Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales Cátedra de Microbiología

Centro Universitario de Paysandú Facultad de Química- Universidad de la República

Laboratorio Tecnológico del Uruguay Montevideo, Uruguay

Influencia de factores experimentales

sobre la degradación

de agroquímicos por

Basidiomicetes

1° Workshop Latinoamericano

en Lechos Biológicos Una oportunidad para Latinoamerica y su medio ambiente

Universidad de La Frontera, Pucón Chile

Mayo 2012

Anisleidy Rivero, Silvina Niell, Lucía Pareja, M.Pía Cerdeiras, Horacio Heinzen ,

Verónica Cesio

1

Buenas prácticas agrícolas

∙Triple enjuague de envases y verter el líquido en un lugar seguro. Resolución MGAP 19 nov 1996

∙ Correcta concentración de aplicación

∙Organización del material

∙Personal capacitado

∙Regulación del flujo de los equipos de aspersión.

Fuentes de polución por pesticidas en las granjas

17 %

8 %

28 %

12 %

10 %25 %

Mud from tractor

wheels

Tractor exterior

washings

Spillage of container

washings

Spillage while

mixing

Tank Rinse

Water

Foil Seals

Results from Year 1 Aventis Cherwell StudyBayer CropScience Cherwell Study

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Selección del par hongo-pesticidas

• Selección de una cepa de Abortiporus

• Se decidió trabajar con endosulfán y clorpirifós como modelo por su uso extendido e insdiscriminado en la agricultura

Porqué de la selección de endosulfán y clorpirifós

• Uso indiscriminado y extendido

• Ambos pesticidas son de amplio espectro

• Características fisicoquímicas

• Regulación referida a endosulfán por ser organoclorado recalcitrante y a clorpirifós por ser un órgano fosforado de elevada toxicidad

Plagas en común

Lagarta cogollera,

Lagarta cortadora,

Lagarta del girasol,

Lagarta del maní,

Lagarta de los cereales

Psila del peral

Pulgón lanígero

Pulgón verde de la papa

Pulgón verde del duraznero

Pulguilla de las solanáceas

Trips de la cebolla

Se aplican en los mismos

cultivos agrícolas :

Soja

Trébol

Lotus

Girasol

Trigo

Cebada

Avena

Manzanero

AMPLIO ESPECTRO

Endosulfán

Koc: Coeficiente de adsorción de carbono orgánico

Koc=11500 No-móvil

Solubilidad α endosulfán=0,32 mgL-1 Baja β endosulfán=0,33 mgL-1

Kow: log P α endosulfán =4,74 Alta

log P β endosulfán=4,79

Kow: Coeficiente de partición octanol-agua

Presión de vapor=0,83 Volátil

Constantes de la Ley de Henry a 25°C=1,48 Volatilidad moderada

IUPAC FOODPRINT Pesticides Properties DATABASE

Endosulfán: Organoclorado

Características físico-químicas ambientales

Potencial de bioacumulación

Mamíferos: Alta

Oral Ratas DL50 70 mgkg-1

Perros DL50 77 mgkg-1

Piel y ojos Conejos DL50 359 mgkg-1 Ratas DL50 500 mgkg-1

Inhalación (4h) Ratas hembra DL50 0,0126 mgkg-1 Ratas macho DL50 0,0345 mgkg-1

Endosulfán

Modo de acción : Acaricida Insecticida no sistémico .Contacto .Ingestión Toxicidad

Invertebrados acuáticos (Daphnia magna) Moderado

DL50=0,44 mgL-1 Algas: DL50=4,15 mgL-1 Moderado

Peces: DL50=0,002 mgL-1 Alto

Europeas

• http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public

• Prohibido su uso 2007

Uruguay

• MGAP

• 2007 restringieron algún tipo de formulado

• 2011 prohibe su uso

Resolución Ministerial Nº 056 del 17 de enero de 2011.

Disposiciones sobre aplicación de productos fitosanitarios formulados a base de ENDOSULFAN.

