uL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
13 Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
34
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
14 Estaacutendares
141 Procedencia
- Oxitetraciclina (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 956 Uplusmn10
- Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
142 Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol y Oxitetraciclina
Las soluciones stock (SS) de cada antibioacutetico se sentildealan a continuacioacuten
Solucioacuten Stock OTC 10 mgmL
Solucioacuten Stock FF 10 mgmL
A partir de las soluciones stock se preparan las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (alimento sin antibioacutetico)
Conc OTC y FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota OTC
(microL) Alicuota FF (microL)
01 05 50 50
04 05 200 200
08 05 400 400
12 05 600 600
16 05 800 800
15 Procedimiento de preparacioacuten de muestra
1) Pesar 500 mg en un tubo falcoacuten de 50 mL
2) Antildeadir 50 mL de solucioacuten de extraccioacuten de Acido oxaacutelico dihidratado 001 M en
AguaMetanol 11 mediante una pipeta aforada de 50 mL
3) Agitar 10 min sonicar 20 min y centriacutefuga 5 min a 5000 rpm
4) Traspasar 300 microL a un vial de inyeccioacuten con inserto plaacutestico mediante filtro millex
5) Inyectar en equipo HPLC-DAD
35
16 Anaacutelisis Instrumental
161 Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) utilizaacutendolo con doble lectura a las siguientes
longitudes de onda
- Longitud de onda para Oxitetraciclina 360 nm
- Longitud de onda para Florfenicol 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 microL
36
17 Resultados
Los resultados en el alimento seraacuten expresados en kgTonelada
18 Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a los
espectros de libreriacutea del instrumento
19 Paraacutemetros de validacioacuten Oxitetraciclina y Florfenicol
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE
- FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology
- NCh-ISO 17025Of2005
Los Paraacutemetros a evaluar son los siguientes
- Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado para
evaluar tiempos de retencioacuten
- Especificidad Se analizan 20 muestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
- Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
-
- Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces la
desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos blancos
fortificados analizados previamente
- Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2 es
mayor o igual a 095
37
- Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
- Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
- Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
- Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para oxitetraciclina en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
6813 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg Cumple rsr 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
011 mgg Cumple rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 099 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 000000045 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 0100 mgg 121 02 mgg 131 04 mgg 31
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 171 02 mgg 187 04 mgg 72
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000004 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE 01 mgg 179 02 mgg 138 04 mgg 65
Menor a un 35
38
Tabla 2 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en alimento medicado
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV) 01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
Verificacioacuten de estabilidad
1- Se realizaron estudios de estabilidad acelerada considerando que
Un alimento medicado se prepara en respuesta a una Prescripcioacuten Meacutedica Veterinaria
(PMV)
Un lote de alimento medicado no deberiacutea almacenarse maacutes de tres meses considerando
que la cantidad solicitada en una PMV solo debe utilizarse para un tratamiento
2- Se siguieron las recomendaciones de la Guiacutea para la realizacioacuten y presentacioacuten de estudios
de estabilidad para productos Farmacoloacutegicos de uso veterinario (SAG 2014)
3- Las condiciones experimentales durante todo el estudio fueron a 40degC plusmn 2degC y 75 plusmn 5 de
humedad relativa
4- Los tiempos de muestreo fueron a los 0 ndash 1 ndash 2 ndash 3 y 4 meses
5- Se analizaron 7 lotes diferentes de alimento con oxitetraciclina y 7 de florfenicol
7- Cada lote se analizoacute por cuadruplicado en cada tiempo de muestreo
39
Verificacioacuten de concentracioacuten y homogeneidad
Se contratoacute dos profesionales de terreno Sra Berta Contreras y Sr Jorge Ponce para
obtener las muestras desde diferentes plantas de proceso de alimento medicado o de
centros de cultivos
Las muestras recolectadas correspondieron a diferentes lotes de alimento medicado
De cada lote se tomaron 200 a 400 g de alimento medicado y se envasaron en bolsas de
polietileno debidamente selladas Cada bolsa veniacutea con su identificacioacuten de lote nombre
del antibioacutetico correspondiente y cantidad de antibioacuteticotonelada de alimento declarada
por la empresa Se omitioacute el nombre de la empresa de alimento con el fin de no sesgar
los resultados del estudio
Nuacutemero de muestras de alimento medicado Se obtuvieron 47 muestras de alimento de
diferentes calibres De cada lote se tomaron seis sub-muestras las que se procesaron y
analizaron de forma independiente
Las muestras fueron las siguientes
Florfenicol calibre 12 mm 10
Florfenicol calibre 9 mm 23
Florfenicol calibre 64 y 41 mm 7
Oxitetraciclina calibre 41 mm 7
Total 47
Verificacioacuten de la cantidad declarada y evaluacioacuten de la homogeneidad Cada muestra se
analizoacute por sextuplicado 47 x 6 = 282 anaacutelisis
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO DE LOS RESULTADOS
1- Verificacioacuten de la cantidad de antibioacutetico declarada
El promedio de las seis repeticiones (cantidad real) se comparoacute con el valor
declarado en la etiqueta
La diferencia entre la cantidad declarada en la etiqueta y la cantidad real se
expresoacute en porcentaje
2- Evaluacioacuten de la homogeneidad
Se calculoacute la dispersioacuten entre las seis repeticiones a traveacutes del CV
CV = S x100
Ẋ
40
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones prestablecidas de
antimicrobianos
Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica recopilando informacioacuten de las plantas de alimentos
medicados de la zona sur del paiacutes para evaluar de queacute forma de elaboran y solicitan los
alimentos medicados para salmoacutenidos en el paiacutes
41
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD LA
RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
Unidad Ejecutora Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas Universidad de Chile
Objetivos
Objetivo general
Caracterizar la cineacutetica y mecanismo de liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos
medicados para peces utilizando medios de disolucioacuten que consideren caracteriacutesticas
biorrelevantes
Objetivos especiacuteficos
a- Evaluar la influencia en la liberacioacuten de florfenicol y oxitetraciclina desde alimentos medicados
a1- Del pH
a2- La tensioacuten superficial
a3- La temperatura
b- Identificar las cineacuteticas y mecanismos y que describan el proceso de disolucioacuten
c- Establecer las diferencias en la liberacioacuten de los faacutermacos entre las diferentes formulaciones
y entre las diferentes condiciones experimentales
42
Materiales y meacutetodos
Muestras analizadas e informadas en este avance alimentos medicados proporcionados por
las empresas productoras codificados seguacuten se presenta en la siguiente tabla
Coacutedigo Principio Activo Tipo de Muestra Concentracioacuten Teoacuterica
01C Florfenicol 50 Alimento 27 Kg Tonelada
04B Florfenicol 50 Alimento 353 KgTonelada
06B Florfenicol 50 Alimento 53 KgTonelada
Coacutedigo Principio
Activo Tipo de Muestra
Concentracioacuten determinada
experimentalmente
OTC M1 020 Oxitetraciclina Alimento 18440 ppm
Equipo de disolucioacuten
Aparato 2 de la USP (paleta) a 50 rpm
900 ml de medio de disolucioacuten
Temperatura de los ensayos de disolucioacuten
10 degC
Composicioacuten de Medios de disolucioacuten (gL)
pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
373 g KCl
53 mL HCl 2
N
208 g Acetato de
sodio3H2O
424 mL Aacutecido aceacutetico 2N
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
68 g de KH2PO4
115 mL NaOH 2 M
Lauril sulfato de sodio 1
gl
Agregar a cada medio por cada litro 272 g NaCl ndash 1075 g MgCl26H2O -12 g de CaCl2 para
simular composicioacuten y fuerza ioacutenica del agua de mar Se ajustoacute con NaCl para obtener una
concentracioacuten equivalente de 326 000 Las sales de calcio y magnesio no fueron incluidas en
el medio que contiene LSS por incompatibilidad
43
Anaacutelisis de las muestras
La cantidad de faacutermaco disuelto fue determinado por el meacutetodo desarrollado yacute validado para
cuantificar la cantidad de faacutermaco en los alimentos (HPLC)
Tiempos de muestreo
025 - 05 ndash 1 ndash 2 ndash 3 ndash 4 ndash 5 ndash 6 ndash 7 y 9 horas
Tratamiento de los resultados de disolucioacuten
Los perfiles de disolucioacuten fueron tratados matemaacuteticamente para identificar cuaacutel de los siguientes
modelos describe de forma adecuada su comportamiento
a Modelo difusional de Higuchi
b Cineacutetica de orden cero
c Cineacutetica de orden uno
d Modelo de la raiacutez cuacutebica
Tambieacuten se exploroacute la comparacioacuten de los resultados utilizando el factor de similitud f2 un
meacutetodo que es modelo independiente siempre y cuando la variabilidad de los resultados permita
aplicar el meacutetodo
44
OBJETIVO 4 VERIFICACIOacuteN DE LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
a) Administracioacuten de florfenicol 50 por viacutea oral a salmoacuten del atlaacutentico (Salmo salar) en
distintas pautas horarias
Unidad Ejecutora Aquainnovo SA
Emplazamiento del estudio
La fase experimental se llevoacute a cabo en las instalaciones del Centro de Investigacioacuten y
Transferencia Acuiacutecola (CITA) perteneciente a empresa Aquainnovo SA ubicado a 33 km de
Puerto Montt Carretera Austral sector Lenca Chile
Programa de operaciones fase cliacutenica A continuacioacuten la Tabla 1 indica las actividades que fueron ejecutadas durante el estudio con
un total de 33 diacuteas desde iniciada la aclimatacioacuten y hasta el teacutermino de la recoleccioacuten de muestras
de sangre posteriores al tratamiento
45
Tabla 1 Carta gantt
46
Disentildeo general del Estudio
Un total de 1368 ejemplares de la especie Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio
de 350-450 gramos fueron distribuidos y mantenidos en 6 estanques de 5 msup3 para una
aclimatacioacuten miacutenima de 14 diacuteas en agua de mar
Posteriormente se administroacute el faacutermaco por viacutea oral en dosis de 20 mg de Florfenicolkg de
peso vivo considerando 5 regiacutemenes de pauta horaria (correspondiente a matriz alimento
comercial con el medicamento) Adicionalmente el faacutermaco fue administrado a un grupo de
ejemplares a razoacuten de 20 mg de Florfenicol Kg de peso vivo en dosis uacutenica por viacutea inyectable
que sirvioacute como grupo control La dosis seleccionada corresponde a la dosis maacutes utilizada por
los Meacutedicos Veterinarios en terreno de acuerdo al Informe sobre Diagnoacutestico sobre el consumo
de antimicrobianos en los centros de cultivo de salmones a nivel nacional (antildeos 2011-2015)
realizado por el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria Universidad de Chile para el Servicio
Nacional de Pesca y Acuicultura
La administracioacuten del tratamiento oral se realizoacute a 5 estanques con 228 peces cada uno para
cada pauta horaria (Fig 1) y uno de los estanques recibioacute el tratamiento por viacutea inyectable La
entrega oral fue a razoacuten de 1- 15 SFR de alimento medicado por 3 diacuteas consecutivos (dosis
repetida)
Una vez finalizado el tratamiento 12 peces por grupo de tratamiento fueron eutanasiados
aleatoriamente a los tiempos 0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 96 y 100 horas
post tratamiento a partir de los cuales se tomaraacuten muestras de sangre (ge 3 mL) con
anticoagulante (EDTA) para la obtencioacuten de plasma Los salmones fueron eutanasiados
mediante contusioacuten de acuerdo a las condiciones de bienestar animal que recomienda la
Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales (EMA 2009) y la Directiva
201063EU (Unioacuten Europea 2010) Las muestras fueron centrifugadas y el plasma obtenido fue
depositado en tubos eppendorff previamente rotulados con el grupo de tratamiento nuacutemero de
estanque fecha y tiempo de muestreo Las muestras fueron congeladas a -20 degC y
posteriormente derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile
Santiago para su anaacutelisis Luego del uacuteltimo tiempo de muestreo (100 horas post tratamiento) se
dio por terminado el ensayo
47
Figura 1 Disentildeo Experimental del bioensayo
48
Producto veterinario A continuacioacuten la Tabla 2 describe el producto veterinario utilizado en el estudio
Tabla 2 Especificacioacuten del producto veterinario
Nombre comercial Principio activo Forma Farmaceacuteutica Dosis recomendada
Veterin 50 Florfenicol Polvo oral 10 mgKg peso vivo
Animales de estudio Se utilizaron 1368 Salmon del Atlaacutentico (Salmo salar) con peso promedio general de 390 a 400
g al iniciar la aclimatacioacuten y que tuvieron un peso aproximado de 420 gramos al iniciar la
