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8/2/2019 Lab Oratorio en Reumato

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USO DEL LABORATORIO REUMATOLGICO

Dra. Vernica Mezzano

El uso del laboratorio en enfermedades autoinmunes reumatolgicas es

indispensable por su papel tanto en la clasificacin o apoyo diagnstico dealgunas enfermedades y en el pronstico de otras. La utilidad de los resultadosva a depender de muchos factores como sensibilidad y especificidad delensayo y la probabilidad pre-test para determinados diagnsticos. Losresultados deben ser siempre analizados en el contexto clnico del paciente, yaque stos constituyen un apoyo y no aseguran un diagnstico. Su mal usopuede conducir a errores diagnsticos y teraputicos por lo que deben pedir yevaluar con prudencia.

Estos exmenes consisten principalmente en la deteccin de autoanticuerpossricos. Tambin se tratar el anlisis de lquido articular ya que es de gran

utilidad en el estudio de las artritis.

El uso del laboratorio general (Hemograma, VHS, PCR, Perfil Bioqumico,exmenes de orina, etc.) ser mencionado en los distintos captulos.

Tcnicas de Laboratorio

A modo de introduccin es importante conocer las tcnicas de laboratorio mscomnmente usadas:

1. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)2. ELISA3. Aglutinacin por ltex4. Nefelometra

A continuacin se detallan algunas caractersticas de las tcnicas.

Inmunofluorescencia Indirecta

Es un examen de sencillo y de alta sensibilidad para la deteccinprincipalmente de anticuerpos antinucleares (actualmente el gold standard

para su bsqueda). Se usa tambin para la deteccin de anticuerpos anti-DNA,ANCA y otros.

Consiste en incubar suero del paciente en distintas diluciones, con clulas otejidos sustrato (HEp-2, Crithidia luciliae, neutrfilos, etc.), montados en unportaobjeto. Los resultados son expresados como positivos o negativos adistintas diluciones 1/40, 1/80, 1/160 y as progresivamente mayores segn elexamen.

La gran desventaja de este mtodo es que es operador dependiente y laconfiabilidad de sus resultados est directamente relacionada a la experiencia

del observador.


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ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)

Es una tcnica simple que se basa en la unin antgeno-anticuerpo. Para labsqueda de autoanticuerpos se incuba el suero del paciente en un pocillo encuyas paredes se encuentra adherido el antgeno especfico, luego se lava

quedando en el pocillo slo los anticuerpos que se han unido al antgeno. Seusa luego un segundo anticuerpo dirigido contra la porcin Fc de la Ig (anti IgG,M, A o polivalentes) que se unira al primer anticuerpo (el del paciente).Finalmente, mediante un sustrato colorimtrico (se activa mediante enzimasque se encuentran en el segundo anticuerpo) se determina la cantidad deanticuerpo presente (a mayor intensidad del color, mayor concentracin sricadel autoanticuerpo).

Es de fcil procesamiento y generalmente automatizado lo que permite realizarun mayor nmero de exmenes, barato y menos operador dependiente.

Aglutinacin por ltex

Esta tcnica se usa principalmente para la bsqueda de Factores Reumatoides(FR).Se utilizan partculas de ltex recubiertas con IgG, las cuales se aglutinanen contacto con FR polimricos. Se usan diluciones progresivamente mayoresdel suero del paciente, y se informa como positivo o negativo a la ltimadilucin en la que se observa aglutinacin. Es un examen sencillo y barato.

Nefelometra

Consiste en el anlisis automatizado de la dispersin de la luz al chocar contracomplejos antgeno-anticuerpo formados al incubar suero del paciente con elreactivo. A mayor concentracin de complejos (mayor turbidez de lasuspensin), mayor la dispersin.

A continuacin se detallarn los exmenes de utilidad segn enfermedades.

ARTRITIS REUMATOIDE

Factor ReumatoideLos Factores Reumatoides (FR) se asocian principalmente a ArtritisReumatoide pero tambin se encuentran en otras enfermedades autoinmunese infecciosas. Son inmunoglobulinas tipo IgM (se puede detectar por mtodostradicionales tambin de tipo IgA) dirigidas contra la porcin Fc de las IgG.

