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Jornada Práctica

Determinación deHuevos de Helmintos en Aguas

según método Bailengermodificado por la OMS

Meritxell Mas

Introducción

•Toma de muestras:

• Objetivos

• Tipos de muestras

• Control y vigilancia

• Punto de muestreo

• Medidas de seguridad

• Volumen de muestra

• Materiales y equipos

• Muestreo

• Etiquetado

• Transporte y conservación

Introducción

•Técnica analítica:

• Selección del método

• Equipos y material

• Reactivos

• Concentración por sedimentación

• Concentración por centrifugación

• Concentración por método difásico

• Concentración por flotación

• Observación

• Identificación

• Artefactos

TOMA DE MUESTRAS

Toma de muestrasObjetivos

• Obtener una muestra de agua que sea representativa del agua que queremos ensayar.

• La muestra debe ser suficientemente pequeña para poder ser transportada y manipulada con facilidad en el laboratorio.

• El personal encargado de la toma de muestras debe garantizar la validez e integridad de la toma de muestra, de su transporte y su conservación.

Toma de muestrasTipos de muestras

• Muestras simples: Muestras tomadas en un lugar y momento determinados para su posterior análisis individual.

• Muestras compuestas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas en un lugar determinado y en tiempos distintos, las cuales se mezclan y homogenizan.

• Muestras integradas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas simultáneamente en distintos lugares, las cuales se mezclan y se homogenizan.

Para el análisis de huevos de helmintos pueden tomarse muestras simples o compuestas

Toma de muestrasControl y vigilancia

• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El laboratorio debe disponer de un plan de muestreo que incluya:

• Objetivo• Antecedentes• Tipo de muestreo• Ubicación y descripción del sitio de muestreo• Medio de transporte• Personal• Lista de verificación de materiales, reactivos y equipos• Plan de seguridad• Control de calidad


• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El muestreo debe estar debidamente documentado y debe ser

trazable.• El control del muestreo debe incluir:

• Recipientes para el muestreo• Reactivos y equipos necesarios• Condiciones de toma de la muestra• Preservación• Codificación• Transporte• Entrega de la muestra al laboratorio


• Proceso de control:• Identificar la muestra con la etiqueta

correspondiente

•Sellar la muestra con cinta adhesiva para evitar adulteraciones


• Proceso de control:• Elaborar un libro de campo donde anotar todas las observaciones

que procedan durante el muestreo


• Proceso de control:• Establecer un registro de control y vigilancia de la muestra


• Proceso de control:• Acompañar la muestra con una solicitud del análisis• Entrega de la muestra al laboratorio en el menor tiempo posible• Registrar la recepción de la muestra en el laboratorio

Laboratorio

Toma de muestrasPunto de muestreo

• Consideraciones generales:• Punto de muestreo accesible• Posibles fuentes de contaminación• Caudal• Velocidad de la corriente

En general, tomar las muestras en zonas de mayor turbulencia o en el centro de la corriente

MUESTRA REPRESENTATIVA


• Tipo de masa de agua:• Embalse• Lago natural• Lago artificial• Balsa• Río• Efluente tratamiento secundario EDAR• Efluente tratamiento terciario EDAR• Industrial:

• Tipo de industria• Tratamientos aplicados• Posibles contaminantes


• Tipo de agua:• Agua corriente• Agua estancada superficial• Agua estancada de profundidad

• Uso al que se va a destinar (RD 1620/2007):• Urbano• Agrícola• Industrial• Recreativo• Ambiental

Medidas de seguridadEquipos y materiales necesarios

Toma de muestrasMedidas de seguridad

• El personal debe recibir formación e información sobre las medidas de seguridad y del uso de equipamiento adecuado.

•Si procede, debe recibir la inmunizaciónapropiada y someterse a un examen médicopara verificar que la actividad no supone riesgo para él ni para sus compañeros.


