lineamientos para la vigilancia epidemiológica de tos ... · tos ferina y síndrome coqueluchoide...

Direccin General de Epidemiologa

Instituto de Diagnstico y referencia EpidemiolgicosDr. Manuel Martnez Bez

lineamientos para la vigilancia epidemiolgicade tos-ferina y sndrome coqueluchoide

por laboratorio

Tos Ferina y Sndrome Coqueluchoide RNLSP/InDRE Pgina 1 de 91

Versin No.01

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DE TOS-FERINA Y SNDROME COQUELUCHOIDE POR

LABORATORIO

DGE-InDRERNLSP 2015

Fotografa de la portada propiedad HKS Arquitectos


Versin No.01

PRIMERA EDICIN, 2015 TOS FERINA Y SNDROME COQUELUCHOIDERNLSP ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE CONFORMAN EL GRUPO TCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMIT NACIONAL PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA (CONAVE). TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY, INDRE-DGE-SECRETARA DE SALUD SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DE TOS-FERINA Y SNDROME COQUELUCHOIDE POR LABORATORIO. VERSIN NO. 01. INDRE, 2015. COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE: ISBN: EN PROCESO INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS DR. MANUEL MARTNEZ BEZ. FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. LVARO OBREGN, C. P. 01480, MXICO, D. F. WWW.INDRE.SALUD.GOB.MX TEL. (55)53-42-75-50 LA EDICIN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ EL DISEO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LPEZ IMPRESO EN MXICO. PRINTED IN MEXICO

http://www.indre.salud.gob.mx/


Versin No.01

SECRETARA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LPEZ SECRETARIA DE SALUD

DR. EDUARDO GONZLEZ PIER

SUBSECRETARIO DE INTEGRACIN Y DESARROLLO DEL SECTOR SALUD

DR. PABLO ANTONIO KURI MORALES SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD

LIC. MARCELA GUILLERMINA VELASCO GONZLEZ

SUBSECRETARIA DE ADMINISTRACIN Y FINANZAS

DR. GABRIEL OSHEA CUEVAS COMISIONADO NACIONAL DE PROTECCIN SOCIAL EN SALUD

LIC. MIKEL ARRIOLA PEALOZA

COMISIONADO FEDERAL DE PROTECCIN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

DR. JOS MELJEM MOCTEZUMA COMISIONADO NACIONAL DE ARBITRAJE MDICO

DR. GUILLERMO MIGUEL RUIZ-PALACIOS Y SANTOS

TITULAR DE LA COMISIN COORDINADORA DE INSTITUTOS NACIONALES DE SALUD Y HOSPITALES DE ALTA ESPECIALIDAD

LIC. RODRIGO REINA LICEAGA

TITULAR DE LA UNIDAD COORDINADORA DE VINCULACIN Y PARTICIPACIN SOCIAL

DR. NELLY AGUILERA ABURTO TITULAR DE LA UNIDAD DE ANLISIS ECONMICO

LIC. CARLOS SANDOVAL LEYVA

DIRECTOR GENERAL DE COMUNICACIN SOCIAL

DR. JESS FELIPE GONZLEZ ROLDAN DIRECTOR GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE PROGRAMAS PREVENTIVOS Y CONTROL DE

ENFERMEDADES

DR. EDUARDO JARAMILLO NAVARRETE DIRECTOR GENERAL DE PROMOCIN DE LA SALUD

DR. CUITLHUAC RUIZ MATUS

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA


Versin No.01

LIC. JUAN CARLOS REYES OROPEZA DIRECTOR GENERAL DE INFORMACIN EN SALUD


Versin No.01

INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS

DR. MANUEL MARTNEZ BEZ

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

BIOL. IRMA LPEZ MARTNEZ DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO

LIC. ADRIANA CASTRO CABRERA SUBDIRECTORA DE OPERACIN

M. EN C. BELN TORRES LONGORIA

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA

QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M EN C. JUAN CARLOS CARPIO PEDROZA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA

M. EN C. JUDITH ESTEVEZ RAMREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. JOS ERNESTO RAMREZ GONZLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y VALIDACIN DE TCNICAS

BIOL. NORMA ANGLICA MONTES COLIMA JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA

QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY ASESORA TCNICA DE LA DIRECCIN

DRA. LUCIA LVAREZ HERNNDEZ

JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y PERTUSIS COORDINADORA DE LA RED DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y

PERTUSIS


Versin No.01

GRUPO DE TRABAJO

DRA. LUCIA LVAREZ HERNNDEZ

JEFA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y PERTUSIS

COORDINADORA DE LA RED DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y PERTUSIS

QBP. MNICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS

COORDINADORA TCNICA DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y PERTUSIS

COORDINADORA DE LABORATORIO EN SIREVA II

IMI. JORGE MACEDO ESPAA QBP. MARA DEL CARMEN HERRERA BAUTISTA

QBP. SUSANA JIMNEZ MORENO QPB. SUGEI JEANNETTE GMEZ CONTRERAS

IBI. PATRICIA GABINO NORIEGA TC. LAB. ENRIQUE HERRERA GONZLEZ

ADSCRITOS AL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y PERTUSIS

BIOL. IRMA LPEZ MARTNEZ

DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

DR. HUGO MARTNEZ ROJANO ASESOR TCNICO DE LA DIRECCIN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE

COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO


Versin No.01

AGRADECIMIENTOS

Q.B.P. GUADALUPE ADRIANA GALICIA NICOLS JEFA DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA MOLECULAR

Q.F.B. ALEJANDRA MORENO ESCOBAR

Q.B.P. MARA DOLORES TLLEZ SAUCEDO Q.F.B. JESS MANUEL TENORIO LARA

ADSCRITOS AL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA MOLECULAR

Q.B.P. ALTAGRACIA VILLANUEVA ZAMUDIO JEFA DEL LABORATORIO DE PRODUCCIN DE SUEROS

Q.F.B. JOS PATRICIO MARTNEZ LPEZ

ADSCRITO AL LABORATORIO DE PRODUCCIN DE SUEROS

M. EN C. ILIANA ALEJANDRA CORTS ORTIZ Q.F.B. ISAURA ISABEL MARTNEZ RIVERA

Q.B.P. NO ESCOBAR ESCAMILLA ADSCRITOS AL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR


Versin No.01

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA DE TOS-FERINA Y SNDROME COQUELUCHOIDE POR

LABORATORIO

DGE-InDRERNLSP 2015


Versin No.01

NDICE ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA EL DIAGNSTICO DE TOS FERINA ............ 12

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA TOS FERINA 13

DEFINICIONES OPERATIVAS ............................................................................................. 13

OBJETIVOS .............................................................................................................................. 14

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO................................................................................. 16

ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE TOS FERINA ... 17

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED .......................................................... 18

Funciones del laboratorio nacional de referencia ............................................................... 18

Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) .................................. 19

Funciones de los laboratorios a nivel local........................................................................... 20

TOMA, MANEJO, Y ENVO DE MUESTRAS ..................................................................... 20

ALGORITMOS DIAGNSTICOS PARA EXUDADO NASOFARNGEO ......................... 29

CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS .............................................................................. 35

PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) ..................... 36

CRITERIOS PARA LA LIBERACIN DEL DIAGNSTICO EN LA EVALUACIN EXTERNA DE DESEMPEO ................................................................................................ 37

BANCO DE MATERIAL BIOLGICO .................................................................................. 38

BIBLIOGRAFA ....................................................................................................................... 39

Procesamiento de las muestras para serologa .................................................................... 51

TRANSPORTE Y ENVO DE CEPAS DE Bordetella pertussis Y OTRAS ESPECIES DE Bordetella spp. ......................................................................................................................... 74

PRUEBAS DIFERENCIALES DE CATALASA Y OXIDASA .............................................. 75

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA MTODOS BACTERIOLGICOS .............................................................................................................. 77

CONSERVACIN A CORTO PLAZO DE MICROORGANIAMOA EXIGENTES EN MEDIO DE TRANSPORTE DE AMIES ................................................................................ 90


Versin No.01

INTRODUCCIN La tos ferina es una enfermedad altamente transmisible, comn en la infancia que

puede causar neumona intersticial o bronconeumona por Bordetella pertussis, B.

parapertussis o B. bronchiseptica y tambin puede ser asociada a patgenos

bacterianos secundarios, aumentando as la afeccin al epitelio respiratorio y

complicando an ms al paciente. Esta enfermedad reporta tasas de morbilidad del 90

al 100% en contactos intradomiciliarios que no han sido vacunados, se puede

presentar en cualquier poca del ao. Los lactantes menores de un ao de edad ocupan

el 41% de los casos declarados de tos ferina y el 78% de los fallecimientos debido a esta

enfermedad. Entre adolescentes y adultos cercanos a casos de tos ferina, del 40 al 80%

de los miembros de la familia desarrollan anticuerpos contra B. pertussis y de estos

solo el 50% presentan signos y sntomas compatibles con la enfermedad. En la

actualidad se acepta que adolescentes y adultos sintomticos no diagnosticados,

representan una fuente de transmisin a lactantes y nios, as como un mecanismo de

perpetuacin de la enfermedad en la poblacin en general.

