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Inmunotipicacin de linfoma canino

y su relacin con el pronstico clnico

Mnica Aristizbal-Arbelez1, Lina Osorio-Morales1, Francisco Pedraza-Ordez1, 2

1Grupo de Investigacin en Patologa Veterinaria, Universidad de Caldas, Manizales, Colombia.2Departamento de Salud Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas.

Manizales, Colombia.

[email protected]

(Recibido: octubre 5, 2010; aprobado: noviembre 24, 2010)

RESUMEN: El linfoma canino ha sido til como modelo animal en los linfomas no Hodgkin de loshumanos. En este trabajo se relatan cinco casos de linfoma maligno (linfosarcoma) en caninos que murieron

por causa de la enfermedad. Los casos fueron inmunomarcados utilizando anticuerpos mono y policlonalescontra antgenos de supercie de Linfocitos T y B con el n de clasicar las neoplasias y establecer parmetrosde pronstico alrededor de esta caracterstica celular. Dos casos fueron clasicados como originarios de lasclulas T y ninguno originado en las clulas B. Se discute sobre la posibilidad de utilizar la inmunomarcacinen futuros casos donde se pueda establecer criterios de pronstico y tratamiento en los pacientes afectados porlinfoma canino.

Palabras clave:anticuerpos, inmunomarcacin, linfosarcoma, neoplasias, perros

Immunophenotyping of canine lymphomaand relationship with clinical prognosis

ABSTRACT:Canine lymphoma has been a useful animal model for non-Hodgkins lymphomas inhumans. Five cases of malignant lymphoma (lymphosarcoma) in dogs that died due to illness are accountedfor in this study. The cases were immuno-labeled using monoclonal and polyclonal antibodies against surfaceantigens of T and B Lymphoid cells in order to attempt the neoplasias classication and to establish prognosticparameters around this cellular characteristic. Two cases were classied as originating from T cells and no onein the B cells. The possibility of using immunohistochemistry in future cases where prognostic criteria andtreatment in patients affected by canine lymphoma can be established is discussed.

Key words:antibodies, immune-labeled, lymphosarcoma, neoplasias, dogs

ARTCULOCORTO

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Introduccin

El linfoma es una de las neoplasias frecuentes en laespecie canina representando el 24,7% (Gavazza

et al., 2008) de las neoplasias de todos lossistemas orgnicos y aproximadamente el 83%de los tumores hematopoyticos (Kaiser, 1981;Jacobs et al., 2002). Debido a que el linfomacanino tiene muchas similitudes con el linfomano Hodgkin (LNH), es un modelo atractivo paralos estudios en humanos (Jamadar et al., 2009;Vail et al., 2009). En humanos, los linfomasHodgkin y los LNH se diferencian, entre otrascaractersticas, porque los primeros muestran lapresencia de unas clulas gigantes (ms de 50

m) denominadas de Reed-Sternberg (Chuaqui& Gonzlez, 2011). Los LNH son ms frecuentesy el riesgo de sufrir la enfermedad y morir escada vez mayor, lo que obliga a un tratamientoquirrgico, radioterapia, quimioterapia o terapiabiolgica, para tratar de controlar la enfermedad(Gavazza et al., 2008). Recientemente fuepublicado un artculo sealando que el uso deanimales de compaa aparentemente tieneun efecto benco en el sentido de reducir laprobabilidad de sufrir LNH (Tranah et al., 2008).

