La cèl·lula:Unitat d’estructura i funció (4)

La cèl·lula: unitat d'estructura i funcióEl descobriment de la cèl·lula. La teoria cel·lular.Concepte de cèl·lula.Els virus: formes acel·lulars.Forma i mida de les cèl·lules.L'estructura de les cèl·lules.Mètodes d'estudi de les cèl·lules.

Els mètodes d’estudi de les cèl·lules.

La microscòpia òptica (1000 augments)

El microscopi òptic està constituït basicament per:•••

•

•

•

2 lents d'augment (ocular i objectiu). Font d’il·luminació (llum).Condensador (lent que concentra la llum cap a la mostra)Diafragma (dispositiu que s'obre més o menys per regular la quantitat de llum que entra)Platina (on posem el portaobjectes amb la mostra o preparació).Medi: aire atmosfèric.

Preparació de mostres per al microscopi òptic.

http://webs.uvigo.es/mmegias/inicio.html

Preparacions talls histològics permanents.

FIXACIÓ (conservar)

INCLUSIÓ (donar rigidesa)

TALL (facilitar que la llum travessi)

TÍNCIÓ (les cèl·lules són incolores)

MUNTATGE (per posar-­la al MO)

FIXACIÓ

-­ Objectiu: conservar la mostra, és a dir, preservar la

morfologia, l’organització interna i composició quimica.

-­ Fixadors químics (conservants): alcohol etílic 70%,

formaldehid, glutaraldehid, líquid de Bouin i el de Carnoy.

-­ Fixadors físics: la calor, el fred.

Tipus de fixacióPer inmersió Per perfusió (a traves del sistema circulatori)

Fijación por perfusión de un órgano. Mediante perfusión se consigue que la solución fijadora llegue a todas las células del órgano a través del sistema sanguíneo. Mediante una bomba peristáltica se introduce la solución fijadora a través de la arteria que irriga el órgano. Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al órgano.

Fijación por perfusión de un organismos completo. Mediante este tipo de perfusión se introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la presión suficiente permitiendo al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar, la solución fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solución fijadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda;; Vd: ventrículo derecho.

INCLUSIÓ• Objectiu: donar rigidesa per evitar-­ne la deformació durant el tall.

• Més utilitzat: PARAFINA• Abans s’ha de deshidratar perquè el medi d’inclusió (parafina) és hidròfob i cal eliminar l’aigua per una bona inclusió.

• Deshidratació: passar la mostra per dissolucions d’alcohol cada vegada + riques en alcohol → xilé

Deshidratació

Inclusió

TALL

• Objectiu: hem de tallar la mostraen capes fines per deixar passarla llum i poder formar la imatge.• Aparell:micròtom.• Gruix mostra: 6-­12µm

• Micròtoms

Preparació del bloc de parafina per ser tallat

Un cop devastat i retallat el bloc s'obtenen seccions en tires quees col·loquen sobre un

cobert ambportaobjectesaigua calentaportaobjectesprèviament

a uns 40°C. Elha estat tractatamb solucions

adhesives. El calor i lahidrofobicitat de la parafina faque les seccions s'estirin sobrela superfície de l'aigua i un copevaporada queden adherides alportaobjectes.

TINCIÓ• Objectiu: les mostres són incolores i transparents a

la llum, cal tenyir-les per observar les estructures.

• Segons les estructures que es vulguin destacar,

s’utilitzen uns colorants o uns altres• Colorants més coneguts: blau de metilè, l’eosina,

hematoxilina, l’orceïna, la safranina, la picrofucsina,

el Sudan i el verd de metil.

Exemple colorants:hematoxilina (nucli) i eosina (citoplasma)

• Abans de procedir a la tinció pròpiament, si es parteix de talls de parafina, s'han de dur a terme uns tractaments previs ja que els colorants són hidrosolubles.

Secció d'un glomèrul d'un ronyó de mamífer obtinguda a partir d'una inclusió de parafina i tenyit amb hematoxilina-­eosina.

Els nuclis apareixen de color violat (hematoxilina) i el citoplasma de color rosat (eosina)

MUNTATGE

• Objectiu: preparar la mostra perpoder observar-la.

• Es cobreix la mostra amb medi demuntatge viscós i transparent, idesprés es col·loca al damunt uncobreobjectes per protegir-la.

La microscòpia electrònica.A diferencia dels microscopis òptics...•

•

•

•

•

Es recorre al microscopi electrònic quan es volen observar estructuresque estan per sota del poder de resolució del m.o. (ultraestructures)El gran poder de resolució del m.e s'aconsegueix gràcies a que noes fa servir la radiació electromagnètica de la llum visible sino l'altafreqüència d'un feix d'electrons que incideix sobre una mostra.El m.e no usa lents, sinó electroimants que concentren els feixosd'electrons emesos per un filament.Normalment són aparells molt grans ja que els electrons han deviatjar pel buit.Hi ha dos tipus principals:

– Microscopi electrònic de transmissió (MET)– Microscopi electrònic de rastreig (MER)

M.E.TÉs a grans trets, similar al microscopi òptic però molt més gran iinvertit.