En Mxico los estudios realizados en brotes de tos ferina, sugieren que la inmunidad

protectora inducida por la vacuna tiene una duracin determinada, de tal forma que el

biolgico elaborado con la bacteria completa solo ofrece proteccin aproximadamente

durante 12 aos. Esto hace necesario que en las zonas endmicas se mantenga una

vigilancia epidemiolgica permanente para disminuir los ndices de morbilidad. Es

conveniente evaluar de manera constante la eficacia del programa de inmunizacin, as

como conocer la potencia, composicin y cobertura de los serotipos de la vacuna anti-

Pertussis. En nuestro pas la aplicacin de la vacuna anti-Pertussis, ha favorecido la

disminucin de la morbilidad de la tos ferina de tal manera que en 1950 la tasa de

morbilidad era de 130 por 100000 habitantes y en 1980 disminuy a menos de 10 por

100000 habitantes. Sin embargo, en el ao 2008 se present un notable incremento

con un reporte de 162 casos de este padecimiento a nivel nacional, con una incidencia

global de 0.15 por 100000 habitantes. Durante el 2009 se confirmaron por laboratorio

185 casos (21%) de 879 estudiados y se estudiaron un total de 2060 contactos, de los

cuales 76 (3.8%), presentaron Bordetella pertussis. En el 2011 se estudiaron un total

de 983 casos de Sndrome Coqueluchoide por la tcnica de cultivo; de estos casos, 161

(16.4%) fueron confirmados por el laboratorio como positivos a tos ferina; los

contactos estudiados fueron 3340 y 56 fueron positivos a Bordetella pertussis.

Con la introduccin de la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

mltiple en Tiempo Real (TR) se observ un increment en la positividad en la

deteccin de B. pertussis y otras especies de Bordetella, lo que nos permite aumentar

la sensibilidad en el diagnstico por el laboratorio, de tal forma que de noviembre de

2011 a mayo de 2012 se realiz un estudio piloto con cinco Laboratorios Estatales de

Salud Pblica (LESP) de la Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud Pblica

(RNLESP) para Infecciones Respiratorias Agudas (IRA) bacterianas (Chiapas, D.F.,

Nuevo Len, San Luis Potos y Sonora) para la implementacin de la Reaccin en


Versin No.01

Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (PCR TR) mltiple. En este estudio se

procesaron un total de 463 casos probables de tos ferina por PCR TR y por cultivo, de

los cuales 155 (33.5%) fueron positivos a B. pertussis por PCR TR y solamente 47

(10.1%) fue positivo a B. pertussis, por cultivo. Tambin se analizaron, por ambas

tcnicas, un total de 1614 muestras de contactos resultando que el 1.0% (17/1614)

fueron positivas por cultivo y el 6.3% (102/1614) positivas por PCR TR. De estos

resultados se concluye la importancia de la bsqueda tanto de casos como de

portadores por las dos tcnicas siendo estos ltimos, los portadores, quienes favorecen

la transmisin de esta enfermedad, a pesar de existir la prevencin a travs de la

vacunacin.

Todo esto impulsa a mantener una vigilancia estrecha entre casos y contactos porque

una de las complicaciones pulmonares ms comunes es la presencia de atelectasias,

neumona bacteriana o muerte por asfixia durante la fase paroxstica.

La vigilancia epidemiolgica de la tos ferina y el sndrome coqueluchoide consiste en

promover y difundir la informacin generada en el laboratorio, que contribuya a la

prevencin y control de estos padecimientos mediante el estudio y confirmacin de

casos probables o sospechosos as como de sus contactos intra-domiciliarios.

Una de las principales funciones de la vigilancia por el laboratorio es caracterizar la

etiologa del sndrome coqueluchoide y determinar la frecuencia con que se presenta

Bordetella pertussis y B. parapertusis, como agentes etiolgicos de este sndrome.

El propsito del siguiente lineamiento es el de establecer las directrices para la toma,

manejo y envi de muestras para el diagnstico por laboratorio de tos ferina y

sndrome coqueluchoide de una forma estandarizada, estableciendo los flujos de

informacin adecuados de los datos generados por el laboratorio en apoyo a la

vigilancia epidemiolgica.

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP) es el conjunto de

laboratorios para la vigilancia epidemiolgica con objetivos especficos que le han

permitido unificar mtodos de diagnstico, criterios de interpretacin de resultados,

transferencia tecnolgica, generacin de conocimiento y formacin de recursos

humanos. Es el soporte tcnico-cientfico til para la vigilancia epidemiolgica y que

genera informacin de calidad para la toma oportuna de decisiones a travs de la

confirmacin de diagnsticos mediante estudios de laboratorio en muestras biolgicas.

La RNLSP depende de la Secretara de Salud y es el Instituto de Diagnstico y

Referencia Epidemiolgicos Dr. Manuel Martnez Bez (InDRE) su rgano rector en el

rea de vigilancia epidemiolgica. Tiene fundamento legal en la Norma Oficial

Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiolgica y est conformada

por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) de las 32 entidades federativas

del pas (el Distrito Federal enva sus muestras al InDRE).


Versin No.01

El Marco Analtico Bsico de la RNLSP consta de 27 diagnsticos, distribuidos en 16

redes de vigilancia especfica.

ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA EL DIAGNSTICO DE TOS FERINA

El Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) y Pertussis,

inici en la dcada de los ochenta, e instrument el diagnstico de tos ferina a partir

del estudio de casos de Sndrome Coqueluchoide y sus contactos, estableciendo hasta

la fecha una red con hospitales de concentracin peditrica, en su mayora localizados

en el rea metropolitana.

Desde hace aproximadamente 32 aos, se ha trabajado en el perfeccionamiento del

proceso de obtencin y manejo de muestras de cultivo.

En colaboracin con los servicios de salud del Distrito Federal a partir del ao 2001 se

realiz la descentralizacin de la toma y manejo de muestras para el diagnstico de tos

ferina en el rea metropolitana. Paralelamente se capacit en la tcnica de cultivo a los

Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) que conforman hasta nuestros das la

Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud Pblica (RNLESP). Actualmente 26

estados de nuestro pas realizan el diagnstico por cultivo.

En 2007 en el laboratorio de IRAB y Pertusis del Instituto de Diagnstico y Referencia

Epidemiolgicos (InDRE) se implement la tcnica de PCR punto final y en el ao

2010 la de PCR tiempo real empleada por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)

y los Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades [Centers for Disease

Control and Prevention (CDC), por sus siglas en ingles]. Posteriormente se realizaron

modificaciones al algoritmo diagnstico utilizado en el InDRE y se adopt la tcnica de

PCR tiempo real mltiple, transferida por el CDC en agosto de 2011.

Hoy en da los 26 LESP ya fueron capacitados por el InDRE para realizar el diagnstico

por cultivo y PCR tiempo real mltiple, de la tos ferina. Sin embargo, solo 4 estados

(Nuevo Len, Sonora, San Luis Potos y Chiapas), tienen la infraestructura y los

insumos necesarios para la realizacin de la PCR.

El InDRE tambin lleva a cabo el aseguramiento de la calidad para los laboratorios de

la red, los abastece con medio de transporte Regan Lowe en situacin de brotes y les

proporciona reactivos y materiales necesarios para el diagnstico y la toma de muestra

cuando estos son requeridos.

Todas las cepas aisladas a travs de la red se envan al InDRE para su confirmacin ya

sea para control de calidad o referencia.


Versin No.01

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA TOS

FERINA

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica para el diagnstico de Tos ferina

(RNLSP-Tos ferina) est formada por 26 laboratorios en los siguientes estados:

Aguascalientes, Baja California, Baja California Sur, Chiapas, Chihuahua, Coahuila,

Colima, Estado de Mxico, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacn,

Morelos, Nuevo Len, Oaxaca, Puebla, Quertaro, Quintana Roo, San Luis Potos,

Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas, los cuales declaran en su

marco analtico que realizan el cultivo para Bordetella pertussis y otras especies, la

mayora de los LESP (83.8%) ya realizan este diagnstico sin embargo, es necesario

que el 100% de los laboratorios participen en la Red para fortalecer la vigilancia

epidemiolgica continua de la tos ferina a nivel nacional.

Los LESP de los estados de Campeche, Durango, Nayarit, Tamaulipas y Yucatn no

estn incorporados a la red (ver figura 1).