• Es recomendable que el personal vaya acompañado cuando la zona de muestreo se considere de riesgo e informar a otros de la ubicación del punto de muestreo.

•Debe disponer de radio o teléfono, y de un botiquín de primeros auxilios, así como de un plan de emergencia.


• Deben usarse los equipos necesariosque garanticen la seguridad del personal, y una vez finalizada la toma de muestras, deshacerse de los residuos generadosde forma adecuada (papel secante, guantes desechables…), lavarse bien las manos y desinfectar.

•Está prohibido comer, beber o fumardurante el muestreo.


• Equipo obligatorio:• Ropa cómoda• Bata• Guantes• Gafas de protección• Mascarilla con válvula• Calzado antideslizante

• Otros equipos/accesorios:• Casco de seguridad• Lámparas (muestreo nocturno)• Detector de gases• Arnés de seguridad

Toma de muestrasVolumen de muestra

• Según RD 162072007, la técnica de referencia para el análisis de huevos de helmintos en aguas és el método Bailenger modificado por Bouhoum & Schwartzbrod (OMS, 1989), que dispone que el volumen inicial de muestra es de:

• 1 litro para aguas residuales crudas o parcialmente tratadas• 10 litros para aguas tratadas

• La Agencia de Protección Ambiental (EPA) establece para lodos de clase A:

• Huevos de helmintos viables: < 1 huevo 7 4 gramos de SST

Toma de muestrasMateriales y equipos

• Envases de polietileno, con paredes lisas

• Etiquetas de identificación de la muestra

• Rotulador resistente al agua

• Cinta adhesiva para precintar la muestra

• Formol 4% si se requiere fijar la muestra

• Neveras para transporte a 4ºC

• Documentos que deben acompañar la muestra

10 L 1 L

4ºC

Toma de muestrasMuestreo

• Consideraciones previas:

• Lavar el recipiente con detergente (Tween al 80% o Tritón X-100) o con lejía.

• Enjuagar varias veces con agua destilada o desionizada.

• Antes de tomar la muestra, lavar varias veces con el agua que seva a muestrear (algunos autores consideran que para análisis de huevos de helmintos no es necesario).

• En caso de que no se pueda tomar las muestras directamente, se pueden tomar con muestreadores, cubeta y cuerda, o con una botella Van Dorn.

Van Dorn


• Muestreo en descarga libre:

• Colocar el recipiente directamente en el chorro de agua, destaparlo, dejar que se llene hasta el volumen deseado y tapar sacándolo del chorro.


• Muestreo en canales y colectores:

• Introducir el recipiente cerrado entre 15 y 30 cm de profundidadprocurando que la abertura esté a contracorriente del canal. Destapar y llenar hasta el volumen deseado. Cerrar y extraer.

Toma de muestrasEtiquetado

• Tomada la muestra:

• Se sella

• Se colocan las etiquetas identificativas

• Se rellena el cuaderno de campo y los documentos pertinentes

Toma de muestrasTransporte y conservación

• Muestras de agua:

• Transporte en neveras a 4ºC.

• Conservación a temperatura ambiente y sin fijar: hasta 4 días desde de la toma de muestras.

• Conservación refrigeradas a 4ºC en oscuridad: hasta 6 meses desde de la toma de muestras.

• Fijadas con formaldehído al 4%: hasta 6 meses desde la toma de muestras.

• Muestras de lodo:

• Transporte en neveras a 4ºC.

• Idealmente el análisis debe realizarse inmediatamente después de la toma de muestras.