Està format per una columna en què es fa el buit, amb un filamento càtode en la part superior que emet electrons. Els electronssón concentrats sobre el pla on es disposa la mostra mitjançantuns electroimants situats a l'interior de la columna.

Les seccions de teixit han de ser ultrafines per poder sertravessades pel electrons.

Prèviament la mostra ha de rebre un tractament amb sals demetalls pesants per tal de donar contrast a la imatge ques'obtindrà: els electrons que xoquen contra els metalls reboten ino travessen la mostra, els electrons que passen xocaran contrauna pantalla fluorescent emeten una llum per cada xoc. Lesimatges obtingudes són sempre per tant en blanc i negre.

M.E.RServeixen per observar superfícies tissulars. Això es possible perquè els electrons no travessen la mostra sinó que són reflectits per la superfície. Per a que això pugui passar s'ha de cobrir la mostra amb una capa demetall pesant com l'or que s'adapti perfectament al relleu de la mostra.

No es necessari fer talls fins.La mostra es escanejada punt per punt amb el feix d'electrons, els electrons reflectits formaran la imatge sobre una pantalla digital.

La imatge obtinguda es tridimensional

M.O. M.E.T. M.E.R.

a) MET (Microscopi electrònic de transmissió)Transmission electronmicroscope••••

Els electrons travessen la mostra.Imatge sobre placa fotogràfica o pantalla fluorescent. Poder de resolució: 4Å1.000.000 augments.

b) MER (Microscopi electrònic de rastreig)Scanning electron microscope••••

Els electrons són reflectits per la mostra. Imatges en 3D sobre projector de televisió. Poder de resolució: 200Å200.000 augments

Comparació

Preparació de mostres per al microscopi electrònic.

• FIXACIÓ:hi ha prefixació amb glutaraldehid i fixació amb tetraòxid d’osmi.

Tetraòxid d’osmi

• INCLUSIÓ:amb resina plàstica.

• TALL: molts fins (150-­500Å) mitjançantultramicròtoms.

ultramicròtom tall i recollida de les mostres en una reixeta

• TINCIÓ: no hi ha tinció, ja que la imatge que resulta de la difracció dels electrons és sempre en positiu i negatiu (blanc i negre).

CONTRAST: en MET es fa un contrast amb solucions de sals de metalls pesants per

ressaltar-­ne les estructures.

Per al MER, cal cobrir completament la mostra

amb una capa de metalls que s’adaptin

perfectament al relleu de la mostra i que no

deixin passar els electrons a través

d’aquesta.

Després s’introdueix la reixeta al tub del

microscopi a través d’una comporta que

evita l’entrada d’aire.

Exemple: linfòcits.Microscopi òptic M.E.T

M.E.R

Augments i resolució dels microscopis.

Nombred’augments = Mida de la imatge (MA) / mida real del’objecte (MR)

Nombred’augments = augments de l’ocular X augments del’objectiu.

Un elevat nombre d'augments no és suficient per distingir bé una imatge si el poder de resolució és baix.

Poder de resolució:• Distància mínima a la qual poden estar dos punts perquè se'ls vegi separats, és a dir, capacitat de distingir dos punts que són molt a prop.

humans: punts separats a 0,1mm (100µm) poder de resolució 100µm

M.O.: punts separats a 0,2µm poder de resolució 0,2µm

M.E.: punts separats a 4Å poder de resolució 4Å

Obertura numèrica

El poder de resolució està directament relacionat amb l'obertura numèrica (O.N)

L'O.N ve a representar la quantitat de raigs de llum que entren a l'objectiu per formar la imatge.

Es compren que com més gran sigui el nº de raigs de llum que procedents de la mostra entrin a formar part de la imatge, major serà la definició d'aquesta.

Una estratègia utilitzada per augmentar l'O.N consisteix en l'ús de les immersions en diferents líquids (que augmenten l'index de refracció entre la preparació i la lent).

Una immersió en oli de cedre permet que tots els raigs que surtin de la mostra siguin aprofitables per a la formació de la imatge.

En un M.E, com que l’amplada del flux d’e-­ és molt més petita que el flux de fotons de la llum visible, pot arribar a un milió d’augmentsamb una bona resolució

Quin microscopi és?

Epiteli nasal

Epiteli respiratori

Epiteli intestinal

Epiteli intestinal