LABORATORIO ENSAYO COMETA Y MICRONUCLEO

Jos Mercado - Carlos lvarez - Carlos Prez - Yeison Tenorio

Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa, Qumica .AmbientalDoc. Carlos Vergara

Resumen

Las investigaciones relacionadas con el tema de la genotoxicidad adquieren cada da mayor importancia a nivel mundial, debido al creciente deterioro del ambiente al que se encuentra expuesto el hombre moderno. Existen tres razones fundamentales que justifican la preocupacin por la exposicin del hombre a los agentes mutagnicos. Primero, el incremento en el grado de mutacin de las clulas germinales (vulos, espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar un aumento de la incidencia de las enfermedades genticas en futuras generaciones. Segundo, la existencia de una estrecha relacin entre la inestabilidad genmica de clulas somticas con el cncer y las enfermedades degenerativas crnicas. Tercero, el origen ambiental del cncer. Ello orienta a la utilizacin de ensayos a corto plazo los cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagnica de dichas sustancias y en algunos casos brindan informacin suficiente para establecer los niveles de seguridad para el hombre. En estos ensayos de genotoxicidad se emplea un gran nmero de sistemas biolgicos dentro de los cuales se encuentran: virus, bacterias, hongos, cultivos de clulas eucariotas, plantas, insectos y mamferos. Para lo cual nos trazamos como objetivo de este trabajo ver la metodologa sobre el uso del ensayo cometa y el ensayo de microncleos.(ARENCIBIA, Daniel.2003.)

Palabras clave: Genotoxicidad; ensayo de cometa; ensayo de microncleos.

Abstract

The research related with the genotoxicity topic acquire every day bigger importance at world level, due to the growing deterioration of the environment that is exposed the modern man. Three fundamental reasons exist that justify the concern for the exhibition from the man to the mutagenics agents. First, the increment in the degree of germinal cells mutation (ova, sperms and their precursors) that which can cause the increase of the genetic illnesses incidence in the future generations. Second, the narrow relationship existence among the uncertainty of somatic cells genomic with cancer and chronic degenerative illnesses. Third, the environmental origin of the cancer. It bears to the use of short term assays and they inform in little time about the mutagenic activity of this substances, in some cases they offer enough information to establish the levels of security for the man. These genotoxicity assays used a great number of biological systems inside which are: virus, bacterial, fungus, eukaryote cells cultivations, plants, insects and mammals.

Key words: Genotoxicity, comet assay, micronuclei assays.

INTRODUCCION

La integridad de nuestro DNA es un aspecto fundamental para la salud y

el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo, sabemos que el material gentico es susceptible a ser danado por numerosos agentes y/o procesos; asi, por ejemplo, la guanina es especialmente susceptible a las especies reactivas de oxigeno producidas durante el metabolismo normal de la celula (Moller y Loft, 2002).

En relacin al ejemplo anterior, se ha estimado que en el cuerpo humano

se producen diariamente alrededor de 10.000 puntos de oxidacin en el DNA

por clula, y se han encontrado ms de 35 formas diferentes de bases oxidadas en el DNA in vitro (Halliwell, 2000).

Aunque la mayora del dao que se produce en nuestro material gentico

es reparado eficientemente por una compleja maquinaria enzimtica de

reparacin (Jackson y Loeb, 2001), parte de l escapa a este proceso

(acumulndose con la edad) constituyendo uno de los sustratos para el potencial desarrollo de un proceso carcinognico (Hollander et al., 1995).

Estas lesiones no reparadas, o mal reparadas, pueden afectar diversos mecanismos tales como el control del ciclo celular, la expresin gnica y la comunicacin citoplasma-mitocondria, entre otros (Halliwell, 1996; Singh, 1996; Wiseman y Halliwell, 1996).

Si se acepta que el dao en el DNA es perjudicial, la prevencin del mismo o, en su defecto, el incremento en la eficiencia de reparacin, cabe considerarlos como beneficiosos; as, surge la necesidad de contar con herramientas sensibles y fiables que nos permitan profundizar en los aspectos relacionados con ladeteccin de dao en el DNA, as como con su proteccin y reparacin.