DEFINICIONES OPERATIVAS Caso sospechoso de tos ferina: persona de cualquier edad con tos, sin importar los das de duracin y con asociacin con otros casos probables o confirmados. Esta definicin se utiliza para la bsqueda activa de casos adicionales ante la presencia de casos probables, confirmados o atpicos, portadores, defunciones y en brotes. Caso probable de tos ferina: persona de cualquier edad, con tos de 14 o ms das de evolucin y dos o ms de las siguientes caractersticas; tos paroxstica, en accesos, espasmdica o estridor larngeo inspiratorio y uno o ms de los siguientes datos; tos cianosante, hemorragia (conjuntival, petequias, epistaxis), leucocitosis con predominio de linfocitos; o historia de contacto con casos similares en las ltimas 2 a 4 semanas previas al inicio del padecimiento. Nota: En esta definicin se incluyen a los menores de 3 meses que pueden manifestar slo episodios de apnea o cianosis con o sin tos. Caso confirmado de tos ferina: todo caso que tenga aislamiento de Bordetella pertussis por cultivo o PCR en el caso per se o cualquiera de sus contactos, convivientes o personas con asociacin epidemiolgica. Caso de tos ferina clnica: todo caso con datos clnicos caractersticos y que no cuenta con muestra, independientemente de sus cinco contactos. Caso de tos ferina atpico: todo caso sospechoso que tenga aislamiento de Bordetella pertussis. Portador asintomtico de Bordetella pertussis: toda persona sin signos o sntomas de enfermedad respiratoria a quien se tom muestras por tener asociacin epidemiolgica con un caso probable o confirmado y cuyos resultados de cultivo o PCR son positivos a Bordetella pertussis.


Versin No.01

OBJETIVOS Objetivo general

Establecer las directrices para realizar el diagnstico por laboratorio de la Tos Ferina y

el Sndrome Coqueluchoide a travs de la RNLSP de forma estandarizada, as como

crear los flujos de informacin adecuados de los datos generados por el laboratorio en

apoyo a la vigilancia epidemiolgica.

Objetivos especficos

Generar y difundir informacin de laboratorio que contribuya a la prevencin y

control epidemiolgico de la Tos ferina.

Alcanzar difusin en las tcnicas del manejo del microorganismo as como la

integracin del formato nico para el estudio de cada paciente.

Realizar el diagnstico, control de calidad y referencia de Bordetella pertussis y

otras especies mediante las tcnicas de cultivo y PCR Tiempo Real Multiplex

(TRM).

Emitir lineamientos para la operacin de la RNLSP.

Asegurar la calidad del diagnstico del Laboratorio Nacional de Referencia a

travs de la participacin en programas internacionales de evaluacin externa

para Tos ferina.

Desarrollar y evaluar la competencia tcnica de los laboratorios de la red.


Versin No.01

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE TOS FERINA

Figura. 1. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP) para el Diagnstico

de Tos ferina

N

Estados con metodologa de cultivo implementada para diagnstico de Tosferina que envan cepas de B. pertussis y B. parapertussis para control de calidad o referencia.

LESP NO integrantes de la Red Tos ferina.

Estados con metodologa de cultivo implementada para diagnstico de Tos ferina.


Versin No.01

Figura. 2. Cobertura diagnstica por PCR-TRM

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO

1. Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. Artculo 4. DOF

05/02/1917, ltima Reforma D.O.F. 15/02/2012.

2. Ley General de Salud. Artculo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y

141. DOF 7/02/1984, ltima Reforma DOF 07/06/2012.

3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia

epidemiolgica. DOF: 19/02/2013.

4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Proteccin

ambiental-salud ambiental-residuos peligrosos biolgico-infecciosos-

clasificacin y especificaciones de manejo.

5. Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las

caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de

los residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.

LESP capacitados en PCR TR multiplex en julio 2012.

Estados con metodologa implementada para PCR TR Multiplex para diagnstico de Tos ferina (Proyecto Latinoamericano)

LESP capacitados en mayo-junio 2012 en PCR TR multiplex.


Versin No.01

6. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organizacin y

funcionamiento de los laboratorios clnicos.

7. Reglamento Interior de la Secretara de Salud, publicado en el Diario Oficial de

la Federacin el 19 de enero de 2004, ltima reforma publicada DOF 10 de

enero de 2011.

8. Secretara de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la

Federacin DOF: 12/12/2013.

9. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federacin, DOF:

20/05/2013, www.dof.gob.mx

10. Secretara de Salud. Programa de Accin Especfico 2013-2018. Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, primera edicin 2014.

11. Lineamientos para programas de evaluacin externa del desempeo de la Red

Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, InDRE- Secretara de Salud, Mxico

2014.

12. Criterios de Operacin para la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica,

InDRE-Secretara de Salud, Mxico 2014.

ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE TOS FERINA El Laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) y Pertusis adscrito al departamento de bacteriologa, coordina la Red Nacional de Laboratorios de diagnstico de Tos-ferina (RNLSP-Tos), integrada por 26 Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) y los laboratorios de diagnstico locales (centros de salud, jurisdicciones sanitarias), aunado a todos los laboratorios pblicos y privados que realicen las tcnicas de cultivo y PCR TRM para el diagnstico de la tosferina por el laboratorio, ver figura 3.


Versin No.01

Figura. 3. Flujo de trabajo de la red nacional de laboratorios para el diagnstico de la Tos ferina. Clave de tabulador: IB1534001

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED Funciones del Laboratorio Nacional de Referencia El InDRE coordina la Red Nacional de Laboratorios de diagnstico de Tos ferina (RNLSP-Tos), y es la institucin de referencia a nivel nacional y desempea las siguientes funciones:

Llevar a cabo actividades de diagnstico y anlisis diversos en muestras de seres humanos en apoyo a la vigilancia epidemiolgica.

Participar en el desarrollo, estandarizacin, adaptacin y validacin de tcnicas y procedimientos de laboratorio para pruebas mnimas, generales y especializadas.

Realizar estudios de referencia y control de calidad de los LESP a nivel nacional.

PCR TR a partir de la muestra clnica (exudado nasofarngeo) o confirmacin de cepas

LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PUBLICA

(LESP) (Nivel II)

Bsqueda de B. pertussis y B. parapertussis Cultivo en Agar Bordet-Gengou o Agar Charcoal (con y sin cefalexina)

ENVO DEL AISLAMIENTO AL InDRE PARA SU IDENTIFICACIN

FINAL (REFERENCIA)

Unidad de salud de primer nivel

(Centros de Salud, J.S. Hospitales de

1er y 2 nivel) (Nivel III)

Tomar exudado nasofarngeo en solucin salina o en tubo estril para PCR TR

Tomar Exudado Nasofarngeo en Medio de transporte Regan-Lowe para cultivo

ENVO DE LAS MUESTRAS EN RED FRA CON LA INFORMACIN CORRESPONDIENTE AL LESP

Tomar suero para confirmacin de casos en etapas tardas de la enfermedad o en situacin de brotes.

InDRE (Nivel I)

CONTROL DE CALIDAD, REFERENCIA y

VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA

Envo de informacin a Epidemiologa

Control de calidad y Referencia Internacional CDC de Atlanta


Versin No.01

Participar en el diseo de programas de vigilancia epidemiolgica y diagnstico de la tos ferina a nivel nacional.

Realizar investigaciones seroepidemiolgicas y bacteriolgicas que permitan conocer directa o indirectamente la prevalencia de la tos ferina en poblaciones que viven en zonas endmicas del pas.

Establecer la utilizacin de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE, en apoyo a la vigilancia epidemiolgica de la tos ferina.

Capacitar al personal de los LESP en las tcnicas, procedimientos y en la toma y manejo de muestras respectivamente para el diagnstico por laboratorio de la tos ferina en las instalaciones del InDRE.

Establecer programas de supervisin continua a las actividades de la red. Orientar a los LESP en la preparacin, compra de reactivos y de estndares de

referencia para el aislamiento de los agentes etiolgicos del Sndrome Coqueluchoide y la tos ferina.

Elaborar y mantener actualizados los manuales de procedimientos y tcnicas de laboratorio para el diagnstico de estas enfermedades.

Organizar y participar en reuniones cientficas donde se aborden temas relacionados con procesos infecciosos de las vas respiratorias.

Coordinar el flujo de informacin de la RNLSP y notificar al rgano normativo de vigilancia epidemiolgica correspondiente de los casos confirmados de los padecimientos ya sealados.

Funciones de los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP)

Participar en actividades de vigilancia epidemiolgica mediante la realizacin de pruebas mnimas y generales en el diagnstico de la tos ferina.

Ser el centro de referencia de la red estatal de laboratorios locales de salud pblica.

Coordinar, asesorar y supervisar las actividades de la red estatal de laboratorios de diagnstico.

Participar en el diseo de programas de vigilancia epidemiolgica y de diagnstico por laboratorio a nivel estatal.

Realizar investigaciones seroepidemiolgicas y bacteriolgicas acerca de la prevalencia de la tos ferina a nivel estatal.

Colaborar en el seguimiento y control de casos y contactos de pacientes con infecciones respiratorias sujetas a vigilancia epidemiolgica.

Promover la utilizacin adecuada de las pruebas diagnsticas ya estandarizadas, as como la interpretacin de los resultados obtenidos en apoyo a las actividades de vigilancia epidemiolgicas de la tos ferina y la aplicacin de medidas de prevencin y control correspondientes al mbito estatal.