administracioacuten del medicado No obstante se dispuso de peces adicionales (n=1500) para lograr
un coeficiente de variacioacuten menor o igual al 15 al administrar el tratamiento Los peces se
obtuvieron de un stock que mantiene el centro experimental con origen en el centro Aguas
Buenas perteneciente a la empresa Aguas Claras Lote S15AQ (E) 2IPSCAB ingresados en el
mes de mayo del 2016
Condicioacuten sanitaria de animales de estudio Antes de iniciar el estudio la condicioacuten sanitaria fue aprobada por el Meacutedico Veterinario
responsable a traveacutes de la inspeccioacuten visual de los ejemplares e historial sanitario del grupo Asiacute
mismo realizoacute la toma de muestras de ejemplares que fueron analizados mediante la teacutecnica de
biologiacutea molecular (RT-PCR) para virus IPN SRS y BKD Finalmente se realizaron anaacutelisis para
descartar la presencia del faacutermaco en plasma y muacutesculopiel previo al inicio de la administracioacuten
de tratamientos
Criterio de inclusioacuten de animales de estudio El criterio de inclusioacuten correspondioacute a aquellos animales que cumpliacutean con un peso promedio
general de 390-400 gramos al iniciar la aclimatacioacuten cliacutenicamente sanos y que no habiacutean recibido
tratamiento farmacoloacutegico o quiacutemico de ninguacuten tipo a lo menos 90 diacuteas antes del inicio de la
prueba que pudieran interferir posteriormente con el anaacutelisis del principio activo en las muestras
de plasma El Meacutedico Veterinario de la estacioacuten emitioacute una constancia que indicaba que no se
habiacutean administrado faacutermacos durante los uacuteltimos 90 diacuteas en el grupo de peces
Criterio de exclusioacuten de animales
Se excluyoacute de este estudio cualquier animal que mostrara signos de enfermedad incluyendo
anorexia letargia y nado erraacutetico tambieacuten los peces que presenten hongos en su superficie
corporal o en aletas lesiones de piel deformidades ausencia ocular aletas roiacutedas entre otras
o cualquier alteracioacuten que a juicio del Meacutedico Veterinario responsable pudiera comprometer los
resultados del estudio Ante alguacuten evento de exclusioacuten yo muerte antes de iniciado el ensayo el
animal fue reemplazado por alguno que cumpliera con las mismas caracteriacutesticas requeridas en
este
49
Distribucioacuten y alojamiento de animales de estudio
Se realizoacute un muestreo exploratorio para seleccionar y establecer el peso promedio de la
poblacioacuten de peces destinados al ensayo Al momento del muestreo 1368 peces fueron
distribuidos en 6 estanques de 5 msup3 228 pecestk donde permanecieron por al menos 14 diacuteas
en aclimatacioacuten en sistema de recirculacioacuten y agua de mar En la mantencioacuten se tuvo una tasa
de recambio de agua de 15hora temperatura de 13degC (plusmn 1degC) niveles de oxiacutegeno disuelto en
el agua en rango de 80-120 saturacioacuten salinidad de (30 a 35permil) y los valores de pH (entre 70
y 80) Finalmente la densidad no superoacute los 30 kgm3 de biomasa durante el estudio
Alimentacioacuten Durante el periacuteodo de climatizacioacuten los peces fueron alimentados con una dieta comercial (libre
de medicacioacuten) para salmoacutenidos en calibre de pellet de 6mm y a una tasa de 10 a 15 PC
diacutea El alimento durante esta etapa se suministroacute de forma manual entregando el 60 de la
racioacuten durante la mantildeana y el 40 en la tarde
Alimento medicado El alimento medicado necesario para llevar a cabo el estudio fue producido por una planta de
alimento bajo el mismo estaacutendar o proceso utilizado en la fabricacioacuten del medicado utilizado por
centros productivos Se tomaron muestras que fueron derivadas al laboratorio de Farmacologiacutea
Veterinaria de la Universidad de Chile para determinar la concentracioacuten lograda la cual presentoacute
un 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado (20 mgKg) El alimento medicado necesario
para llevar a cabo el estudio fue ingresado al centro experimental 1 diacutea antes de iniciar el
tratamiento
Tratamientos durante el estudio
Durante el estudio no se aplicoacute ninguacuten tipo de tratamiento al grupo de peces especiacuteficamente
antibioacuteticos anesteacutesicos y quiacutemicos en general
Paraacutemetros ambientales Durante toda la etapa de evaluacioacuten se midieron paraacutemetros ambientales como salinidad [ppt]
pH temperatura y oxiacutegeno ( saturacioacuten) de acuerdo a la rutina del centro experimental Los
rangos para estos paraacutemetros se establecen la Tabla 4
50
Tabla 4 Paraacutemetros ambientales durante el estudio Etapa Temperatura pH Salinidad Oxiacutegeno
Aclimatacioacuten 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat Tratamientos 13degplusmn 1degC 7 - 8 30-35 ppt 80-120 sat
Aplicacioacuten de tratamiento medicado
Se realizoacute la administracioacuten del medicado bajo 5 regiacutemenes de pauta horaria por 3 diacuteas
consecutivos y con un desfase de una semana por cada 2 tratamientos es decir se trataron 2
estanques la primera semana 2 en la segunda semana y la tercera los 2 estanques restantes
(Tabla 5) El alimento se entregoacute en forma manual y automaacutetica en base al consumo real que
tuvieron los peces durante la etapa de aclimatacioacuten (10 a 15 SFR) y fue ajustado diariamente
seguacuten crecimiento esperado para la especie
Para la ejecucioacuten cada grupo de tratamiento fue alimentado con la racioacuten seguacuten pauta horaria
especificada en la Tabla 5 En el caso del tratamiento 6 el faacutermaco fue administrado por viacutea
intraperitoneal en ejemplares previamente anestesiados por una vez y en igual dosis que el
tratamiento oral (20 mg Kg)
Finalizada la entrega de la primera racioacuten del diacutea se procedioacute a la toma de muestras de sangre
correspondiente al t0 y se continuoacute con el plan de muestreo indicado en el punto 6
Previo a la administracioacuten del tratamiento (aclimatacioacuten) y durante esta se estimoacute el consumo
real de alimento diacutea en todos los estanques de prueba mediante la recoleccioacuten del alimento no
consumido desde las cajas decantadoras (sedimentador) que posee cada estanque Previo al
inicio de la alimentacioacuten se tomoacute una muestra de 100 pellets en triplicado para registrar el peso
seco Durante la alimentacioacuten y a partir del alimento recolectado se pesaron 30 pellets huacutemedos
Con estos datos se determinoacute la relacioacuten de pellet seco vs pellet huacutemedo obteniendo de esta
forma la curva de humedad que permitioacute aplicar el factor de correlacioacuten para la obtencioacuten del
alimento real consumido para cada estanque
51
Tabla 5 Pauta horaria de tratamiento medicado
Pauta horaria Hora entrega
() Ndeg peces
Dosis medicado
Diacuteas Trat SFR
()
Racioacuten
diacutea
Semana
administracioacuten
Dosis del faacutermaco 1 racioacuten dia
900
1300
228
20 mgKg
3
1-15
100
1 Dosis del faacutermaco en 2 raciones dia
900
1230
1400
1700
228
20 mgKg
3
1-15
60
40
Dosis del faacutermaco en 3 raciones dia
900
1030
1230
1430
1630
1830
228
20 mgKg
3
1-15
33
33
33
2
Dosis del faacutermaco en micro-raciones
900
1630
228 20 mgKg 3 1-15
100
(70 pulsos)
3 Dosis del faacutermaco cada 8 horas
900
1300
2100
130
930
1400
228
20 mgKg
3
1-15
100
100
100
3
Dosis por viacutea inyectable bull 228 20 mgKg 1 bull bull
() El tiempo de entrega del alimento medicado podriacutea tener variacioacuten de acuerdo a la
velocidad de consumo de cada uno de los estanques de prueba
() SFR estipulado es de referencia se ajustoacute al consumo que tengas los grupos durante
la aclimatacioacuten
Mortalidad
No existioacute mortalidad durante el estudio
Plan de Muestreo
Una vez finalizada la primera administracioacuten de alimento medicado se sacrificaron 12 ejemplares
de cada estanque mediante golpe en la cabeza sin uso de anestesia seguacuten los tiempos indicados
en la Tabla 6 Se tomaron las muestras de sangre mediante venipuntura caudal utilizando
jeringas de 5- 10 ml Las muestras recolectadas fueron depositadas en tubos vacutainer (6 mL)
con EDTA (tapa color lila) debidamente rotulados con la fecha tiempo de muestreo Ndeg de
estanque Ndeg de pez y tipo de medicacioacuten (grupo) Posterior a depositar la sangre en el tubo
52
este fue agitado muy suavemente para asegurar el contacto con el anticoagulante Luego los
tubos fueron centrifugados a 4500 Rpm x 10 minutos para la obtencioacuten de plasma Este fue
separado y recolectado en 2 tubos eppendorf de 2 mL (muestra y contra muestra) previamente
rotulados con el tiempo de muestreo Ndeg de pez grupo estanque y fecha de obtencioacuten de la
muestra verificando que coincidiera exactamente con la informacioacuten del tubo vacutainer de
origen El plasma se mantuvo congelado a -20 degC a la espera del enviacuteo programado al laboratorio
de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago Cabe sentildealar que la toma de
muestras de sangre fue ejecutada por 2 personas demorando un tiempo aproximado de 1-2
minutos por cada muestra
Tabla 6 Tiempo de muestreo para estudio de pauta horaria de Florfenicol administrado por viacutea
oral
Muestras T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
T11
T12 T13
T14
T15
T16 T17
Horas post-
tratamiento
0 05 1 2 4 6 9 12 24 30 36 48 54 62 72 80 95 100
Nordm de
animalesTk
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
Ndeg
animales
tratamiento
12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
Tiempo de inicio en la toma de muestras de sangre
Se aceptoacute un margen de 10 minutos de variacioacuten en el inicio del horario de la toma de muestra Pesaje final
Inmediatamente despueacutes de la toma de muestras de sangre se realizoacute el pesaje de cada pez el
cual fue registrado indicando el grupo estanque y tiempo de muestreo En el caso de los
ejemplares sacrificados durante las primeras 12 horas de muestreo adicionalmente se verificoacute
el contenido de pellets en estoacutemago
Destino de los peces de estudio Cada vez que se realizoacute la toma de muestras los peces y sus restos fueron eliminados
mediante el sistema de ensilaje que posee las instalaciones del centro experimental de
Aquainnovo
53
Enviacuteo y transporte de muestras Finalizado el estudio las muestras debidamente rotuladas fueron separadas por tiempo de
muestreo y depositadas en cajas rotuladas indicando el tiempo de muestreo estanque y tipo de
tratamiento (pauta horaria) Estas fueron enviadas desde la estacioacuten experimental de
Aquainnovo SA al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria de la Universidad de Chile Santiago
bajo condiciones que permitieran mantener la cadena de frio del total de las muestras Se
utilizaron recipientes isoteacutermicos cerrados y mantenidos con hielo seco o gel-packs para evitar
la peacuterdida de la temperatura de congelacioacuten durante el transporte El despacho fue programado
en 3 enviacuteos correspondiente a cada lunes posterior al teacutermino de cada tanda de tratamiento
Desviacuteos y o modificaciones del protocolo
No hubo desviacuteos ni modificaciones durante el ensayo Validacioacuten del ensayo A continuacioacuten se detallan los criterios que se establecieron para determinar coacutemo satisfactorio
el ensayo
a) Que el alimento medicado alcanzara la dosis a utilizar en el estudio (Florfenicol a 20
mgKg) con un maacuteximo del 10 de variacioacuten en relacioacuten al nivel intentado
b) El grupo de peces a utilizar durante todo el estudio presentaran oacuteptimas condiciones
sanitarias libres de enfermedades antibioacuteticos faacutermacos en general y dentro del rango
de peso establecido
c) Que los peces durante el periodo de aclimatacioacuten tuvieran un consumo miacutenimo de
alimento del 1 SFR
d) No debioacute existir aplicacioacuten de quiacutemicos (desinfectantes anesteacutesicos faacutermacos u otros)
durante todo el estudio
e) Se debieron obtener 10 muestras como miacutenimo de cada grupo en todos los puntos de
muestreos definidos en el presente estudio
54
Registros
Con el fin de llevar registro del estudio y de las observaciones realizadas asiacute como la
trazabilidad del mismo se dejoacute por escrito las evaluaciones y mediciones realizadas Para esto
se utilizaron planillas disentildeadas para este propoacutesito Todos los documentos asociados al
estudio fueron archivados en la carpeta del estudio
Informe final Al finalizar el estudio se elaboroacute un informe final que siguiacuteo el formato del presente protocolo
incluyendo las desviaciones yo las modificaciones al protocolo si las hubiera resumen de
registros de paraacutemetros ambientales mortalidad y alimentacioacuten Este fue enviado a la empresa
contratante 21 diacuteas haacutebiles posterior al teacutermino del ensayo
Instruccioacuten para el equipo de Investigacioacuten
Sobre la base de este protocolo de estudio fue explicado al personal que participoacute en la
ejecucioacuten quedando registro de un entendimiento y comprensioacuten clara de cada uno de los
iacutetems descritos en el presente protocolo
Buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC)
La metodologiacutea descrita en el presente protocolo se rige bajo el marco de la directriz VICH GL9
de buenas praacutecticas cliacutenicas (BPC) aplicando los principales procedimientos y praacutecticas
mencionadas en la guiacutea Ademaacutes se llevoacute a cabo el estudio de acuerdo a las condiciones de
bienestar animal que recomienda la Agencia Europea de Evaluacioacuten de Productos Medicinales
(EMA 2009) y la Directiva 201063EU (Unioacuten Europea 2010)
55
b) Validacioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de florfenicol y