El FR es uno de los criterios de clasificacin de la Artritis Reumatoide (AR) delAmerican College of Rheumatology de 1987 y se asocia a mal pronstico(enfermedad articular agresiva y compromiso extra-articular).

La tcnica ms utilizada es generalmente la aglutinacin por ltex. Tambin sepueden determinar mediante ELISA y nefelometra y otras. Se usan distintas


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diluciones del suero y los valores se expresan segn la tcnica en estasmismas diluciones o en unidades.

ste es un ensayo sensible pero no especfico (especificidad deaproximadamente 80%) para AR, ya que se encuentra presente en muchas

otras enfermedades, entre stas: infecciones crnicas, enfermedadespulmonares inflamatorias o fibrosantes, neoplasias, etc. Por lo tanto, lainterpretacin de su resultado depende exclusivamente del criterio clnico.

Tabla 1. Frecuencia de FR en enfermedades reumticas y otras

Enfermedad Frecuencia aproximada (%)

Artritis Reumatoide 80

Sndrome de Sjgren 75 - 90LES 15 - 35EMTC 50 - 60Esclerosis Sistmica 20PM / DM 5 - 10Croglobulinemia mixta 90Endocarditis bacteriana subaguda (EBSA) 40Hepatitis infecciosas 25Tuberculosis 15Sarcoidosis 10

Artritis Idioptica Juvenil 10

*Frecuencia en adultos sanos: 5-7%; en mayores de 60 aos puede llegar a15%.

Adaptada y modificada de (4).

Utilidad del FR en AR:1. Clasificacin2. Apoyo diagnstico3. Pronstico

Anticuerpos Anti-Pptidos Citrulinados Cclicos

Los anticuerpos anti-pptidos citrulinados cclicos (anti-CCP) se hanidentificado como marcadores sensibles y altamente especficos, detectablesen fases precoces de la AR y con capacidad pronstica, siendo hoy en da unapoyo diagnstico importante. Es especialmente til en AR precoz y artritisindiferenciadas. Se ha asociado a enfermedad ms agresiva.

Los ensayos comerciales detectan la presencia de anticuerpos medianteELISA. Los CCP son pptidos sintticos en los cules el sitio citrulinado

esencial es expuesto en forma ptima para ser detectados por los anticuerposdel paciente.


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La sensibilidad de este examen es similar o mejor (hasta 90%aproximadamente) al del FR y su especificidad es >95%.

En cuadros de artritis indiferenciadas su valor predictivo positivo para AR es de

93% y el negativo de 75%. Su hallazgo en sujetos asintomticos podrareflejar un estado de enfermedad latente.

Utilidad de anti-CCP:1. Diagnstico (AR precoz y en AR sero negativa)2. Pronstico3. Seguimiento?

ENFERMEDADES DEL TEJIDO CONECTIVO

Se consideran enfermedades del tejido conectivo (ETC):

1. Lupus Eritematoso Sistmico (LES)2. Sndrome de Sjgren (SS)3. Esclerodermia (SScl)4. Dermato / Polimiositis (DM / PM)5. Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo (EMTC)6. Enfermedad Indiferenciada del Tejido Conectivo (EITC)

Anticuerpos Anti-Nucleares

Los anticuerpos antinucleares (ANA) son fundamentales en el diagnstico yexclusin de enfermedades del tejido conectivo, ya que en stas son positivosen un porcentaje alto. Pero, a la vez son inespecficos ya que se puedenencontrar en enfermedades autoinmunes rgano-especficas, en enfermedadesno autoinmunes como infecciones crnicas, enfermedades linfoproliferativas ytambin en poblacin sana (especialmente en personas mayores, en mujeres yen familiares de primer grado de pacientes con enfermedades reumatolgicasANA positivas). Es por esto que su evaluacin debe ser hecha dentro delcontexto clnico del paciente y con una sospecha diagnstica que justifique supeticin.