En los ltimos treinta aos, se han desarrollado con xito nuevas metodologas capaces de evaluar el dao en el DNA, metodologas que han sido exhaustivamente investigadas, disendose tcnicas que permiten medir directamente roturas de cadena simple (SSB) y de doble cadena (DSB) en el DNA. (Halliwell, 2000).

El ensayo cometa y micronucleo ha tenido un gran impacto en numerosas reas del conocimiento cientfico, especialmente en bioqumica, gentica y biologa molecular. Actualmente el uso de estos dos tipos de ensayo, tanto para su optimizacin como para sus aplicaciones, sigue desarrollndose continuamente.

Ensayo del cometa

Es ampliamente reconocido que el ensayo del cometa fue descrito como

un nuevo mtodo para la deteccin del dao en el DNA a mediados de la

dcada de 1980, aunque la deteccin de dao en el DNA en clulas embebidas en agarosa ya haba sido descrita con anterioridad As, en 1976, Cook et al. publicaron un artculo donde se investigaba la

estructura nuclear basndose en la lisis de clulas usando detergentes no inicos y una alta molaridad de cloruro de sodio. Este tratamiento eliminaba membranas, citoplasma y nucleoplasma, y alteraba los nucleosomas dejando casi todas las histonas solubles en la alta concentracin de sales contenidas en la solucin de lisis. El resultado de esta reaccin es una estructura a la que denominaron nucleoide y que consiste en una matriz (o andamiaje) nuclear compuesto de DNA, RNA y protenas. Esta matriz posee un superenrrollamiento negativo como consecuencia de las torsiones de la doble hlice alrededor de las histonas que conforman los nucleosomas. La permanencia de este superenrrollamiento implica que la libre rotacin del DNA no es posible; as, estos investigadores propusieron un modelo en el cual el DNA est anclado a intervalos a la matriz, organizado en una serie de lazos. Cuando los nucleoides fueron sometidos a la accin de un agente intercalante (bromuro de etidio), se relaj el superenrrollamiento negativo y los lazos de DNA se expandieron fuera del nucleoide, visualizndose mediante la formacin de un halo alrededor del mismo.

Efectos similares fueron observados cuando se utiliz radiacin ionizante.

As, en 1978, Rydberg y Johanson describieron un mtodo para el anlisis de clulas individuales basado en la lisis alcalina de las clulas previamente irradiadas. Posteriormente, esta tcnica fue adaptada a la metodologa de citometra de flujo mediante la encapsulacin de las clulas en agarosa antes de la irradiacin, seguido de una lisis alcalina (Rydberg, 1984). El tratamiento de las clulas con cloruro de sodio 2 M mezclado con detergentes aninicos produjo los ya descritos nucleoides. Estas estructuras estaban compuestas por lazos de DNA de entre 50 y 100 kb que permanecan anclados a una red de naturaleza

proteica (Cook et al., 1976), lo que condujo al desarrollo del ensayo del halo (Roti Roti y Wright, 1987), estructura que se visualizaba alrededor del nucleoide despus de un tratamiento alcalino. En este ensayo, las roturas en el DNA producan el relajamiento del superenrrollamiento de la molcula de DNA, lo que permita la expansin del halo anclado a una matriz de protenas en cada una de las clulas. Esto permite interpretar que una sola rotura en un lazo de DNA es suficiente para relajar el superenrrollamiento del mismo (Rydberg y Johanson, 1978).

En 1984, stling y Johanson presentaron una idea nueva que consisti en la utilizacin de microgeles de electroforesis. As, las clulas embebidas en agarosa fueron lisadas para la formacin de los halos descritos anteriormente y sometidas luego a un campo elctrico, lo que permiti la migracin del material que haba sido expulsado desde el nucleoide. Esta migracin de las molculas de DNA, cargadas negativamente, desde dicho nucleoide hacia el nodo permiti, tanto un evidente incremento de la sensibilidad en la deteccin del dao, como un aumento en la resolucin de subpoblaciones de clulas que mostraban diferente magnitud de dao (stling y Johanson, 1987).