florfenicolamina en plasma de Salmoacuten del Atlaacutentico (Salmo salar)
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Introduccioacuten
La validacioacuten del meacutetodo analiacutetico se realizoacute siguiendo las siguientes recomendaciones
- Unioacuten Europea Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657CE - FDA Q2B Validation of Analytical Procedures Methodology - NCh-ISO 17025Of2005
Equipamiento
a Balanza analiacutetica
b Agitador Vortex
c Sonicador
d Centrifuga
e Tubos de propileno de 50 mL
f Bandejas de pesaje desechables
g Paletas de madera para procedimientos cliacutenicos
h Filtros Millex de 025 microm
i Viales de inyeccioacuten de vidrio ambar
j Insertos desechables para viales (250 microL)
k Jeringas 1 mL
l Pizeta de 500 mL
m Pipeta aforada de 50 mL
n Micropipeta 100-1000 microL
o Micropipeta 10-100 microL
Reactivos y Soluciones
p Agua HPLC
q Acetonitrilo HPLC
r Aacutecido Oxaacutelico grado PA
s Metanol HPLC
Fase Moacutevil pH 45 plusmn 02
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
56
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Estaacutendares
Procedencia
Florfenicol (Dr Ehrenstorfer Sigma o similar) Pureza certificada 990 plusmn 10
Forma de Preparacioacuten
Para realizar la validacioacuten se debe seleccionar matriz blanco para la adicioacuten de estaacutendar de
Florfenicol
Las soluciones stock (SS) de florfenicol se realizoacute a una concentracioacuten de 10 mgmL
A partir de la solucioacuten stock se prepararon las siguientes concentraciones de trabajo en la matriz (plasma sin florfenicol)
Concentracioacuten FF mgmL Pesaje matriz (g) Alicuota FF (microL)
01 05 50
04 05 200
08 05 400
12 05 600
16 05 800
Procedimiento de preparacioacuten de muestra
Por cada muestra se tomoacute 250 microL de plasma y se le agregoacute 500 microL de agua y 2 mL de acetona
Se agitoacute se sonicoacute y se centrifugoacute por 3 minutos a 5000 rpm El sobrenadante era traspasado
a un nuevo tubo se le agregaban 2 mL de diclorometano y se volviacutea a agitar sonicar y
centrifugar durante 3 minutos a 5000 rpm Luego se descartaba la fase superior (agua) y la
fase restante era evaporada bajo flujo de nitroacutegeno a un rango de temperatura de 40 a 50degC
Posteriormente se reconstituiacutea con 1 mL de una solucioacuten de fosfato monosoacutedico
001Mmetanol 8020 y 1 mL de hexano Finalmente era agitada sonicada y centrifugada
durante 3 minutos a 5000 rpm para tomar 300 microL de la fase inferior y traspasarlos a un vial de
inyeccioacuten
57
Anaacutelisis Instrumental
Condiciones instrumentales para el meacutetodo analiacutetico
Para el anaacutelisis de las muestras se utilizoacute un Cromatoacutegrafo liacutequido acoplado a un detector de
arreglo de diodos de marca Elite LaChrom el cual se subdivide en los siguientes moacutedulos
- Bomba HPLC Elite La Chrom modelo L2130
- Horno HPLC Elite La Chrom modelo L2300
- Autosampler HPLC Elite La Chrom modelo L2200
- Detector DAD Elite La Chrom modelo L2455
- Estacioacuten de trabajo con software de integracioacuten de datos EZChrom Elite Versioacuten 321
Build 32131
Las condiciones Cromatograacuteficas para el anaacutelisis de muestras se implementoacute seguacuten lo
siguiente
Fase moacutevil A Acetonitrilo grado HPLC
Fase moacutevil B Aacutecido oxaacutelico 001 M en Agua grado HPLC Por cada 100 mL de solucioacuten pesar
0126 g de aacutecido oxaacutelico dihidratado y luego terminar de aforar con agua HPLC Agitar y sonicar
hasta disolver completamente
Fase moacutevil C Metanol grado HPLC
Gradiente de fases moacuteviles
Tiempo (minutos) Acetonitrilo
Acido Oxaacutelico
001 M en Agua
HPLC
Metanol
0 10 85 5
1 10 85 5
5 25 45 30
6 10 85 5
12 10 85 5
Flujo 1mLmin
Columna Symmetry C18 5 microm x 46 x 250 mm WATERS
- Detector DAD (ldquoDiode Array Detectorrdquo) con una longitud de onda para de 224 nm
Volumen de inyeccioacuten 20 uL
58
Resultados
Los resultados en plasma seraacuten expresados en microgmL
Criterios de confirmacioacuten para muestras positivas y controles de calidad interno
Para la aceptacioacuten de resultados de cada batch analizado se realizaron los siguientes controles
de calidad internos
- Blanco matriz sin presencia de interferentes al tiempo de retencioacuten de los analitos
- Controles fortificados al nivel del punto 1 de la curva a 01 mgmL Los controles deben
tener una recuperacioacuten de un 80 a 120
- Curva de calibracioacuten de 5 puntos la que debe tener un R2 mayor o igual a 095
- Tiempos de retencioacuten de los analitos en las muestras no debe superar un 5 respecto
al tiempo de retencioacuten de los estaacutendares certificados en el batch de muestras
- Espectro de las muestras debe tener una similitud mayor o igual a un 90 respecto a
los espectros de libreriacutea del instrumento
Paraacutemetros de validacioacuten de florfenicol
1 Tiempo de retencioacuten del analito Se analizan 6 repeticiones de estaacutendar certificado
para evaluar tiempos de retencioacuten
2 Especificidad Se analizan 20 nuestras de alimentos blancos para evaluar interferencia
en la regioacuten de intereacutes en la cual se espera la elucioacuten del analito
3 Liacutemite de Deteccioacuten Se fortifican 20 muestras de alimentos blancos a concentraciones
definidas para cada analito donde se presente una relacioacuten sentildeal ruido (rsr) de al menos
31 El Coeficiente de Variacioacuten no debe superar un 25
4 Liacutemite de Cuantificacioacuten Al Liacutemite de Deteccioacuten seleccionado se le suma 164 veces
la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en las 20 muestras de alimentos
blancos fortificados analizados previamente
5 Linealidad de la Curva de Calibracioacuten Se analizan 3 curvas de calibracioacuten en matriz
fortificada con cinco puntos cada una Se aceptan si el Coeficiente de Correlacioacuten R2
es mayor o igual a 095
6 Precisioacuten (Repetitividad y Reproducibilidad) La precisioacuten se calcula mediante la
evaluacioacuten de la repetitividad y reproducibilidad intralaboratorio mediante 6 curvas de
matriz fortificada con tres puntos de calibracioacuten para cada paraacutemetro calculando la
concentracioacuten media de cada punto Se acepta el paraacutemetro cuando el coeficiente de
variacioacuten (CV) de cada punto de la curva en la repetitividad son iguales o menores al
coeficiente de variacioacuten de la reproducibilidad medida
7 Recuperacioacuten Se calcula comparando curvas de estaacutendar puro certificado con curvas
en matriz fortificada al mismo nivel de fortificacioacuten
8 Robustez Se seleccionan factores que pueden influir en el resultado final y mediante
un anaacutelisis fraccional incompleto mediante el meacutetodo de Youden se determina el factor
que maacutes afecte al meacutetodo analiacutetico
59
9 Incertidumbre Se calcula la incertidumbre expandida del meacutetodo analiacutetico mediante
anaacutelisis estadiacutestico multifactorial de los elementos que maacutes afectan al resultado final
Tabla 1 Resumen validacioacuten de meacutetodo analiacutetico para florfenicol en plasma
RESUMEN VALIDACIOacuteN CRITERIOS DE ACEPTACIOacuteN
1 TIEMPO DE RETENCIOacuteN (tr)
9600 min CV 5 variacioacuten
2 ESPECIFICIDAD No hay interferentes en el tr del analito
tr sin interferencias
3 LIacuteMITE DE DETECCIOacuteN (LD)
01 mgg rsr 21 o 31 CV de las 20 repe le 25
4 LIacuteMITE DE CUANTIFICACIOacuteN (LC)
0112 mgg rsr miacutenimo 101
5 LINEALIDAD DE LA CURVA DE CALIBRACIOacuteN
Rsup2 gt 098 Condiciones de Linealidad CD (Rsup2) ge 095 CV de las pendientes le 25
7 PRECISIOacuteN (intralaboratorio)
DS = 00000032 (mgg) DS de la reproducibilidad intralab (precisioacuten)
7a REPETITIVIDAD (CV)
01 mgg 132 02 mgg 147 04 mgg 46
CV a la mitad o igual al CV de la reproducibilidad
7b
REPRODUCIBILIDAD INTRALAB (CV)
01 mgg 195 02 mgg 191 04 mgg 84
1-10 mgg CV le 35 100 mgg CV 23 1000 mgg CV 16
8 ROBUSTEZ Factor que maacutes afecta la robustez del meacutetodo
DS = 000000002 Meacutetodo robusto Medidas precautorias centrifugado a 5000 rpm
Meacutetodo robusto DS robustez lt DS reproducibilidad Buscar factor del meacutetodo que maacutes afecta la robustez
9 INCERTIDUMBRE U 01 mgg 147 02 mgg 101 04 mgg 72
Menor a un 35
60
c) Determinacioacuten de las concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol administrado viacutea
alimento
Unidad Ejecutora Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria (FARMAVET) Universidad de
Chile
Anaacutelisis de las Muestras
Las muestras fueron analizadas por LCMSMS en el Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria
(FARMAVET) de la Universidad de Chile El meacutetodo analiacutetico fue previamente validado de
acuerdo a las Normas ISO 17025 of2005 Se analizoacute florfenicol + florfenicol amina (metabolito
activo)
Anaacutelisis estadiacutestico
1 Para cada tiempo de muestreo se calculoacute el promedio y desviacioacuten estaacutendar de las concentraciones plasmaacuteticas Con los resultados obtenidos para cada grupo experimental se realizaron las curvas de concentracioacuten plasmaacutetica (microgml) en funcioacuten del tiempo
2 Mediante un anaacutelisis de varianzas (ANDEVA) se determinoacute si existiacutean diferencias significativas del comportamiento de las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo en los diferentes grupos
3 Los paraacutemetros farmacocineacuteticos Cmax y ABC se calcularon utilizando el programa computacional WinNonlin (Version 63 Pharsight Corporation Mountain View CA USA)
4 El paraacutemetro farmacodinaacutemico utilizado fue la CMI cliacutenica Para determinar la CMI cliacutenica se utilizoacute un graacutefico de barra agrupando los valores de la MIC individual de 87 cepas de P salmonis De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST (2017) la CMI cliacutenica se definioacute a dos diluciones inmediatamente inferior a la CMI obtenida experimentalmente
5 Se determinaron los Iacutendices de Eficacia mediante las siguientes relaciones farmacocineacuteticasfarmacodinaacutemicas (PKPD) ABCCMI y TgtCMI
61
RESULTADOS
OBJETIVO 1 DEFINIR LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA 90 (MIC90) DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL FRENTE A P salmonis
a) Establecimiento de una coleccioacuten de aislados de Piscirickettsia salmonis agente
causal de la Septicemia Rickettsial Salmoniacutedea (SRS)
Identificacioacuten bacteriana
La identificacioacuten bacteriana se realizoacute mediante la tincioacuten Gram (Whitman 2004)
Inmunofluorescencia para Piscirickettsia salmonis (ETECMA-PT-IN-02) y reaccioacuten de la
polimerasa en cadena (PCR) para Piscirickettsia salmonis (Corbeil et al 2003)
Distribucioacuten geograacutefica e informacioacuten epidemioloacutegica general
La tabla 1 muestra la informacioacuten de los aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en
el marco de este proyecto Las filas resaltadas en rojo corresponden a cepas que fueron
despachadas y recepcionadas en el Laboratorio de Farmacologiacutea Facultad de Ciencias
Pecuarias de la Universidad de Chile
62
Tabla 1 Nuacutemero de aislados nuacutemero de caso especie de aislamiento antildeo de aislamiento tipo
de agua regioacuten aacuterea y barrio de aislados de Piscirickettsia salmonis consideradas en el
proyecto
Nuacutemero Nuacutemero de caso
Especie de aislamiento
Antildeo de aislamiento
Tipo de agua
Regioacuten Aacuterea Barrio
1 9386 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2012 Mar X Chiloeacute 8
2 9734 Trucha arcoiacuteris
2013 Mar X Chiloeacute 12A
3 5289 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 22B
4 5348 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 1
5 5463 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
6 5503 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar XI Melinka 17B
7 5595 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18C
8 5593 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Puerto Aysen 26B
9 5636 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 31B
10 6055 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 2
11 6220 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute
No aplica
12 6253 Trucha arcoiacuteris
2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
13 6439 Salmoacuten
coho 2014 Estuario X E Reloncaviacute 1
14 6808 Trucha arcoiacuteris
2014 Mar X E Reloncaviacute 1
15 6858 Salmoacuten
coho 2014 Mar X Calbuco 2
16 4699 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Calbuco 2
17 11808 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
18 11531 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
19 6896 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 18D
20 12371 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar XI Melinka 21B
21 12564 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 3B
22 12565 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 15
63
23 12601 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Melinka 18D
24 7398 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Puerto Montt 3B
25 5449 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2014 Mar X Chiloeacute 9A
26 9108 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Piscicultura X Puerto Montt
No aplica
27 842 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar X Chiloeacute 9A
28 860 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
29 815 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 11
30 9268 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 3A
31 9178 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Melinka 21C
32 9004 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Calbuco 2
33 8942 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 3B
34 10267 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