Tiene relevancia el ttulo en que son positivos, a mayor dilucin mssignificativo es su hallazgo.En personas sanas se describen valores de hasta:

- >1 / 40: 20 a 30%- >1 / 80: 10 a 12%- >1 / 160: 5%- >1 / 320: 3%

Se determinan generalmente mediante IFI en clulas HEp-2 (clulas epitelialeshumanas de estirpe neoplsica), como sustrato estandarizado. Se pueden

tambin determinar por ELISA.


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Se describen distintos patrones de fluorescencia, los cules se asocian aanticuerpos especficos contra ciertos antgenos y a determinadasenfermedades. Los principales son:

1. Homogneo: se asocia principalmente a anticuerpos anti-DNA.

2. Moteado: se asocia a la presencia de anticuerpos anti-ENA (Ro, La,Sm, RNP, Scl-70).

3. Centrmero (ACA): Dentro de los ANA un subtipo importante y quese puede solicitar de manera independiente son los anticuerpos anti-centrmero. Reconocen hasta 5 protenas centromricas. Suprincipal caracterstica es su presencia en Esclerodermia limitada,con una sensibilidad de aproximadamente 60% y especificidad de >95%. stos rara vez coexisten con anticuerpos anti Scl-70(Esclerodermia difusa).

4. Nucleolar: se asocia a Esclerodermia difusa.

Patrn Homogneo Patrn Moteado

Patrn Centrmero Patrn Nucleolar

Tabla 2. Sensibilidad de ANA en enfermedades autoinmunes

Enfermedad Sensibilidad

Reumatolgicas


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LES 95 100%Esclerodermia 60 80%Sndrome de Sjgren 40 70%PM/DM 40 70%

EMTC 100%Lupus inducido por drogas 100%Artritis Reumatoide 50%

No Reumatolgicas

Tiroiditis de Hashimoto 45%Enfermedad de Graves 50%Hepatitis Autoinmune 100%Hipertensin Pulmonar Primaria 40%

Adaptada y modificada de (2).

Utilidad de ANA en ETC:1. Apoyo diagnstico

Anticuerpos Anti-DNA

La denominacin de anticuerpos anti-DNA, en la actualidad, se refiere casiexclusivamente a aquellos que se unen a DNA de doble hebra (dsDNA), ya quela determinacin de los dirigidos contra de DNA de hebra simple (ssDNA) notiene utilidad clnica.

Se usan para el diagnstico de LES con una alta especificidad (95%) pero conbaja sensibilidad (30-70%).

Se pueden determinar por diversas tcnicas, siendo las ms usadas: IFI,mtodo de Farr (RIA) y ELISA. Mediante IFI y tcnica de Farr se detectananticuerpos de alta afinidad, ms especficos para el diagnstico de LES.La deteccin por IFI se realiza en Crithidia luciliae (protozoos con kinetoplastocon dsDNA circular), como sustrato. El uso de RIA tiene la ventaja de ser un

mtodo cuantitativo que permite el seguimiento clnico del paciente ya que losvalores se correlacionan con la actividad de la enfermedad. El uso de ELISAtiene la desventaja de tener un mayor nmero de falsos positivos.

Utilidad de anticuerpos anti- DNA en LES:1. Determinacin por IFI: diagnstico2. Determinacin por Farr: seguimiento

Anticuerpos Anti-DNA por IFI


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Anticuerpos Anti-ENA (anti Ro, La, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1)

El trmino ENA se refiere a antgenos nucleares extractables: Ro (SS-A), La(SS-B), Sm, RNP, Scl-70, Jo-1. Estos antgenos se han identificado comoblanco de algunos anticuerpos antinucleares. La bsqueda de anticuerposespecficos contra estos ENAs tiene utilidad en la prctica clnica dadas susasociaciones con determinadas manifestaciones y enfermedades.

Su bsqueda se hace preferentemente mediante ELISA para cada uno de losdiferentes antgenos. Este mtodo es de gran sensibilidad y puede detectarconcentraciones pequeas de anticuerpos.