El tipo de dao ms simple detectado con este ensayo correspondi a roturas de cadena doble (DSB), que resultaron en fragmentos de DNA que pudieron ser fcilmente revelados sometindolos a la movilidad en una electroforesis a pH neutro, como lo realizaron stling y Johanson. Las roturas de cadena simple (SSB) no producen fragmentos de DNA a menos que exista una separacin (desnaturalizacin) de las hebras, lo que se logra sometiendo el material a condiciones alcalinas con un pH superior a 12.

Los primeros describieron la versin del ensayo en la que aumentaron

considerablemente el pH de la electroforesis (pH >13), lo que les permiti detectar SSB, sitios lcali-lbiles (ALS) y SSB asociados a la reparacin incompleta por escisin. Debido a que la produccin de SSB y/o ALS por parte de los agentes genotxicos es varias veces mayor en orden de magnitud, comparado con la produccin de DSB, esta versin del ensayo brind un notable incremento de la sensibilidad para identificar agentes genotxicos. Es en este trabajo donde se denomina formalmente a la tcnica como Electroforesis de geles de clulas individualizadas (SCGE del ingls Single Cell Gel Electrophoresis), ms popularmente llamada ensayo del cometa.

Esta tcnica alcalina es la que ha sido adoptada por la mayora de laboratorios frente a la versin neutra de Olive (1989), que slo detecta DSB. Una idea de la aceptacin de la versin alcalina la da el nmero de trabajos publicados que la utilizan (1650), respecto a los que utilizan la versin neutra (44), tal y como se obtiene en la Web of Science, Octubre 2005 (http://wok.mimas.ac.uk/).

Este mtodo ha sido recomendado como la versin ptima del ensayo para la identificacin de agentes con potencial actividad genotxica en el International Workshop on Genotoxicity Test Procedures (IWGTP) (Tice et al., 2000).

En las siguiente siguientes imgenes podemos observar cometas obtenidos de linfocitos aislados

Imagen a) se observa cometas que podran estar clasificados en 0-1

b) se observa la forma tpica de un cometa: cabeza y cola. Donde podramos tener en el rango 3 y 4

en la siguiente imagene se observa un Esquema de la formacin de la cola del cometa

METODOLOGA Y CONSIDERACIONES TCNICAS

Actualmente se estn aplicando numerosas versiones del ensayo del

cometa con mayor o menor frecuencia. Debido a que la versin alcalina (pH>13) es superior en cuanto al espectro de lesiones que reconoce en el DNA y en su mayor sensibilidad para la deteccin de bajos niveles de dao, en comparacin a la neutra (pH = 9,5) o a la medianamente alcalina (pH ~ 12,3), se ha elegido como versin estndar, tanto para la descripcin en detalle de su proceso como para la comparacin con otras versiones.

Despus de la obtencin de las clulas de inters, los pasos bsicos en el ensayo del cometa incluyen la preparacin de los portaobjetos precubiertos con las clulas a evaluar embebidas en agarosa, la lisis de membranas para liberar el DNA, la desnaturalizacin del DNA, la electroforesis, la neutralizacin de la alcalinidad, la tincin y la visualizacin. El aumento del rendimiento de cada una de estas etapas permite una deteccin muy fiable del dao en el DNA.

Los dos objetivos principales de una buena preparacin de las capas de

agarosa son asegurar un soporte estable para la manipulacin de las clulas a evaluar durante todo el proceso, y permitir una fcil y buena visualizacin con un mnimo ruido de fondo. Generalmente, se reparan las capas de agarosa a modo de sndwich, en cuya capa central se encuentran las clulas.

Las clulas son suspendidas en agarosa de bajo punto de fusin (LMP), generalmente a 37 C, y depositadas sobre una primera capa de agarosa de punto de fusin normal (NMP) que cubre el portaobjetos. Se deposita una

tercera capa de agarosa sobre la capa de clulas una vez la segunda se haya solidificado.

La primera capa es utilizada para asegurar una buena adherencia de la capa celular y de la tercera capa al portaobjetos.

Se utilizan soluciones de lisis neutra y alcalina para la deteccin de DSB y SSB, respectivamente. La seleccin del pH de la solucin depender de los objetivos del estudio. Como ya mencionamos, la lisis alcalina es mucho ms frecuentemente utilizada, en comparacin con la lisis neutra, ya que detecta una amplia gama de daos que, adems, son los ms comnmente producidos por los agentes genotxicos, y consiste en someter las clulas ya embebidas en una solucin con una alta concentracin de sales y detergentes a un pH entre 10 y >12, durante al menos una hora.