35 10113 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Ayseacuten 27
36 10114 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 9C
37 10135 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Calbuco 2
38 10255 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 15
39 10462 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar XI Melinka 21B
40 10054 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
41 10246 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 7
42 10197 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Puerto Montt 2
43 10002 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2015 Mar X Chiloeacute 10A
44 10309 Salmoacuten
coho 2015 Mar X Puerto Montt 3B
45 10143 Trucha arcoiacuteris
2015 Mar XI Puerto Ayseacuten 18B
46 10693 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28C
47 10514 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Chiloeacute 10A
64
48 10329 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 10A
49 15986 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar X Puerto Montt 2
50 PA2492 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
51 PA2493 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
52 PA2494 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
53 11152 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 1
54 11209 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
55 11210 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aguirre 33
56 PA2855 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 28A
57 PA2920 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Aysen 28A
58 PA2273 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
59 PA2192 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
60 17738 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Melinka 21B
61 11236 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Calbuco 2
62 11216 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 7
63 11330 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Chiloeacute 11
64 11259 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
65 11297 Salmoacuten
coho 2016 Mar X Hornopiren 17B
66 PA3045 Salmoacuten del
Atlaacutentico 2016 Mar XI Puerto Ayseacuten 26B
Continuacioacuten Tabla 1
65
Figura 1 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis pertenecientes a la
regioacuten de Los Lagos consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten
enviadas a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de
Chile
66
Figura 2 Ubicacioacuten geograacutefica de las cepas de Piscirickettsia salmonis perteneciente a la
regioacuten de Ayseacuten consideradas en el marco del proyecto de aislamiento y reactivacioacuten enviadas
a la fecha al Laboratorio de Farmacologiacutea Veterinaria FARMAVET - Universidad de Chile
67
b) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria de Piscirickettsia salmonis
genotipificadas frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
1- Resultados de la concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la Cepa E coli ATCC 22925
como control del Meacutetodo
Tabla 1 Concentracioacuten miacutenima inhibitoria de la cepa E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina y
florfenicol
CMI Oxitetraciclina (ugml) CMI Florfenicol (ugml)
Macrodilucioacuten Microdilucioacuten Macrodilucioacuten Microdilucioacuten
2 2 8 8
Nota La CMI de E coli ATCC 22925 para oxitetraciclina fue 2 microgml y para florfenicol 8 microgml
Graacutefico 1 Absorbancia versus concentracioacuten de oxitetraciclina de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
68
Graacutefico 2 Absorbancia versus concentracioacuten de florfenicol de la cepa E coli ATCC
Concentracioacuten de antibioacutetico en microgml
Tabla 2 Curva de Crecimiento E coli ATCC 25922 Se detallan las horas de incubacioacuten y la
absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Horas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 006 0056 0058
1 0082 0095 00885
2 0174 0167 01705
3 0289 0291 029
4 0460 0439 04495
5 0934 0891 09125
6 2023 1809 1916
10 4 023 4102 4102
12 4071 4094 40825
24 4060 4026 4043
69
Grafico 3 Absorbancia (eje Y) versus horas (eje X) para el crecimiento de la cepa E coli
ATCC 25922
Tabla 3 Curva de Crecimiento para cepa de P salmonis L89 Se detallan los diacuteas de incubacioacuten
y la absorbancia obtenida en cada medicioacuten y su promedio
Diacuteas de incubacioacuten Absorbancia a 600 Promedio
0 0056 006 0058
2 006 0064 0062
4 0116 0123 01195
6 0206 0198 0202
8 0309 0287 0298
10 0389 0369 0379
12 0416 0432 0424
14 0445 0471 0458
16 0598 0536 0567
0
05
1
15
2
25
3
35
4
45
0 1 2 3 4 5 6 10 12 24
E coli 25922
70
Grafico 4 Absorbancia (eje Y) versus diacuteas (eje X) de crecimiento de la cepa L89
2- Resultados de las absorbancias de la cepa de P salmonis L89 LVV
Tabla 4 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Oxitetraciclina Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias al diacutea 14 de incubacioacuten media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0499 0501 0500
00125 0513 0521 0517
0 0556 0561 0559
0
01
02
03
04
05
06
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Cepa LF 89
71
Tabla 5 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Florfenicol Cepa LF-89 LVV
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas media
128 0000 0000 0000
64 0000 0000 0000
32 0000 0000 0000
16 0000 0000 0000
8 0000 0000 0000
4 0000 0000 0000
2 0000 0000 0000
1 0000 0000 0000
05 0000 0000 0000
025 0000 0000 0000
0125 0000 0000 0000
006 0000 0000 0000
003 0498 00486 0492
00125 0522 0526 0524
0 0567 0569 0568
Figura 1 Foto de evaluacioacuten visual de la CMI por meacutetodo de macrodilucioacuten de la cepa P
salmonis L89 LVV frente a las distintas concentraciones de oxitetraciclina C- control
negativo OTC 006 tubo con concentracioacuten de oxitetraciclina de 006 ugml C+ tubo
control positivo
72
3- Resultados de absorbancia obtenidos en las cepas de Piscirickettsia salmonis CRG1
CRG2 INTA y LF89 ligth donadas por el INTA
Tabla 6 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 7 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa CRG1
CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0602 0521 0997 0994
00125 0648 0538 1028 1000
0 0657 0565 1084 1026
Florfenicol Cepa CRG1 CRG2 INTA LF-89 light
Concentracioacuten antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 0603 0616 0901 0723
0 0628 0642 0938 0777
73
4- Resultados obtenidos en las cepas de Psirickettsia salmonis EM-90 TGIM-11 SGIM-
12 LF-89 ATCC donadas por la Universidad de Valparaiacuteso
Tabla 8 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de oxitetraciclina
Tabla 9 Absorbancias obtenidas para distintas concentraciones de florfenicol
Oxitetraciclina Cepa EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1624 0496 1106 1098
00125 1689 0521 1200 1189
0 1773 0596 1264 1250
Florfenicol Cepas EM-90 TGIM-11 SGIM-12 LF-89
Concentracioacuten Antibioacutetico (microgml)
Absorbancias a los 14 diacuteas
128 0 0 0 0
64 0 0 0 0
32 0 0 0 0
16 0 0 0 0
8 0 0 0 0
4 0 0 0 0
2 0 0 0 0
1 0 0 0 0
05 0 0 0 0
025 0 0 0 0
0125 0 0 0 0
006 0 0 0 0
003 1698 1389 1267 1497
0 1772 1438 1312 1533
74
Tabla 10 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias (CMI) frente a drogas de referencia de
oxitetraciclina y florfenicol obtenidas para cada una de las distintas cepas de P salmonis
analizadas
Resumen de Resultados
Coacutedigo del Aislado
Antimicrobianos CMI (microgml)
CRG1 Oxitetraciclina 006
CRG1 Florfenicol 006
CRG2 Oxitetraciclina 006
CRG2 Florfenicol 006
INTA Oxitetraciclina 006
INTA Florfenicol 006
L89 LIGHT Oxitetraciclina 006
L89 LIGHT Florfenicol 006
EM90 Oxitetraciclina 006
EM90 Florfenicol 006
TGIM11 Oxitetraciclina 006
TGIM11 Florfenicol 006
SGIM12 Oxitetraciclina 006
SGIM12 Florfenicol 006
LF89 Oxitetraciclina 006
LF89 Florfenicol 006
L89 LVV Oxitetraciclina 006
L89 LVV Florfenicol 006
75
c) Determinacioacuten de la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria (CMI) cliacutenica de aislados de P
salmonis frente a Oxitetraciclina y Florfenicol
De acuerdo a las recomendaciones del EUCAST la Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria Cliacutenica
definida para Piscirickettsia salmonis frente a oxitetraciclina es le 2 microgml y para florfenicol le 1
microgml Los puntos de corte para la CMI Cliacutenica se definieron 2 diluciones inferiores a la uacuteltima
concentracioacuten definida experimentalmente (Figuras 1 y 2)
En las figuras 1 y 2 tambieacuten se sentildeala la distribucioacuten de los diferentes valores de CMI En estas
figuras se puede observar que la distribucioacuten cumple los requerimientos del EUCAST ya que
abarca 3 y 4 diluciones para florfenicol y oxitetraciclina respectivamente
En el Anexo 2 se sentildeala CMI obtenida para cada cepa
Figura 1 CMI Cliacutenica para florfenicol frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
76
Figura 2 CMI Cliacutenica para oxitetraciclina frente a P salmonis
CMI Cliacutenica
77
OBJETIVO 2 EVALUACIOacuteN DEL EFECTO DEL PROCESO DE ELABORACIOacuteN DE LOS
ALIMENTOS MEDICADOS SOBRE LAS DIFERENTES PREMEZCLAS DE
OXITETRACICLINA Y FLORFENICOL
a) Evaluacioacuten de la potencia microbioloacutegica de premezclas de Oxitetraciclina y
Florfenicol frente a Piscirickettsia salmonis
Para el caacutelculo de potencia del antibioacutetico en la premezcla se consideroacute la absorbancia
de la concentracioacuten maacutes alta en la que se observa crecimiento bacteriano
De acuerdo a esto se utiliza la siguiente formula
X= A x B C
Donde X= potencia del antibioacutetico en la premezcla A= Absorbancia del antibioacutetico de referencia B= 100 C= Absorbancia de la premezcla Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa E coli ATCC 25922 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 2 ugmL - CMI Florfenicol 8 ugmL
Concentracioacuten Miacutenima Inhibitoria para la cepa P salmonis L89 para macro y microdilucioacuten frente a oxitetraciclina y florfenicol como antibioacuteticos de referencia (drogas certificadas)
- CMI Oxitetraciclina 006 ugmL - CMI Florfenicol 006 ugmL
1- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a distintas concentraciones de los antibioacuteticos
de referencia
Tabla 1 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0284
2 029
1 0632
05 1996
025 3294
0125 3532
006 3742
0 406
78
Tabla 2 Absorbancias de E coli ATCC 25922frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
4 0646
2 0722
1 1856
05 2716
025 292
0125 2934
006 3186
0 406
Tabla 3 Absorbancias de P salmonis L89 frente a oxitetraciclina de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0510
00125 0517
0 0728
Tabla 4 Absorbancias frente a florfenicol de referencia
Concentraciones (microgml) Antibioacutetico de referencia
Absorbancia
1 00
05 00
025 00
0125 00
006 00
003 0490
00125 0524
0 0701
79
2- Resultados de los promedios de las absorbancias obtenidas para el crecimiento de E
coli ATCC 25922 y P salmonis L89 frente a las 13 premezclas de antibioacuteticos (PM)
Tabla 5 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 406 406 406 402 406 402
006 41 36 38 41 39 39
0125 39 34 37 38 36 37
0250 38 32 32 38 34 31
05 37 23 28 36 27 28
1 22 09 10 21 20 20
2 09 04 05 08 09 09
4 03 03 03 06 03 03
Tabla 6 Absorbancias de E coli ATCC 25922 frente a las premezclas de florfenicol
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol
01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 406 406 406 406 406 406 406 406 406 406 405 406 406 406
006 39 39 40 35 39 39 33 41 37 31 37 34 39 40
0125 38 38 35 32 34 39 33 37 35 31 37 32 35 35
0250 37 37 34 31 28 35 31 32 34 31 36 30 35 32
05 35 35 34 31 26 29 23 31 29 27 34 30 29 31
1 28 28 24 21 17 16 16 23 21 16 27 21 17 23
2 12 12 14 12 15 14 14 19 06 06 12 12 14 19
4 07 07 07 06 06 06 06 06 06 06 07 06 06 06
Tabla 7 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de oxitetraciclina
Concentracioacuten (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de oxitetraciclina
03 a Cto1 Otc2 Otc4 Otc5 Otc6
0 0728 0728 0728 0723 0728 0728
003 0728 0708 0719 0723 0706 0718
006 0017 0023 0017 0018 0023 0018
0125 0006 0003 0005 006 0003 005
0250 0001 0001 0002 0001 0002 001
05 00 00 00 00 00 00
Tabla 8 Absorbancias de P salmonis L89 frente a las premezclas de florfenicol
Conc (microgml)
Absorbancias para cada Premezcla de florfenicol 01 a 02 a 04 a 06 a 07 a 08 a 09 a Ff1 Ff2 Ff3 Ff4 Ff5 Ff6 Ff7
0 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701 0701
003 0571 0561 0552 0531 0522 0532 0533 0532 0531 0530 0571 0530 0530 0552
006 0012 0019 0015 0021 0013 0013 0014 0024 0008 0008 0019 0021 0013 0024
0125 0005 0004 0002 0003 0007 0007 0007 0004 0001 0002 0004 0002 0007 0004
0250 0001 0000 0000 0000 0001 0002 0002 0002 0000 0000 0000 0000 0002 0002
05 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
80
3- Resultados de la potencia microbiologica de los antibioacuteticos de las diferentes
premezclas expresados como porcentaje del antibioacutetico de referncia frente a E coli
ATCC 25922 y P salmonis L89
Se analizaron 14 premezclas de florfenicol y 6 de oxitetraciclina de diferentes lotes y
laboratorios
Para el caso de florfenicol la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
fueron iguales o superiores al 85 (Tabla 9)
Para el caso de oxitetraciclina la potencia microbioloacutegica frente a las dos bacterias analizadas
estuvo entre un 70 y un 75 (Tabla 10)
Tabla 9 Potencia microbioloacutegica de Florfenicol
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
01a 865 85
02a 884 86
04a 89 89
06a 96 92
07a 100 93
08a 100 92
09a 100 92
Ff1 100 95
Ff2 100 92
Ff3 100 96
Ff4 883 86
Ff5 96 92
Ff6 100 92
Ff7 100 95