Disear programas de capacitacin para el personal de la red de laboratorios locales, para el manejo de muestras, y el aislamiento y caracterizacin de Bordetella pertussis y B. parapertussis.

Promover y apoyar programas de control de calidad para el mejoramiento integral de los laboratorios locales.

Participar en la elaboracin y actualizacin de los manuales de procedimientos relacionados con el diagnstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos, etc.).


Versin No.01

Notificar al rgano normativo correspondiente los casos confirmados de tos ferina.

Coordinar el flujo de informacin de la red estatal al nivel nacional. Funciones de los laboratorios a nivel local En este nivel se incluyen los laboratorios de los centros de salud, jurisdiccionales y algunos laboratorios de hospitales de primer nivel, que deben realizar la toma, manejo y transporte de muestras, sus funciones son:

Realizar las pruebas mnimas para el diagnstico de tos ferina en muestras humanas que requieren nicamente el uso de equipo bsico de laboratorio.

Referir muestras al LESP de su entidad para control de calidad y para la realizacin de pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen en su laboratorio.

Llevar a cabo la toma de muestras por personal capacitado, de los contactos de un caso probable o sospechoso de tos ferina.

Notificar al rgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos confirmados de tos ferina.

Mantener el flujo de informacin con los niveles estatal y nacional (LESP e InDRE).

TOMA, MANEJO, Y ENVO DE MUESTRAS Para la toma de muestras es importante considerar las definiciones operacionales de caso probable, caso sospechoso y portador asintomtico. La caracterstica de la infeccin por Bordetella pertussis y B. parapertussis es que la bacteria se adhiere a los cilios del epitelio respiratorio que recubre la nasofaringe, por lo que se puede aislar a partir de exudados o aspirados nasofarngeos. Pero debido a la dificultad y el tipo de material requerido para la toma del aspirado nasofarngeo, en la mayora de los casos se prefiere la toma del exudado nasofarngeo (ExNF). La obtencin de las muestras de todos aquellos pacientes con evidencia clnica de Sndrome Coqueluchoide o Tos ferina se realizar en el laboratorio de la unidad hospitalaria pblica o privada, centro de salud o jurisdiccin correspondiente. Las muestras deben ser tomadas durante el episodio agudo de la enfermedad a fin de tener la mayor posibilidad de aislamiento del agente etiolgico y previo al tratamiento con antibiticos. El laboratorio del hospital, del centro de salud o de la jurisdiccin procesar las muestras clnicas y todos los aislamientos presuntivos de Bordetella spp los remitir al LESP. Si el hospital no cuenta con laboratorio o recursos para procesar las muestras clnicas, deber tomar las muestras y enviarlas al LESP.

Los LESP recibirn las muestras clnicas o los aislamientos presuntivos de Bordetella pertussis o Bordetella spp procedentes de las unidades hospitalarias a fin de que se realice el diagnstico o se confirmen las cepas. Los LESP se encargarn de transportar


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las cepas confirmadas como positivas (en medio de transporte de AMIES con carbn) al InDRE, con la informacin solicitada (formato nico de envo de muestras con los resultados obtenidos y formato adicional de estudio Epidemiolgico de caso) y aplicarn para hacer el envo, el sistema bsico de triple embalaje utilizado en el InDRE1. Los LESP debern apoyar a los laboratorios de las unidades hospitalarias y jurisdiccionales en aquellas situaciones en que se requiera y de acuerdo a los recursos disponibles, a fin de realizar los estudios de las muestras y enviar los resultados al laboratorio correspondiente.

En el InDRE el laboratorio de Infecciones Respiratorias Agudas Bacterianas (IRAB) y Pertusis ser el responsable de recibir las muestras para diagnstico de los hospitales del rea metropolitana o las cepas de Bordetella pertussis o Bordetella spp procedentes de los LESP.

En el InDRE se llevar a cabo el estudio de confirmacin y enviar los resultados a los LESP y a la Direccin General Adjunta de Epidemiologa.

Toma de muestra

Mtodo directo o Toma de exudado nasofarngeo para cultivo y PCR

El exudado nasofarngeo (ExNF) es la muestra de eleccin para el estudio de casos probables y sospechosos de Tos ferina, as como de sus contactos para la bsqueda de Bordetella en portadores asintomticos; debido a que esta bacteria se adhiere a los cilios del epitelio del tracto respiratorio superior en el hombre.

Para la toma de la muestra se utiliza un hisopo con mango flexible (alambre de aluminio o plstico) para no lastimar al paciente. Si el estudio solicitado es cultivo, la toma de la muestra puede ser con hisopo de alginato de calcio, rayn o dacrn.

Para el estudio de PCR la muestra debe ser tomada con hisopo de rayn o dacrn (tambin conocido como polyester), nunca de alginato de calcio ya que este ltimo inhibe la actividad de la Taq polimerasa y se pueden obtener resultados falsos negativos.

Si se van a realizar las dos tcnicas, cultivo y PCR, lo ideal es tomar dos muestras; la muestra destinada para cultivo debe ser depositada en el medio de transporte Regan Lowe y la muestra para PCR en el medio de transporte solucin salina con Cefalexina,

(1). El sistema bsico de triple embalaje consiste en la utilizacin de un recipiente primario, en el cual est contenida la muestra biolgica

(Exudado nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermtico para evitar que la muestra se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o nmero de muestra

del paciente. El recipiente primario deber rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente

secundario hermtico a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un recipiente secundario se deber usar una gradilla y material absorbente para evitar algn derrame. Es importante mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene

que haber suficientes refrigerantes para mantener una temperatura de 4 a 8 C. Los recipientes secundarios debern llevar las etiquetas de

riesgo biolgico y seal de orientacin del recipiente, a su vez el recipiente secundario deber ir contenido en un paquete externo de envo (caja de cartn o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los datos del remitente,

destinatario y seal de orientacin. La documentacin que se integre al triple embalaje deber colocarse en la parte interior del paquete.


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a una concentracin final de 40 g/mL. Cada tubo de muestra debe ser perfectamente etiquetado con los datos de la solicitud del estudio para cultivo o para PCR y las dos muestras deben transportarse en red fra y de acuerdo a la metodologa implementada

en el InDRE (ver figura 5). [1]

Condiciones para la toma de las muestras (Exudado nasofarngeo y aspirado nasofarngeo)

La toma de muestra se efecta con el paciente sentado y la cabeza ligeramente hacia atrs. Se introduce el hisopo de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz, hasta aproximadamente 10 cm hacia dentro, cuidando tocar slo el extremo posterior del mango y evitar tocar los cornetes. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe, frotar suavemente el hisopo durante 10 segundos, pedir al paciente que tosa y retirar con cuidado para que no se contamine (ver figura 4).

Figura 4. Toma de exudado nasofarngeo

Fuente: Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA,

2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/

Depositar el hisopo con la muestra para cultivo en el medio de transporte Regan Lowe y cortar con tijeras el excedente del mango de aluminio que queda fuera del tubo, el mango de aluminio no debe enrollarse dentro del tubo para evitar contaminacin de la muestra. Las muestras destinadas para PCR deben depositarse en medio de transporte de solucin salina con Cefalexina y transportarse en red fra. El rea donde se toman las muestras en el caso de los centros de salud u hospitales, debe ser un rea independiente del rea de vacunacin DPT o la vacuna acelular contra Pertussis para evitar contaminacin cruzada en la muestra tomada. Toma del aspirado nasofarngeo (ANF) Para esta toma se utiliza un kit de aspiracin que contiene una jeringa de 3.0 mL con solucin salina estril y una sonda. Durante la recoleccin de la muestra el paciente se mantiene acostado con el cuello extendido y la sonda se introduce suavemente a travs

http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/


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de una fosa nasal por el piso de la nariz hasta alcanzar la nasofaringe. La solucin salina se introduce en la nariz a travs de la sonda hasta estancarse en la nasofaringe, de donde se aspira la muestra rpidamente. Se colectan aproximadamente 2.0 mL de aspirado por este mtodo. Despus de la recoleccin, se quita el catter de la jeringa, se desecha, y a continuacin se tapa la jeringa. Despus de etiquetarlo debidamente, la jeringa se coloca en una bolsa de plstico zip-top o el aspirado se puede depositar en un tubo estril y se transportan al laboratorio en bolsas con hielo en una hielera. La muestra debe llegar al laboratorio dentro de las primeras 24 horas de su extraccin. Las muestras aceptadas para analizarse por PCR TRM, exudado o aspirado nasofarngeo, deben de depositarse en medio de transporte de solucin salina con Cefalexina a una concentracin final de 40 g/mL, y la muestra debe ser tomada con hisopo de rayn o dacrn. (No emplear hisopos de alginato de calcio debido a que se inhibe la accin de la Taq polimerasa y se pueden obtener resultados falsos negativos). El tiempo de transporte no debe exceder ms de 3 das. En el laboratorio de IRA bacterianas se reciben las dos muestras, se les asigna el nmero de identificacin TOS correspondiente y una muestra se lleva al rea de proceso de cultivos y la otra al rea de Bacteriologa molecular. En el caso de extraccin del ADN sta se realiza empleando las columnas de QIAamp ADN Mini and Blood Kit de la marca QIAGEN, cuando se procesan 10 muestras como mximo. Si el nmero de muestras es mayor se debe realizar la extraccin automatizada (por robot) para evitar el riesgo de contaminacin cruzada. Una vez realizada la extraccin del ADN, se efecta el corrimiento de la PCR TRM por el grupo de expertos. Las muestras que no amplifican se reportan como negativas a Bordetella pertussis, B. parapertussis y B. holmesii, y se sugiere efectuar el diagnstico diferencial con la finalidad de determinar el origen de la infeccin: viral o bacteriana. Para descartar la presencia de otras bacterias se debe solicitar otro tipo de muestra, para la bsqueda de Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Chlamydia trachomatis.