Tabla 3. Asociaciones clnicas de los anticuerpos anti-ENA


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Anti-ENA Enfermedad o Manifestacin Clnica

Ro Sndrome de Sjgren Primario (SS)Fotosensibilidad

Lupus cutneo subagudoLupus neonatalBloqueo AV completo (BAVC) neonatal

La SSBAVC neonatal

Sm LES

RNP EMTCRaynaud

Scl-70 Esclerodermia difusaFibrosis pulmonar

Jo-1 Dermato/Polimiositis

Utilidad de la determinacin de ENAs en ETC:1. Diagnstico2. Ro y La especficamente: evaluar riesgo neonatal y conducta

teraputica y seguimiento en mujeres con ETC embarazadas Ro y/oLa positivas.

Sistema del Complemento

El sistema del complemento est compuesto numerosas protenas plasmticas.

stas constituyen una pieza fundamental en la respuesta inflamatoria. Losniveles de sus componentes se pueden determinar mediante anlisisfuncionales o antignicos. Se busca, en general, encontrar deficiencias de suscomponentes, las que pueden ser adquiridas (por consumo) o heredadas(predisponen al desarrollo de algunas enfermedades autoinmunes o produceninmunodeficiencias).

Los componentes que se analizan de rutina son C3 y C4 y esta determinacinse realiza mediante nefelometra. Niveles elevados se pueden encontrar enenfermedades inflamatorias e infecciosas ya que estas protenas se comportancomo reactantes de fase aguda. Niveles bajos se pueden observar en

enfermedades por complejos inmunes activas como LES y crioglobulinemias,


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donde los componentes se consumen. Por este motivo la determinacin de C3y C4 permite seguir y en algunos casos estimar la actividad de la enfermedad.

Se realiza tambin la determinacin cuantitativa y funcional del Inhibidor deC1. Su deficiencia se asocia a angioedema hereditario.

Utilidad:1. Diagnstico2. Seguimiento de pacientes con LES, evaluacin de actividad.

Figura 1. Algoritmo simplificado para el uso del laboratorio en ETC

ANA (IFI) 1/40 (establecer valor de corte local)ANA (IFI) 1/40 (establecer valor de corte local)

NegativoNegativo PositivoPositivo

LES (ETC) improbableLES (ETC) improbable LES (ETC) posibleLES (ETC) posible

HgmaHgma

VHSVHS

PCRPCR

AntiAnti --DNADNA

(IFI)(IFI)ENAENARoRo

LaLa

SmSm

RNPRNP

C3, C4C3, C4

VASCULITIS

Las vasculitis son diversas y su clasificacin ha sido motivo de controversia. Eneste sentido existen algunos exmenes que nos permiten agruparlas con un findiagnstico y teraputico aunque slo algunas cuentan con marcadoresserolgicos.

Los anticuerpos anti-citoplasma de neutrfilos o ANCA son marcadores quecaracterizan a las siguientes vasculitis sistmicas:

1. Granulomatosis de Wegener (WG) asociado generalmente a c-ANCA

2. Micropoliangetis (MPA) asociado generalmente a p-ANCA


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Sin embargo, tambin pueden estar presentes en otras vasculitis como elSndrome de Churg-Strauss, vasculitis renal aislada, vasculitis inducida pordrogas y en otras enfermedades inflamatorias como ETC, enfermedadesinflamatorias intestinales y hepatitis autoinmune (en estas ltimas,habitualmente p-ANCA).

El mtodo tradicional de determinacin de la presencia de estos anticuerpos yel ms sensible, es mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI). sta serealiza en placas con neutrfilos fijados con etanol. Al haber unin delanticuerpo al neutrfilo se pueden distinguir 2 tipos de patrones segn ladistribucin de la fluorescencia intracelular:

- p-ANCA o patrn perinuclear- c-ANCA o patrn citoplasmtico

Otro mtodo de deteccin de ANCA es mediante ELISA, ms especfico. Con

esta tcnica se realiza la bsqueda de anticuerpos contra 2 antgenos. stos selocalizan en los grnulos azuroflicos de los neutrfilos y en los lisosomaspositivos para peroxidasa de los monocitos:

- Anti-PR3 o anti-proteinasa 3 que es el que generalmente produceun patrn citoplasmtico mediante IFI

- Anti-MPO o anti-mieloperoxidasa que se asocia al patrnperinuclear

Se considera necesario al obtener un resultado positivo mediante IFI elconfirmarlo mediante ELISA.