Tabla 10 Potencia microbioloacutegica de Oxitetraciclina
Coacutedigo Premezcla
Potencia microbioloacutegica
Potencia microbioloacutegica
E coli ATCC 25922
P salmonis L89
03a 755 70
Cto1 755 72
Otc2 755 71
Otc4 761 70
Otc5 757 747
Otc6 75 72
81
ANAacuteLISIS DE RESULTADOS
Ambas metodologiacuteas entregan los mismos valores de CIM tanto para E coli ATCC 25922
como para P salmonis L89
La CMI puede variar un valor mayor o menor con respecto a las drogas certificadas por lo
que las variaciones entre las premezclas evaluadas en el caso de E coli ATCC 25922
estaacuten dentro de lo esperado Se puede concluir que en el caso de E coli ATCC25922 en
las condiciones del estudio tanto para oxitetraciclina como para florfenicol las premezclas
estariacutean bien formuladas
Para el caso de la inhibicioacuten de los antibioacuteticos frente a P salmonis L89 2 de las premezclas
compuestas por oxitetraciclina y 1 de las compuestas por florfenicol aumentaron sus valores
de CMI respecto de las drogas certificadas indicando que existe un problema en la
formulacioacuten donde existe menor concentracioacuten del antibioacutetico
82
b) Verificacioacuten del porcentaje de pureza de oxitetraciclina y florfenicol declarado en las
premezclas
Para definir la pureza se consideroacute el aacuterea bajo la curva del peak cromatograacutefico (entregado
por el software de integracioacuten) de cada muestra
Para obtener los resultados se siguen los siguientes pasos
1 El aacuterea obtenida de cada repeticioacuten de una premezcla se comparoacute con el promedio de las aacutereas cromatograacutefiacutecas obtenidas del estaacutendar certificado
2 Se obtiene el de pureza considerando que todas las muestras se encuentran a una concentracioacuten equivalente (1 mgmL) es decir teoacutericamente todas poseen una pureza cercana al 100 Para esto se utilizoacute la siguiente formula
119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871
= 100 lowast 119860119903119890119886 119898119906119890119904119905119903119886119875119903119900119898119890119889119894119900 119860119903119890119886119904 119864119904119905119886119899119889119886119903 119862119890119903119905119894119891119894119888119886119889119900
3 Se corrige la pureza en relacioacuten al porcentaje declarado en cada premezcla de acuerdo a la siguiente foacutermula
119875119906119903119890119911119886 119877119890119886119897 = (119875119906119903119890119911119886 119889119890119888119897119886119903119886119889119886 () lowast 119875119906119903119890119911119886 119890119902119906119894119907119886119897119890119899119905119890 119886 1 119898119892119898119871)100
En la tabla 1 y 2 se sentildealan los porcentajes de pureza declarada y calculada en las premezclas
de oxitetraciclina y florfenicol respectivamente
Tabla 1 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de oxitetraciclina
de pureza
declarada Muestra
Pureza Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
80 08 A 6952 6828 6987 6922 -134
80 07 A 7796 7583 7111 7496 -63
80 03 A 7846 7408 7028 7427 -716
80 17 A 8287 7371 7343 7667 -416
80 24 A 8030 8020 8010 8020 +025
80 07 B 7798 7780 7810 7796 -255
80 09 A 6860 6860 6860 6860 -1425
80 6 A 8340 8330 8320 8330 +412
83
Tabla 2 Porcentaje de pureza declarada y calculada para las premezclas de florfenicol
de pureza declarada
Muestra Pureza
Calculada n = 1
Pureza Calculada
n=2
Pureza Calculada
n=3
de pureza
calculada (promedio)
Desviacioacuten de la pureza entre la concentracioacuten declarada y calculada
()
50 22ordf 4992 4913 4886 4930 -14
50 19ordf 4777 4697 4751 4741 -518
50 18ordf 5378 4963 5215 5186 +372
50 12ordf 4970 5014 4956 4980 -04
50 11ordf 4720 4737 4857 4771 -458
50 10ordf 5039 5294 4836 5056 +112
50 09ordf 4976 4858 4881 4905 -19
50 06ordf 4946 4835 4778 4853 -294
50 04ordf 5086 5121 5093 5100 +200
50 02ordf 5492 5354 5786 5544 +1088
50 07ordf 4970 4960 4970 4960 -08
50 08ordf 5076 5020 5060 5052 +104
50 09ordf 4720 4730 4730 4726 -548
50 13B 4900 4870 4890 4886 -228
50 14B 5020 5010 5010 5013 +026
50 |15B 5360 5350 5350 5353 +706
50 16B 5350 5340 5340 5343 +686
50 17B 4920 4910 4920 4816 -368
50 18B 4960 4950 4960 4956 -088
50 19B 4780 4790 4790 4786 -428
En el graacutefico 1 se muestra el porcentaje pureza declarado y el porcentaje de pureza calculado
para las premezclas de oxitetraciclina
En el grafico 2 se muestra el porcentaje de pureza declarado y el porcentaje de pureza
calculado para las premezclas de florfenicol
84
Graacutefico 1 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Oxitetraciclina con su respectiva DE
Graacutefico 2 Comparativa de porcentaje promedio de purezas declaradas y calculadas para
Florfenicol con su respectiva DE
600
650
700
750
800
850
900
950
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
d
e p
ure
za
Muestras
Pureza premezclas
Pureza declarada
85
Anaacutelisis de los resultados
Para el caso de las premezclas de oxitetraciclina solo un 50 de las muestras estaacuten dentro de
los rangos de aceptabilidad (la diferencia entre el valor declarado y el calculado es menor al
5) Por el contrario un 50 de las muestras se salen del rango de aceptabilidad declarando
purezas menores al declarado
Para el caso de las premezclas de florfenicol un 75 de las muestras estaacuten dentro del rango
de aceptabilidad
En las premezclas cuyos valores de pureza estaacuten fuera de los rangos de aceptabilidad la
pureza evaluada por el laboratorio fue mayor a la declarada en el caso de florfenicol y menor
a la declarada en el caso de oxitetraciclina
86
c) Verificacioacuten de la estabilidad concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y
oxitetraciclina en los alimentos medicados
Resultados de la estabilidad de alimento medicado con florfenicol u oxitetraciclina
En las Tablas 1 y 2 se muestran los resultados de estabilidad de cada lote de alimento medicado
con florfenicol y oxitetraciclina respectivamente En estos se puede observar que el CV entre
los resultados de cada tiempo de muestreo no superoacute el 7
Tabla 1 Estabilidad de florfenicol en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
28A 21 24 23 21 22 222 013 587
74B 15 15 13 15 15 146 009 613
54A 26 29 28 3 29 284 015 534
77A 16 16 16 16 17 162 004 276
135A 28 28 31 29 27 286 015 530
145A 26 28 27 3 27 276 015 549
68A 67 65 63 68 69 664 024 363
87
Tabla 2 Estabilidad de oxitetraciclina en el alimento
Coacutedigo
Muestra
Concentraciones Promedio en Diferentes Tiempos de
Muestreo (mgg)
Promedio DE CV () Tiempo 0
(promedio
n=3)
Tiempo 1
(promedio
n=3)
Tiempo 2
(promedio
n=3)
Tiempo 3
(promedio
n=3)
Tiempo 4
(promedio
n=3)
33A 649 634 700 63 612 6314 013 209
17B 879 597 595 595 583 6098 039 641
49A 819 820 729 723 72 7622 052 688
50A 800 799 807 792 791 7978 007 082
67A 931 960 984 925 921 9442 027 286
68A 902 931 933 924 905 919 015 159
27A 1196 1157 1156 1125 1136 1154 027 235
88
Resultados de concentracioacuten y homogeneidad de florfenicol y oxitetraciclina en
alimentos medicados
Alimentos medicados con florfenicol
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas e independiente del calibre del pellet 32 presentaron
cantidades inferiores a las declaradas y 8 cantidades superiores a las declaradas
De las 8 muestras con cantidades superiores a las declaradas en 3 de ellas la diferencia
fue menor al 10 y en 5 la diferencia fluctuoacute entre un 11 y un 185
De las 32 muestras con cantidades inferiores a las declaradas las diferencias por nuacutemero
de muestras fueron las siguientes
Diferencia menor al 10 14 muestras
Diferencia entre un 10 y un 15 3 muestras
Diferencia entre un 15 a un 21 15 muestras
De acuerdo a lo sentildealado del total de muestras de alimento con florfenicol (40) la
distribucioacuten de las muestras entre el valor declarado y el real es el siguiente
En un 425 de las muestras hubo una diferencia entre el valor declarado y el
real menor o igual a 10
En un 125 de las muestras con cantidades superiores a las declaradas la
diferencia fue mayor al 10
En un 45 de las muestras con cantidades inferiores a las declarada la
diferencia fue mayor al 10
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 8
En las Tablas 1 ndash 2 y 3 se muestran los resultados de florfenicol
Alimentos medicados con oxitetraciclina
1- Diferencia entre la cantidad declarada y la real
Del total de muestras analizadas los resultados fueron los siguientes
4 muestras presentaron cantidades menores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 9 y un 18
3 muestras presentaron cantidades mayores a las declaradas Las diferencias
encontradas fluctuaron entre un 16 y un 20
89
2- Homogeneidad
En todas las muestras el CV fue menor al 7
En la Tabla 4 se muestran los resultados de oxitetraciclina
Tabla 1 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 12
Coacutedigo
muestra Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia
Homogeneidad
CV
24A 12 500 39 -201 49
34A 12 394 31 -193 55
37A 12 400 32 -200 44
73A 12 410 35 -146 71
76A 12 328 32 -24 49
91A 12 391 32 -182 53
95A 12 391 31 -207 40
100A 12 263 25 -49 36
63A 12 370 30 -189 56
70A 12 369 35 -52 34
90
Tabla 2 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 9
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn) Diferencia Homogeneidad CV
25A 9 235 21 -106 21
29A 9 266 25 -60 22
30A 9 259 25 -35 06
32A 9 266 25 -60 27
35A 9 266 26 -23 59
36A 9 189 22 164 17
39A 9 409 39 -46 12
40A 9 259 22 -151 47
42A 9 259 24 -73 62
43A 9 261 25 -42 34
44A 9 261 24 -80 48
78A 9 412 32 -223 73
79A 9 235 24 21 24
80A 9 499 52 42 05
90A 9 259 26 04 20
92A 9 181 21 160 32
97A 9 260 23 -115 51
99A 9 259 22 -151 23
59A 9 265 24 -94 15
60A 9 267 25 -64 11
62A 9 499 42 -158 67
71A 9 264 26 -15 24
72A 9 349 29 -169 39
91
Tabla 3 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
florfenicol en los alimentos medicados calibre 64 y 41 mm
Coacutedigo
muestra Calibre
Cantidad
declarada
(kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
28A 64 189 21 111 13
74A 64 132 15 136 14
54A 41 354 29 -181 07
77A 41 135 16 185 3
135A 41 34 28 -176 09
145A 41 34 27 -206 07
68A 41 807 65 -195 53
Tabla 4 Diferencia () entre la cantidad declarada y la cantidad real y homogeneidad de
oxitetraciclina en los alimentos medicados calibres 41 mm (n=7)
Coacutedigo Calibre Cantidad
declarada (kgTn)
Cantidad
real (kgTn)
Diferencia
()
Homogeneidad
CV
17B 41 10 82 -180 51
49A 41 807 8 -09 64
50A 41 807 8 -09 05
67A 41 807 95 177 27
68A 41 807 94 165 34
27A 41 1351 117 -134 17
33A 41 51 61 196 45
Para analizar los resultados se tomoacute como referencia el Reglamento del Parlamento Europeo
y del Consejo relativo a la fabricacioacuten la comercializacioacuten y el uso de piensos medicados Este
reglamento coge las recomendaciones de la FAO organismo intergubernamental que ademaacutes
solicita a todos los paiacuteses armonizar al respecto y sentildeala
1- Que se acepta una tolerancia del 10 en la dispersioacuten de la cantidad de
antimicrobianotonelada de alimento declarado en la etiqueta
2- Los fabricantes deben garantizar la distribucioacuten homogeacutenea del medicamento veterinario en
el pienso con el fin de asegurar la eficacia de los tratamientos Sentildeala ademaacutes que se deben
establecer criterios para la incorporacioacuten homogeacutenea de los medicamentos dejando abierto las
reglamentaciones para evaluar la homogeneidad de los antibioacuteticos en los piensos medicados
Al respecto actualmente en Chile como en otros paiacuteses las empresas que elaboran pienso
deben realizar test de homogeneidad despueacutes de determinado el proceso de mezclado de los
ingredientes de la formulacioacuten El objetivo es asegurarse una adecuada homogeneidad de los
nutrientes con el fin de garantizar una absorcioacuten completa de estos En este test se acepta una
dispersioacuten de un 5 a un 15 (CV)
92
En el caso de las empresas elaboradoras de alimento medicado el antibioacutetico lo incorporan en
la etapa de aceitado razoacuten por la cual el test de homogeneidad realizado despueacutes del proceso
de mezclado no avala la homogeneidad del antibioacutetico en el alimento Es por eso que se hace
necesario incorporar a la brevedad posible un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad el cual
tambieacuten podriacutea tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
3- Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
4- Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
93
d) Propuesta de elaboracioacuten de alimentos con concentraciones pre establecidas de
antimicrobianos Alimentos medicados prefabricados a concentraciones fijas y su
uso en la industria en fase de engorda en mar
Al abordar el informe sobre uso de antimicrobianos del 2016 podemos evidenciar que la
Regiones X y XI presentan el mayor consumo de antibioacuteticos (946) correspondiendo a un
324 para la X Regioacuten y 622 para la XI regioacuten En ambas regiones piscirickettsiosis
corresponde a la principal causa de uso de estos faacutermacos
Si abordamos la ubicacioacuten de las plantas que producen los alimentos medicados estas se
situacutean desde la X Regioacuten hacia el norte lo que claramente limita los tiempos de despacho de
productos hacia las regiones australes Importante consideracioacuten que se debe tener si vemos
que la regioacuten de Ayseacuten representoacute un 622 del consumo de antibioacuteticos el antildeo 2016
Ubicacioacuten de plantas productoras de alimento para salmones
EWOS Coronel VIII Regioacuten
Desde Coronel el alimento se traslada hasta Puerto Montt (Regioacuten de Los Lagos) A traveacutes de
los puertos Detroit y en menor medida Oxxean son repartidos en los centros de engorda
SKREETING Osorno X Regioacuten