Regulaciones para endosulfán

Clorpirifós

Koc: Coeficiente de adsorción de carbono orgánico

Koc=8151 No-móvil

Solubilidad clorpirifós=1,5 mgL-1 Baja

Kow: Coeficiente de partición octanol-agua

Presión de vapor=1,43 Volátil

Constantes de la Ley de Henry a 25°C=0,478 Volatilidad moderada

IUPAC FOODPRINT Pesticides Properties DATABASE

Kow: log P clorpirifós=4,7 Alta

Potencial de bioacumulación

Características físico-químicas ambientales

Clorpirifós: Organofosforado

Insecticida

Mamíferos: Alta

Oral Ratas DL50 60 mgkg-1

Piel y ojos Ratas DL50 >1250 mgkg-1

Inhalación Ratas LC50 0,1 mgkg-1

Clorpirifós

Modo de acción : Inhibidor de la Acetilcolinesterasa Insecticida no sistémico . Contacto . Ingestión

Toxicidad

Invertebrados acuáticos(Daphnia magna) Alto

EC50=0,0001 mgL-1 Algas: DL50=0,48 mgL-1 Moderado

Peces: DL50=0,0013 mgL-1 Alto

Europeas

• http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public

• LMRs son definidos por la UE para cada commodity

Uruguay

• Está permitido aún y su MRL esta definido por el Codex Alimentarius

Regulaciones para Clorpirifós

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Importancia de la metodología analítica validada

• Permite conocer exactamente la eficiencia del proceso en evaluación

• Brinda un dato preciso del % de bio-conversión

• Permite determinar los metabolitos productos de la bio-conversión

• Permite determinar la ruta que siguen esos metabolitos intermedios

matriz

Selección del

solvente

Extracción Clean up

Análisis instrumental

Resultados

Proceso

Analítico

Como se desarrolla un nuevo método analítico.

Como se desarrolla un nuevo método analítico.

• Metodología debe cumplir con los parámetros analíticos generales de validación:

PRECISO, EXACTO Y REPRODUCIBLE

Para asegurar la performance del método se valida de acuerdo a guías para determinación de trazas de pesticidas.

Metodologías desarrolladas para dos matrices

Agar en placa y afrechillo de arroz

Matriz libre de

pesticidas

Agregado de

pesticidas

Análisis Recupera

ción & RSD

Efecto matriz Precisión y

exactitud

Ajuste de la metodología

Parámetros de validación

Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Document No. SANCO/10684/2009

• Linealidad

• % Recuperación

• Efecto Matriz

• LOD • LOQ

• Repetitibilidad (DSRr) • Precisión intermedia (DSRwR)

•3 niveles de concentración 1, 25, 50 mgkg-1.

•5 réplicas a cada nivel.

• Se incluyeron los metabolitos clorados intermedios de la ruta de degradación reportada.

Proceso de validación

Endosulfán sulfato

Endosulfán alcohol

Endosulfán éter

Desarrollo de una metodología analítica para evaluar el porcentaje de bioconversión

Validación de la metodología analítica

Stomacher 2 min

Adición de Clorpirifos metil

(Std Interno )

GC-ECD

alícuota AcOEt

Crecimiento en el medio YNB +1%

glucosa+50 mg kg-1 endosulfán

27 DÍAS 28 ºC Rivero et al. J. Chromat BCHROMB-S-12-00461

.

1mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg

Rec (%) % DSRr % DSRwR Rec (%) % DSRr % DSRwR Rec (%) % DSRr % DSRwR

1 Endosulfan

eter 91 4 7 80 8 14 102 3 8

2 Endosulfan

alcohol 78 4 9 103 9 10 112 2 11

3 Endosulfan α 94 4 7 94 8 10 103 4 7

4 Endosulfan β 95 3 9 101 7 7 112 2 5

5 Sulfato de Endosulfan

95 5 7 104 8 6 128 5 11

% Recuperación y RSD

Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. Document No. SANCO/10684/2009

% DSRr: Repetibilidad, Reproducibilidad intermedia: % DSRwR

LOD 0,3 mgkg-1

LOQ 1 mgkg-1

LINEALIDAD

r2 >0,99

Efecto Matriz

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Endosulfan eter

Endosulfan alcohol

Endosulfan α

Endosulfan β

Sulfate endosulfan 1mg/L

25mg/L

50 mg/L

%EM=((pend matriz-pend solvente)/pend solvente)*100

Es la influencia de uno o más componentes no detectados de la muestra en la

medición de la concentración o masa del analito. Se observa como una

respuesta del analito, aumentada o disminuida en el detector cuando se la compara con la producida en la solución de dicho analito en solvente.