Mtodo indirecto

o Toma de muestra para serologa

Condiciones para la toma de las muestras para serologa

Para la prueba de Ensayo por Inmunoabsorcin Ligado a Enzimas [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA), por sus siglas en ingls] se requiere de una muestra de suero, la muestra de sangre se debe tomar a partir de las 2 semanas o hasta las 8 semanas de iniciada la tos.

Para obtener la sangre se deben utilizar tubos con tapn de gel que permitan separar los componentes de la sangre despus de la centrifugacin.


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La toma deber hacerse en un lugar perfectamente iluminado y con el paciente cmodamente sentado

Localizar una vena adecuada en la cara anterior del codo y colocar el torniquete en la parte media del brazo. Desinfectar el rea con un algodn humedecido con alcohol al 70% e introducir la aguja con el bisel hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre retirar el torniquete y una vez que se haya obtenido la cantidad de sangre requerida (3.0-6.0 mL), retirar la aguja y colocar una torunda con alcohol sobre el sitio de puncin ejerciendo presin para detener la hemorragia.

Si la toma se realiz con jeringa, retirar la aguja y verter la sangre a un tubo estril, dejndola resbalar lentamente por la pared para evitar hemlisis. Tapar el tubo cuidadosamente.

Debido a que la toma de sangre es para la obtencin de suero, no utilizar ningn anticoagulante y si el tubo tiene gel, centrifugar lo antes posible es decir, dentro de las primeras 8 horas de recolectada la muestra sangunea.

Es muy importante que la sangre se deje coagular de 30 a 45 minutos (mximo 2 horas) para que al final se obtenga un volumen mayor de suero. Envo y manejo de muestras

1. Las muestras deben ser centrifugadas antes de refrigerarse, si se utilizan tubos con gel separador de suero es necesario centrifugar antes de que la muestra sea refrigerada.

2. Despus de la centrifugacin transferir el suero a criotubos para su almacenamiento; el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y la separacin del suero a mediano plazo no debe exceder las 24 horas.

3. Las alcuotas de suero que se procesan a corto plazo se pueden mantener en refrigeracin hasta 8 das. Si el proceso de la muestra excede de los ocho das, estas debern congelarse entre -20 C y hasta -80 C. Es muy importante minimizar los ciclos de congelacin y descongelacin de las muestras serolgicas para evitar el deterioro de los anticuerpos.

4. Para este estudio se solicita de 1.0 a 3.0 mL de suero, el cual no debe estar hemolizada, ni lipmica o contaminada. Estas muestras deben ser separadas y transportadas en red fra.

5. Las muestras de suero deben estar bien etiquetadas y acompaadas de los formatos: de laboratorio de estudio de caso y contactos de Tos ferina y copia del Formato del Sistema Nacional de Salud de estudio epidemiolgico de caso.

6. Recordar que es muy importante que la muestra serolgica sea tomada a partir de las dos semanas o ms de iniciada la tos, pero no antes. Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio. La falta de alguno de estos documentos o condiciones inadecuadas de la muestra, causa el rechazo de las mismas y se notificar al responsable del envo. Seguir procedimiento de Sistema Bsico de Triple Embalaje para envo de muestras.


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Material

Los materiales requeridos para la toma y manejo de muestras son:

Equipo de proteccin personal (bata, guantes, cubrebocas, lentes de seguridad)

Bolsas de plstico

Gradillas para tubos de ensaye

Hisopos de alginato de calcio, rayn o dacrn estriles, con mango flexible de aluminio para los menores de 6 aos y con mango de plstico, para adolescentes y adultos

Tubos con medio de transporte Regan Lowe, para cultivo

Tubos con solucin salina con Cefalexina a una concentracin final de 40 g/mL

Refrigerantes, hieleras

Para la toma de aspirados nasofarngeos se requiere de un kit que est formado por:

o Jeringa estril con 3.0 mL de solucin salina estril o Una sonda nasofarngea o Tubos estriles con tapn de rosca

Transporte de las muestras El transporte de las muestras clnicas indicadas para el diagnstico de tos ferina debe ser utilizando red fra, y en las condiciones y tiempo de transporte que se indican en el cuadro 1.


Versin No.01

Cuadro 1.- Condiciones para la toma manejo y envo de muestras para el diagnstico

por cultivo, PCR y serologa de la tos ferina

Tipo de muestra Mtodo Medio/contenedor/forma de

envo

Tiempo indicado para la

toma de muestras

Tcnica

Exudado nasofarngeo

Se pueden utilizar hisopos de alginato de calcio, rayn o dacrn

(polister)

Tubos con 3.0 mL de medio de transporte Regan Lowe, enviar en un tiempo mximo de 48-72

horas y temperatura de transporte en red fra

Durante fase catarral y hasta las 2 primeras semanas de la

fase paroxstica

Cultivo

Aspirado nasofarngeo

Se utiliza una jeringa estril con una sonda nasofarngea y 3.0 mL

de solucin salina estril, y se recuperan

2.0 mL de aspirado nasofarngeo

Contenedor estril (tubo o vaso recolector de muestra) enviar en un tiempo mximo de 24 horas y temperatura de transporte en

red fra

Exudado nasofarngeo

Para diagnstico por PCR utilizar

exclusivamente hisopos de rayn o

dacrn(polister)

Se puede utilizar como medio de transporte solucin salina con

Cefalexina 40 g/mL, enviar en un tiempo mximo de 24 a 72


Durante la fase catarral y hasta las 4 semanas

de la fase paroxstica

PCR TRM

Depositar el hisopo en seco, en tubo estril enviar en un tiempo

mximo de 24 horas y temperatura de transporte en

red fra

Aspirado nasofarngeo

Se utiliza una jeringa estril con una sonda nasofarngea y 3.0 mL

de solucin salina estril, y se recuperan

2.0 mL de aspirado nasofarngeo

Contenedor tubo estril enviar en un tiempo mximo de 24


Suero

Por venopuncin, la sangre se deposita en

tubos sin anticoagulante, se

pueden utilizar tubos con gel separador

Tubo estril con o sin gel separador, enviar en un tiempo

mximo y temperatura de transporte de 24 horas en red

fra y si el tiempo de transporte es mayor en congelacin

Necesariamente a partir de la

segunda semana de

iniciada la tos y hasta mximo 8

semanas

Serologa (ELISA

para deteccin

de Acs. anti-toxina pertussis)

Cepas

Hisopos de alginato de calcio, rayn o dacrn (polister) nunca de

algodn

Medio de transporte de Amies enviar en un tiempo mximo 48-72 horas y temperatura de

transporte en red fra

No aplica Cultivo y/o

PCR


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DIAGNSTICO POR LABORATORIO

El diagnstico en el laboratorio est basado en el uso de mtodos directos e indirectos

para la identificacin de la bacteria. El mtodo directo consiste en identificar B.

pertussis, B. parapertussis, u otras especies de Bordetella spp., ya sea por cultivo o por

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

El procedimiento indirecto esencialmente se lleva a cabo con pruebas serolgicas que

consisten en detectar anticuerpos especficos contra los componentes de la bacteria de

un paciente infectado.

Mtodo directo

El mtodo de cultivo es considerado por la OMS como el estndar de oro para la

recuperacin y confirmacin del microorganismo de casos por laboratorio, es sensible

hasta el 60%. El xito de la tcnica de cultivo est basado en su especificidad y en la

oportunidad para la toma de la muestra, que debe ser dentro de las dos a tres primeras

semanas del inicio de la tos.

El mtodo de PCR presenta la ventaja de ser ms sensible que el cultivo bacteriano y

adems, disminuye el tiempo en la obtencin de resultados, no obstante, es importante

seguir realizando el cultivo para analizar la evolucin de este microorganismo

patgeno y vigilar variantes que puedan ser antignicamente diferentes a las cepas

vacunales actuales, porque a que a travs de la PCR esto no se podra evaluar.

La tincin de inmunofluorescencia directa con anticuerpos especficos a partir de

secreciones nasofarngeas no se debe realizar ni se recomienda por su inespecificidad

ya que frecuentemente se obtienen resultados falsos positivos y negativos (ver figura

5).

Mtodo indirecto

Para el diagnstico por mtodo indirecto (serologa) anteriormente se requera de una

muestra inicial en la fase aguda de la enfermedad y de una segunda muestra en la fase

de convalecencia. Sin embargo, hoy en da existen diferentes inmunoensayos dirigidos

contra diferentes factores de virulencia de B. pertussis entre ellos estn la

Hemaglutinina filamentosa, la Pertactina y la toxina Pertussis, este ltimo antgeno ha

demostrado en diferentes investigaciones realizadas por el Centro de Control y

Prevencin de Enfermedades [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), por

sus siglas en ingles] de Atlanta, ser el inmungeno ms sensible y especfico

comparado con los otros factores de virulencia de B. pertussis. La presencia de altas

concentraciones de anticuerpos IgG anti-toxina Pertussis en el suero de pacientes no

vacunados, indica infeccin.

Inicialmente las pruebas serolgicas de tos ferina fueron diseadas para la evaluacin

de la respuesta de anticuerpos contra diferentes componentes de las vacunas,


Versin No.01

actualmente estos inmunoensayos son de gran utilidad para confirmar el diagnstico

de tos ferina, especialmente cuando los resultados de PCR y/o cultivos no son

determinantes en el diagnstico, considerando que algunas veces se administra

tratamiento con antibiticos previo a la toma de la muestra y que esta situacin

impacta directamente en la recuperacin de B. pertussis por cultivo. Por esta razn la

serologa es empleada como una herramienta diagnstica en individuos que incluso

tienen como antecedente haber recibido vacunacin reciente un ao previo. Esto se

debe a que la cantidad de IgG en contra de la toxina Pertussis tiene un patrn nico,

alcanzando su mxima concentracin rpidamente justo a las 2 semanas de iniciada la

tos y posteriormente decae, por lo tanto se puede dar un diagnstico de una infeccin

reciente siempre y cuando la toma de la muestra se realice en el momento oportuno.

El grupo de edad ms vulnerable son los menores de dos meses, en donde la serologa

no es recomendable por su sensibilidad debido a que su sistema inmune es inmaduro y

existe la interferencia de anticuerpos maternos adquiridos va transplacentaria.

El criterio para la eleccin del estudio por laboratorio en el diagnstico depender de la

evolucin de la enfermedad, la edad del paciente y del estado de su sistema inmune de

tal forma que solo se realizar:

En menores de 2 meses: se recomienda el cultivo bacteriolgico del exudado

nasofarngeo y PCR.

En nios mayores de 2 meses: se debe hacer cultivo del exudado

nasofarngeo y/o PCR con o sin vacunacin reciente, pero la toma de la muestra

debe ser obtenida entre l0 a 14 das del inicio de la tos.

En adultos: el cultivo se recomienda si la muestra es tomada en la fase catarral

o incluso hasta la primera semana de la fase paroxstica; la PCR y la serologa se

recomienda para aquellos pacientes que se encuentran en fases tardas de la

enfermedad.


Versin No.01

ALGORITMOS DIAGNSTICOS PARA EXUDADO NASOFARNGEO

Figura. 5. IRAB-M-01/1 Diagnstico, referencia y control de calidad de Bordetella

pertussis y otras especies a partir de exudado nasofarngeo o cepas. Clave del

tabulador: 1B1534001

Exudado nasofarngeo y cepas para diagnstico, control de calidad o referencia

Aislamientos sugestivos de B. pertussis

Pruebas de coaglutinacin con antisuero especfico para B. pertussis y B. parapertussis

Pruebas bioqumicas

Conservacin a -70 C en Stainer Sholtter

Resiembras en Bordet Gengou o agar Charcoal

Exudado nasofarngeo y cepas se envan para

diagnstico por PCRTR

Estndar del servicio 15 das


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ALGORITMO DIAGNSTICO PARA PCR TR

Figura. 6 Algoritmo para el diagnstico de Tos ferina por PCR TR Mltiple*.

*Todos los casos clasificados como probables o sospechosos en situacin de brotes o defunciones y a los contactos de los casos. Si el resultado del cultivo y PCR es negativo a B. pertussis o B. parapertussis u otras especie de Bordetella, hacer diagnstico diferencial con otros microorganismos.


Versin No.01

ALGORITMO PARA LA DETERMINACIN DE LA TOXINA POR PCR TR

Figura. 7. Algoritmo para la determinacin de la toxina por PCR TR Mltiple Clave tabulador: 1B1530001

Muestra clnica

Extraccin de ADN, manual o

automatizada

PCR en tiempo real multiplex

Resultado

Reportar negativo

Diagnstico diferencial con virus

respiratorios

Reportar

PCR en tiempo real para toxina ptx1

Reportar de acuerdo al criterio de interpretacin

Negativo

Positivo


Versin No.01

Figura. 8. Algoritmo para la vigilancia por laboratorio de Tos ferina y Sndrome

Coqueluchoide Clave tabulador: 1B1534001


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ESTNDARES DE CALIDAD

Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por el laboratorio de la tos ferina se definen los siguientes estndares (cuadro 2).

Cuadro 2. Estndares de evaluacin de la calidad

Indicador Estndar Clculo Accin Evaluacin

Calidad de las muestras

90% de las muestras cumplen con los criterios de aceptacin

(Muestras aceptadas/muestras recibidas) X 100

La define el laboratorio local o estatal. Puede ser capacitacin dirigida u oficio de notificacin

Mensual

Oportunidad en el envo de la muestra

90% de las muestras aceptadas se recibieron hasta 3 das posteriores a su fecha de toma

(Muestras aceptadas hasta 3 das posteriores a su fecha de toma/total de muestras aceptadas) X 100

La define el laboratorio local o estatal. Puede ser capacitacin dirigida u oficio de notificacin.

Mensual

Concordancia analtica

90% de concordancia de las cepas enviadas al InDRE

(Cepas concordantes/Total de cepas aceptadas en el InDRE) X 100

La define el laboratorio con base en el anlisis de causas que deber enviar al InDRE

Trimestral

Evaluacin del desempeo

Al menos 80% de cumplimiento en cada uno de los componentes (IRAS bacterianas)

Se realiza con base en los criterios que se especifican en el informe del anlisis de resultados

El laboratorio realizar un anlisis de causas y enviar su plan de acciones al InDRE.

Semestral

Cumplimiento del envo de cepas

Envo de los aislamientos de Bordetella pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica u otras especies de B. spp.

(Cepas aceptadas en el InDRE/cepas informadas en el Sistema de Informacin en Salud) X 100

El laboratorio de referencia nacional enviar oficio de notificacin.

Trimestral

Para asegurar la funcionalidad de la red de diagnstico para la vigilancia epidemiolgica de tos ferina se deben cumplir los siguientes estndares de servicio, en la fase pre analtica (toma y manejo de muestras), despus en la fase analtica en donde el xito del diagnstico por laboratorio radica en el empleo de la tcnica adecuada en funcin de la evolucin de la enfermedad del paciente y por ltimo, la fase post- analtica en el cumplimiento de los estndares de servicio en tiempo y forma (cuadro 3).


Versin No.01

Cuadro 3. Estndares de servicio por tcnica

Tcnica diagnstica Estndar de servicio

Cultivo Para diagnstico, control de calidad y referencia 15 das

PCR TRM Para diagnstico, control de calidad y referencia 5 das

Serologa (ELISA para deteccin de Acs anti-toxina

Pertussis) Para diagnstico 96 horas

Criterios de aceptacin de muestras

Se aceptarn las muestras que cumplan con las definiciones operacionales de caso para el diagnstico de tos ferina (caso probable, caso sospechoso, caso atpico y contacto).

Muestras registradas en el InDRE. Muestras con volumen de 1.0 mL de solucin salina con Cefalexina para PCR y

medio de transporte Regan Lowe que contengan de 3.0 a 5.0 mL, perfectamente etiquetadas.

Muestras de casos que hayan sido tomadas dentro de las primeras 4 semanas de iniciados los sntomas en pacientes.

Muestras de contactos para bsqueda de portadores tomadas dentro de los 10 das primeros das de iniciado el estudio de caso probable o sospechoso.

Muestras que no excedan las 72 horas de transporte. Muestras almacenadas de 4 a 8 C. Muestras que cumplan los lineamientos del Manual de toma y envo de muestras

editado por el InDRE. Criterios de rechazo de muestras

Se rechazarn las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales de caso para el diagnstico de tos ferina (caso probable, caso sospechoso, caso atpico y contacto).

Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos (formato de laboratorio de estudio de caso de tos ferina y contactos intradomiciliarios, copia del Formato del Sistema Nacional de Salud de Estudio Epidemiolgico de caso de tos ferina).

Muestras de referencia o control de calidad con datos incompletos, sin resultados o que no cuenten con formatos de envo.

Muestras con volumen inadecuado (menos o ms de 1.0 mL) y que no estn etiquetadas adecuadamente.

Muestras que sean tomadas con hisopo de algodn. Muestras que excedan los 2 das de trnsito en reas locales y 3 das en reas

forneas aunque hayan estado refrigerados. Muestras derramadas. Muestras no etiquetadas.


Versin No.01

Muestras que no sean enviadas con refrigerantes. CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS CAPTURA DE DATOS Los datos que acompaan a la muestra en el formato nico para el envo de muestras biolgicas del InDRE o en la historia clnica, o en la solicitud correspondiente son revisados y cotejados inicialmente por el personal del departamento de recepcin de muestras del InDRE, en donde se realiza la clasificacin y distribucin al laboratorio que corresponda y se depositan en el registro general de muestras del laboratorio. En caso de que las muestras o cepas no cumplan con las condiciones de envo se realiza el rechazo correspondiente de muestras el cual depende de su calidad, de acuerdo con lo especificado en el formato de rechazo definitivo de las muestras. Este se entrega en el rea de recepcin de muestras para que se informe al usuario y se solucione el problema administrativo o bien, que se enve otra muestra. En caso de aceptacin se distribuye al rea correspondiente, dependiendo del servicio solicitado o del diagnstico presuntivo del paciente, para su anlisis. La captura de los datos se realiza conforme al procedimiento REMU-P-04, en el sistema de captura INFOLAB.

CAPTURA DE RESULTADOS Todos los resultados emitidos por los diferentes niveles de los integrantes de la RNLESP deben cumplir con las siguientes caractersticas.

Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripcin e informados a las personas autorizadas para recibir y utilizar la informacin mdica.

El informe de resultados debe incluir y sin estar limitado la siguiente informacin:

o Identificacin clara y sin ambigedad del examen. o Identificacin del laboratorio que emite el informe. o Identificacin nica, ubicacin del paciente y destino del informe.

Nombre u otra identificacin nica del solicitante y la direccin del mismo.

Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando est disponible y sea pertinente para el cuidado del paciente, as como la hora de recepcin en el laboratorio.

Fecha y hora de la liberacin del informe, las cuales si no estn en el informe, deben estar fcilmente accesibles cuando sea necesario.

Tipo de muestra primaria.

Resultados de los exmenes.

Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan haber comprometido el resultado).

Identificacin de la persona que autoriza la liberacin del informe.

Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos.


Versin No.01

Firma o autorizacin de la persona que verifica o libera el informe, cuando sea posible.

El correcto y oportuno intercambio de informacin, es la base de la interaccin interna de la RNLSP y a la que debe tener con sus respectivos niveles tcnico-administrativos. Los resultados de laboratorio del InDRE se envan directamente al LESP de la entidad federativa de la que proviene la muestra, la que a su vez es el responsable de hacer llegar el resultado al destinatario final y a la jurisdiccin correspondiente. Este mismo procedimiento es aplicable a los resultados de los estudios que realizan cada LESP o laboratorio local. Los resultados producidos a nivel nacional o estatal deben ser enviados por este ltimo nivel a su homnimo de las otras instituciones del sector salud. En el nivel central la notificacin de resultados de laboratorio la realiza el InDRE por va electrnica al Centro Nacional de Vigilancia Epidemiolgica, a la Direccin General de Epidemiologa y a la mxima autoridad de salud en cada entidad federativa con la frecuencia establecida para cada padecimiento de las vas respiratorias ya mencionados. Si las circunstancias lo ameritan, el informe de los resultados de los estudios realizados para el diagnstico del Sndrome Coqueluchoide y la Tos ferina, en cualquiera de los tres niveles de laboratorios, debe ser enviado en forma inmediata y directa al responsable de la solicitud del examen, con el propsito de administrar al paciente el tratamiento oportuno y adecuado, llevando a cabo el seguimiento de los contactos y convivientes para evitar la posible aparicin de brotes. Con la caracterizacin de la etiologa de la Tos ferina y el Sndrome Coqueluchoide se podr conocer la temporada, su distribucin por grupo de edad, rea geogrfica, y de esta manera ofrecer informacin til a los servicios de salud para la eleccin de las mejores medidas de prevencin y tratamiento adecuado de los casos. PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) A partir de la introduccin del Programa de Evaluacin Externa del Desempeo en la RNLSP, el Laboratorio de IRA bacterianas y Pertussis ha enviado trece paneles de eficiencia; de 2005 a 2012, inicialmente se envi un panel por ao y en 2008 considerando los resultados obtenidos por la red de laboratorios para el diagnstico de IRAS Bacterianas en este periodo, se propuso hacer una modificacin del esquema (un panel por ao) y privilegiar el envo de paneles de eficiencia como una mejor herramienta para la evaluacin del desempeo. Para evaluar el desempeo de la RNLESP se propuso comparar la concordancia de los resultados obtenidos en la identificacin bacteriana obtenida por los laboratorios participantes con los resultados del Laboratorio coordinador considerando los siguientes criterios a partir del 2010.


Versin No.01

a) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos

ltimos aos de evaluacin entre 9.0 y 10.0 en el PEED, se clasifican como sobresalientes

b) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos ltimos aos de evaluacin entre 8.0 y 8.9 en el PEED, se clasifican como satisfactorios

c) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos ltimos aos de evaluacin entre 6.0 de 7.9 en el PEED, se clasifican como mnimos

d) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos ltimos aos de evaluacin menos 5.9 en el PEED, se clasifican como precarios

Es importante mencionar que los criterios empleados durante los aos 2005 al 2009 que se emplearon para evaluar el desempeo de los paneles del primero al sptimo, fueron modificados a partir del 2010 con el fin de mejorar el desempeo de los LESP participantes. La clasificacin del desempeo se realiz empleando los criterios que se especifican en el cuadro 4.

Cuadro 4. Clasificacin del desempeo

Concordancia (%) 2005-2009

Concordancia (%) 2010

Clasificacin del desempeo

90-100 90-100 Sobresaliente 70-89 80-89 Satisfactorio 50-69 60-79 Mnimo


Versin No.01

Cuadro 5. Evaluacin del Desempeo

Concordancia

(%) 2012-2013

Clasificacin

del

desempeo

Porcentaje solicitado para control de

calidad en 2014

90-100 Sobresaliente No envan cepas para control de calidad.

Diagnstico liberado 80-89 Satisfactorio

60-79 Mnimo Se solicita el 100% de cepas positivas para control

de calidad y la asistencia al InDRE del personal

responsable del diagnstico de tos ferina en el

LESP para capacitacin en servicio y atender

reas de oportunidad


Versin No.01

BIBLIOGRAFA

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Versin No.01

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Versin No.01

ANEXOS


Versin No.01

TCNICAS DIAGNSTICAS PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Bordetella pertussis Y OTRAS ESPECIES AFINES.

I. Procesamiento de muestras para cultivo

Propsito Establecer la metodologa para el aislamiento e identificacin de Bordetella pertussis y otras especies de Bordetella spp a partir de muestras clnicas de casos sospechosos y contactos intrafamiliares, as como cepas puras aisladas previamente en otros laboratorios y que son enviadas al InDRE para referencia o control de calidad. Principio del mtodo Este es un mtodo cualitativo recomendado para el aislamiento e identificacin de Bordetella pertussis y otras especies afines. El mtodo se basa en el reconocimiento de las caractersticas morfolgicas microscpicas y coloniales, adems de su comportamiento en los diversos medios de cultivo y pruebas bioqumicas. Sistema de muestra primaria Es toda muestra de exudado nasofarngeo y cepas (cultivos puros) que son enviadas al laboratorio para la bsqueda o confirmacin de B. pertussis u otras especies de Bordetella spp.

Tipo de contenedor y aditivos Utilizar tubos con tapa de rosca para muestras de exudado nasofarngeo con el medio de transporte (solucin salina 0.85% + Cefalexina con una concentracin final de 40 g/mL) o medio de transporte Regan Lowe. El envo de las cepas debe ser en tubos con medio de transporte de Amies o placas con agar Bordet-Gengou o Agar Charcoal. Equipo

Agitador tipo vrtex Balanza semi analtica Incubadora con rango de temperatura de 35 a 37 C Micropipeta de volumen variable de 10 a 100 L. Microscopio ptico Nefelmetro de McFarland. Refrigerador con rango de temperatura de 4 a 6 C Microscopio estereoscpico

Material

Aplicadores de madera Asas bacteriolgicas Bolsas de plstico Cubrebocas


Versin No.01

Guantes Filtros Millipore con tamao de poro de 0.45 m Gasas Gradillas para tubos de ensaye Hisopos de alginato de calcio, rayn o dacrn estriles, con mango flexible Jeringas desechables estriles de 1.0 y 10 mL Mechero Bunsen Marcador indeleble Pinzas Pipetas graduadas estriles desechables de 5.0 y 10 mL Portaobjetos Tiras de papel filtro

Reactivos y material biolgico Reactivos

Antisueros especficos anti B. pertussis y anti B. parapertussis Placas con medio de cultivo BordetGengou, Bordet-Gengou+cefalexina Agar

Charcoal y Agar Charcoal + Cefalexina Medio de transporte (Solucin salina + Cefalexina a una concentracin de 40

g/mL) Reactivos para determinacin de oxidasa, catalasa y nitratos Medio de Citrato de Simmons Medio para ureasa Medio Movilidad Nitratos Agar Charcoal (AC) Agar sangre de carnero Agar Mac Conkey Agar Soya Tripticasena (TSA) Medio para movilidad Reactivos para tincin de Gram Reactivo de coaglutinacin para sensibilizar con antisueros anti B. pertussis y

anti B. parapertussis Solucin desinfectante (hipoclorito de sodio al 1%) Solucin salina 0.85% estril

Material biolgico

Cepa de referencia trazable con Bordetella pertussis ATCC 8467 Cepa de referencia trazable con Bordetella parapertussis Cepa de referencia trazable con Bordetella bronchiseptica ATCC 4617 y/o ATCC

10580 Cepa de referencia trazable con E. coli ATCC 25922 Cepa de referencia trazable con S. aureus ATCC 25923


Versin No.01

Procedimiento

El aislamiento e identificacin de Bordetella pertussis se basa en la identificacin habitual realizando la Tincin de Gram, morfologa colonial y microscpica, prueba de catalasa, prueba de oxidasa, crecimiento en medios especficos, comportamiento bioqumico y confirmacin con antisueros especficos de especie.

Para el diagnstico de tos ferina, tambin se realiza la prueba de PCR tiempo real mltiple a partir de exudado nasofarngeo en solucin salina con cefalexina.

Cuando en el laboratorio se recibe muestra en medio de transporte Regan Lowe esta se procesar por cultivo como se indica en este mtodo.

Si en el laboratorio se recibe nicamente una muestra de exudado nasofarngeo en solucin salina con cefalexina, esta ser dividida en dos partes, una de ellas para procesarla por cultivo y la otra parte se enva al Laboratorio de Bacteriologa (usar formato IRAB-F-103) para que se procese por PCR Tiempo Real Mltiple.

Si en el laboratorio se reciben dos muestras de exudado nasofarngeo del mismo paciente, una en medio de transporte Regan Lowe y la otra en solucin salina con cefalexina, la primera se procesar por cultivo y la segunda por PCR Tiempo Real Mltiple.

1. Aislamiento e identificacin de Bordetella pertussis

El aislamiento de Bordetella pertussis por cultivo, es la prueba especfica para confirmar un caso de tos ferina. Si la muestra se va a procesar de inmediato deber dejarla en el medio de transporte durante 15 a 30 minutos para inhibir la flora asociada y despus sembrar la muestra por duplicado en Agar Bordet Gengou (ABG) y en Agar Bordet Gengou con Cefalexina. Tambin puede utilizarse Agar Charcoal con sangre de carnero al 15% o sangre de caballo al 10% (Agar Regan Lowe) (ARL). Utilizar dos placas, una sin antibitico y otra con antibitico, incubar a 37 C en aerobiosis y en bolsas plsticas (para evitar la desecacin del medio de cultivo). Realizar una primera lectura a las 72 horas de incubacin. En caso de que no se pueda inocular inmediatamente la muestra, en los medios de cultivo para el primer aislamiento; depositarla en el medio de transporte y trasladarla para su procesamiento lo ms pronto posible al laboratorio, en red fra y utilizando el sistema bsico de triple embalaje. (No deben pasar ms de dos das en transporte).

Inocular las muestras de exudado nasofarngeo en Bordet-Gengou (BG), (BG+cefalexina) o Agar Charcoal (AC), (AC+cefalexina) por la tcnica de estra cruzada. Incubar las placas a 37 C durante 3 a 10 das en una atmsfera hmeda.

Revisar las placas diariamente para la bsqueda de colonias sugestivas de Bordetella spp., con la ayuda del microscopio estereoscpico. Las placas se siguen incubando hasta un mximo de 10 das.


Versin No.01

Una vez que se tiene el aislamiento de colonias sospechosas de Bordetella spp., a partir de las muestras clnicas procesadas se realiza la identificacin.

2. Pruebas de identificacin a. Morfologa colonial

En la morfologa colonial sugestiva de B. pertussis en el medio de BG se presentan pequeas colonias ligeramente convexas, de aspecto aperlado con apariencia de pequeas gotas de mercurio, que en su alrededor presentan un halo de beta hemlisis discreta, tienen un olor caracterstico a hipoclorito y se desarrollan a las 72 horas de incubacin. Las colonias de B. pertussis se diferencian de las colonias de B. parapertussis porque estas ltimas crecen en menor tiempo (a las 48 horas de incubacin) son colonias opacas y suaves que generalmente producen hemlisis y pigmento.

Las colonias de Bordetella bronchiseptica van de grises a blancas y crecen en 24 horas.

Nota: La apariencia colonial de estos microorganismos es la misma en placas de Agar Charcoal.

b. Morfologa microscpica Hacer un frote a partir de las colonias sospechosas, teir con la tcnica de Tincin de Gram y buscar la presencia de cocobacilos Gram negativos.

c. Prueba de catalasa y oxidasa Si la tincin de Gram, revela la presencia de cocobacilos Gram negativos realizar las pruebas de oxidasa y catalasa.

Bordetella pertussis y B. bronchiseptica son oxidasa positiva.

B. parapertussis y B. holmessi son oxidasa negativa.

d. Pruebas bioqumicas Las pruebas para la diferenciacin de especie de Bordetella ssp se realizan por medio de la utilizacin de una fuente de carbono diferente (citrato) para su metabolismo, as como por la capacidad para reducir los nitratos a nitritos, movilidad (por la presencia de cilios) y la capacidad de producir la enzima ureasa para la utilizacin de la urea.

Para la inoculacin de las pruebas diferenciales, tomar con una asa desechable estril o hisopo de rayn o dacrn las colonias de un cultivo de 48 horas y preparar una suspensin bacteriana en solucin salina estril al 0.85%.

Igualar visualmente a una turbidez del tubo 4 del Nefelmetro de Mc Farland. Inocular cada una de las pruebas diferenciales (urea, citrato de Simmons y

nitratos) adicionando 4 gotas de esta suspensin (9.5.1.) a cada una de las pruebas. Para la prueba de reduccin de nitratos, una vez inoculado, se realiza una picadura en el agar para visualizar la movilidad.

Incubar a 35 2 C en condiciones de aerobiosis.


Versin No.01

Realizar revisin diaria durante 3 das. Registrar los resultados en el formato IRAB-F-01 para la identificacin de cepas de Bordetella spp.

3. Confirmacin con antisueros especficos

Esta prueba se basa en la identificacin de los antgenos de B. pertussis y B. parapertussis empleando antisueros especficos de especie. Los antisueros empleados para realizar la tipificacin de estos microorganismos son comerciales (Difco o Remel). Procedimiento

1. A partir de un cultivo puro de 72 horas de incubacin en el medio de Bordet-Gengou, realizar una suspensin bacteriana en un tubo que contenga 2.0 mL de solucin salina formalinizada y ajustar la turbidez al tubo no 1 o 2 del nefelmetro de Mc Farland.

2. Limpiar una placa de aglutinacin o un portaobjetos con alcohol (opcional si las lminas ya se han limpiado con anterioridad). Dividir la lmina en dos secciones iguales con un lpiz de cera o marcador indeleble.

3. Para la reaccin de aglutinacin, usar una micropipeta, para transferir una gota (2530 L) de la suspensin bacteriana ajustada anteriormente, a la placa de aglutinacin o el portaobjetos.

4. Agregar 2530 L de antisuero especfico para B. pertussis sobre la gota de suspensin, en una de las secciones de prueba. En una seccin adyacente de la lmina, usar el mismo mtodo para agregar una gota (2530 L) de solucin salina sobre la gota final de suspensin.

5. Mezclar el antisuero y el control de solucin salina con la gota correspondiente de la suspensin bacteriana utilizando un palillo (o un asa estril) por cada seccin. Evite la contaminacin de las secciones.

6. Mover suavemente la lmina hacia atrs y hacia delante con movimientos concntricos durante 2 minutos (tener cuidado de no mezclar las diferentes secciones y evitar que se contamine una mezcla con la otra). Despus de dos minutos, observe las gotas mezcladas y lea las reacciones bajo una luz brillante y sobre un fondo negro.

7. Solo se consideran positivas las reacciones de aglutinacin fuertes. En una reaccin fuerte, todas las clulas bacterianas se agrupan y la suspensin aparece clara.

8. Si las colonias sospechosas no aglutinan con el antisuero especfico se repite la identificacin con el antisuero especfico contra B. parapertussis. Se repiten los pasos del 1 al 6.

9. Cuando una cepa reacciona con ms de dos antisueros y no se aglutina en solucin salina, el resultado se registra como reaccin cruzada.

10. Si se produce agl

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