Desde Osorno se despachan a Puerto Montt al terminal portuario Pargua de Skretting
BIOMAR Castro y Pargua X Regioacuten
Desde Pargua y Castro el alimento es trasladado hasta los puntos de embarque que son los
puertos comerciales en Puerto Montt Calbuco Dalcahue y Quelloacuten Desde estos puertos viacutea
mariacutetima se trasladan a los distintos centros de cultivo
SALMOFOOD Castro X Regioacuten
Para los alimentos de engorda utilizan puertos de embarques como Cabo Froward en Calbuco
Empormontt en Castro y el Muelle SPQ en Quelloacuten Todos ubicados en la Regioacuten de Los Lagos
Considerando que P salmonis representa un problema para las Regiones X y XI debido a su
alta patogenicidad debe ser afrontada de forma raacutepida frente a un diagnoacutestico positivo lo que
incluye iniciar lo antes posible la terapia antimicrobiana Dentro de este contexto lo maacutes
importante es la llegada oportuna del alimento medicado
De acuerdo a lo sentildealado por los Meacutedicos veterinarios en promedio la llegada de un alimento
medicado a un centro de cultivo va de 7 a 10 diacuteas desde la emisioacuten de la Prescripcioacuten Meacutedico
Veterinaria sin considerar contratiempos como son principalmente las condiciones climaacuteticas
que muchas veces pueden retrasar el despacho y arribo del alimento medicado Estos tiempos
se acortan entre 3 a 5 diacuteas promedio si consideramos utilizar un producto prefabricado y
94
disponible para despacho inmediato
Por otro lado el Servicio Nacional de Pesca emitioacute en el antildeo 2015 la resolucioacuten exenta Ndeg8228
que ldquoAprueba Programa Sanitario General Para Uso De Antimicrobianos En La Salmonicultura
y Otros Peces De Cultivordquo Esta resolucioacuten tiene como objetivo ldquodefinir los lineamientos y las
medidas para mejorar la eficacia de los tratamientos y reducir los riesgos asociados a la
emergencia de resistencia de microorganismos a los antimicrobianos con el fin de proteger la
sanidad y el bienestar animal junto con garantizar la inocuidad de los alimentos derivados de
la salmonicultura y otros peces de cultivordquo
Buscando mejorar la eficacia en la resolucioacuten se autoriza a las plantas de alimento elaborar y
mantener stock de alimento medicado siempre que cumplan con ciertas condiciones
- La elaboracioacuten deberaacute estar respaldada por una prescripcioacuten meacutedico veterinaria (PMV)
emitida por un meacutedico veterinario perteneciente a la planta o a la empresa de cultivo La planta
deberaacute informar a Sernapesca el nombre y RUT de los meacutedicos veterinarios habilitados
- El alimento se deberaacute almacenar en instalaciones acondicionadas para ello de uso uacutenico
o compartido cuya ubicacioacuten deberaacute ser informada al Servicio
- La planta deberaacute mantener un control de stock actualizado disponible para inspecciones de
Sernapesca El rotulado del alimento medicado deberaacute incluir la fecha de caducidad del mismo
teniendo en consideracioacuten antecedentes de estabilidad del producto
- La planta podraacute liberar y distribuir el alimento ante la presentacioacuten de una PMV emitida por
el meacutedico veterinario de la empresa de cultivo en conformidad a lo sentildealado en la normativa
Dentro de este contexto diferentes plantas cuentan con stock de alimentos medicados con
diferentes niveles de inclusioacuten de los antibioacuteticos en relacioacuten a los calibres de los pellets
De acuerdo a la opinioacuten de los Meacutedicos Veterinarios estos alimentos medicados con niveles
de inclusioacuten de antibioacuteticos preestablecidos no siempre se pueden adaptar en relacioacuten a los
SFR que ellos deben considerar en relacioacuten al peso de los peces en el momento de iniciar un
tratamiento
Asiacute tambieacuten los Meacutedicos Veterinarios sentildealan que los stocks de alimento medicado con
inclusiones de antibioacutetico preestablecidas deben realizarse en concordancia con la empresa
salmonera que adquiere el producto ya que de la forma en que estaacute establecido en la
actualidad la seleccioacuten del antibioacutetico queda a criterio de la empresa de alimento medicado
La forma en la que el Meacutedico Veterinario adapta la cantidad de alimento a administrar a los
peces de manera de cumplir con las concentraciones adecuadas es mediante el SFR a
administrar Esto se puede profundizar mediante un ejemplo
Requerimos realizar un tratamiento con urgencia y la planta de alimento nos informa que cuenta
con un alimento medicado en base a una dieta que llamaremos SALAR FLOR que utilizoacute
florfenicol al 50 y el antibioacutetico se adquirioacute al laboratorio FARMACHILE que se encuentra con
95
una tasa de inclusioacuten de 6 kgtonelada
6kgton (florfenicol al 50) = 3000 mg de producto activoKg alimento
Si mi intencioacuten es administrar una dosis de 20mgkg de florfenicol requiero realizar el
siguiente calculo
(Dosis de producto a administrar (mgkg) Tasa de inclusioacuten producto activo (mgkg))
100 = tasa de consumo SFR
(20 (mgkg) 3000 (mgkg)) 100 = 067 (SFR)
Con este dato de SFR puedo dirigirme a mi tabla Excel y calcular el tratamiento para la dosis y
tasa de inclusioacuten indicada
Dado el crecimiento de los peces y los desafiacuteos que se presentan en las distintas eacutepocas del
antildeo y en base a lo visto anteriormente seriacutea recomendable establecer que al menos respecto
a los calibres de alimentos que se administran para los pesos sobre el kilo si o si se deberiacutean
existir alimentos medicados prefabricados donde se observa la mayor problemaacutetica
Como podemos ver la autorizacioacuten dada por el Servicio Nacional de Pesca para poder contar
con alimentos medicados prefabricados es una buena herramienta Sin embargo para poder
obtener el maacuteximo beneficio se requiere que cada empresa de alimento pueda reunirse con las
empresas productoras en forma perioacutedica para poder establecer criterios que fortalecen la
uniformidad y la discusioacuten de coacutemo se administran los tratamientos Establecer un 2 a 3
como base de alimentos prefabricados es un valor prudente pensando en la diversidad de
criterios que cada profesional tiene a la hora de administrar un tratamiento
Finalmente respecto al producto farmaceacuteutico que se administra por el momento solo
florfenicol seriacutea el adecuado para considerar en dietas prefabricadas debido a lo antes
expuesto Mientras no exista un medicamento que asegure tiempos de liberacioacuten acotados y
que pueda ser utilizado sobre el kilo de peso solo seraacute necesario considerar este producto para
dietas prefabricadas
96
OBJETIVO 3 COMPARAR Y EVALUAR MEDIANTE ESTUDIOS DE BIODISPONIBILIDAD
LA RELACIOacuteN ENTRE LA LIBERACIOacuteN Y DISOLUCIOacuteN DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL A NIVEL INTESTINAL CON LAS CONCENTRACIONES PLASMAacuteTICAS DE
LOS DIFERENTES ALIMENTOS MEDICADOS ETAPA 1 DETERMINACIOacuteN DE LA
LIBERACIOacuteN DE FLORFENICOL Y OXITETRACICLINA DESDE ALIMENTOS MEDICADOS
PARA PECES
31 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
florfenicol
311 Muestra 04 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 4 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 1 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 2
Muestra 04B pH 2
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1762 1234 2035 1546 1899 2262 1790 36455 2037
05 2309 2097 2479 1686 2277 2536 2231 30911 1386
1 3429 3000 2918 2153 2896 3186 2930 43015 1468
2 5781 5114 4054 3123 3853 4161 4348 94935 2184
3 7772 6909 4893 3680 4958 5179 5565 149674 2689
4 9146 8423 5675 4177 4642 4279 6057 219035 3616
5 10718 9645 6551 3118 4566 4933 6588 300899 4567
6 11859 10719 6642 5594 5633 6579 7838 273435 3489
7 12510 9162 7670 5794 6364 7592 8182 242127 2959
9 14819 14233 7969 6413 7763 8151 9891 364651 3687
97
Tabla 2 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 2
Tabla 3 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 4
Tabla 4 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 4
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 53711 0996 15199 0970 0232 0837 0303 0893
Muestra 2 48133 0958 13641 0936 0240 0800 0297 0864
Muestra 3 25288 0990 7116 0955 0154 0876 0182 0907
Muestra 4 19418 0894 5591 0902 0159 0858 0171 0880
Muestra 5 20991 0941 6013 0939 0142 0869 0163 0901
Muestra 6 22861 0912 6623 0931 0140 0893 0167 0913
Promedio 31734 0948 9031 0939 0178 0855 0214 0893
DS 15095 0041 4236 0023 0046 0033 0067 0018
CV () 4757 435 4690 247 2576 384 3140 205
Muestra 04B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 261 251 215 273 265 229 249 02246 902
05 358 362 308 329 334 305 333 02428 730
1 587 595 505 513 613 484 549 05495 1000
2 827 876 754 721 930 696 801 09213 1151
3 979 1294 1019 825 1225 847 1032 19265 1867
4 979 1487 1130 1006 1411 1082 1182 21460 1815
5 1218 1601 1334 1261 1695 1220 1388 20784 1497
6 1395 1827 1483 1330 1971 1396 1567 26551 1694
7 1441 2047 1435 1503 2128 1498 1675 32148 1919
9 1686 2334 1807 1651 2417 1693 1931 34895 1807
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5554 0988 1564 0954 0188 0810 0124 0869
Muestra 2 8478 0995 2396 0967 0234 0818 0164 0881
Muestra 3 6314 0991 1772 0950 0218 0801 0142 0863
Muestra 4 5723 0989 1627 0973 0199 0865 0131 0912
Muestra 5 8910 0994 2531 0976 0240 0831 0170 0895
Muestra 6 6036 0995 1711 0973 0215 0845 0139 0900
Promedio 6836 0992 1934 0966 0215 0828 0145 0887
DS 1469 0003 0419 0011 0020 0024 0018 0019
CV () 2149 032 2166 114 918 285 1252 213
98
Tabla 5 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74
Tabla 6 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74
Tabla 7 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 04B a pH 74 + LSS
Muestra 04B pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 340 344 413 401 391 389 380 03042 801
05 590 523 737 715 705 676 658 08338 1268
1 883 834 1067 1054 1076 1025 990 10449 1056
2 1332 1318 1686 1626 1693 1785 1573 19874 1263
3 1691 1542 2130 2040 1983 2064 1908 23552 1234
4 1883 1795 2449 2340 2411 2334 2202 28565 1297
5 2056 1928 2711 2553 2662 2549 2410 33225 1379
6 2155 1994 2992 2817 2915 2837 2618 42899 1638
7 2224 2028 3198 3571 3095 2969 2847 59721 2097
9 2564 2294 3607 3384 3626 3365 3140 56770 1808
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 8809 0984 2417 0902 0193 0735 0146 0800
Muestra 2 7912 0971 2152 0873 0186 0722 0137 0778
Muestra 3 12848 0998 3580 0943 0212 0773 0176 0843
Muestra 4 12705 0978 3549 0929 0214 0778 0177 0844
Muestra 5 12795 0998 3554 0950 0215 0772 0177 0846
Muestra 6 11902 0990 3289 0920 0209 0744 0170 0813
Promedio 11162 0986 3090 0919 0205 0754 0164 0821
DS 2215 0011 0639 0028 0012 0024 0018 0028
CV () 1985 112 2066 310 602 312 1091 344
Muestra 04B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 301 312 361 414 381 376 358 04315 1207
05 571 425 452 601 539 723 552 10809 1959
1 704 823 743 1073 807 943 849 13671 1611
2 1184 1091 971 1563 1491 1373 1279 23396 1829
3 1811 1349 1263 1713 1441 1630 1534 21660 1412
4 1953 1785 1298 1980 1601 1814 1738 25518 1468
5 1852 1904 1631 2096 1712 1932 1854 16558 893
6 2007 2104 1497 3092 2159 2137 2166 51670 2386
7 2504 2079 1474 2470 2337 2231 2183 38086 1745
9 2639 2409 1599 2696 2550 2470 2394 40325 1684
99
Tabla 8 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes de
velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 04B a pH 74 +
LSS
Tabla 9 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en los cuatro medios
de disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 9448 0964 2620 0903 0213 0756 0159 0816
Muestra 2 8666 0986 2404 0924 0211 0771 0154 0832
Muestra 3 5323 0919 1423 0799 0154 0706 0106 0742
Muestra 4 9927 0914 2720 0835 0191 0731 0151 0780
Muestra 5 8609 0970 2412 0926 0192 0783 0145 0841
Muestra 6 8130 0986 2236 0909 0174 0735 0133 0803
Promedio 8350 0956 2303 0883 0189 0747 0141 0802
DS 1617 0032 0464 0053 0022 0029 0019 0037
CV () 1936 337 2014 596 1180 382 1375 456
Muestra 04B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 pH 74 +LSS
disuelto
025 1790 249 380 358
05 2231 333 658 552
1 2930 549 990 849
2 4348 801 1573 1279
3 5565 1032 1908 1534
4 6057 1182 2202 1738
5 6588 1388 2410 1854
6 7838 1567 2618 2166
7 8182 1675 2847 2183
9 9891 1931 3140 2394
100
Figura 1
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten observado
experimentalmente Este modelo considera que el producto es una matriz cuya porosidad y
tortuosidad de los poros son factores que impactan en forma positiva y negativa
respectivamente en la liberacioacuten del faacutermaco El comportamiento observado en el producto es
de poca erosioacuten y al final del experimento permanece en una forma de esponja porosa
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 2 y todas las otras condiciones (plt005)
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 74 y
74 + LSS
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que no se cumple en este caso (ver
CV en las tablas 13 5 y 7
312 Muestra 06 B
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
101
Tabla 10 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 2
Tabla 11 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 2
Tabla 12 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 4
MUESTRA 06B pH2
Temperatura 10degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 189 130 119 133 121 070 127 0380 2991
05 290 203 262 199 191 144 215 0524 2440
1 413 356 390 371 345 235 351 0622 1771
2 729 702 669 590 514 451 609 1102 1809
3 1030 787 814 728 740 568 778 1505 1935
4 1284 854 1012 977 1021 640 965 2126 2203
5 1421 1156 1206 1024 1054 811 1112 2039 1834
6 1200 1120 1207 1227 1151 936 1140 1076 944
7 1630 1133 1204 1286 1201 1082 1256 1960 1561