Igual como ocurre en humanos, existen variossistemas de clasicacin de tumores linfoidesen los animales domsticos. La denominadaclasicacin de Kiel, actualizada con base acriterios inmunocitolgicos se puede aplicar a lacitologa por aspiracin con aguja na (Fournelet al., 1997), existiendo correlaciones fuertescon la clasicacin de la OMS (Uppenkamp &Feller, 2002; Ponce et al., 2010; Vezzali et al.,2010). Otra clasicacin tiene que ver con elsitio donde se origina, pudiendo ser mediastnico,multicntrico, gastrointestinal y extranodal, esteltimo involucra a los riones, el sistema nerviosocentral, la piel y el corazn, entre otros (Gavazzaet al., 2008). El linfoma multicntrico es el msfrecuente (85% de los casos), se localiza a nivelde los ganglios linfticos pudiendo algunasveces involucrar al hgado, bazo y mdula sea,explicando de esa forma la presentacin de lossignos clnicos inespeccos como anorexia,prdida de peso, vmito, diarrea, poliuria,polidipsia y ebre (Gavazza et al., 2008).

La mayora de los linfomas en los caninosson de grado histolgico alto o intermedio,mientras que el linfoma de bajo grado (menosagresivo) representa cerca del 5% de los casos

(Arespacochaga et al., 2007). Varios factorespronsticos se han reportado en el linfoma canino,entre ellos el gnero (MacEwen et al., 1987), elpeso corporal (Garrett et al., 2002), la presenciade anemia (Miller et al., 2009), el estadio clnico(Hosoya et al., 2007) y el inmunofenotipo(Greenlee et al., 1990).

La inmunotipicacin de linfomas en caninosha permitido en muchos casos la aproximacin

entre el diagnstico y el pronstico, facilitandolas decisiones clnicas de tratamiento o eutanasiade los pacientes, sin embargo, en algunos casosen los que la inmunotipicacin no fue posible,el diagnstico clsico morfolgico fue la nicaopcin para establecer ese factor pronstico(Arespacochaga et al., 2007).

El estudio tuvo como objetivo analizar lasposibles diferencias en la expresin de receptoresde membrana que permitieran clasicar los casos

de linfoma en dos grupos (clulas B o clulas T)y comparar esa expresin con la condicin demalignidad de los diagnsticos obtenidos.

Material y Mtodos

Animales y tipo de estudio

Se realiz un estudio retrospectivo utilizando elarchivo del Laboratorio de Patologa Veterinariade la Universidad de Caldas, donde se encontrarondieciocho casos registrados con el diagnsticode Linfoma canino entre el ao 2000 y el 2008.Once casos presentaron datos clnico-patolgicoscompletos, de los cuales ocho caninos habanmuerto o fueron eutanasiados por causa de laenfermedad avanzada y ninguno haba recibidotratamiento. De estos ltimos, solo de cincocasos se tena archivo de tejidos conservadosen bloques de parana y nalmente fueron

usados para la presente investigacin. Todos losanimales fueron atendidos por consulta externa


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en el Hospital Veterinario de la Universidadde Caldas por manifestar decaimiento general,inapetencia, aumentos de volumen en nodoslinfoides en diferentes partes del cuerpo y en la

piel. El criterio diagnstico incluy radiografas,biopsias por aspiracin con aguja na y nalmentehistopatologa a partir de especmenes obtenidosen las necropsias.

Estudio inmunohistoqumico

El estudio inmunohistoqumico fue realizado enel Laboratorio de Patologa de la UniversidadEstadual Paulista (FCAV-UNESP), en Sao Paulo,

Brasil, de acuerdo a la tcnica estandarizadaen el Laboratorio de Neuropatologa (Pedrazaet al., 2008). Los anticuerpos primarios, lossecundarios y el tipo de recuperacin antignicase resumen en la Tabla 1. Los cortes de tejidofueron desparanados por calor y colocados enbaos de alcohol en concentraciones decrecientes

para deshidratarlos. Posteriormente se utiliz unbloqueador de peroxidasa endgena (Dako)durante 20 minutos. Los cortes fueron baadosen solucin tampn de salina fosfato (PBS)

e incubados por 30 minutos en una solucinde albmina srica bovina en PBS al 2,5%para bloquear protenas inespeccas. Tresincubaciones se realizaron seguidas cada una pordos lavados con PBS; primero, con el anticuerpoprimario especco para cada antgeno celular;segundo, con un anticuerpo secundario biotiniladodirigido contra el anticuerpo primario; y tercero,con el complejo avidina-biotina (Dako) diluidoen PBS durante 30 minutos a 30C. El complejo

se revel con la adicin de 3,3 diaminobenzidina.Finalmente los cortes fueron contra coloreadoscon hematoxilina de Harris, deshidratados porel paso en varios alcoholes crecientes, aclaradoscon xilol y montados con blsamo de Canad.