No existe mucha diferencia entre las soluciones de lisis utilizadas en los distintos laboratorios en cuanto a su

composicin, sin embargo existen tipos celulares que requieren de un segundo detergente para lograr la completa lisis de las membranas.

Esto debe ser evaluado caso a caso.

Antes de la electroforesis, las preparaciones son incubadas durante un tiempo en la solucin de electroforesis alcalina (pH > 13, baja concentracin de sales y sin detergentes), con lo que se consigue la separacin de la doble cadena de DNA y, con esto, la produccin de SSB y la expresin de ALS como SSB y SSB transitorias relativas al proceso de reparacin.

La electroforesis de las clulas para producir los cometas ha mostrado ser uno de los parmetros ms complejos de validar, por lo que en la literatura es el paso descrito con ms variaciones. Las propiedades de la electroforesis son muy analizadas a la hora de estudiar la naturaleza de la formacin de los cometas.

La eleccin del voltaje y del tiempo de electroforesis debe estarrelacionada con los niveles de dao en el DNA expresados y con la concentracin de sales del tampn.

La electroforesis en el ensayo del cometa es diferente de una electroforesis convencional, ya que el DNA necesita migrar slo una fraccin de milmetros para obtener una significativa movilizacin del DNA y, por ende, la formacin de cometas. Esto se puede conseguir con un breve tiempo de electroforesis (5 - 30 minutos) y con voltajes bajos (0,5 5 V/cm). (Singh et al., 1994).

La duracin, tanto de la desnaturalizacin alcalina como de la electroforesis, pueden variar dependiendo tanto del tipo de clula que se quiera analizar como del tipo de dao que ser quiera detectar. Siempre es importante considerar variaciones en esta etapa del ensayo; as, se pueden obtener largos cometas sometiendo las preparaciones a altos voltajes y a largos periodos de tiempo durante la electroforesis.

Las condiciones ptimas de voltaje/amperaje y de duracin de la

electroforesis generalmente dependen de la migracin visualizada en los controles, y el rango de migracin que est siendo evaluado en las clulas tratadas.

El tampn durante la electroforesis contina con el mismo pH (>13) utilizado durante la desnaturalizacin y, con respecto a la temperatura, se han llevado a cabo electroforesis en un rango entre 5 C a temperatura ambiente, resultando que 15 C parece ser la temperatura de mxima discriminacin.

Despus de la electroforesis, se neutraliza la alcalinidad de las preparaciones mediante lavados en un tampn a pH 7,5. Comnmente esta solucin est compuesta de Tris y se contina utilizando, pero una alternativa ms econmica es utilizar PBS 1x disuelto en agua bidestilada, conservando el mismo pH neutro. Tpicamente se realizan tres lavados de 5 minutos; sin embargo, cuando se aprecia un alto ruido de fondo durante la visualizacin, realizar un mayor nmero de lavados y/o incrementar el tiempo de los mismos puede resultar de mucha utilidad en esta y otras situaciones.

Durante la neutralizacin, las hebras de DNA separadas anteriormente y

ubicadas en la cabeza del cometa, se renaturalizan debido a que la estructura (superenrrollamiento) de los lazos est intacta, mientras que el DNA contenido en la cola del cometa permanece como DNA monocatenario.

Esto se ha confirmado mediante tincin con naranja de acridina (AO), donde la fluorescencia producida en los sitios de doble cadena es de color verde y roja en los sitios donde el DNA se encuentra desnaturalizado As, los cometas teidos con AO muestran cabezas verdes y colas rojas (Collins et al., 1997a).

Despus de la neutralizacin, las preparaciones pueden ser teidas y los cometas pueden ser visualizados. Alternativamente, los geles pueden ser deshidratados sumergindolos dos veces en etanol absoluto por 5 minutos cada vez y, as, las preparaciones pueden ser almacenadas y evaluadas cuando se estime conveniente (Singh et al., 1995).