9 1580 1274 1716 1570 1312 1146 1433 2202 1536
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 61689 09451 16951 08684 02257 07553 0143 08031
Muestra 2 48328 09642 13253 08805 02305 07223 01331 07848
Muestra 3 586 09751 16574 09493 02467 07635 01491 08488
Muestra 4 57177 0993 16236 09744 02536 0808 01512 08816
Muestra 5 51784 09795 14363 0917 02491 07679 01437 08307
Muestra 6 4514 09888 12801 09677 02798 07825 01478 08686
Promedio 5379 0974 1503 0926 0248 0767 0145 0836
DS 0641 0018 0179 0045 0019 0029 0006 0038
CV () 1192 180 1194 485 777 372 448 449
Muestra 06B pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 PROMEDIO DESV EST CV ()
025 091 121 113 079 105 004 085 04249 4976
05 163 195 196 150 164 071 157 04574 2921
1 311 320 316 222 288 195 275 05348 1944
2 507 531 507 459 413 409 471 05192 1103
3 667 708 653 547 614 590 630 05753 913
4 789 874 768 589 771 683 746 09801 1314
5 902 997 860 872 885 817 889 06020 677
6 1021 1147 947 1016 1002 013 858 41890 4883
7 1105 1246 1050 1148 1063 804 1069 14780 1382
9 1288 1392 1228 1409 1350 925 1265 17988 1422
102
Tabla 13 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 4
Tabla 14 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 06B a pH 74 + LSS
Tabla 15 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 06B a pH 74
+ LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 48245 09995 1359 09659 02622 07706 0145 08548
Muestra 2 5309 09966 15 09681 02547 08075 01478 08776
Muestra 3 442 09992 1246 0966 02364 07896 01325 08648
Muestra 4 5197 09628 151 0989 0294 08407 01611 092
Muestra 5 4901 09878 1403 09852 02644 08329 01479 09039
Muestra 6 3906 0961 1053 08592 04093 0498 01623 06719
Promedio 4760 0984 1345 0956 0287 0757 0149 0849
DS 0522 0018 0173 0048 0063 0129 0011 0090
CV () 1096 183 1287 505 2190 1710 741 1061
Muestra 06B pH 74 LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Prom DS CV()
disuelto
025 184 190 262 177 238 210 03760 1787
05 338 308 593 324 385 390 11735 3010
1 573 499 987 593 739 678 19313 2847
2 846 754 1494 890 1052 1007 29294 2908
3 1043 929 1750 1029 1413 1233 34299 2782
4 1182 1126 2012 1090 1678 1417 40896 2885
5 1292 1173 2196 1281 1646 1518 41887 2760
6 1329 1265 2296 1406 1802 1619 43207 2668
7 1403 1296 2561 1481 1905 1729 51932 3003
9 1446 1325 2776 1692 2046 1857 58292 3139
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 5287 096 1425 08485 01945 06798 01225 07447
Muestra 2 4921 09613 1331 08552 01935 07111 01196 07671
Muestra 3 9896 09843 2716 09021 02113 0686 01595 07718
Muestra 4 589 0988 163 09213 02096 07191 01341 07988
Muestra 5 7526 09679 2046 08705 02096 07026 01449 07671
Promedio 6704 0972 1830 0880 0204 0700 0136 0770
DS 2044 0013 0567 0031 0009 0017 0016 0019
CV () 3049 134 3097 355 436 237 1211 251
103
Tabla 16 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 04B en tres medios de
disolucioacuten
Figura 2
Al igual que en el producto 04B el modelo que mejor describe el comportamiento frente a la
disolucioacuten en todos los casos es el modelo difusional de Higuchi por las mismas razones
mencionadas anteriormente
Muestra 06B
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 2 pH 4 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 127 085 210
05 215 157 390
1 351 275 678
2 609 471 1007
3 778 630 1233
4 965 746 1417
5 1112 889 1518
6 1140 858 1619
7 1256 1069 1729
9 1433 1265 1857
104
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos condiciones
(plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1012 y 14)
313 Muestra 01C
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
Tabla 17 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 4
Tabla 18 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 4
Muestra 01 C pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 000 000 1289 000 000 000 215 5262 24495
05 1585 1656 1368 1599 1471 1309 1498 1387 926
1 1807 1911 1533 1860 1747 1603 1743 1482 850
2 2050 2358 2206 2295 2542 1795 2208 2595 1175
3 2277 2475 2412 2905 2639 2423 2522 2210 876
4 2869 3170 3020 3208 3148 2348 2961 3249 1097
5 2812 3132 2962 3882 3403 2808 3166 4158 1313
6 3083 3957 3335 4289 3987 3101 3625 5168 1425
7 3622 3983 3503 4234 4004 3297 3774 3554 942
9 3849 4170 3890 4249 3945 3732 3973 1982 499
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 10114 09613 2731 09721 0105 09485 0103 09595
Muestra 2 1193 09568 3178 09413 0112 09115 0113 09246
Muestra 3 11319 09846 2976 09439 012 0873 0116 08999
Muestra 4 13571 09511 3536 08953 0122 08576 0124 08732
Muestra 5 12195 09542 3157 08868 1117 08286 0116 08516
Muestra 6 10565 09766 2843 09745 0119 09264 0113 09465
Promedio 11616 09641 3070 09357 0283 08909 0114 09092
DS 12413 00135 0287 00373 0409 00454 0007 00421
CV () 1069 140 935 399 14473 510 595 463
105
Tabla 19 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74
Tabla 20 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
Tabla 21 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol 01C a pH 74 + LSS
Muestra 01 C pH 74
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 1040 964 836 927 000 000 628 4907 7816
05 1329 1181 789 1225 000 865 898 4884 5437
1 1845 1535 1483 1596 1597 1618 1612 1243 771
2 2978 2403 2228 2467 2605 2616 2550 2539 996
3 3147 2731 2304 2833 3667 2987 2945 4546 1544
4 3554 3182 3144 3228 4102 2559 3295 5100 1548
5 3827 3518 3436 3229 4185 3403 3599 3477 966
6 4000 3935 3725 3472 3684 4063 3813 2248 589
7 4178 4217 4201 3631 3644 4143 4002 2836 709
9 4429 4087 4283 4512 4237 4341 4315 1493 346
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 14114 09621 3824 08603 0149 07449 0145 07858
Muestra 2 14188 09756 3912 09017 0163 08092 0155 08451
Muestra 3 1532 09805 4282 09312 0192 081 0178 08588
Muestra 4 13411 09771 3732 09213 0157 08032 0148 08485
Muestra 5 11349 06714 2542 05467 0089 05216 0091 05319
Muestra 6 14903 09305 3866 08617 0156 07284 0149 07836
Promedio 13881 09162 3693 08372 0151 07362 0144 07756
DS 14068 01213 05947 01453 00339 01109 00287 01238
CV () 1013 1324 1610 1736 2243 1506 1991 1596
Muestra 01 C pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 143 166 145 859 171 136 270 2890 10707
05 704 168 727 146 173 138 343 2894 8448
1 1921 784 719 920 1595 1408 1225 4896 3998
2 2264 1403 1797 1640 2043 1936 1847 3042 1647
3 2630 3089 2342 3000 2158 2644 4040 1528
4 3406 3801 2437 3303 3187 2449 3097 5473 1767
5 3755 3864 2873 3610 3395 2422 3320 5623 1694
6 4461 4706 3123 4266 3301 2938 3799 7647 2013
7 4670 4881 3532 4084 4460 2518 4024 8782 2182
9 4976 5750 3838 4712 4560 3641 4579 7717 1685
106
Tabla 22 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra 01C a pH 74
+ LSS
Tabla 23 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra 01C en tres medios de
disolucioacuten
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 19311 09767 5349 0912 0286 05875 0235 07269
Muestra 2 24177 09772 6808 09431 0394 07306 03121 08258
Muestra 3 1487 09832 4132 09241 02815 06548 0216 07738
Muestra 4 18688 09471 5222 08999 0292 06268 0239 07551
Muestra 5 1803 09573 5017 09022 03298 06203 0251 07303
Muestra 6 12721 09112 3507 08363 0315 05865 0216 06739
Promedio 17966 0959 5006 0903 0316 0634 0245 07476
DS 39498 00271 11334 00363 00423 00537 00357 00510
CV () 2198 282 2264 402 1337 847 1456 682
Muestra 01C
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 215 628 270
05 1498 898 343
1 1743 1612 1225
2 2208 2550 1847
3 2522 2945 2644
4 2961 3295 3097
5 3166 3599 3320
6 3625 3813 3799
7 3774 4002 4024
9 3973 4315 4579
107
Figura 3
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi por las mismas razones mencionadas anteriormente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas entre todas las cineacuteticas (plt005)
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 tampoco fue posible en este caso por no cumplir con los
requisitos de variabilidad para la aplicacioacuten del meacutetodo (ver CV tablas 1719 y 21)
No es posible identificar una tendencia general en la liberacioacuten de florfenicol desde las muestras
enfrentadas a diferentes medios de disolucioacuten En la muestra 04B se observa una fuerte
influencia del medio aacutecido situacioacuten que no se replica en la muestra 06B Una situacioacuten
semejante ocurre con la inclusioacuten de laurilsulfato de sodio en el medio de disolucioacuten
32 Influencia de las caracteriacutesticas del medio de disolucioacuten en la liberacioacuten de
oxitetraciclina
Muestra OTC M1 020 (en las tablas y figuras OTCM1)
Las tablas siguientes muestran los perfiles de disolucioacuten en los 3 medios de disolucioacuten
ensayados y los correspondientes anaacutelisis de los modelos de disolucioacuten
108
Tabla 24 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 4
Tabla 25 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 4
Tabla 26 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74
OTCM1 pH 4
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 342 342 342 342 342 293 334 0199 597
05 980 1029 1029 1078 980 1077 1029 0435 423
1 2256 1964 2257 2355 2305 2306 2240 1404 627
2 4954 4951 5052 5004 4809 5248 5003 1450 290
3 7034 6741 7084 7084 6593 7184 6953 2316 333
4 8424 8274 8278 8570 7833 8523 8317 2667 321
5 8439 9120 9169 9465 8725 9611 9088 4420 486
6 10001 9764 9960 10061 10053 10355 10032 1917 191
7 10360 10357 10408 10507 9579 10851 10344 4179 404
9 11095 10705 11096 10902 10062 11003 10811 3949 365
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 46030 0976 12810 0894 0325 0660 0343 0760
Muestra 2 46432 0971 12697 0883 0326 0661 0344 0760
Muestra 3 47650 0976 12880 0890 0323 0657 0343 0757
Muestra 4 47084 0968 12831 0875 0320 0649 0341 0748
Muestra 5 43777 0962 11906 0866 0316 0648 0330 0743
Muestra 6 48158 0968 13118 0874 0330 0637 0348 0742
Promedio 46522 09701 12707 08803 0323 06520 0342 07516
DS 15524 00055 04163 00105 00048 00093 00062 00083
CV () 334 056 328 119 148 142 181 110
OTCM1 pH 7 fosfato
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 244 342 342 293 244 098 260 0909 3491
05 735 834 834 735 735 343 702 1827 2601
1 2009 1913 2059 1814 1863 1078 1789 3603 2014
2 4073 3730 3879 3729 3730 3038 3697 3499 946
3 5511 4873 5656 5264 5264 4866 5239 3232 617
4 6113 5813 6212 5671 5768 5618 5866 2420 413
5 6116 6560 6310 10215 10311 7902 21612 2735
6 10498 10121 9785 10172 10557 10559 10282 3112 303
7 10171 9971 9674 9581 9877 10610 9981 3732 374
9 10068 9920 9672 10159 10700 10104 3805 377
109
Tabla 27 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74
Tabla 28 Perfiles de disolucioacuten () de la muestra de florfenicol OTC M1 020 a pH 74 + LSS
Tabla 29 Resultados de la aplicacioacuten de los modelos cineacuteticos expresados como constantes
de velocidad de disolucioacuten (K) y coeficiente de determinacioacuten (R^2) a la muestra OTC M1 020
a pH 74 + LSS
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 45213 09608 12513 09109 0349 06785 0354 07958
Muestra 2 42895 0946 12139 09221 0332 07361 0344 08365
Muestra 3 41833 09628 11678 09131 0325 07038 0334 08043
Muestra 4 43318 09544 12238 09271 0346 07225 0352 08284
Muestra 5 48045 09385 13441 0894 0367 0705 0375 08099
Muestra 6 5515 09358 17534 09572 0601 07792 0548 08995
Promedio 46076 09497 13257 09207 0387 07209 0384 08291
DS 49535 00114 21754 00212 01061 00346 00813 00377
CV () 1075 120 1641 230 2745 480 2116 455
OTCM1 pH 74 + LSS
Temperatura 10 degC
Tiempo (h) Vaso 1 Vaso 2 Vaso 3 Vaso 4 Vaso 5 Vaso 6 Prom DS CV()
disuelto
025 488 439 439 488 488 390 456 0399 875
05 1128 1079 981 1177 1128 980 1079 0821 761
1 2355 2208 1963 2356 2160 1817 2143 2162 1009
2 4614 4612 4268 4809 4514 3973 4465 2984 668
3 5957 6103 5660 6300 6102 5510 5939 2987 503
4 6899 7242 6651 7098 7144 6162 6866 4039 588
5 7495 7742 7345 7643 7888 6754 7478 4017 537
6 7892 8285 7743 8235 8286 7200 7940 4276 538
7 8140 8632 7992 8485 8584 7693 8254 3746 454
9 8484 8978 8385 8683 8880 7991 8567 3609 421
Modelo Higuchi Oden cero Orden uno Raiacutez cuacutebica
K (h^12) R^2 K (h) R^2 K (1h) R^2 K (^13h) R^2
Muestra 1 34884 09562 9405 08459 0268 06481 0278 07277
Muestra 2 37548 09624 10173 08598 0284 06564 0296 07399
Muestra 3 35151 09627 9534 0862 0284 06688 0290 07475
Muestra 4 36063 09518 9706 0839 0269 06438 0282 07228
Muestra 5 37302 09603 10105 08577 0278 06679 0292 07461
Muestra 6 33263 0967 9047 08706 0286 06672 0285 07508
Promedio 35702 09601 9662 08558 0278 06587 0287 07391
DS 16137 00054 04290 00115 00081 00109 00066 00114
CV () 452 056 444 134 292 166 232 155
110
Tabla 30 Valores promedio de los perfiles de disolucioacuten de la muestra OTC M1 020 en tres
medios de disolucioacuten
Figura 4
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos es el
modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde un sistema
matricial
No se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 4 y 74
Siacute se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas entre las muestras a pH 74 + LSS
y las otras dos (plt 005)
OTCM1
Temperatura 10degC
Tiempo (h) pH 4 pH 74 pH 74 + LSS
disuelto disuelto disuelto
025 334 260 456
05 1029 702 1079
1 2240 1789 2143
2 5003 3697 4465
3 6953 5239 5939
4 8317 5866 6866
5 9088 7902 7478
6 10032 10282 7940
7 10344 9981 8254
9 10811 10104 8567
111
La aplicacioacuten del factor de similitud f2 no fue posible porque a diferencia de los otros modelos
probados trabaja con el promedio de los valores para cada tiempo de disolucioacuten por lo que
establece una variabilidad maacutexima que no puede sobrepasarse (CV maacuteximo de 15 en los
tiempos tempranos y 10 en los otros tiempos) situacioacuten que en este caso estuvo cerca de
cumplirse pero no en todas las condiciones experimentales lo que hizo inviable su aplicacioacuten