Cromatograma de degradación de endosulfán a los 9 y 27 días de crecimiento en placa

27 días

9 días

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Estrategia de trabajo

Biobeds

Selección del par hongo-pesticida

Metodología Analítica

Selección de los

componentes de la matriz

Composición de un Biobed típico

25% turba 50% desecho afrechillo de arroz

25% suelo

Desarrollo de metodología para afrechillo de arroz

• Composición diferente

• Textura distinta

• Medio se debe disgregar todo el agar para asegurarnos recuperar todo el pesticida y eso con el Stomacher se resolvió muy bien

• Paja es heterogénea aun cuando sea un tamaño de partícula definido

• Es mas rígido que el agar que es plástico

• Agar es mas hidrofílico que el afrechillo por lo que la disgregación con un solvente orgánico es mas difícil

• Paja por procesos simples difusión y desorción permite q el solvente orgánico extraiga mejor los pesticidas

Metodologías ensayadas

• Acetato de Etilo en Stomacher

• Acetato de Etilo en shaker

• Acetonitrilo en shaker :

Por las características de su miscibilidad con agua el solvente se mezcla con el agua de la matriz y extrae en una sola fase los analitos de interés

Desarrollo de una metodología analítica para evaluar el porcentaje de bioconversión

Validación de la metodología analítica

Shaker overnight

Adición de

(Std Interno )

GC-ECD

alícuota ACN

Bioconversión de Endosulfán en la matriz Afrechillo de arroz

0

10

20

30

40

50

60

0 30 60 90

Co

n(m

gkg-

1)

Tiempo(días)

Endosulfán α+β

Endosulfánα+β

% Biocon 30 días 60 días 90 días α+ β

Endosulfán 92 90 94

Metabolitos intermedios del endosulfán obtenidos sobre afrechillo de arroz

0

2

4

6

8

10

12

14

0 30 60 90

Co

n(m

gkg-

1)

Tiempo(días)

Endosufán sulfato

Endosulfán éter

Endosulfán alcohol

Bioconversión de Clorpirifós en la matriz afrechillo de arroz

0

10

20

30

40

50

60

70

0 30 60 90

Co

n(m

gkg-

1)

Tiempo(días)

Clorpirifós

Clorpirifós

% Biocon 30 días 60 días 90 días

Clorpirifós 74 81 87

Evolución de la biotransformación de endosulfán y clorpirifós a los 9 y 27 días de

crecimiento

clorpirifos Endosulfan

α y β

Endosulfan

sulfato

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

α Endosulfán β Endosulfán Clorpirifós α β Endosulfán

% d

e d

egra

dac

ión

60 días(s/ recambio de aire)

60 días(c/ recambio de aire)

Efecto de la aireación sobre la PERFORMANCE DE LA BIOCONVERSION

Conclusiones

• Se validó una metodología para la determinación de endosulfán y clorpirifós en medio YNB con 1% de glucosa de acuerdo al documento SANCO

• La cepa de Abortiporus seleccionada fue capaz de biotransformar 75 % de endosulfán (83 % de α y 93 % de β endosulfán) a los 27 días de crecimiento en el medio YNB con 1% de glucosa

• Se validó una metodología para la determinación de endosulfán y clorpirifós en afrechillo de arroz

• La cepa de Abortiporus seleccionada fue capaz de biotransformar a los 90 días; 94% de endosulfán α + β y 87 % de clorpirifós

• La aireación del sistema provoca una degradación mas rápida y efectiva de los pesticidas del estudio en las condiciones ensayadas.

∙Facultad de Química-Universidad de la República ∙LATU ∙PEDECIBA Química ∙ANII Proyecto ANII_PR_Fondo María Viñas_2009_1_2942 •Proyecto PDT 65/16

•Cátedra de Microbiología

•Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales

Agradecimientos