Tabla 1. Relacin de anticuerpos utilizados para detectar dos poblaciones de linfocitos

en tejido neoplsico linfoide de caninos.

Reactivacin /

Recuperacin

Antignica

Anticuerpos

primarios

Dilucin /

Tiempo

Anticuerpos

secundarios

Dilucin /

Tiempo

Stem Cock 1

Pronasa 2

Antilinfocito BNCL-BLA 36 3

Antilinfocito TCD

34 a

1:20012-18 horas

1:1002 horas

Cabra anti-ratn b

Cabra anti-conejo c

1:20045 minutos

1:30045 minutos

1Stem cock, 20 minutos (solucin de citrato pH 6,0). 2Recuperacin enzimtica, 15 minutos.3Anticuerpo monoclonal.4Anticuerpo policlonal.a Dako A0452.bDako E0433.cDako E0432.

Resultados y Discusin

Todos los casos fueron considerados de altamalignidad, tanto por la clasicacin morfolgicade las neoplasias como por la condicin clnicade los pacientes que nalmente murieron porcausa de la enfermedad. La inmunodeteccin,usando anticuerpos contra el antgeno CD

3 de

la supercie celular de Linfocitos T,permitila localizacin de este tipo de clulas en un altogrado de inltracin en dos de los cinco casos,

diagnosticados histopatolgicamente comolinfoma, uno de ellos con metstasis a variosrganos. Los Linfocitos B evidenciados por ladeteccin del antgeno BLA, fueron encontradossolo en un caso que haba sido tambin positivoa la marcacin de CD

3, sin embargo, por el

escaso conteo de linfocitos marcados (calculadoen menos del 5% de la proporcin) se considernegativo (Figura 1 y Tabla 2), aunque existenreportes de linfomas linfoblsticos T quedemuestran expresin conjunta de CD

3 y CD

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(usado para Linfocitos B) en la misma clula(Sapierzyski, 2010). Los restantes tres casos,un linfoma, un linfoma multicntrico y unlinfosarcoma multicntrico linfoblstico, fueron

negativos para la deteccin de ambos marcadoresy fueron clasicados como linfomas no B/no T. Lomismo ha ocurrido en LNH en humanos, dondese atribuye que el origen de este tipo de linfomases a partir de clulas naturales asesinas (NK);

para su conrmacin, sera necesario utilizarotros anticuerpos especcos para antgenos demembrana de esas clulas, que en humanos sonCD56, CD94 y CD16 (Abbas et al., 1999). Estos

antgenos no han sido utilizados en perros y,por lo tanto, se desconoce si existe una reaccincruzada entre estas especies (Dobson et al., 2001;Thomas et al., 2001).

Figura 1.A: radiografa mostrando un desplazamiento cardaco hacia el quinto y eloctavo espacios intercostales. B: se aprecia en la mano izquierda el corazn y en la

mano derecha un aumento de volumen de aproximadamente el doble de tamao del

corazn. C: coloracin inmunohistoqumica para CD3 (Linfocitos T). D: coloracin

inmunohistoqumica para BLA (Linfocito B).

Tabla 2.Principales datos de los pacientes relatados.

Nmero Raza Sexo EdadD i a g n s t i c o

histopatolgico

Caracterstica

Inmunofenotpica

CD3 BLA00-003

MestizoPastor

Macho 8 aosLinfoma ymetstasis

Positivo Negativo

Boxer Macho 6 aos Linfoma Positivo Negativo *

06-126 Siberiano Hembra 10 aosLinfosarcomamulticntricolinfoblstico

Negativo Negativo

07-097L a b r a d o rdorado

Macho 7 aos Linfoma Negativo Negativo

08-054 Labrador Macho 7 aosLinfomamulticntrico

Negativo Negativo

* Inicialmente positivo, sin embargo, fue considerado negativo por la escasa marcacin contra el antgeno BLA de lasupercie celular del Linfocito B.


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Una segunda posibilidad para que no hubieramarcacin es que su origen fuera a partir declulas precursoras B o inmaduras T, las cualesen este estado no presentan la expresin de los

anticuerpos usados, por lo que sera necesarioutilizar marcadores de membrana especcos,como ocurre en humanos con los CD9 y CD10para precursores B y CD44, CD25 y CD117 paraprecursores T (Abbas et al., 1999).

El control positivo para los dos marcadoresusados en el presente estudio correspondi a unlinfonodo normal de canino, el cual fue procesadocon 12 horas de jacin en una solucin de

formol tamponado en fosfato, mientras que loscasos analizados estuvieron por un periodo detiempo que vari entre los cinco das y los dosmeses en solucin jadora de formol cido, locual podra ser un motivo para ocasionar daosestructurales a los antgenos de membranay de esta forma los anticuerpos no pudieranligarse a ellos, tal vez utilizando otros sistemassimultneos de recuperacin antignica (comola utilizacin de un sistema pascal de presin)los resultados podran variar en este sentido. De

igual forma, el uso de un linfonodo normal comocontrol positivo podra estar relacionado con otraposibilidad para intentar explicar la falla en lautilizacin de estos inmunomarcadores, tal comoest reportado en la literatura, que puede ser lapresencia de linfocitos malignos anaplsicos omal diferenciados que no expresen las mismasmolculas o protenas presentes en las clulasbien diferenciadas (lvarez et al., 2009).

Existen reportes en el sentido de que laclasicacin morfolgica del linfoma caninocomo nico parmetro de pronstico clnico noes adecuada, mientras que la inmunotipicacinha demostrado ser muy til en el diagnstico atravs de identicacin de marcadores especcosen las lneas celulares (Vernau & Moore, 1999).Se sabe que la mayora de linfomas y leucemiasen humanos tienen perles de expresingnica que caracterizan a los diferentes tiposhistolgicos e inmunofenotpicos de linfoma

y leucemia; se pueden identicar diferentessubtipos con base en el perl de expresin gnica

(Alizadeh et al., 2000). En el presente estudiose pudo establecer que los pacientes afectadoscon este tipo de tumores en algunas ocasionesse agravan y terminan muriendo por causa de

la enfermedad, esto es, por la carencia de unprotocolo de manejo que incluya un diagnsticotemprano con un criterio inmunomolecular quefacilite el establecimiento de un pronsticoy permita recuperar algunos casos mediantetratamiento quimioteraputico. En el futuro, estetipo de estudios podran ser realizados con mayorfacilidad, obteniendo as una mejor clasicacindel linfoma canino, con base en las caractersticashistolgicas, inmunofenotpicas y genticas.

Conclusiones

Fue posible marcar Linfocitos T y B en casosde linfoma canino que haban sido archivadosen bloques de parana, lo que permite suponeruna eciente utilizacin de la tcnica deinmunohistoqumica para casos rutinarios en elHospital Veterinario de la Universidad de Caldas.

El linfoma canino en Manizales deber ser mejorestudiado y caracterizado con el n de iniciarprotocolos de tratamiento en pacientes quepuedan ser sometidos a este tipo de terapia.Es necesario proponer investigaciones tendientesa la inmunotipicacin de linfomas caninos,relacionando las diferentes molculas presentesen ellos con el pronstico clnico de los pacientesafectados.

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