TÉCNICA ANALÍTICA

Técnicas analíticasSelección del método

Equipos:•Bomba peristáltica•Centrífuga de 0 a 3.000 rpm•Microscopio de campo claro (Köheler)y objetivos de 10x y 40x

•Balanza•Agitador magnético•Densímetro

Método Bailenger modificado

Material:•Bomba de sifón•Tubos de centrífuga•Pipetas Pasteur de 3 ml•Cámara de McMaster•Probeta graduada de 1 litro•Matraz aforado de 1000 ml•Espátula•Guantes de látex•Varilla de agitación•Recipientes de plástico inerte con paredes lisas de 2000 ml•Pipetas graduadas de 5 y 10 ml

Equipos y Material

Método Bailenger modificadoReactivos

• Reactivos comerciales:• Acido acético glacial• Sodio acetato anhidro• Etil Acetato• Zinc Sulfato 7-hidrato• Agua destilada

• Preparación de soluciones:• Solución amortiguadora ácido-acética (pH 4,5): Disolver 15 g de

acetato sódico y 3,6 ml de ácido acético glacial; enrasar a 1 litro con agua destilada.

• Solución de sulfato de zinc al 33% de densidad relativa 1,18: Disolver 330 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4·7H2O) en 1000 ml de agua destilada; mezclar en el agitador magnético hasta homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro. Ajustar la densidad a 1,18 agregando sulfato de zinc o agua destilada según sea el caso.

• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger 2 litros de sedimento• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger de 50-200 ml de sedimento

25 o 10 L

Agua

Decantar mín. 24 h

Decantar mín. 24 h

50-200 mL

Método Bailenger modificadoConcentración por sedimentación

2 L

50-200 mL

• Centrifugar a 1000g durante 15 min• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento

1000 g15 min

Centrifgar Eliminarsobrenadante

Concentración por centrifugaciónMétodo Bailenger modificado

• Adicionar Tampón aceto-acético (a mín 10 mL)• Adicionar Acetato de etilo (a mín 5 mL)• Homogenizar y centrifugar a 1000g durante 15 min

1000 g15 min

1.Homogenizar

2.Centrifgar

-Tampón aceto-acético (mín.10 mL)

- Acetato de etilo (mín.5 mL)

Tapón lipófilo

Fase acuosaSedimento

Fase etérea

Método Bailenger modificadoConcentración por método difásico

• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento• Addicionar Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)

Eliminarsobrenadante

Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)

Método Bailenger modificadoConcentración por flotación

• Homogenizar la muestra• Transferir la muestra a la cámara McMaster• Dejar reposar durante 5 min• Observar al microscopio óptico (campo claro) a 10x• Repetir las operaciones anteriores hasta haber analizado toda la muestra

Homogenizar

Detectar, Identificar y Cuantificar

Método Bailenger modificadoObservación

IdentificaciónMétodo Bailenger modificado

ArtefactosMétodo Bailenger modificado

Ascaris fértilGrano de polen

TaeniaGrano de polen


AnquilostómidoTecameba (Arcella)

Grano de polen Diphyllobothrium


TaeniaGrano de polen

AnquilostómidoGrano de polen


TrichurisAlga

TrichurisEspora de hongo


Ascaris

Anquilostómido

Grano de polen

AnquilostómidoHuevo de metazoo


Ascaris fértilQuiste de protozoo

Ascaris infértilFlóculo


AnquilostómidoBurbuja de aire

Dipylidium caninumGránulos de almidón

EJERCICIOS PRÁCTICOS

Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado

Ascaris


Ascaris

Trichuris


Ascaris


Burbuja de aireAscaris fértil

Grano de polenAscaris decorticado

25um


Taenia

Quistes de protozoos Ascaris infértil

Flóculo compacto


Anquilostómido

Granos de polen(Euphorbia pulcherrima)

Trichuris

Granos de polen


TaeniaAscaris

Anquilostómido

Tecamebas(Centropyxis)


Trichuris Tecamebas(Arcella)

Huevo de rotífero(Macrotrachella)

Ascaris

Anquilostómido


Hymenolepis

Huevo de rotífero

Fasciola

Paragonimus


Ascaris Diphyllobothrium

Taenia

Schistosoma


Clonorchis

Hymenolepis

Capillaria

Toxocara


Dicrocoelium

Opistorchis

Enterobius

Fasciola

Jornada Práctica

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