El ltimo paso del ensayo alude a la tincin especfica del DNA. Variables

tales como el fluorocromo para la visualizacin y/o la metodologa utilizada para la recoleccin de datos dependen principalmente de las necesidades especficas del investigador, lo que presumiblemente tendr un pequeo efecto en la sensibilidad y en el poder de resolucin.

Hoy en da, existen aproximadamente tantos mtodos para la cuantificacin del dao como investigadores dedicados a esta tcnica. Se han realizado numerosos intentos para evaluar y cuantificar los patrones de formacin de los cometas de una manera ms fiable y exacta. Se dispone de una gran variedad de sistemas de anlisis de imgenes de clulas individuales, siendo una de las aproximaciones ms flexibles para la coleccin de datos; sin embargo, los mtodos que no disponen de un sistema sofisticado de anlisis, son igualmente tiles.

Ensayo De Microncleos

Durante la divisin celular el material gentico (ADN) contenido en el ncleo celular se replica y divide equitativamente dando lugar a dos clulas hijas idnticas; este proceso puede producirse de manera errnea debido a errores durante la replicacin y posterior divisin del ADN, a roturas cromosmicas y al efecto de la radiacin y de sustancias genotxicas, producindose prdida cromosmica y haciendo que el reparto del material gentico no sea equitativo. Cuando esto ocurre, el material gentico que se desprende y que, por tanto, queda excluido y no se incorpora correctamente al ncleo de la clula hija, origina un nuevo ncleo de menor tamao que el primario denominado microncleo (MN), visible fcilmente al microscopio ptico7. El material gentico desprendido puede derivar de cromosomas enteros o, ms frecuentemente, de fragmentos cromosmicos acntricos que quedan excluidos de los ncleos de las nuevas clulas durante anafase mittica.

El uso de la tcnica del recuento de MN como medida de dao cromosmico sobre cultivos de linfocitos humanos fue propuesta por primera vez por Countryman y Heddle en 1976, cuyo nico requisito era la eleccin de tipos celulares con gran actividad mittica8. Ms tarde, en 1985, el ensayo de genotoxicidad fue mejorado por Fenech y Morley, consiguiendo frenar el proceso de divisin celular cuando la clula slo hubiese sufrido una divisin mittica, para ello desarrollaron la tcnica del bloqueo de la citocinesis (CBMN:cytokinesis-block micronucleus) cuyo fundamento es la utilizacin de un agente qumico denominado citocalasina-B cuya funcin es impedir la citocinesis celular.

Metodologa del ensayo de microncleos

El protocolo bsico para el recuento de MN en sangre perifrica consiste en el aislamiento de los linfocitos mediante una centrifugacin en gradiente. Se realiza el recuento celular y siembra de 0,5x106clulas/mL, que crecen en suspensin en medio de cultivo RPMI 1.640 suplementado con suero fetal bovino, penicilina/estreptomicina y con fitohemaglutinina y se incuban durante 44 horas en estufa a 37C y 5% CO2para favorecer la proliferacin celular.

La muestra de inicio tambin puede ser sangre total, clulas exfoliadas de la mucosa oral o cualquier otro tipo celular con actividad mittica con algunas variaciones en el protocolo. Posteriormente y tras 44 horas, el cultivo celular se somete a la accin de la citocalasina-B. Una vez bloqueada la mitosis y unas 72 horas tras la siembra (28 horas tras el bloqueo) se lleva a cabo el cosechado celular que consiste en someter a las clulas a un choque hipotnico favoreciendo que se hinchen los citoplasmas por un proceso osmtico donde la concentracin de iones del medio es menor que la que la del interior de la clula. Se fijan las clulas con una solucin fresca de metanol: cido actico glacial (6:1 24:1), se tien las preparaciones con Giemsa durante 5 a 10 min y se visualizan al microscopio ptico. El recuento de MN se debe realizar sobre 1.000 clulas binucleadas por cultivo e individuo.