Como todo resultado por ELISA esta determinacin es cuantitativa. Sirve enseguimiento de la actividad de la enfermedad. Tambin de puede usar la IFIpara la evaluacin de actividad, ya que se puede negativizar en algunospacientes en remisin.

Se considera que el encontrar tanto ANCA por IFI y ELISA aumento su valorpredictivo positivo: VPP IFI: 45%, VPP ELISA: 83%, VPP IFI ms ELISA: 88%.

Tabla 4. Frecuencia de ANCA en distintas enfermedades

Enfermedad Frecuencia p-ANCA(%)

Frecuencia c-ANCA(%)

Granulomatosis de Wegener 5-10 90Poliangetis Microscpica 50-70 50Vasculitis de Churg-Strauss 70-85 10Poliarteritis Nodosa Se ha reportado 5-10GN idioptica 50-85LES Se ha reportado Raro

Sndrome de Goodpasture 10-30ANCA Patrn Citoplasmtico


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ANCA Patrn Perinuclear

SNDROME ANTIFOSFOLPIDOS

Los exmenes de laboratorio en el Sndrome Anti-Fosfolpidos (SAF) son unpilar del diagnstico ya que en los Criterios de Clasificacin su presencia esindispensable junto con las manifestaciones clnicas. Los anticuerposantifosfolpidos son anticuerpos dirigidos contra protenas que se unen afosfolpidos con carga aninica.

Para un diagnstico definitivo de SAF se deben detectar en al menos 2oportunidades separadas por al menos 12 semanas y mximo 5 aos antes de

las manifestaciones clnicas. Estos anticuerpos pueden ser uno o ms de lossiguientes:


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1. Anticuerpos Anti-Cardiolipinas (ACL)2. Anticoagulante Ldico (LAC)3. Anticuerpos Anti-_2 GPI

La presencia de estos anticuerpos pueden dar VDRL falsos positivos.

Los anticuerpos anti-cardiolipinas y los anti-_2 GPI se determinan medianteELISA, rutinariamente para isotipos IgG e IgM (tambin se pueden determinarIgA). Los resultados se expresan en unidades GPL (para anti-cardiolipinas tipoIgG) o MPL (anti-cardiolipinas tipo IgM). Los anticuerpos anti-_2 GPI seexpresan en unidades tradicionales. Se consideran valores significativosclnicamente aquellos moderados (> 40 GPL o MPL) o altos (>percentil 99 parala poblacin).

El anticoagulante lpico se detecta mediante ensayos de coagulacin donde el

ms usado es el de veneno de serpiente de Russell (DRVV). La presencia deeste anticoagulante se puede sospechar por un TTPK prolongado que no secorrige con la adicin de plasma de un pool normal. Se expresa el resultadocomo razn entre el control normal y el paciente, que sugiere o no la presenciade un inhibidor tipo lpico.

Se pueden encontrar anticuerpos antifosfolpidos falsos positivos eninfecciones virales y otras y ocasionalmente asociadas a drogas. Esto se vecon ACL y LAC pero no as con anticuerpos anti-_2 GPI. Por este motivo esfundamental repetir la determinacin despus de al menos 12 semanas de unaprimera muestra positiva.

Estos anticuerpos tambin se pueden observar con distintas frecuencias enenfermedades autoinmunes distintas del LES (en los que se encuentran enaproximadamente un 30%)..

ANLISIS DE LQUIDO ARTICULAR - ARTRITIS POR CRISTALES

El anlisis del lquido articular o sinovial es un examen sencillo y barato y unaherramienta fundamental en el estudio de las artritis ya que es un apoyo en eldiagnstico de las artritis inflamatorias e indispensable en el diagnstico de lasartritis por cristales y artritis sptica. El estudio y manejo de artritis sptica estdescrito en otro captulo de este manual.

En las artritis por cristales ms frecuentes: Gota (cristales de uratomonosdico) y Condrocalcinosis (cristales de pirofosfato de calcio) el anlisisdel lquido sinovial es diagnstico.

En la evaluacin del lquido sinovial hay tres etapas:


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1. Evaluacin de caractersticas fsicas: color, transparencia o turbidez yviscosidad.

a. Color: incoloro, amarillo, hemtico / rojizo, purulento, blanco /quiloso, gris, etc.

Incoloro: lquido sinovial normal, hidrartrosisAmarillos: lquidos inflamatorios y no inflamatorios (distintasintensidades)Purulentos: artritis spticaHemticos: hemofilias, trauma, sinovitis villonodular

b. Turbidez: se considera turbio si no permite leer a travs, a mayorcelularidad mayor turbidez.

c. Viscosidad: se describe viscosidad normal si la filancia es mayora 3 cm al dejar caer una gota del lquido desde una jeringa. El

lquido sinovial normal es viscoso; esta propiedad se pierde en loslquidos inflamatorios.

2. Evaluacin microscpica:

a. Anlisis al fresco: permite la bsqueda de cristales y de clulascon inclusiones (grnulos citoplasmticos grandes observables enAR, artritis por cristales y artritis sptica).

b. Mediante el uso de luz polarizada se facilita la bsqueda decristales birrefringentes. La luz polarizada se obtiene al agregar ala ptica tradicional lentes especiales (polarizador y analizador).La birrefringencia consiste en el brillo de los cristales en un fondooscuro; los cristales tienen colores caractersticos segn laorientacin de su eje mayor en relacin al polarizador cuando sonobservados en un fondo color magenta.

Birrefringencia negativa: el cristal es amarillo cuando el ejelargo se encuentra paralelo al polarizador del microscopio y azulcuando es perpendicular.Birrefringencia positiva: amarillo al estar perpendicular y azul al

estar paralelo (eje largo del cristal).Cristales de urato monosdico:Forma: agujas, generalmente largas, que pueden atravesar losleucocitosBirrefringencia: negativa intensa

Cristales de pirofosfato de calcio:Forma: pequeos, pleomrficos aunque generalmenteromboidalesBirrefringencia: dbilmente positiva


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Se describe tambin la ubicacin de los cristales: intra oextracelulares. En general, durante una crisis debieran observarsecristales intracelulares.

c. Recuento celular de leucocitos. Se expresa en leucocitos por

microlitro. Se debe realizar tambin un recuento diferencial demononucleares y polimorfonucleares.

El recuento permite diferenciar lquidos inflamatorios de aquellosno inflamatorios. Se consideran lquidos inflamatorios aquelloscon un recuento celular mayor a 2000 leucocitos por microlitro.

< 200: normal

< 2000: artrosis, lesiones de ligamentos o cartlagos,trauma, artropatas neuropticas, artropatas

asociadas a enfermedades endocrinolgicasy otras

> 2000: considerar AR, ETC, espondiloartropatas,artritis por cristales, vasculitis, etc.

> 50000: descartar infeccin siempre, tambin sepuede ver en artritis por cristales

3. Gram y cultivo: necesario para el estudio bacteriolgico en artritissptica. Se deben solicitar los exmenes correspondientes segn lasospecha clnica (TBC, artritis gonoccica, etc.).

El anlisis qumico del lquido sinovial, por ejemplo la determinacin de glucosao protenas no es de utilidad clnica y por lo tanto no se realiza de rutina.

REFERENCIAS

1. UpToDate 14.3, 2006.2. Rheumatology 3rd Edition, 2003.3. Kelleys Textbook of Rheumatology, 7th Edition.4. Manual of Rheumatology and Outpatient Orthopedic Disorders.

Diagnosis and Therapy 4th Edition.5. Arch Pathol Lab Med Jan 2000 Vol 124; Arthur Kavanaugh et al.6. Atlas of Synovial Fluid Analysis and Cristal Identification, 1991. R.

Schumacher, Jr. and A. Reginato.

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