(ver CV en la tabla 26)
Hasta este momento se tiene una muestra de oxitetraciclina procesada bajo 3 de las 4
condiciones de medios de disolucioacuten por lo que auacuten no es posible obtener alguna conclusioacuten
de tipo general
112
OBJETIVO 4 VERIFICAR LAS DOSIS Y RITMO HORARIO DE OXITETRACICLINA Y
FLORFENICOL QUE ASEGURE LA EFICACIA CLIacuteNICA DE ESTOS FAacuteRMACOS
UTILIZANDO EL MODELO FARMACOCINEacuteTICOFARMACODINAacuteMICO (PKPD) ETAPA 1
Al analizar las concentraciones plasmaacuteticas en funcioacuten del tiempo se puede observar que en
los grupos en el cual el antibioacutetico se administroacute en una dos o tres raciones al diacutea las
concentraciones plasmaacuteticas de florfenicol + florfenicol amina se mantuvieron en
concentraciones entre 5 a 10 microgml durante los tres diacuteas de estudio No se observaron
diferencias significativas entre los grupos Situacioacuten semejante ocurrioacute cuando florfenicol se
administroacute viacutea intraperitoneal (inyectable) en dosis uacutenica
No ocurrioacute lo mismo cuando florfenicol se administroacute en micro raciones ya que a las 4 horas
despueacutes de finalizada la terapia del primer diacutea (T 4) las concentraciones plasmaacuteticas superaron
los 15microgml Estas concentraciones se mantuvieron hasta las 6 horas despueacutes de finalizado el
uacuteltimo diacutea de tratamiento (T 12) bajando a niveles cercanos a 5 microgml veinticuatro horas
despueacutes de finalizado el uacuteltimo tratamiento (T14)
En la figura1 se muestra el comportamiento de florfenicol (FF) + florfenicol amina (FFA) a nivel
plasmaacutetico de todos los grupos experimentales
Figura 1 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias
Para definir los Iacutendices de eficacia se consideroacute
El ABC
Una CMI cliacutenica de 1 microgml
Tiempo en que las concentraciones plasmaacuteticas se encuentran sobre la CMI
113
En la Figura 2 se muestra se muestra el comportamiento de florfenicol + florfenicol amina a
nivel plasmaacutetico hasta las 24 horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento
medicado
En el Cuadro Ndeg1 se sentildealan los Iacutendices de eficacia para cada grupo experimental
Figura 2 Concentraciones plasmaacuteticas de FF+FFA a diferentes pautas horarias hasta las 24
horas despueacutes de haber administrado la uacuteltima dosis de alimento medicado
Figura 3 Concentraciones Miacutenimas Inhibitorias de florfenicol frente a P salmonis
114
Cuadro Ndeg 1 Iacutendices de eficacia para florfenicol administrado en diferentes pautas horarias
Pauta de Administracioacuten Iacutendice de Eficacia
ABC96h MIC T gt CMI
Dosis en 1 racioacuten al diacutea 34222 h 100
Dosis en 2 raciones al diacutea 47864 h 100
Dosis en 3 raciones al diacutea 34840 h 100
Dosis en micro-raciones 101670 h 100
Dosis inyectable 20517 h 896
Si se analizan los iacutendices de eficacia en todos los grupos experimentales aun cuando todos
estaacuten sobre los valores sentildealadores en la literatura estos Iacutendices son significativamente
mayores cuando el alimento medicado se administra en micro-raciones
Por otro lado podriacuteamos sentildealar que florfenicol administrado viacutea inyectable no muestra
diferencias significativas en las concentraciones plasmaacuteticas si se comparan los grupos
experimentales con una dos y tres raciones al diacutea
Anaacutelisis de los resultados
Considerando que el objetivo central de este proyecto es ldquoEstablecer las Bases para el buen
uso de antimicrobianos en la salmoniculturardquo con el fin de disminuir el uso de antibioacuteticos
pero sin disminuir o arriesgar la eficacia de estos faacutermacos podriacuteamos sentildealar que la
forma y pauta de administracioacuten de un antibioacutetico a una misma dosis y viacutea de administracioacuten
influye considerablemente en la Biodisponibilidad de estos faacutermacos siendo las micro-
raciones la forma maacutes adecuada de administrar alimento medicado con florfenicol
Esto podriacutea explicarse debido a que en el caso de los peces el tiempo de vaciado gaacutestrico es
una funcioacuten directa del nivel de consumo de alimento aumentando exponencialmente la
evacuacioacuten gaacutestrica cuando la ingesta de alimento aumenta
Lo expuesto nos permite sentildealar que la dosis de florfenicol podriacutea ser menor a 20mgKg cuando
el alimento medicado se administra en forma de micro-raciones
115
CONCLUSIONES
Objetivo 1
Los estudios PKPD para definir las dosis de oxitetraciclina o florfenicol a traveacutes de los
Iacutendices de Eficacia deberiacutean usar los valores de la CMI Cliacutenica sentildealada en este proyecto
La CMI Cliacutenica para oxitetraciclina es le 2 microgml
La CMI Cliacutenica para florfenicol es le 1 microgml
Los laboratorios que realizan estudios de sensibilidad deberiacutean considerar ademaacutes estos
puntos de corte para las bacterias sensibles Las bacterias resistentes deberiacutean definirse
en concentraciones ge2 microgml para florfenicol y ge 4 microgml para oxitetraciclina
Objetivo 2
Para el caso de las premezclas de florfenicol y oxitetraciclina la mayoriacutea de las premezclas
cumpliriacutean con la potencia microbioloacutegica esperada
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje de premezclas no
cumplen con la pureza declarada siendo estas mayores a la declarada para florfenicol y
menores a la declarada para oxitetraciclina
Las empresas de alimento al no conocer esta dispersioacuten de la pureza de antibioacutetico
declarado en la premezcla involuntariamente estaacuten colocando mayor cantidad de estos
faacutermacos en los alimentos en relacioacuten a lo solicitado por los Meacutedicos veterinarios en la
prescripcioacuten
La sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los
Meacutedicos Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces
destinados para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los
niveles maacuteximos permitidos Debido a esto se favorece el impacto negativo sobre el medio
ambiente ya que el alimento medicado no ingerido por los peces es eliminado al medio
acuaacutetico
En condiciones extremas de temperatura y humedad los alimentos medicados mantuvieron
la cantidad de principio activo dentro de un margen aceptable (sobre el 90)
De acuerdo a los resultados se puede concluir que un porcentaje alto de alimentos
medicados no cumplen con las cantidades de antibioacuteticotonelada de alimentos declarados
en la etiqueta
Los Meacutedicos Veterinarios al no conocer la dispersioacuten entre la cantidad de antibioacutetico
declarado en al alimento y la cantidad real pueden estar involuntariamente sub-dosificando
o sobre-dosificando a los peces en una terapia antimicrobiana
La sub-dosificacioacuten puede generar principalmente fracaso terapeacuteutico Por otro lado la
sobredosificacioacuten puede ser un riesgo para la salud puacuteblica ya que aun cuando los Meacutedicos
Veterinarios respeten los periacuteodos de resguardo correspondientes los peces destinados
para consumo humano pueden tener concentraciones de faacutermaco sobre los niveles
maacuteximos permitidos
116
La sub-dosificacioacuten o sobre-dosificacioacuten con antibioacuteticos de forma involuntaria por parte de
los Meacutedicos veterinarios puede ser una de las causas de la generacioacuten de bacterias
resistentes
La elaboracioacuten de alimento medicado con inclusioacuten de antibioacutetico en cantidades
preestablecidas es una solucioacuten para disminuir el tiempo de llegada del alimento medicado
a los centros de cultivos
El estado deberiacutea definir los criterios de inclusioacuten en alimentos premedicados
La seleccioacuten del antibioacutetico es responsabilidad del Meacutedico Veterinario del centro de cultivo
Actualmente la planta de alimento es quien compra el antibioacutetico apoyado con una PMV
Esta situacioacuten no cumple con la finalidad de una PMV
Objetivo 3
Florfenicol
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con el tipo de liberacioacuten
observado experimentalmente
El anaacutelisis estadiacutestico de la constante de velocidad del modelo de Higuchi arrojoacute diferencias
estadiacutesticamente significativas (plt005) para la muestra 04B entre la cineacutetica a pH 2 y todas
las otras condiciones para la muestra 06B entre la cineacutetica a pH 74 + LSS y las otras dos
condiciones y para la muestra 01C entre todas las cineacuteticas
Oxitetraciclina
El modelo que mejor describe el comportamiento frente a la disolucioacuten en todos los casos
es el modelo difusional de Higuchi lo que estaacute de acuerdo con un tipo de liberacioacuten desde
un sistema matricial
Objetivo 4
Disminuir la dosis de florfenicol cuando se administra en el alimento en forma de micro-
raciones
Realizar estudios que permitan determinar la dosis maacutes adecuada de florfenicol cuando se
administra en el alimento en forma de micro-raciones
Realizar estudios PKPD con alimento medicando con oxitetraciclina administrado en forma
de micro raciones
117
RECOMENDACIONES
Incrementar los controles de potencia microbioloacutegica en los lotes que se van a comercializar
Incrementar los controles en las diferentes etapas de elaboracioacuten de las premezclas
Solicitar estudios de estabilidad de las premezclas a diferentes temperaturas
Realizar controles regulares de las premezclas por parte de los organismos reguladores
Solicitar a la industria farmaceacuteutica la tolerancia real de la pureza controlada por lote
Mejorar las reglamentaciones nacionales sobre los alimentos medicados especiacuteficamente
en relacioacuten a la tolerancia permitida en la cantidad de antibioacutetico declarado en los alimentos
Realizar controles regulares de los alimentos medicados por parte de los organismos
reguladores
Solicitar a las empresas elaboradoras de alimento declarar la cantidad real de antibioacutetico en
la etiqueta avalada por controles internos Esto permitiriacutea al meacutedico veterinario adaptar sus
dosis
Incorporar un criterio de aceptacioacuten de homogeneidad del alimento medicado el cual podriacutea
tener una dispersioacuten de un 5 a un 15
Para los antimicrobianos se recomienda como liacutemite maacuteximo de transferencia un 1 del
principio activo del uacuteltimo lote medicado
Los piensos medicados deben estar sometidos a un control regular incluida el control
mediante pruebas de laboratorio para comprobar que cumplen con lo establecido por los
organismos reguladores correspondientes
118
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121
ANEXOS
ANEXO 1 PROGRAMA PILOTO DE PRESCRIPCIONES MEacuteDICO VETERINARIAS EN
LIacuteNEA PARA TERAPIAS ANTIMICROBIANAS EN AGUA DE MAR
Introduccioacuten
La Prescripcioacuten Meacutedico Veterinaria (PMV) es una orden suscrita por un Meacutedico Veterinario con
el fin de que una cantidad de cualquier medicamento o mezcla de ellos sea dispensada
conforme a lo sentildealado por el profesional que la extiende
Numerosos estudios indican que existen frecuentes errores de prescripcioacuten que atentan contra
el restablecimiento de la salud de los animales siendo algunos de los maacutes habituales recetar
una dosis inapropiada y la duracioacuten inadecuada del tratamiento
En el aacutembito de la salmonicultura nacional no existe un formato uniforme para las PMVs
emitidas por los Meacutedicos Veterinarios ni tampoco se tiene la seguridad de que la informacioacuten
contenida en ellas sea transcrita por los mismos profesionales al Sistema de Informacioacuten para
la Fiscalizacioacuten de Acuicultura (SIFA) de SERNAPESCA Esta situacioacuten incrementa el riesgo
de cometer errores en el registro oficial de la informacioacuten y ademaacutes mantiene como incoacutegnitas
las variables y valores considerados para el caacutelculo de dosis de los faacutermacos administradas a
los peces
Por otro lado no existe un control de venta de antimicrobianos por parte de la industria
farmaceacuteutica que pueda ser contrastado con las PMVs emitidas dificultando la trazabilidad en
la cadena de prescripcioacuten de estos faacutermacos y el aseguramiento de las Buenas Praacutecticas en el
Uso de Medicamentos Veterinarios
Objetivos
Implementar un formato oficial para la generacioacuten online de PMVs de antimicrobianos
en acuicultura
Integrar la generacioacuten de las PMVs y el registro oficial de la informacioacuten contenida en
ellas en un solo proceso de entrega de datos
Obtener informacioacuten relevante sobre las terapias antimicrobianas utilizadas en un lapso
de tiempo que permita corregir los problemas de manera oportuna
Facilitar la trazabilidad del uso de antimicrobianos en la salmonicultura
Obtener informacioacuten histoacuterica de las terapias antimicrobianas utilizadas para poder
realizar anaacutelisis de las praacutecticas terapeacuteuticas empleadas por los MV
122
Metodologiacutea
Se elaboroacute la plataforma online PMV ANTIMICROBIANOS AGUA SALADA a la que se puede
acceder mediante la direccioacuten web ldquopmvsernapescaclrdquo Una vez creada se realizaron
modificaciones en base a solicitudes de SERNAPESCA y considerando ademaacutes las
sugerencias hechas por 36 Meacutedicos Veterinarios pertenecientes a las industrias salmoneras
farmaceacuteuticas y elaboradoras de alimentos medicado
Tras varias reuniones con los diferentes actores involucrados en la prescripcioacuten de
antimicrobianos en la salmonicultura se llegoacute a la versioacuten actual de la plataforma que recaba
los datos utilizados para la elaboracioacuten de las PMVs junto con informacioacuten relevante para
realizar un completo anaacutelisis sobre el uso de estos faacutermacos en la acuicultura
123
ANEXO 2 OBJETIVO 1 - CMI OBTENIDA PARA CADA CEPA ANALIZADA