Aunque en teora los linfocitos en cultivo se dividan de forma sincronizada, en la prctica no ocurre de forma idntica en todas las clulas del cultivo, de manera que se pueden encontrar en un mismo cultivo celular clulas mono, bi y multinucleadas, clulas en vas de apoptosis y necrosis

Por ello es necesario conocer tambin las caractersticas de clulas en vas de apoptosis y necrosis para que sean eliminadas del recuento, ya que slo deben incluirse las clulas viables. Las clulas en vas de apoptosis se caracterizan por presentar cromatina condensada, que en etapas tempranas de apoptosis puede manifestarse como cromatina marginal y que ms tarde, conforme avanza el proceso apopttico, culmina en la fragmentacin del material nuclear, quedando ste disperso en el citoplasma y reflejndose en una tincin ms oscura con respecto a la habitual. En el caso de fenmenos necrticos, las clulas que los sufren muestran citoplasmas plidos, presencia de vacuolas que se localizan principalmente en el citoplasma, dao evidente en la membrana citoplasmtica con ncleos intactos en etapas tempranas de necrosis; en cambio las clulas en estados avanzados del proceso necrtico muestran prdida del citoplasma y dao irregular en la membrana nuclear con slo una parte de la estructura nuclear intacta. Las condiciones ptimas en un ensayo de MN requieren un porcentaje de clulas binucleadas entre 35-60% sobre 500 clulas viables10.

Factores de variabilidad

Existen diversos factores que pueden influir en la frecuencia basal de MN; la edad ha sido ampliamente estudiada, relacionndose mayor edad con mayor ndice de MN11,13,14. En el caso del anlisis del gnero, las mujeres presentan una frecuencia basal superior a la de los hombres y el nmero de MN incrementa cuando se superan los 35 aos de edad. La presencia de homocistena en plasma, el dficit de folato y vitamina B12 conducen a un incremento de la frecuencia basal de MN

En el caso de las mujeres, la entrada en la menopausia y el posible desarrollo de osteoporosis se relacionan con un mayor ndice de MN16. Otros estudios relacionan un descenso del nmero de MN al suplementar la dieta con agentes antioxidantes como la vitamina E, vitamina C, -caroteno, ginseng e incluso infusiones de t17-19.

CONCLUSIONES

El ensayo de MN es una alternativa al test de aberraciones cromosmicas convencional, en el que se analizan las alteraciones presentes en metafases mitticas y permite detectar aberraciones cromosmicas que responden a alteraciones de tipo estructural (efecto clastognico) o alteraciones numricas (efecto aneugnico) del agente en estudio.

Adems, con el ensayo de MN se consigue:

Reducir la dificultad a la hora de realizar el recuento.

Mejorar la sensibilidad del ensayo, ya que los MN slo se cuentan en clulas que han completado una divisin nuclear.

Incrementar la potencia estadstica de los estudios al analizar miles de clulas en lugar de cientos de ellas.

Reducir el coste del ensayo.

El ensayo de MN es, por tanto, un ensayo prctico, universalmente validado y accesible tecnolgicamente, til para evaluar la inestabilidad gentica inducida por agentes genotxicos.

BIBLIOGRAFA

Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C. A., Krieger M., Scott M. P., Zipursky S. L., Darnell J. Molecular Biology of the Cell, WH Freeman, New York, 2004.

Ziga Venegas, L.A. Optimizaciones metodolgicas del ensayo del cometa y su aplicacin en biomonitorizacin humana. Tesis Doctoral en Gentica, Universidad Autnoma de Barcelona- Barcelona, Espaa, 2009.

M. Madigan. J. Martinko. J. Parker, Brock, Biologa de los microorganismos, Pearson, Espaa, 2003.

Albert, L. 2004. Toxicologa Ambiental. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez. Ciudad Jurez, Chihuahua, Mxico

Jimnez, A. M. (2004). Estudio de la capacidad apopttica del cuachalalate (Amphipterygium dstringens) evaluada con el ensayo cometa (Electroforesis unicelular en gel). FES-Cuautitln- Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Tesis para obtener el ttulo de licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo.

Martnez, E., y Flores, G. (2003). Estudio de la accin anticlastognica del cuachalalate (Amphipterygium adstringens.) sobre la induccin de microncleos producidos por ifosfamida. FES-Cuautitln-Universidad

Nacional Autnoma de Mxico. Tesis para obtener el ttulo de licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo