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MODELO FÍSICO DE LOS PARÁMETROS Y EFECTOS HIDRODINÁMICOS

INVOLUCRADOS EN UNA SEPARACIÓN ÓPTIMA DE CÉLULAS USANDO

UNA TÉCNICA CAMPO-FLUJO (S-SPLITT)

Iván Camilo Navarrete Quecano

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Física

Bogotá, Colombia

2013

MODELO FÍSICO DE LOS PARÁMETROS Y EFECTOS HIDRODINÁMICOS

INVOLUCRADOS EN UNA SEPARACIÓN ÓPTIMA DE CÉLULAS USANDO

UNA TÉCNICA CAMPO-FLUJO (S-SPLITT)

Iván Camilo Navarrete Quecano

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias-Física

Directora:

Ph.D. María Marcela Camacho Navarro

Codirector:

Ph.D. Mauricio Hoyos Hoyos

Grupo de Investigación:

Grupo de Biofísica y Biología de Membranas.

Avalado por Centro Internacional de Física (CIF) y Universidad Nacional de Colombia.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Física

Bogotá, Colombia

2013

Por su esfuerzo y su desvelo, por su ejemplo

y ternura, por todo lo que compartimos en

esta foránea existencia con el amor más

absoluto. Por todas sus enseñanzas sobre

todo la de tener valor y perseverar para

conocer. A mis padres y hermano mío.

A una mujer única con quién compartimos el

amor por la vida, la ciencia y la física: Mi

Adru.

Agradecimientos

A la profesora María Marcela Camacho Navarro, gracias por el apoyo recibido a lo largo

de esta grata estadía, por permitirme aprender muchas cosas en Biofísica, y propender

experiencias académicas que me hicieron crecer, gracias a sus aportes y correcciones,

pero sobre todo por permitirme trabajar en el laboratorio de biofísica, grupo de Biofísica y

Biología de membranas.

Al profesor Mauricio Hoyos por sus aportes y correcciones, muchas gracias por abrir las

puertas de su laboratorio en París, por la información y formación suministrada en Splitt y

en la construcción de canales S-Splitt.

Al Centro Internacional de Física por permitirme estar en un centro de investigación

independiente y único en su tipo, por el acceso a sus laboratorios y equipos, al igual que

por el apoyo suministrado por sus funcionarios y cuerpo administrativo.

A la Universidad Nacional de Colombia por brindarme buenas experiencias académicas,

al igual que docentes de calidad a los cuales agradezco la formación en estos años.

A Colciencias1 por darme la oportunidad de contar con un apoyo económico durante el

transcurso de este trabajo.

1 Camacho M, Sánchez M, Gómez MP, Stuhmer W. (2010) Estudios de la membrana de la vacuola

parasitófora de Leishmania. 519-2010 Banco proyectos Salud-nacional Colciencias, 222851928951, Código

Hermes 13002.

VIII

Al Laboratoire Du Physique et mecanique du mileaux heterogenes (LPMMH) en el marco

de cooperación ECOS NORD - Colciencias 2, me ofreció la posibilidad de llevar a cabo

una pasantía de investigación en tan reconocido centro.

Agradecimientos a mis compañeros del laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas

por sus enseñanzas y apoyo directo en el trabajo, en especial a Michael García, Carolina

Ochoa, Lina Taboada, July Buitrago, Yenny Lozano, gracias a todos los compañeros del

grupo de Biofísica y Biología de Membranas que apoyaron el trabajo.

Un agradecimiento especial a mi colega y amigo Abelino Vargas pues gracias a las

discusiones planteadas alrededor del trabajo fue posible madurar conceptos e ideas que

hicieron posible su realización.

2 Camacho M, Hoyos M. Utilización de la levitación acústica para la separación y clasificación de células.

Convocatoria para conformar un banco de elegibles para el intercambio internacional de investigadores e innovadores en el marco de la formulación o de la ejecución de proyectos de investigación año 2011. ECOS-Colciencias.

Resumen y Abstract IX

RESUMEN

Este trabajo reporta un modelo de separación y los parámetros físicos necesarios para

enriquecer fracciones de un organelo intracelular llamado vacuola parasitófora PV. La PV

es generada al interior de macrófagos (células del sistema inmune) de la línea celular

J774.A1 al ser infectados por el parásito Leishmania amazonensis. Para la separación se

usó la técnica de separación hidrodinámica llamada Splitt thin flow fractionation acoplada

a una celda de separación Step-Splitt.

Se determinaron los parámetros propios (densidad, tamaño, forma), de esta línea celular

sin infección, en infección por el parásito L. amazonensis y luego de ruptura mecánica.

Además se determinaron las propiedades físicas del fluido transportador en el dispositivo

Step-Splitt (densidad, viscosidad dinámica) a dos temperaturas diferentes en el rango

fisiológico.

Con el hallazgo de estos parámetros y con criterios de sedimentación gravitacional de los

cuerpos celulares se diseñó, construyó y simuló mediante el paquete CFD Fluent® la

celda de separación, para analizar la estabilidad hidrodinámica y los parámetros que

optimizan la separación de estos organelos celulares.

Palabras clave: Separación celular, Técnica Splitt, Celda S-Splitt, Vacuola Parasitófora,

Leishmania amazonensis, Macrófago infectado, Ruptura Celular, Simulación,

Estabilidad Hidrodinámica.

X

Abstract

This manuscript reports a fractionation model using a hydrodynamic cell separation

technique called Splitt Thin Flow (SPLITT) coupled to a Step-Splitt mechanism to

separate a fraction of an intracellular organelle called the parasitophorous vacuole (PV) of

Leishmania amazonesis. It reports the physical parameters involved in the enrichment of

PVs which are generated inside macrophages (immune system cells) after interaction

with the parasite Leishmania. The physical parameters (density, size, shape) of the

macrophage-like mammalian cell line J774.A1 were measured in control conditions and

after infection. Differences in density, size and shape were found between these two

groups of cells and after mechanical disruption of infected cells. The physical parameters

of the carrier fluid (density and dynamical viscosity) were also measured at two different

temperatures within the physiological range. Based on the parameters found and

gravitational sedimentation criteria over the cell bodies, a Step Splitt cell was designed

built and simulated using the CFD Fluent® Package to analyze the hydrodynamic stability

and the potential parameters to achieve organelle separation.

Keywords: Cell fractionation, Splitt Technique, Parasitophorous Vacuole, Leishmania

amazonensis, infected macrophage, Cell’s rupture, Simulation, hydrodynamic stability.

Contenido XI

Contenido

1 LA TÉCNICA SPLITT .............................................................................................. 20 1.1 La celda de Splitt ................................................................................................ 20 1.2 Flujos en el canal y manipulación de planos de separación. ............................... 23 1.3 Mecanismo de transporte por sedimentación gravitacional ................................. 28 1.4 Mecanismo de Separación Step-Splitt................................................................. 30 1.5 Consideraciones. ................................................................................................ 32 2 PROPIEDADES FÍSICAS DE CÉLULAS Y FLUIDO VECTOR. ............................... 33 2.1 Vacuolas parasitóforas y el ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis. 33 2.2 Obtención de vacuolas parasitóforas en cultivo de macrófagos. ......................... 35 2.3 Disrupción mecánica de macrófagos infectados. ................................................ 37

2.3.1 Dispositivo de Ruptura. ........................................................................... 38 2.3.2 Montaje para ruptura de membrana celular ............................................ 39

2.4 Parámetros físicos de interés posteriores a una ruptura celular. ......................... 42 2.4.1 Densidad ................................................................................................ 44 Elaboración de rangos de densidad ..................................................................... 45 Medición de densidad: macrófagos infectados, sin infectar y vacuolas parasitóforas con detritos celulares. ..................................................................... 47 2.4.2 Tamaños ................................................................................................ 51 Tamaño macrófagos sin infección ........................................................................ 53 Tamaño macrófagos infectados ........................................................................... 54 Tamaño vacuolas parasitóforas y detritos celulares ............................................. 55 2.4.3 Forma. .................................................................................................... 58

2.5 Caracterización de parámetros en el flujo transportador ..................................... 61 2.5.1 Viscosidad del Fluido vector. .................................................................. 62

2.6 Medida de densidad Para la solución Salina NaCl .............................................. 65 2.7 Caracterización y fabricación de la celda de separación. .................................... 66 3 MODELO FISICO DE LA SEPARACIÓN................................................................. 73 3.1 Fuerzas sobre las células en la celda Step-Splitt. ............................................... 73 3.2 Velocidad de sedimentación para cuerpos celulares. .......................................... 75 3.3 Estabilidad hidrodinámica y tasas de flujo. .......................................................... 77 3.4 Separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis. .................. 83 4 Conclusiones. ......................................................................................................... 87 5 Recomendaciones .................................................................................................. 89 6 Anexo 1: Solución numérica de las ecuaciones que caracterizan el movimiento de un fluido. ................................................................................................................... 91 6.1 Solución numérica de las ecuaciones de Navier-Stokes ..................................... 93

Proceso de solución numérico ............................................................................. 95

Contenido XII

Lista de tablas

............................................................................................................................. Pág. Tabla 2-1 En valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o NaCl 0,15M) que

se intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes, en la medida de

macrófagos a los que se les ha aplicado ruptura celular. ....................................................

Tabla 2-2 valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o Nacl 0,15M) que se

intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes .................................... 47

Tabla 2-3 Medición de macrófagos infectados, no infectado e infectados rotos, por cada

vial .................................................................................................................................. 51

Tabla 2-4 Cconcentraciones y peso molecular de los compuestos utilizados en la solución

salina empleada como fluido transportador en Splitt ....................................................... 62

LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

Símbolo Término Unidad

A Área m2

A Salida superior del canal

′ Entrada superior del canal

B Salida inferior del canal

B Ancho del canal m

b’ Entrada inferior del canal

Diámetro celular m

Diámetro critico m

Infinitesimal de tiempo s

Infinitesimal de espesor m

Infinitesimal de largo m

Fuerza de flotación N

Fuerza de arrastre N

Fuerza de empuje N

Fuerza gravitacional N

G Aceleración debida a la gravedad m/s2

L Longitud del canal s-splitt m

Re Número de Reynolds 1

Flujo total m3/s

Flujo por la salida a m3/s

Flujo por la salida b m3/s

Flujo en la región de transporte m3/s

U Velocidad de sedimentación m/s

Velocidad critica inducida m/s

Velocidad media del flujo total

Volumen del medio de cultivo m3

Volumen solución isotónica m3

Flujo total m3/s


Flujo por la salida b m3/s

Espesor del canal S-Splitt m

Posición del plano OSP m

′ Posición del plano ISP m

Espesor de la región de transporte M

Flujo total m3/s


14 Modelo físico de los parámetros y efectos hidrodinámicos

Letras Griegas

Abreviaturas

Símbolo Término Unidad

Δ Diferencias de presiones Pa

Δ Flujo transversal de partículas m3/s

Densidad de la partícula Kg/m3

Densidad del fluido Kg/m3

Abreviatura Término

VP Vacuola Parasitófora SS Canal Step Splitt ISP Inlet Splitting plane OSP Oulet Splitting plane DT Detritos Celulares M Macrófago sin infectar

M Macrófago con infección PBS Solución salina Fosfatada Buferada ISP Inlet Splitting plane NaCl Clorúro de Sodio

SIP solución isotónica de Percoll™


Introducción

La separación y selección celular son procesos de importancia crítica en una variedad de

aplicaciones biomédicas y biotecnológicas que incluyen (i) diagnóstico (ii) terapia, e (iii)

investigación en biología celular (Gossett et al. 2010). En este último aspecto es

necesario realizar separaciones de material biológico cada vez más específico, valioso,

frágil y en algunos casos difícil de separar. Para afrontar estas dificultades desde los

años 60 hasta la actualidad las técnicas y mecanismos de separación se han optimizado

logrando generar variantes cada vez más adecuadas para la separación y el bioanálisis

de muestras biológicas como ADN, proteínas, virus y células (Roda et al. 2009), todo

esto aprovechando propiedades físicas de la muestra como: tamaño, forma, densidad,

impedancia eléctrica o acústica; junto a propiedades físicas de reacción a un campo de

fuerzas, ligado a propiedades hidrodinámicas. Entre los campos de fuerza más

empleados en las técnicas de separación y selección encontramos campos de tipo

gravitacional (Levin et al. 1992), eléctrico (Gale et al. 2001), magnético (Fuh et al. 1998).

ó acústico (Ratier et al 2010), cada uno de ellos con eficiencias características en el

resultado de la separación.

Los procesos de separar y seleccionar materiales particulados, no sólo tienen lugar en

células o material biológico, sino que pueden ser aplicados también en diversos

materiales como macromoléculas (Hoyos et al. 2003), partículas de almidón de trigo

(Contado et al. 2000), polímeros sintéticos y coloides industriales (Cölfen et al. 2000), al

igual que en emulsiones farmacéuticas (Fuh et al. 1997). Por tal motivo, los esfuerzos por

mejorar dichos procesos se convierten en un problema de interés a nivel investigativo,

que incluye a disciplinas como la Biología y la Física, esta última en relación a la

hidrodinámica y la microfluídica.

17

Cuando se realizan procesos de separación de cualquier material particulado, el

resultado obtenido puede ser útil para diferentes finalidades y catalogado de dos

maneras según el método que se emplea. Si el objetivo de la separación es analizar y

caracterizar a cualquier componente constitutivo de la mezcla en la búsqueda de un

parámetro físico específico, como el coeficiente de difusión de un virus (Reschiglian et al.

2005), su masa molar y densidad (Yonker et al. 1981), el método se denomina analítico.

Por otra parte si el objeto de la separación es el de obtener material que será reutilizado

posteriormente para otro fin como por ejemplo realizar una separación de células

infectadas de no infectadas para posterior tratamiento (Gascoyne et al 2004), el método

en este caso se denomina preparativo.

Las técnicas de separación que competen en este trabajo tienen su origen en el método

analítico, bajo una familia de técnicas de separación hidrodinámica inventadas por J.

Calvin Giddings en los años 60 bajo el nombre de Field Flow Fractionation o FFF

(Giddings et al 1966), con el fin de hacer separación y análisis de muestras con

partículas en el rango macromolecular y supramolecular, utilizando como mecanismo de

separación un canal rectangular de una entrada y una salida de flujo tipo Hele-Shaw

(Figura 1.1), donde su largo y ancho son mucho mayores que su espesor (Giddings et

al.1966), en este tipo de canal se introduce y aspira muestra suspendida en un fluido, por

medio de bombas de inyección y succión, lo cual genera transporte de las partículas en

suspensión a través del volumen del canal; durante este transporte, las partículas son

sujetas a un campo de fuerzas ortogonal al flujo, lo que genera un gradiente de

concentración transversal el cual depende de los parámetros físicos de las partículas en

suspensión como: tamaño, densidad y rigidez; parámetros que generan diferentes

tiempos de residencia dentro del canal y permiten una caracterización del material en

suspensión .

Las técnicas de separación (FFF) iniciales tenían problemas para identificar, medir y

eventualmente separar componentes de partículas biológicas, dado que se hace

necesario procesar un volumen elevado de material por unidad de tiempo (troughoutput).

Esta limitante llevó al mismo Giddings en los años 80 a optimizar la técnica (Giddings et

al. 1985) adicionando una entrada y una salida al mecanismo de separación, llevando la

técnica al funcionamiento en continuo. Al momento de realizar esta modificación surge

una nueva técnica de separación conocida como Split-Flow Thin Fracionation (Splitt).


Sobre la cual se hacen nuevas reformas en el mecanismo de separación por parte del

laboratorio du Physique et Mechanique du Mileux Heterogenes, elevando la eficiencia de

la celda en términos hidrodinámicos y generando un nuevo mecanismo llamado Step-

Splitt (Figura 1.8) (Patente Hoyos et al. 2011). Éste mecanismo, se probó con éxito en

separaciones de partículas inertes de látex y sílice, extendiéndose para la separación de

algunos cuerpos biológicos como levaduras y bacterias (Callens et al. 2008).

En el laboratorio de Biofísica y Biología De Membranas del Centro Internacional de Física

(CIF), para la separación de cuerpos y organelos celulares concretos es necesario contar

con un método de separación celular económico, que no utilice membranas ni filtros que

atente contra la viabilidad celular, que sea capaz de procesar grandes poblaciones de

células en continuo sin cambiar sus condiciones fisiológicas, donde sea posible reutilizar

los cuerpos celulares enriquecidos para otros fines en el laboratorio, como la práctica de

la electrofisiología, en donde se necesitan condiciones ideales en la membrana celular

para realizar sellos (electrodo-membrana) y medir así las propiedades eléctricas de la

célula. En la experiencia del laboratorio el mecanismo de separación Step-Splitt, ha sido

utilizado con éxito en la separación de macrófagos infectados con el parásito Leishmania

amazonensis de aquellos que han fagocitado perlas de sílice (Hoyos et al. 2009),

logrando enriquecer macrófagos con infección para su posterior cultivo. Dado que la

técnica de separación es satisfactoria en la separación celular, los esfuerzos se

encaminan ahora al potencial que puede tener Step-Splitt en el enriquecimiento de un

organelo intracelular llamado vacuola parasitófora; el cuál es de importancia en las

investigaciones actuales del laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas en el

entendimiento de la relación huésped hospedero durante la infección de macrófagos o

células del sistema inmune con el parásito Leishmania, en donde enriquecer vacuolas

parasitóforas podrá facilitar el estudio electrofisiológico de este organelo infectado por

parte del grupo, así que este trabajo busca:

Generar un modelo de separación de vacuolas parasitóforas haciendo uso de la técnica

Step-Splitt, teniendo en cuenta las propiedades físicas de los cuerpos celulares que

puede estar involucrados en el separación: macrófagos infectados, no infectados y restos

celulares con vacuolas parasitóforas, realizando un canal de separación basado en los

parámetros físicos encontrados, haciendo un análisis de los parámetros óptimos para

preservar la estabilidad hidrodinámica.

19

En función de este objetivo, el trabajo se desarrolla en tres capítulos. En el capítulo I, se

realiza una descripción de la técnica Splitt y su mecanismo de separación, para luego

introducir la variante realizada en el mecanismo Step-Splitt, mostrando así los principios

físicos generales que estructuran a esta familia de técnicas y su funcionamiento. En el

capítulo II, se hace una descripción de los cuerpos celulares de interés en la separación:

macrófagos infectados con el parásito Leishmania amazonensis, no infectados y

expuestos a ruptura celular donde se encuentran vacuolas parasitóforas, reportando los

parámetros físicos encontrados experimentalmente: tamaño, forma y densidad, para

realizar a la base de estos parámetros físicos una cámara S-Splitt miniaturizada. En el

capítulo III se expone el modelo para la separación de vacuolas parasitóforas de

Leishmania amazonensis en una celda Step-Splitt de 360 µm de espesor utilizando los

parámetros físicos encontrados experimentalmente en el capitulo anterior, realizando una

simulación con el paquete CFD Fluent™ donde se estudia el comportamiento

hidrodinámico en la celda para dos flujos específicos, para posteriormente reportar las

condiciones hidrodinámicas favorables para contar con estabilidad hidrodinámica in situ

mediante un experimento de intensidad de fluorescencia de células infectadas con

Leishmania, finalizando con el reporte de los flujos que optimizan la separación de

vacuolas, utilizando como criterio de separación el diámetro crítico de los cuerpos

celulares.


1 LA TÉCNICA SPLITT

1.1 La celda de Splitt

El mecanismo y la técnica de separación Splitt Flow Thin Fractionation pertenecen a una

familia de métodos de separación hidrodinámica inventada por Calvin Giddings en los

años 80, en respuesta a la necesidad de separar cantidades elevadas de material

particulado en continuo (Giddings et al. 1985), realizando separación de dicho material

transversalmente y no longitudinalmente como en técnicas previas (Giddings et al.,1966).

La celda de separación Splitt está constituida geométricamente por un canal rectangular

tipo Hele-Shaw, el cual se caracteriza por tener un espesor w pequeño con respecto al

largo L y ancho B, garantizando estabilidad hidrodinámica si

, (Figura 1-1).

Figura 1-1 Celda tipo Hele Shaw: el largo y el ancho b es mucho mayor al espesor .

21

El montaje experimental para realizar separación de material particulado mediante la

técnica Splitt se constituye por (Figura 1-2a): Un canal rectangular tipo Hele-Shaw, el

cual está constituido por una entrada ′ donde por la acción de una bomba de precisión

hay ingreso de muestra o material particulado suspendido en un liquido vector con un

flujo ; otra entrada por donde hay ingreso de de un líquido vector con flujo

el cuál en primer lugar focalizará a las partículas que entraron por ′ hacia la pared

superior del canal, para luego transportarlas en sentido longitudinal para que por la

acción de un campo de fuerzas transversal al flujo las partículas puedan para ser

separadas y recolectadas en las salidas a ó b del mecanismo de separación, para ser

monitoreadas, contadas y medidas por un detector (Figura 1-2b). El campo de fuerza en

mención puede ser: gravitacional, acústico, eléctrico o magnético.

Figura 1-2a Montaje experimental para realizar una separación splitt

Figura 1-2b Vista de un corte transversal de la cama splitt con las respectivas zonas importantes en la

separación: zona de transporte, planos divisores de entrada (ISP) y salida (OSP) junto a los respectivos divisores de flujo.


El canal posee en dirección longitudinalmente opuesta a las entradas de muestra, dos

salidas y , por las cuales saldrá líquido con la muestra separada por acción del campo

de fuerzas, a tasas de flujo y respectivamente. La suma entre los flujos de

entrada y salida deben ser equivalentes al flujo total y dado que la densidad del fluido

vector no varía al interior del canal se respeta el principio de conservación de la masa, y

por tanto principio de conservación del flujo, descrito por las ecuaciones (1.1) y (1.2)

(1.1)

(1.2)

El flujo en la zona de transporte es de importancia en la separación Splitt, pues como

se verá en la siguiente sección, la razón entre el flujo de entrada y el de la zona de

transporte dará paso a la formación de un plano divisor de entrada ISP con

espesor , de manera análoga sucede en la salida formando un plano divisor de salida

OSP; así que los planos virtuales importantes en la teorización de la separación son: ver

(Figura 1.2)

Plano Inlet Spliting plane (ISP): Este plano virtual se genera cuando el fluido

que ingresa por la entrada tiene contacto con una de las caras del divisor de

entrada; manipulando la magnitud del flujo en la entrada respecto al flujo

total se forma un plano ISP con un espesor .

Plano Outlet Spliting Plane (OSP): Este plano virtual se genera cuando el fluido

de la salida tiene contacto con el divisor de salida. Al manipular la magnitud de

la tasa volumétrica del flujo en la salida con respecto al flujo total , este

plano ISP variará su espesor .

Zona de Transporte: esta zona está determinada por la diferencia entre el

espesor del plano ISP y el espesor del plano OSP respecto al espesor

total del dispositivo de separación, el espesor de esta zona se nota como .

Estas zonas son de importancia, pues al momento de hacer un procedimiento de

separación de material particulado, es necesario conjugar de manera correcta la elección

de una tasa volumétrica de flujo total y su distribución en las entradas y salidas para

23

formar planos ISP y OSP con espesor adecuado. Para hacer que según las propiedades

físicas de las partículas en separación lograr según la necesidad experimental que

partículas con menor movilidad salgan por y las más móviles sean capaces de alcanzar

la pared inferior y salir por . En la siguiente sección se mostrará cómo las tasas

volumétricas de flujo están relacionadas con los espesores de estos planos divisores.

1.2 Flujos en el canal y manipulación de planos de separación.

La correcta formación de los planos divisores de flujo de entrada ISP y salida OSP, no

solo dependen de la correcta elección de los flujos en la entrada y salida en el

mecanismo Splitt, sino también de conseguir durante la construcción una razón

conveniente entre el largo L y el espesor para qué , la cuál debe estar dentro del

rango de 50-1000 para generar una celda Hele-Shaw (Callens 2005) (Figura 1-). Esto se

logra mediante la correcta configuración de laminas Mylar (polyethylene terephtalate),

que separadas entre sí por una lámina de metal genera los divisores de flujo de entrada

y salida (Figura 1-3); a la vez que se genera una cámara hueca con espesor que debe

estar de acuerdo con el criterio de celda tipo Hele-Shaw.

Figura 1-3 Configuración de la Celda Splitt. (Giddings. 1980), (Fuh et al. 1998).


Si se garantiza este tipo de celda los efectos de borde pueden ser despreciados y se

garantizará cierta estabilidad hidrodinámica, originándose al interior del canal un perfil de

velocidad parabólico o de tipo Poiseuille a una distancia de la pared; éste perfil a bajos

números de Reynolds es descrito por la expresión:

(1.3)

Siendo la velocidad media transversal a través del canal Splitt, la cual está

relacionada con el flujo total , siendo es el espesor de la celda y el ancho

del canal. Teniendo en cuenta que la velocidad en la entrada , puede ser escrita en

términos de la integral desde el inicio de la pared hasta el espesor del perfil

parabólico de velocidad dado en la ecuación (1.3), la velocidad en la entrada se

expresa como:

(1.4)

De manera que mediante es posible relacionar la tasa de flujo en la

entrada , con la razón entre los espesores para el plano de entrada

(1.5)

Separando y resolviendo la integral (1.5) se obtiene

(1.6)

Como con (1.6) se obtiene una solución, en forma cúbica:

(1.7)

Razón entre los espesores La solución de ésta ecuación cúbica para

está dada por

w

x

w

xvxv 16

dxw

x

w

xBvaQ

aw

0

2

2

6'

aw

dxxvBaQ

0

'

2

32

326'

w

w

w

wBvaQ aa

3

2

2

23'

w

w

w

w

Q

aQ aa

25

(1.8)

En la expresión (1.8) está dado por

(1.9)

Donde está confinado en el rango . Estas dos expresiones (1.8) y (1.9)

son de utilidad pues permiten realizar una relación gráfica (Figura 1-4) de las tasas de

flujo contra la tasa de espesor , las cuales son al momento de desarrollar

un experimento con esta técnica pues siendo conocido el espesor total del canal , el

flujo total y la forma en la que se distribuye este flujo total en la entrada , se

puede conocer el espesor del plano divisor de flujo ISP.

Figura 1-4 Relación entre las tasas de flujo de entrada, para encontrar el espesor del plano divisor de entrada ISP a una tasa de flujo total especifica.

En general la gráfica muestra una tendencia lineal para valores mayores a 0,2; es decir si

la razón aumenta, la zona ISP se hace más grande, obligando a la zona de

2

1

3

senw

wa

12cos

t

a

Q

Qar


transporte a disminuir su espesor y viceversa, si disminuye lo mismo sucede

con , por tal motivo la zona ISP se hace más pequeña y la zona de transporte

aumentará su espesor. El mismo procedimiento se utiliza para calcular la relación entre

las tasas de salida y su espesor, para el cálculo de espesor del plano de salida OSP.

A nivel experimental se propone seguir la metodología expuesta en (Callens et al. 2005),

pero aplicada a un canal S-Splitt (Figura 1-), en donde se puede dejar la zona ISP fija y

variar paulatinamente el plano OSP, ocasionando un cambio en el espesor de la zona de

transporte (Figura 1-); o como otra alternativa, dependiendo de las necesidades en la

separación, desplazar la zona de transporte en el espesor total del canal (Figura 1-),

dependiendo de la resolución que se quiera alcanzar y de las propiedades físicas de las

partículas que se estén separando.

Figura 1-5 Variación del plano de salida OSP dejando el plano de entrada ISP fijo , (Callens et al. 2005)

Figura 1-6 Desplazamiento de la zona de transporte variando tanto el ISP como el OSP

27

La optimización para una separación depende de: hacer una variación adecuada de las

tasas de flujo para tener control preciso de los espesores en planos de entrada ISP y

salida OSP, del conocimiento de los parámetros físicos de la muestra a ser separada, en

conjunción de un manejo de las dimensiones y características en la celda de separación,

todo lo anterior permite proponer condiciones para optimizar el proceso de separación de

material particulado utilizando la técnica Step-Splitt, en este caso para la separación de

objetos biológicos concretos, los cuales serán descritos en el siguiente capítulo.

Uno de los parámetros físicos de interés para lograr optimizar la separación del material

particulado es conocer una expresión para la velocidad de sedimentación de dicho

material, pues como se verá a continuación es un parámetro determinante para

seleccionar condiciones experimentales como el flujo total , las tasas de flujo en las

entradas y salidas para generar planos de entrada y salida ISP y OSP, con espesores

que se ajusten a la necesidad de la separación. Por lo que se realizara a continuación un


análisis del mecanismo de transporte transversal por sedimentación de las partículas por

acción de un campo gravitacional.

1.3 Mecanismo de transporte por sedimentación gravitacional

El modo de transporte por sedimentación gravitacional (Figura 1-) es aplicable para

entender el movimiento de las partículas cuando son llevadas por un flujo axial a lo largo

del canal, con una velocidad y por una velocidad de transversal de sedimentación

bajo la acción de un campo de fuerzas que puede ser gravitacional (Springton et al.

1987), eléctrico (Narayanan et al. 2005) o acústico (Ratier et al. 2010). En este caso si

las partículas tienen propiedades físicas que las hacen tener una velocidad de

sedimentación mayor a la velocidad de flujo , estas contarán con un tiempo de

residencia suficiente en la celda de separación para llegar al plano de división OSP y de

esta manera salir por b.

Figura 1-7 Mecanismo de sedimentación en la celda de separación Splitt.

Para poder representar este modo de transporte en ecuaciones, se debe imaginar que el

flujo en el canal está dividido por en una serie de secciones o laminas diferenciales ,

de manera que las párticulas con velocidad de transporte migrarán hacia una lámina

específica en un tiempo .

(1.10)

U

dxdt

29

Esta ecuación representa las dos componentes de movimiento que posee la partícula en

el canal en modo de sedimentación, relacionando las dos componentes del movimiento

mediante la siguiente expresión tenemos:

(1.11)

Teniendo en cuenta que la tasa volumétrica de flujo que experimentaria una particula en

una lámina está dada por la relación

(1.12)

Introduciendo de (1.12) en (1.11), se genera una expresión que muestra la relación

lineal entre la taza de flujo en el eje (longitudinal) y el elemento de flujo , sobre el

cual la partícula realiza su migración transversal.

(1.13)

Integrando con respecto a la longitud se obtiene

(1.14)

Expresión con la que se puede determinar de manera teórica el lugar por el que saldrá la

partícula, si esta saldrá por , si las partículas saldrán por y por , y

en cualquier otro caso saldrán por . La magnitud de la velocidad de sedimentación en

(1.14) se encuentra mediante la ley de Stokes:

(1.15)

Δ es la diferencia de densidad entre el líquido vector y la partícula, es el diámetro de

la partícula en cuestión, es la aceleración debida a la gravedad y

es el factor de

esfericidad y es la viscosidad.

U

dxvdtvdt z

z

dxvbdQ z

bU

dQdz

bULQ

0

2

18f

f

gdU


Con la velocidad de sedimentación descrita por la ecuación (1.14) es posible calcular la

velocidad de sedimentación crítica en la cual la población de partículas se dividirá en

los sub extremos y

(1.16)

Mediante las ecuaciones (1.15), (1.16) y encontrando tenemos:

(1.17)

Según (1.17) las partícula que posean un serán capaces de atravesar la zona de

transporte y salir por , mientras que las que poseen menor tamaño saldrán por , como

se verá en el ultimo capitulo la expresión de diámetro critico será utilizada como criterio

de separación.

Otro mecanismo de transporte es el de difusión, para el caso particular de las

separaciones que se realizan en este trabajo, todas las partículas son de tamaños

mayores a las especies brownianas ( ) por lo que los efectos difusivos no se

tendrán en cuenta. A continuación se finalizará el primer capítulo describiendo el

dispositivo de separación con el que se desarrollarán los experimentos.

1.4 Mecanismo de Separación Step-Splitt

Aunque la técnica Splitt convencional de los años 80 ha mostrado gran versatilidad y

eficiencia en la separación de material particulado; el mecanismo y los efectos físicos que

producen la separación siguen siendo estudiados en la actualidad, encontrándose

efectos que hacen que la separación no sea la esperada teóricamente (Williams et al.

2003):

En la práctica, el corte crítico entre las poblaciones en la salida no es

exactamente el predicho en la teoría.

Las deformaciones que toma el flujo cerca de las paredes del canal, pueden

perturbar el perfil parabólico.

bL

QUc

2/12

3

fpBLg

tQdc

31

Imperfecciones en las paredes de la celda generan fuerzas de arrastre que

reducen la velocidad de flujo en sus cercanías; lo que hace que la migración

lateral tome más tiempo, haciendo que las partículas que tendrían que salir según

la teoría por salgan por .

Una alta concentración de muestra puede degradar la separación.

Las imperfecciones geométricas en los divisores pueden causar variaciones en el

espesor del canal generando un perfil local de velocidad.

Bajo algunas condiciones, vórtices pueden causarse cerca de los divisores, lo que

puede dañar la separación.

Con el fin de disminuir los efectos hidrodinámicos no deseados algunas investigaciones

recurren a modificaciones en la celda de separación, cambiando el diseño de la celda y

su geometría. La presente tesis se basa en la modificación hecha sobre la celda Splitt

convencional, en donde son eliminados los divisores de flujo o Splitters haciendo

introducción de escalones o Steps (Figura 1-), generando lo que hoy se conoce como

celda Step Splitt (SS) (Callens et al. 2005).

Figura 1-8 Modificación geométrica de la celda Splitt convencional en Step Splitt (SS), en el círculo se muestra la esencia de la modificación.

Esta modificación no solo disminuye los efectos hidrodinámicos no deseados en las

entradas y salidas de la celda, sino que hace posible miniaturizar la celda manipulando

cualquier largo (Callens et al. 2008), conservando los mismos principios teóricos del

Splitt convencional expuesto en secciones anteriores.

Una vez se han planteado las propiedades generales y el trasfondo teórico involucrado

en la separación Splitt convencional y la descripción del cambio de geometría en el

mecanismo de separación. En el siguiente capítulo se reportan los resultados

experimentales y la búsqueda de los parámetros físicos que optimizan la separación de


vacuolas parasitóforas de macrófagos no infectados e infectados con Leishmania

amazonensis. Estudiando las propiedades de las células, de la celda de separación y del

fluido transportador, junto a una descripción de ruptura de la membrana celular para la

obtención de vacuolas, las cuales serán aisladas y purificadas por la técnica Step-Splitt.

1.5 Consideraciones.

Se realizó una descripción de la base teórica y de los fundamentos en técnica de

separación Splitt, la cual deja ciertos aspectos a tener en cuenta para realizar un modelo

de separación en células y organelos intracelulares:

Es de importancia escoger una tasa volumétrica de flujo conveniente, al igual que

una distribución adecuada de las tasas volumétricas de flujo en las entradas y

salidas, teniendo en cuenta el principio de conservación de la masa, para formar

planos (ISP), (OSP) con espesor , según la necesidad en la separación.

Se deben tener en cuenta las componentes básicas del movimiento, las cuales

son propias del modo de transporte por sedimentación gravitacional; modo que

aporta la expresión para la velocidad de sedimentación , la cual depende de

parámetros físicos propios de cada población celular. De manera que para

realizar una separación con cuerpos celulares específicos, se deben conocer

experimentalmente cantidades físicas que afinan el modelo teórico, con el fin de

predecir el lugar de salida de las partículas del canal mediante el criterio de

diámetro crítico.

Al trabajar con una celda de separación en la que se han eliminado los divisores

de flujo o Splitters, se pueden generar diseños y construcción de celdas de

tamaño reducido, lo que puede garantizar velocidades axiales altas con tasas

volumétricas de flujo relativamente bajas.

33

2 PROPIEDADES FÍSICAS DE CÉLULAS Y FLUIDO VECTOR.

La finalidad de este trabajo es buscar un modelo de separación de vacuolas parasitóforas

de Leishmania amazonensis aplicando la técnica Step-splitt, para ello se muestra que es

necesario encontrar propiedades físicas en los cuerpos celulares a ser separados. En el

capitulo anterior se mostró el fundamento teórico de la técnica de separación en el modo

de transporte por sedimentación gravitacional, donde las ecuaciones (1.15) (1.17),

muestran que para separar una población celular usando un campo gravitacional es

necesario conocer parámetros propios del objeto de interés como el tamaño, la densidad,

la forma; junto a propiedades del fluido transportador como densidad y viscosidad

dinámica.

De manera que en este segundo capítulo se documenta el proceso de extracción de la

vacuola parasitófora, mediante un proceso de disrupción mecánica de la membrana

celular en macrófagos de la línea celular J774.A1. Para luego reportar las propiedades

del cuerpo celular de interés: vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis, junto a

los cuerpos celulares involucrados en el proceso de disrupción mecánica, finalizando el

capitulo con las propiedades del fluido transportador y la caracterización de la celda de

separación Step-Splitt como un parámetro de interés en la separación.

2.1 Vacuolas parasitóforas y el ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis.

Leishmania amazonensis es un parásito intracelular obligatorio que ingresa a un

mamífero vertebrado (incluido el hombre), después que un insecto vector del género

Phlebotomus o Lutzomyiam se alimenta de la sangre de dicho mamífero. El parásito hace

su ingreso al hospedero vertebrado en forma de promastigote extracelular, que es una

forma móvil y altamente infectiva del parásito (Figura 2-2), infectando células

mononucleares de línea fagocítica (Alexander et al. 1999) y activando a su vez la

respuesta de células del sistema inmune llamadas macrófagos. Estas células fagocíticas

profesionales inician el proceso de internalización del parasito, aislándolo en un

compartimento endosomal tardío conocido como vacuola parasitófora (VP) (Russel et al.

1995), que se caracteriza ser un compartimento con pH ácido de 4.7 a 5.2 y rico en


hidrolasas, donde el parásito para lograr sobrevivir y multiplicarse en este ambiente

biológico adverso sufre profundas adaptaciones bioquímicas y morfológicas

transformándose en un pequeño amastigote ovoide (Alexander et al. 1999), el cuál

después de dividirse realiza un proceso de salida del macrófago, ingresando en gran

número a nuevas células hospederas (Mosser et al.1997), de tal manera que cuando un

insecto se alimenta de la sangre del mamífero vertebrado, este ingiere macrófagos

infectados, donde el parásito en forma amastigote sufre de nuevo al interior del intestino

medio del insecto nuevas transformaciones bioquímicas y morfológicas a promastigote

metacíclico lo que le permite sobrevivir en el insecto vector y garantizar la continuidad

del ciclo de vida (Figura 2-1).

Dentro del esquema del ciclo de vida, éste trabajo se focaliza únicamente en las horas

post-infección donde hay formación de vacuolas parasitóforas con parásitos en forma

amastigote en su interior, ver cuadro en la (Figura 2-1), como se especifica en la

siguiente sección.

Figura 2-1 Ciclo de vida del parásito Leishmania amazonensis, tomada de (OMS)

35

2.2 Obtención de vacuolas parasitóforas en cultivo de macrófagos.

Para infectar un cultivo de macrófagos y generar vacuolas parasitóforas en su interior, se

realiza primero un cultivo de promastigotes de Leishmania amazonensis a 240 C en

medio Schneider con suplemento de suero fetal bovino al 10% (Figura 2-2), hasta

alcanzar una fase estacionaria de 107. Luego estos parásitos se exponen a células de la

línea de macrófagos peritoneales de ratón J774.A1 a 350 C y 5% de CO2 durante 4

horas, removiendo el excedente de parásitos, para luego mantener bajo incubadora la

infección hasta alcanzar 48h.

Figura 2-2 Promastigotes en cultivo, en el recuadro un parásito en forma promastigote, donde se puede ver el

respectivo flagelo.

El tiempo de post-infección elegido para la realización de mediadas de parámetros

físicos es de 48 horas, dado que experiencias previas del grupo de investigación

(Cortazar et al. 2006), muestran que a horas inferiores las vacuolas parasitóforas

muestran una mayor viabilidad, pero una mayor variabilidad; cuestión que hace difícil

separarlas en una fracción, para tiempos muestran compartimentos muy frágiles

para experimentos posteriores.

Para reconocer si el cultivo de macrófagos en infección es apropiado para la medida de

parámetros físicos, se debe reconocer bajo microscopia criterios específicos del

compartimento llamado vacuola parasitófora (Lang et al. 1994): espacios delimitados por

una membrana, con diámetros entre 10 y 20 m, con parásitos en el interior.


Para reconocer el compartimento de interés, en cada experimento de este trabajo se

realiza marcación con la sonda metacromática naranja de acridina a una concentración

de . Esta sonda permea la membrana del macrófago, marcando en verde cuando se

intercala con los ácidos nucleicos y en rojo cuando tiene contacto con compartimentos

como la vacuola parasitófora ricos en H+, donde la sonda disminuye su movilidad

cambiando su espectro de emisión a un color rojo (Antoine et al.1991), de manera que

vacuolas aisladas deben tener este marcaje rojo para garantizar de manera indirecta su

viabilidad.

En la (Figura 2-) se muestra en simultánea una micrografía adquirida por microscopía de

luz y epifluorescencia, de un macrófago de la línea celular J774.A1 infectado; donde se

evidencian las tres membranas que garantizan la supervivencia del parásito: la

membrana del macrófago (en verde), la vacuola parasitófora (en rojo) y la membrana del

parásito (pequeños puntos verdes en el interior del compartimento).

Figura 2-3. Fotografía de luz y florescencia que muestra a un macrófago que ha generado vacuolas una vez es infectado con por el parasito Leishmania Amazonensis.

Estas vacuolas parasitóforas en rojo son los organelos intracelulares a los que se les

hace medición de los parámetros físicos, para posteriormente encontrar un modelo de

separación Step-Splitt. Para lograr esto, las vacuolas parasitóforas deben ser extraídas

de los macrófagos que las contienen, mediante un proceso previo de disrupción

mecánica de la membrana celular del macrófago en presencia de un medio de lisis

compuesto por inhibidores de proteasas. Proceso que será descrito en mayor detalle la

siguiente sección.

37

Las vacuolas en estado aislado han sido de interés para las investigaciones que lleva a

cabo el Laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas del Centro Internacional de

Física (CIF), con respecto a: el proceso de fagocitosis y la relación huésped hospedero

(Quintana et al. 2010), el proceso de salida del parásito de su célula hospedera (Niño et

al. 2003), la relación existente entre el volumen de la vacuola parasitófora y las

alteraciones de tipo morfológico, eléctrico y de permeabilidad que ésta puede inducir

sobre el macrófago (Forero et al. 1999).

Separaciones de vacuolas parasitóforas ya han sido realizadas con éxito, mediante la

técnica de gradientes de Percoll (Cortazar et al. 2006), pero en este estudio se reporta

que al aislar vacuolas parasitóforas mediante gradientes de densidad se dificulta la

posterior utilización de estos organelos en mediciones electrofisiológicas, dado que el

polímero Percoll se adhiere a la membrana de la vacuola impidiendo generar sellos de

calidad con el electrodo de medición; motivo por el cual es deseable separar con técnicas

que generen un menor daño a la muestra, de manera que se recurre a la potencialidad

de la separación por la técnica Step-Splitt.

En la siguiente sección se reporta el proceso de disrupción mecánica de las membranas

de los macrófagos infectados, como una condición importante para extraer vacuolas

viables para los experimentos de medición de parámetros físicos y pilotos de separación.

2.3 Disrupción mecánica de macrófagos infectados.

Para cualquier experimento de medición de parámetros físicos o separación de vacuolas

parasitóforas primero se debe tener acceso estas vacuolas parasitóforas, encerradas por

la membrana celular del macrófago y el citoplasma celular, en la literatura se han

propuesto diferentes métodos para la ruptura de la membrana celular y el aislamiento de

este compartimiento, donde se estandarizan las soluciones empleadas para mantener

vacuolas viables (Chakraborty et al. 1994), se separa el compartimento mediante

centrifugación diferencial y gradientes de densidad a base de Percoll (Cortazar et

al.2006). Donde es necesaria una manipulación de la muestra por tiempos extensos, una

exposición a esfuerzos mecánicos extendidos y una ruptura de la membrana celular que

depende en gran medida del experimentador. De manera que en esta sección se

propone la construcción y operación de un dispositivo de ruptura en la búsqueda de

estandarización de este proceso.


2.3.1 Dispositivo de Ruptura.

Para el dispositivo de ruptura se propone un sistema análogo a un sistema venturi,

compuesto por tres partes principales: Región de convergencia, garganta y región de

divergencia (Figura 2-4).

Figura 2-4 Representación esquemática del dispositivo de ruptura a ser empleado, este dispositivo tipo

venturi es acoplado a una jeringa de

El mecanismo de ruptura debe cumplir con ciertas condiciones para su uso en el

laboratorio: reutilizable, esterilizable, seguro para el operador evitando escapes de

muestra con parásitos. De manera que partiendo de materiales disponibles en el

laboratorio se diseñó y construyó un dispositivo de ruptura con regiones convergencia-

divergencia con dimensiones de 4,76 de diámetro y 16,76 de longitud, y una

garganta de 800 de diámetro y 4,28 de largo (Figura 2-5 a). El diámetro escogido

de la garganta fue de 800 , dado que después de realizar diferentes pruebas de

ruptura variando el diámetro su diámetro entre 1.7 mm a 450 (Figura 2-5 b), el

diámetro de 800 permitió mediante microscopia evidenciar un daño efectivo de la

membrana celular del macrófago.

(Figura 2-5) a. Dimensiones para la construcción del mecanismo, b. variación de diámetros en la garganta

39

Estos diámetros se alcanzaron mediante el acople de agujas de 26 Gauge, a puntas

metálicas en acero inoxidable y unidas por soldadura de electro plata, configurando la

punta de ruptura (Figura 2-6) que se emplea en el montaje del experimento de ruptura.

(Figura 2-6) Construcción del mecanismo de ruptura.

La estandarización en el montaje y del método de ruptura como se verá a continuación

es de importancia para obtener organelos celulares viables para ser purificados por la

técnica Step-Splitt.

2.3.2 Montaje para ruptura de membrana celular

Una vez obtenido el dispositivo de ruptura éste es acoplado a jeringas de para

configurar el montaje experimental (Figura 2-7), donde se lleva a cabo el proceso de

ruptura de la membrana celular.

(Figura 2-7), Montaje experimental para la ruptura de membrana celular.


En esta ruptura se obliga al material biológico a pasar por la garganta de 800

mientras está suspendido en un medio de lisis celular compuesto por Hepes a 20 mM,

EGTA a 0.5 mM, sacarosa a 250 mM y G-9383 0.1% (Sigma-Aldrich), en presencia de

inhibidores de un proteasas como EDTA 0.5mM, E64 2 , Pepstatina 0.1 ,

Leupeptina 0.1 mM (Chakraborty et al. 1994), a una temperatura exterior de 40C.

Durante el transporte cíclico de la muestra por el mecanismo de la Figura 2-7,

físicamente se espera que cuando el fluido pasa de la región de convergencia hacia la

región central se generen disminuciones de presión debido al aumento de velocidad del

fluido que transporta la muestra, lo que puede ir acompañado de efectos mecánicos en la

muestra como elongaciones y compresiones dado el constante cambio de presiones en

el transporte cíclico entre la región de convergencia-divergencia, a la vez que se

evidencia un gradiente de velocidades, que disminuye con respecto a eje del mecanismo,

lo que puede generar a su vez un efecto de fractura o corte por cizalla en el material

biológico suspendido en el fluido, en este caso medio de lisis celular.

Para visualizar los efectos físicos en el mecanismo de ruptura se llevo a cabo una

simulación del mecanismo utilizando un flujo de mediante el paquete CDF

Fluent® donde se puede evidenciar los cambios de velocidad (Figura 2-8) y presión

(Figura 2-9) en las tres regiones de ruptura (región de convergencia, garganta y región de

convergencia) .

(Figura 2-8) Simulación del mecanismo de ruptura a un flujo de , se evidencia el aumento de

velocidad en las tres zonas del mecanismo.

41

(Figura 2-9) Simulación del mecanismo de ruptura a un flujo de , se evidencia las diferencias de

presiones entras tres zonas de ruptura.

Al utilizar este montaje realizando transporte de células de una jeringa a otra por un

tiempo de 10 minutos se observa por microscopia el daño sobre la célula (Figura 2-10),

en donde se puede contar con organelos de las características de vacuolas parasitóforas

(Lang et al. 1994), macrófagos infectados, macrófagos sin infección y detritos celulares.

(Figura 2-10) Efecto del mecanismo de ruptura empleado sobre macrófagos infectados con L. amazonensis

Cuando se realizan micrografías de fluorescencia (Figura 2-11) mediante la sonda

naranja de acridina se puede evidenciar organelos intracelulares que han sufrido daño


mecánico y una ruptura por cizalla, pero dado que se cuenta con estructuras del orden de

6 a 7 , estas estructuras pueden ser núcleos rotos liberando su material interior, de

manera que se debe controlar la ruptura para generar un daño a la membrana celular y

no a los organelos intracelulares.

(Figura 2-11) Micrografía de fluorescencia de organelos intracelulares después de una ruptura, mediante la

sonda naranja de acridina.

Con estos experimentos es posible afirmar que después de una ruptura mecánica, para

una posible separación de vacuolas parasitóforas por Step-Splitt se tendrán tres

poblaciones, en las cuales se hace necesario conocer los parámetros físicos para una

purificación de vacuolas óptima.

2.4 Parámetros físicos de interés posteriores a una ruptura celular.

Se espera después de una ruptura mecánica de la membrana celular del macrófago

contar con tres tipos de cuerpos celulares:

Macrófagos enteros infectados (M ).

Macrófagos enteros sin infectar (M )

Vacuolas parasitóforas con detritos celulares ( ).

43

Un punto de partida para escoger los parámetros físicos que son de interés en la

separación Step-Splitt se encuentran en el modo de sedimentación gravitacional,

expuesto en la sección 1.3, mediante las relaciones que describen a la tasa volumétrica

de flujo ecuación (1.14) y la velocidad de sedimentación ecuación (1.15) junto a la

ecuación del diámetro critico (1.17) que es de gran importancia pues dará un parámetro

teórico para predecir el lugar por el cual saldrán las células en la celda de separación.

Los términos en estas ecuaciones incorporan las propiedades físicas que deben ser

encontradas experimentalmente con el fin de caracterizar a los cuerpos celulares

involucrados en la separación de las tres poblaciones que se obtienen después de

realizar disrupción mecánica en macrófagos infectados; estas propiedades son:

densidad, tamaño y forma. De igual manera las ecuaciones están escritas en términos de

las propiedades físicas del fluido transportador empleado en la separación: densidad y

viscosidad dinámica, las cuales son encontradas experimentalmente.

Los parámetros y magnitudes de la celda de separación: espesor , largo y ancho

también deben ser conocidos con certeza, para así ajustar de la manera más adecuada

posible los planos divisores de entrada y salida (ISP- OSP), garantizando según la

necesidad de la separación encontrar la tasas de flujo correctas todo lo anterior

constituye el modelo de separación, para optimizar la separación de vacuolas por el

método Step-Splitt.

(Figura 2-12) Expresiones que representan los eventos físicos y cantidades de interés para iniciar con un modelo de separación.


La Figura 2-12 muestra las expresiones y cantidades físicas que deben ser encontradas

para describir la separación en términos de un modelo de separación que describa el

movimiento de las partículas en sentido transversal del canal por sedimentación

gravitacional y el movimiento longitudinal de las partículas por medio de las ecuaciones

que describen el transporte de un fluido.

De manera que en las siguientes secciones se reporta la magnitud de los parámetros

físicos que constituyen el modelo de separación iniciando con la densidad de los cuerpos

biológicos involucrados.

2.4.1 Densidad

Para buscar la densidad de las células y de los organelos relacionados con la infección

del parásito Leishmania se utilizará una técnica que discrimina por densidad y

originalmente es usada para separación de células, organelos, virus y otras partículas

sub celulares, la cual recibe el nombre de gradientes a base de Percoll™.

PercollTM es un coloide que está recubierto del polímero polivinilpirrolidona (PVP), el cual

permite contar con ciertas especificaciones técnicas para el manejo de material biológico

como: baja viscosidad, no se introduce en las membranas biológicas, se obtienen

gradientes de densidad por centrifugación a bajas fuerzas g (Beckman™). La elaboración

del gradiente se inicia con la obtención de un rango de capas que varía de color y

densidad al ser servidas de manera conveniente en un tubo de ensayo Eppendorf™; la

densidad de cada capa se controla mediante la solución adecuada de volúmenes

apropiados de Percoll™ isotónico en volúmenes de medio de cultivo NaCl o RPMI 1640,

dependiendo el color deseado por capa (entre rojo y translúcido).

Una vez se cuenta con el rango de densidades deseado en dos tubos de ensayo, se

incorpora en cada uno de ellos tanto los especímenes a ser medidos como las perlas

calibradoras con densidad ya conocida. Así Cuando las perlas marcadoras y la muestra

con células, cuenten con una movilidad y una velocidad de sedimentación nula después

de centrifugar se dice que las partículas y la muestra han alcanzado sus puntos

isopícnicos (Figura 2-13); es decir que la densidad de la partícula se igualó con la

densidad de la capa de gradiente de exterior.

45

Figura 2-13 (a) Representación de perlas marcadoras suspendidas en un gradiente alcanzando isopícnicos en el tiempo (H- Pertof, GE Healthcare, 2007) (b) densidad de las perlas marcadoras densidad sigma™.

Una vez este equilibrio se alcance se realiza la medida de las distancias en la que quedo

la muestra con respecto al menisco o la punta del Eppendorf (Paterson et al. 2002) se

toma registro de las distancias de la muestra con respecto a la punta del Eppendorf y su

equivalente en densidad con las perlas patrón, para luego con estos registros realizar

una linealización y mediante la ecuación de la recta encontrar los puntos de densidad en

relación a la distancia en la que se alcanzó el punto isopícnico para cada componente de

la muestra. Este proceso parte como se ve a continuación de obtener un buen rango de

valores de densidad y la pericia del experimentador para servir cada una de las capas sin

que estas se mezclen.

Elaboración de rangos de densidad

Para la medición de densidad de las especies biológicas en cuestión es necesaria la

obtención de capas con densidad controlada, para lo cual se obtiene en primer lugar una

solución isotónica de Percoll™ (SIP), mediante un ajuste de osmolaridad del coloide

añadiendo 9 partes (v/v) de éste en 1 parte de NaCl 1.5 M, para luego diluir de manera

intercalada la solución (SIP) con NaCl 0,15 M y RPMI 1640 (1X) para lograr diferencias

de color entre cada capa de gradiente con una densidad particular (Figura 2-14)


Figura 2-14 Rangos de densidad alcanzados mediante la correcta solución de (SIP), de manera intercalada de RPMI y Nacl 0,15M.

Estas densidades están entre el rango de 1,010 y 1,080 g/ml dependiendo de la muestra

con la que se cuente, las relaciones entre de los volúmenes de medio y volúmenes de

(SIP) están dadas por las expresiones (2.1), (2.2) y (2.3):

(2.1)

(2.2)

(2.3)

Los resultados de estas expresiones serán tabulados para cada experimento en términos

de una densidad deseada para la capa entre 1,010 y 1,090 , la densidad del agua

y la densidad de cada medio , y

medsip

dessip

Totalmed VV

medTotalsip VVV

total

sipV

V100

%

47

Medición de densidad: macrófagos infectados, sin infectar y vacuolas parasitóforas con detritos celulares.

La medición que se reporta a continuación pretende lograr una medida de densidad para

las especies involucradas en la separación Step-splitt, posterior a un proceso de ruptura

celular: macrófagos infectados enteros ( ), Macrófagos sin infectar enteros ( ), y

vacuolas parasitóforas con detritos celulares (VP-DTC), involucrando tres mediciones en

un solo experimento, esto se realiza con el fin de asegurar las mismas condiciones para

cada una de las muestras bajo el patrón de densidad ofrecido por las perlas marcadoras;

para ello se elaboraron nueve capas de densidad con volúmenes de medio de cultivo y

solución (SIP) descritas en la (Tabla 2-).

Tabla 2-1 valores de SIP 9:1 junto a los valores de medio (RPMI o Nacl 0,15M) que se intercalan para generar las capas de los respectivos gradientes a un porcentaje de percoll dado.

Capa V

total de SIP

Medio de

cultivo

de Agua

de Medio

deseada

V medio

VSIP %

1 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,010 0,961 0,039 3,91

2 1 1,123 NaCl

0,15M 0,996 1,0046 1,020 0,870 0,130 13,00

3 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,030 0,791 0,209 20,91

4 1 1,123 NaCl

0,15M 0,996 1,0046 1,040 0,701 0,299 29,89

5 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,050 0,621 0,379 37,92

6 1 1,123 NaCl

0,15M 0,996 1,0046 1,060 0,532 0,468 46,79

7 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,070 0,451 0,549 54,93

8 1 1,123 NaCl

0,15M 0,996 1,0046 1,080 0,363 0,637 63,68

9 1 1,123 RPMI 0,996 1,0054 1,090 0,281 0,719 71,93

Suspendiendo cada una de las muestras en viales separados y llevando a centrifugación

se realiza la medida de la posición de los puntos isopícnicos alcanzados por la muestra

en cada uno de los viales, como se puede observar en la Figura 2-15, de manera que

dependiendo del estado biológico de la muestra ésta alcanza un punto isopícnico

determinado que mediante una regresión lineal que relaciona distancia y densidad es

posible encontrar la densidad de cada muestra.


Figura 2-15 Puntos isopícnicos alcanzados por macrófagos sin infección, infectados y con ruptura celular.

VIAL 1 VIAL 2 VIAL 3 PATRÓN

Tabulando y graficando las distancias para cada muestra en el vial desde la punta del vial

(Figura 2-15) con respecto a los puntos isopícnicos de las perlas marcadoras de

densidad se obtiene una gráfica a partir de la cual se hace una regresión lineal (Ecuación

2-4) para obtener la densidad de las diferentes muestras (Figura 2-16).

Figura 2-16. Regresión lineal de distancias y densidades medidas desde la punta del tubo Eppendorf en cada capa de muestra para cada vial, tanto de la muestra como de las perlas marcadoras.

49

La ecuación de la recta para la gráfica obtenida en la Figura 2-16 es:

(2.4)

De manera que los valores de densidad encontrados son los siguientes para cada vial:

Vial numero 1: (Macrófagos sin infección )

En este vial se encontró una sola capa correspondiente a los macrófagos sin infección

(2.5)

De manera que la medida de densidad para macrófagos sin infección es de

. En la (Figura 2-17) se muestra una imagen en microscopía de luz y de

epifluorescencia de la capa extraída en el gradiente, donde se puede evidenciar

mediante la sonda naranja de acridina el estado de no infección de la muestra.

Figura 2-17 Macrófagos sin infección con una densidad de

en luz y en fluorescencia

Vial numero 2: Macrófagos infectados

En este vial se encontraron dos capas de muestra una a desde la punta del

Eppendorf™ y otra a , una correspondiente a macrófagos infectados y otra a

macrófagos sin infección, esto se debe a que en el cultivo de partida no siempre se

cuenta con una infección del 100%, la densidad de macrófagos infectados es:

(2.6)


Al interpretar este resultado se puede inferir que cuando un macrófago es infectado

aumenta su volumen, motivo por el cual la densidad se hace más pequeña. En la (Figura

2-18), se muestra la imagen de fluorescencia resultante con el marcaje de naranja de

acridina, el marcaje en rojo evidencia la presencia de vacuolas parasitóforas y por tanto

de infección por parásitos Leishmania amazonensis.

Figura 2-18 Imagen de luz y fluorescencia con capa de macrófagos infectados con densidad

Vial numero 3: Macrófagos infectados expuestos a ruptura celular

En este vial se encontraron macrófagos infectados y sin infectar; con respecto al

producto de la ruptura en la muestra, se obtienen detritos celulares en el medio de las

dos capas de macrófagos con y sin infección, al no contar con una capa definida se mide

la densidad en la mitad de las capas para contar con un valor aproximado de los detritos

celulares, entre los que se puede encontrar vacuolas parasitóforas:

(2.7)

El marcaje de fluorescencia muestra células que han sufrido estrés mecánico, incluso se

evidencian pedazos de membrana, y vacuolas sueltas, ver recuadros (Figura 2-19).

51

Figura 2-19 Imagen de luz y epiflorescencia con capa de macrófagos a los que se le ha aplicado ruptura con

densidad

Los resultados de las medidas de densidad se resumen en la siguiente tabla (Tabla 2-)

Tabla 2-2 Medición de macrófagos infectados, no infectado e infectados rotos, por cada vial.

2.4.2 Tamaños

La medida de los tamaños de macrófagos infectados (M ), macrófagos sin infectar (M ),

junto a macrófagos en los que se ha aplicado ruptura celular que contiene vacuolas las

poblaciones se realiza mediante un contador Coulter es el dispositivo que se empleara en

la medición de tamaños para las especies celulares en estudio (Figura 2-20): macrófagos

infectados (M ), macrófagos sin infectar (M ), junto a macrófagos en los que se ha

aplicado ruptura celular. Este mecanismo se basa en la detección y medida de cambios

de resistencia eléctrica al paso de partículas con ciertas características de volumen por

una apertura micrométrica.

Estado del cuerpo celular en

estudio

Macrófagos sin Infectar

Macrófagos Infectados

Macrófagos rotos

Tubo No 1 Tubo No 2 Tubo No 3

Infectado 1,048±0,08 1,048±0,008

(Roto)

No infectado 1,075±0,007


Figura 2-20 Sistema de conteo Coulter Beckman empleado para medir tamaños.

En el caso particular las células en estudio son suspendidas en una solución conductora,

en este caso PBS; donde las partículas en suspensión actúan como aislantes, de tal

manera que al pasar por la apertura micrométrica de forma individual (Figura 2-21), se

genera un cambio de impedancia rompiendo el circuito entre dos electrodos, ubicados al

interior y exterior de la apertura, El número de pulsos cuando el aparato está en

funcionamiento indica el conteo de partículas, la amplitud de dicho pulso depende del

volumen de la partícula (Beckman Coulter®). Una vez que se realiza el respectivo conteo

de pulsos, el mecanismo cuenta con un software de análisis y caracterización de

partículas, el cual es capaz de hacer estadística de las partículas por tamaño.

Figura 2-21 Apertura de conteo en el dispositivo contador (Coulter® Z series).

53

Para el conteo de las células que nos compete en este estudio, se utilizó una apertura de

50 , por lo que la calibración del instrumento se realiza siguiendo el protocolo en de la

guía del usuario, con perlas calibradoras de látex de 5 .

Tamaño macrófagos sin infección

Para llevar a cabo esta medición se diluyen 300 de muestra de macrófagos de la línea

celular J744.A1 en 4 ml de PBS, teniendo en cuenta que la apertura es de 50 y la

fracción que recolecta el aparato es de 0,1 ml, de manera que el número de partículas

contado en este de volumen fue de 18082. La distribución de partículas resultante de

tamaños está dada por ver (Figura 2-22):

Figura 2-22 Número de células sin infección contadas en un rango de 12 a 22 partiendo de 300 de

muestra en 0,1ml.

Las mediciones de tamaño fueron confirmadas con microscopía de luz, utilizando una

cámara CCD en interfaz a un microscopio Zeiss® y el software AxioVision LE®, el cual

permite asignar una medida de longitud por cantidad de pixeles, mediante un proceso de

calibración previo con una escala micrométrica, la imagen correspondiente a la medición

Coulter anterior es entre 10 a 15 (Figura 2-23).


Figura 2-23 Medidas de tamaños por microscopía de luz en macrófagos sin infección

Tamaño macrófagos infectados

Mediante el mismo procedimiento con conteo Coulter™ y seguimiento por microscopía

de fluorescencia, utilizando la misma cantidad de muestra se realizó la medida de

tamaños para macrófagos que han sido expuestos a infección con el parasito Leishmania

amazonensis (Figura 2-24). En este caso la muestra posee una sedimentación rápida por

lo que la muestra debía ser agitada con frecuencia con el fin de lograr un registro de

tamaño.

Figura 2-24 Conteos de macrófagos infectados con L.amazonensis por contador Coulter

55

La imagen por microscopía muestran un aumento de tamaño en la muestra (Figura 2-25),

en esta micrografía no es evidente la marcación rojo del compartimento, dado que se

toma con un objetivo de 10X para lograr un panorama general del cuadro.

Figura 2-25 Medidas por microscopía de luz de macrófagos infectados con L.amazonensis

Se realizaron diferentes mediciones de tamaño para macrófagos con infección y sin

infección llegando a la conclusión que los efectos de la infección incrementa el volumen

del macrófago, generando en él una disminución en la densidad, esta diferenciación en

tamaño y densidad lo que es conveniente para la realización de la separación S-Splitt.

Tamaño vacuolas parasitóforas y detritos celulares

La ruptura celular en el desarrollo del trabajo experimental, trato de hacerse cada vez

más específica, para generar daño localizado en la membrana celular y minimizar el

daño en los organelos celulares. De manera que se desarrolló un cámara de ruptura

rectangular (Figura 2-26), pero conservando las dimensiones del dispositivo venturi ver

(Figura 2-a).

(Figura 2-26). Canal de ruptura con geometría rectangular.


Este canal se hizo con el fin de visualizar in situ la ruptura hecha sobre las células

infectadas realizando control de ruptura por medio de microscopía de luz y de

epífluorescencia (Figura 2-28), controlando a la vez los flujos mediante bombas, para

luego realizar conteos Coulter, las tasas de flujo empleadas fueron de 5, 10 y 20 .

(Figura 2-28) Imágenes de fluorescencia de células J774.A1 pasando dentro del canal de ruptura.

Una desventaja de utilizar bombas es la dificultad para cambiar la dirección del flujo,

aumentando el manejo de la muestra y el riesgo de contaminación.

(Figura 2-29) Tamaños de cuerpos celulares a diferentes tasas de flujo en el canal de ruptura 5, 10 y 20

.

57

De manera que refinando el método de ruptura se lograron obtener compartimentos que

conservan la característica de vacuolas parasitóforas, encontrando compartimentos de

tamaños entre 7 a 20 , (Figura 2-30), donde se puede observar compartimentos

diferenciados por una membrana con parásitos en su interior (puntos verdes dentro del

compartimento), estas imágenes son de vacuolas que se han adherido al recipiente que

las contiene, de manera que la mejor manera para obtener medidas de tamaño es de

estos organelos en suspensión; sin embargo para el desarrollo del modelo de separación

se tomará un valor medio de 13,5

(Figura 2-30) vacuolas parasitóforas diferenciados por una membrana y con parásitos en su interior, el

marcaje es del mismo color a cuando están dentro del macrófago.

Una vez se han descrito las propiedades físicas de las partículas al interior del canal, y el

proceso de ruptura mecánica, se puede da paso al reporte de las propiedades del flujo

transportador.


2.4.3 Forma.

Macrófagos infectados adheridos a la caja de cultivo.

Un cultivo de macrófagos de la línea celular J774.A1 que ha sido expuesto al parásito

Leishmania al estar adherido no cuenta con una forma definida, puede poseer

alargamientos, prolongaciones tanto de la membrana celular como del citoplasma

celular, pero se observa en general que aunque el cultivo este adherido, las vacuolas

parasitóforas en un interior conservan una geometría circular. En la Figura 2-31 se

muestra una micrografía de un cultivo en infección adherida donde se puede observar en

general el alargamiento que sufren las células y en la parte superior izquierda se muestra

un macrófago que a pesar de estar en adhesión cuenta con una vacuola circular. El

tamaño de ésta población adherida se puede incrementar de 100 a 200 .

Figura 2-31 Macrófagos de la línea celular J774.A1 adheridos a la caja de cultivo, en la parte superior un

macrófago con una vacuola parasitófora circular con Amastigotes en su interior.

59

Macrófagos infectados en suspensión

Cuando el cultivo se encuentra en suspensión los macrófagos infectados poseen una

forma con una mayor esfericidad, sin embargo se encuentra que la aproximación a la

esfericidad depende de la historia del cultivo, el estrés al que es sometido durante su

desarrollo y mantenimiento, al igual depende del tamaño de la vacuola parasitófora al

interior del macrófago y su grado de infección con respecto al número de parásitos en su

interior. En la Figura 2-32 se muestran macrófagos infectados marcados con la sonda

de fluorescencia naranja de acridina en suspensión, los cuales poseen formas que nos

permiten contar para efectos de un modelo con macrófagos infectados cercanos a una

esfera, en la parte superior de la Figura 2-32 se observa un macrófago infectado con una

vacuola parasitófora en su interior, esta vacuola aunque desplaza a el núcleo y al

citoplasma celular en general posee un geometría esférica conservada.

Figura 2-32, Macrófagos infectados en suspensión, muestran formas cercanas a una geometría esférica.


Macrófagos infectados expuestos a ruptura

Cuando se exponen macrófagos en infección al estrés mecánico del dispositivo de

ruptura (Ver Figura 2-6) con el fin de obtener la vacuola parasitófora del interior, puede

suceder que el macrófago se rompa en su totalidad dejando tras su ruptura pedazos de

membrana y otros organelos (detritos) junto a vacuolas parasitóforas (Figura 2-33 a.), o

que el macrófago no se rompa, pero dado el estrés mecánico al que fue sometido, se

generen cambios de forma, que lo alejan de una forma esférica (Figura 2-33 b-c).

Figura 2-33. a). Núcleos rotos y detritos celulares después de un ruptura celular, b) y c). Células que han

perdido su esfericidad al no desprenderse la vacuola parasitófora de su interior, d) Célula que ha sufrido

ruptura celular y su vacuola parasitófora contiene gran cantidad de Amastigotes.

De igual manera puede suceder que durante un tiempo prolongado de lisis celular se

rompan organelos celulares como núcleos (Figura 2-33 a.) y las mismas vacuolas

parasitóforas, dejando libre el contenido del núcleo o parásitos en forma amastigote

61

(Figura 2-33 d), de manera que para reducir estos efectos, contar con un mecanismo y

proceso de ruptura controlado de la membrana de los macrófagos es de importancia para

no generar consecuencias y cambios físicos que puedan degradar la separación. Con

respecto a la forma de las vacuolas parasitóforas que se han obtenido por ruptura

mecánica se observó por microscopia de fluorescencia que estas poseen un

comportamiento totalmente esférico cuando se encuentran en suspensión (Figura 2-34).

Figura 2-34 Vacuola parasitófora en suspensión.

Lo que es de utilidad en un modelo de separación; aunque se debe tener en cuenta que

en la separación hay células que no han sido completamente rotas y detritos celulares

que no necesariamente contarán con una geometría definida, por lo que a futuro se debe

evaluar el impacto de los objetos celulares que no conservan total esfericidad.

Una vez evaluados los parámetros físicos que describen a las partículas que estarán en

una separación S-Splitt (tamaño, densidad, forma), se describen las propiedades físicas

del flujo transportador, que en este caso es solución salina.

2.5 Caracterización de parámetros en el flujo transportador

Como se mencionó con anterioridad, las propiedades necesarias para lograr un modelo

de separación involucran también la búsqueda de dos parámetros específicos en el


fluido, a ser empleado en la separación Splitt, viscosidad y densidad; en este caso se

emplea, solución salina, que es obtenida bajo los siguientes compuestos (Tabla 2-).

Tabla 2-3 Cconcentraciones y peso molecular de los compuestos utilizados en la solución salina empleada como fluido transportador en Splitt

Compuesto Concentración (mM)

Peso Molecular g/mol

NaCl 145 58,44

KCl 5 74,56

HEPES 10 280

A continuación se reportan los resultados experimentales de la búsqueda de estos dos

parámetros

2.5.1 Viscosidad del Fluido vector.

La viscosidad , es la medida de la fricción interna en un fluido, mientras más grande sea

la fricción, más fuerza será requerida para generar movimiento en el fluido, esto se

representa con el principio de fuerza de cizalla (Figura 2-31)

Figura 2-31 Modelo newtoniano de placas paralelas a diferentes velocidades, al imponer una fuerza en

una de las placas, se mide indirectamente la viscosidad.

Este principio se define mediante el modelo Newtoniano de dos placas paralelas de fluido

de igual área , separadas una distancia , las cuales se mueven en la misma dirección

a diferentes velocidades y . En donde la fuerza requerida para mantener esta

diferencia de velocidad entre las placas, es proporcional al gradiente de velocidades

en el líquido, esta fuerza se denomina fuerza de cizalla y está dada por la expresión:

63

(2.8)

La cual está representando la cantidad de fuerza aplicada en un área para lograr una

componente diferencial de velocidad en todo el fluido y a la vez un gradiente de cizalla

(2.9)

De manera que la viscosidad dinámica puede ser obtenida mediante la relación

(2.10)

En este caso se realizaron registros mediante un viscosímetro para controlar la variación

del gradiente de cizalla, por medio de un mecanismo que hace variaciones en la

velocidad de un rotor cilíndrico y permite obtener valores para la fuerza de cizalla .

El viscosímetro utilizado para la medición del fluido transportador en la separación SS

fue un aparato Rotovisco-RV20™ (Figura 2-32), que se encuentra en el Instituto de

ciencia y tecnología de alimentos de la Universidad Nacional de Colombia (ICTA).

Figura 2-32 Viscosímetro Rotovisco-RV20™ empleado en la medida de viscosidad del fluido transportador NaCl.

Este aparato está constituido por un panel de control que permite ajustar la velocidad de

un rotor cilíndrico hueco (Figura 2-33), que está inmerso en la solución en estudio (NaCl),

de tal manera que se pueden obtener medidas de viscosidad a una velocidad de rotación

determinada, registrando parámetros como , .

A

F

dy

dvD x

D


Figura 2-33 Sistema de rotación que genera variaciones en la fuerza , y gradiente de cizalla

En este caso los valores registrados para y a una temperatura de fueron con la

respectiva gráfica (Figura 2-34)

Figura 2-34 Gráfica gradiente de cizalla en función de la fuerza de cizalla para encontrar la viscosidad de

la solución salina a temperatura ambiente.

La pendiente posee un valor de 0.0013, indicando que el valor de la viscosidad es

corresponde a 0,0013 o 0,0130 . Por otra parte la relación gráfica entre

y para encontrar La viscosidad a C es: (Figura 2-35).

D´( ) ( )

27 0,0356

45,9 0,0712

75,6 0,1246

126,9 0,2136

207,9 0,356

348,3 0,623

583,2 0,9968

969,3 1,6554

1620 2,7768

2700 4,806

65

Figura 2-35 Gráfica vrs para encontrar la viscosidad de la solución salina a C

La pendiente posee un valor de 0,00177, indicando que el valor de la viscosidad

corresponde a (0,00177 o 0,0177 .

2.6 Medida de densidad Para la solución Salina NaCl

Para la medida de la densidad se empleó un montaje compuesto por un picnómetro

Brand Duran™ de 25,317 , una balanza analítica, agua destilada y solución salina

(Figura 2-36), utilizando la relación de densidad relativa ver (Ecuación 2.11)

(2.11)

Esta expresión permite encontrar la densidad del líquido problema, relacionando la

densidad de un líquido ya conocido (agua destilada), con las diferencias de las masas de

estos dos líquidos contenidos en el volumen también conocido del picnómetro.

Después de realizar múltiples mediciones para las diferencias y a

temperatura ambiente se encuentra la densidad está dada por:

(2.12)

D´( ) ( )

27 0,0356

45,9 0,0534

75,6 0,089

126,9 0,1424

207,9 0,2492

348,3 0,3916

583,2 0,6408

969,3 1,1214

1620 1,8512

2700 3,6312

OHsolmm

mm2

01

02

3007,00071,1

cm

gam


Figura 2-36 Montaje experimental utilizado en la medición de la densidad de la solución salina empleada en la separación Splitt.

De manera que la densidad de la solución salina a temperatura ambiente es de

. Se realizo el mismo procedimiento a sin encontrar una variación

significativa.

Los anteriores experimentos permitan la medición de los parámetros que caracterizan al

fluido transportador, donde dichas medidas sugieren que el fluido utilizado es de carácter

Newtoniano, viscoso e incompresible, lo que es útil en términos de la separación.

Una vez se caracterizaron los parámetros físicos de los cuerpos celulares a ser

separados, el fluido vector empleado en la separación, los siguientes parámetros de

interés están relacionados con la celda de separación los cuales se reportan a

continuación.

2.7 Caracterización y fabricación de la celda de separación.

Diseño de la celda de Separación

Cuando se realizan separaciones celulares se encuentra que para optimizar una

separación es necesario: a) Contar con las características físicas propias de la población

67

a ser separada, y una vez se conocen estas características, es necesario b) contar con

una celda de separación que posea dimensiones -compatibles- con esas características

físicas de las células; los que junto con una correcta selección de las tasas de flujo

empleadas en la separación permitirá optimizar una separación. Donde uno de los

problemas fue la disminución de las dimensiones de la celda y la búsqueda de materiales

que permitan estar más cerca de una esterilización de la celda por auto clavado.

La celda de separación se fabrica en este trabajo partiendo de las celdas Step-Splitt

convencionales (Ratier et al. 2006), con materiales que se encuentran en el país y en el

laboratorio de Biofísica y Biología de Membranas del Centro Internacional de Física, la

primera etapa que se tiene en cuenta para caracterizar la celda de separación es el

diseño del canal para lo cual utilizó un programa de asistencia por computadora para

modelado mecánico -Solid Works™- en donde se diseñó cada una de las piezas de la

celda de separación (Figura 2-38) la cual está constituida por el ensamblaje de laminas

intercaladas sucesivas de varios materiales, en éste caso laminas de boro silicato de 76 x

25 x 1 milímetros para formar los soportes superiores e inferiores; y superposición de

laminas policloruro de vinilo, un material flexible recubierto con un adhesivo removible, el

cual cuenta con un calibre de 80 µm, para conformar el cuerpo del canal.

(Figura 2-38) Configuración básica de un canal S-Splitt para separación de vacuolas parasitóforas.

El cuerpo del canal es un parámetro de importancia pues al modificarse el ancho, largo y

espesor dependiendo de los parámetros físicos de la muestra a separar, la separación


puede ser optimizada. De manera que se propone que para optimizar la separación de

cualquier población celular una de las maneras es construir celdas con espesores

determinados, adecuados a los tiempos de residencia y velocidades propias de cada

cuerpo celular en la celda de separación a determinadas tasas de flujo.

En este caso el cuerpo del canal se construyo de tal manera que la superposición de dos

láminas de policloruro de vinilo generara entradas y salidas de 160 , y una zona de

transporte de 320 (Figura 2-39), sin embargo se encontraron aspectos que varían la

el espesor de la celda inicialmente diseñada, al momento de ser construida como se verá

más adelante.

(Figura 2-39), Superposición de láminas de policloruro de vinilo, para lograr espesores deseados para la

separación de organelos intracelulares.

La segunda etapa en la caracterización de la celda después de realizar el sólido

computacional de cada pieza que lo compone, consiste en ensamblar estas piezas y

fabricar “virtualmente” la celda S-Splitt, y partiendo de este ensamble generar un dominio

computacional, de la parte “hueca” por donde fluyen el fluido vector con la muestra en

suspensión (Figura 2-40)

(Figura 2-40) Ensamble de cada pieza para generar una celda S-Splitt (parte inferior), junto al dominio

computacional obtenido del ensamble de piezas (parte superior)

69

Este dominio computacional será de utilidad para caracterizar el comportamiento y los

efectos hidrodinámicos que se generan dentro del canal de separación, al resolver

numéricamente las ecuaciones que describen al fluido pasando por este dominio : las

ecuaciones Navier-Stokes, como se verá más adelante.

Construcción de la celda.

Para obtener el canal que se utilizó en este trabajo fueron diseñados y fabricados 4

prototipos que variaban en dimensiones y espesores. Para el caso del canal definitivo, se

tuvo en cuenta no solo las propiedades físicas de los macrófagos en infección y en

estado de ruptura, sino también propiedades de otros grupos celulares que son utilizados

en el laboratorio.Para el ensamble de la cámara de separación fue necesario un

pegamento a base de Neopreno para garantizar capas uniformes en la superposición de

piezas (Error! Reference source not found.), de manera que se encontró durante la

fabricación que los espesores deseados (Figura 2-42) en las entradas, salidas y zona de

transporte, varían en 20 por cada aplicación de pegamento, esto es de importancia

pues para optimizar el proceso de separación factores como éste al tenerse en cuenta

pueden dar una mejor resolución en la separación.

Figura 2-41 Ensamblaje de la celda Splitt, el pegamento durante el ensamble puede variar el espesor deseado.


Teniendo en cuenta la variación del espesor por cada aplicación de pegamento, las

dimensiones del espesor se modifican, contando con un espesor total , un

largo de y un espesor en las entradas y salidas de (Figura 2-42).

(Figura 2-42), Espesores reales de la celda S-Splitt después de su construcción teniendo en cuenta la

variación que genera la aplicación de pegamento.

Acoplando todas las piezas, para finalizar la construcción del canal de separación se

incorpora a las entradas y salidas tubos de HALAR de diámetro interno de 0.062 in y

diámetro exterior de 0.125 in, que comunicaran al canal con las bombas de inyección de

muestra, para obtener como resultado la celda de separación S-Splitt a ser utilizada en

los experimentos de separación (Figura 2-43).

Figura 2-43 Celda de Separación Step-Splitt utilizada en los experimentos de separación.

En la realización y caracterización de la celda de separación se encuentra que la

miniaturización de la celda es un proceso de importancia en la optimización de la

separación cuando en ésta se involucran muestras de alta dilución, lo que permite

extender el uso de esta celda a casos a otros modelos celulares, haciendo que cámaras

de menores dimensiones disminuyan el problema de la baja dilución de la muestra en la

separación (Figura 2.44).

71

Figura 2.44. Disminución de las dimensiones de la celda Step-Splitt.

Resumen de los parámetros físicos encontrados

En general una condición de partida para optimizar la separación en Step-Splitt, es

conocer los parámetros físicos de las partículas en separación, por lo general cuando se

realizan separaciones de perlas inertes, desde fábrica se cuenta con parámetros físicos

establecidos en tamaño y densidad; pero cuando se trabaja con poblaciones celulares se

debe encontrar las variables físicas características a la población celular que no están a

excepción de glóbulos rojos reportadas en la literatura, de manera que en la Tabla 2-4 se

encuentran los parámetros propios a macrófagos infectados y sin infección, vacuolas

parasitóforas junto a propiedades del fluido transportador de separación.

Tabla 2-4 Parámetros Físicos de cuerpos celulares Involucrados en la separación de vacuolas parasitóforas

de Leishmania amazonensis.


Durante la medición de los parámetros físicos se encontró evidencia experimental inicial,

que sugiere que parámetros como la densidad varían de manera significativa

dependiendo del estado biológico de las células, calidad del cultivo celular así como el

tiempo de infección. Para un cultivo de macrófagos infectado con Leishmania

amazonensis, 24h post infección el tamaño medio de los macrófagos es de 12 µm, un

tamaño de vacuola parasitóforas entre un rango de 6 a 11 µm y una densidad de 1.044 ±

0,008 .

De igual manera mediante la misma metodología experimental por gradientes de

densidad y verificación de conteos por microscopia de luz y fluorescencia se encontró

que los parámetros físicos están sujetos a variaciones que dependen incluso de la

especie de Leishmania que infecta a los macrófagos o células del sistema inmune, para

un cultivo de macrófagos infectados con Leishmania braziliensis, a las 48h post infección,

se encontró una densidad para los macrófagos de 1.005 ± 0,008, con un tamaño

medio de 18 µm y 6 a 10 µm para vacuolas parasitóforas. De manera que para lograr una

separación de células u organelos intracelulares óptima por Step-Splitt, la primera

recomendación es contar con los parámetros físicos de los objetos involucrados en la

separación.

73

3 MODELO FISICO DE LA SEPARACIÓN

Una vez encontrados experimentalmente los parámetros físicos de los cuerpos celulares

involucrados en la separación (macrófagos infectados, no infectados y vacuolas

parasitóforas); junto a las propiedades del flujo transportador, es posible utilizar estos

parámetros para afinar un modelo que logre predecir las tasas de flujo necesarias para

una separación de vacuolas parasitóforas en el mecanismo Step-Splitt. Por tanto en este

último capítulo se realizará una descripción de las fuerzas involucradas en la separación,

para proponer mediante el criterio de diámetro crítico (Ecuación 1.17) y la respectiva

velocidad de sedimentación de cada cuerpo celular (Ecuación 1.15) un rango tasas de

flujo que permiten lograr separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania

amazonensis en un mecanismo Step-Splitt.

3.1 Fuerzas sobre las células en la celda Step-Splitt.

Cuando los cuerpos celulares de interés están en suspensión durante la separación,

estos están sujetos a fuerzas, que varían en magnitud según sus propiedades físicas y el

tipo de campo al que estos son expuestos. En un análisis clásico de fuerzas, los cuerpos

celulares en separación están sujetos a una fuerza de carácter externo , debida al

campo gravitacional, otra de carácter resistivo debida al arrastre hidrodinámico , a la

vez que se genera una fuerza de empuje que es explicable desde el principio de

Arquímedes (Figura 3-1).

Figura 3.1 Fuerzas involucradas sobre un cuerpo esférico en suspensión en la celda Step-Splitt.


El espacio para la sedimentación de las células está dado por el espesor del canal o la

distancia total entre las paredes A y B desde su fabricación (Figura 3-1), que para el caso

de la celda construida es de ; por los experimentos realizados y reportados en el

capítulo anterior se puede encontrar que macrófagos infectados, no infectados y

vacuolas parasitóforas tienen propiedades físicas de densidad y tamaño diferentes, de

manera que cada uno de estos cuerpos celulares posee una velocidad de sedimentación

diferente y una movilidad característica en el espesor del canal, la cual como veremos en

las siguientes secciones es aprovechada para la separación de vacuolas parasitóforas de

otros cuerpos celulares involucrados, en donde se tiene en cuenta que las especies con

menor movilidad serán recuperadas por la salida a, mientras que las que poseen una

mayor movilidad son recuperadas por la salida b.

Las separaciones celulares se realizarán a una baja dilución, y dado que la forma de las

de los macrófagos y vacuolas en suspensión son muy cercanas a una esférica, en una

dilución baja de muestra, es posible despreciar las interacciones hidrodinámicas entre las

células que componen la muestra; por lo que las fuerzas que actúan sobre los

constituyentes de la muestra son (Ratier 2006):

Fuerza de arrastre

La fuerza de arrastre es una fuerza dependiente de las características del objeto que se

mueve en el fluido, en este caso dado que se trabaja con objetos celulares cercanos a

una forma esférica. Para una célula de radio moviéndose con una velocidad relativa

a través de un fluido con viscosidad , esta fuerza puede escribirse por la ley de Stokes

como:

(3.1)

En este caso la velocidad es relativa a la velocidad del fluido y la velocidad de

las partículas , de manera que la ecuación (3.1) se escribe:

(3.2)

Donde es la viscosidad dinámica del fluido y es el radio de las células. La velocidad

del fluido está dada por el perfil parabólico de velocidades (de Poiseuille) que se

genera en la cámara Step-Splitt el cual esta descrito por la Ecuación 3.3.

75

(3.3)

Fuerza boyante o de Flotabilidad

Esta es una fuerza resultante del peso de las partículas y del principio de Arquímedes,

esta expresión se escribe como:

(3.4)

Donde es el radio de las partículas, es la gravedad, es la densidad de las celulas,

en la densidad del fluido, de manera que una célula que está bajo la acción tanto de la

fuerza de arrastre (Ecuación 3.2) como bajo la acción de la fuerza boyante (Ecuación 3.4)

se sedimentará en el canal de separación; donde después de un tiempo bajo el equilibrio

de estas dos fuerzas, la velocidad de sedimentación es constante, descrita por la

expresión:

(3.5)

En la siguiente sección se calcula la velocidad de sedimentación para cada uno de los

cuerpos celulares involucrados en la separación.

3.2 Velocidad de sedimentación para cuerpos celulares.

Para encontrar la velocidad de sedimentación en cada cuerpo celular, se debe tener en

cuenta ésta depende del diámetro dé cada uno y de la diferencia entre la densidad de las

células y del fluido transportador, si el tamaño o la diferencia de densidad en la Ecuación

3.5 disminuyen esta velocidad de sedimentación será más baja. Dado que después de

realizar disrupción mecánica de la membrana se cuenta con tres poblaciones celulares:

macrófagos enteros sin infección con un diámetro de 11,84 , macrófagos infectados

con un diámetro de 13,52 y vacuolas parasitóforas con diámetros de , se

calcula la velocidad de cada una de estas poblaciones; para el caso de las vacuolas

parasitóforas se toma el diámetro medio de 13,5 .

Con los parámetros físicos reportados en segundo capítulo, haciendo uso de una tabla

dinámica que recopila los datos experimentales y los incorpora en la ecuación de


sedimentación, se encontraron las respectivas velocidades de sedimentación para cada

cuerpo celular de interés en el espesor de los cuales se encuentran reportados

en la Tabla 3-1.

Tabla 3-1 velocidades de sedimentación para cuerpos celulares involucrados en la separación.

Al realizar una separación por Step-Splitt de los cuerpos celulares de interés, en la tabla

3-1 se puede observar que los macrófagos sin infectar e infectados poseen una menor

movilidad con una velocidad de sedimentación de de respectivamente,

mientras que vacuolas parasitóforas cuentan por su tamaño y densidad con

una movilidad mayor con una velocidad de sedimentación de ; por tanto se

puede inferir que vacuolas con densidad de y con tamaños mayores a

tendrán una movilidad mayor separándose de los otros cuerpos celulares por

una de las salidas de la celda utilizando un flujo conveniente.

Cuando se realizan separaciones de material biológico es deseable contar con maneras

de realizar experimentos de separación alternos que eviten la perdida de material

biológico y emulen los parámetros físicos de la muestra, de manera que mediante la

ecuación 3.5 se encuentran las similitudes entre las propiedades de células y perlas

inertes de látex, teniendo en mente que este material particulado cuenta con propiedades

estándar: densidad 1.050 , tamaño y la forma (esférica), así que se

calculan los valores de la velocidades de sedimentación para los diferentes tamaños de

perlas inertes con los tres parámetros anteriores, junto a las propiedades del fluido y se

comparan con su cuerpo biológico análogo Tabla 3-2.

77

Tabla 3-2 Velocidades de sedimentación para partículas de látex con parámetros experimentales conocidos,

junto a los tamaños y velocidades de sedimentación junto a la correspondiente Similitud con los cuerpos

celulares de interés.

Observando la Tabla 3-2, se puede encontrar que las perlas con tendrán una

velocidad de sedimentación cercana a macrófagos sin infectar de , las perlas

con de diámetro poseen velocidades similares a macrófagos infectados de

y perlas de poseen una velocidad de sedimentación cercana a vacuolas

parasitóforas de , lo que puede ser de utilidad para realizar experimentos piloto

de separación sin la necesidad de perder material valioso que proviene de varios días de

preparación y mantenimiento de cultivo celular. Una vez se conocen las velocidades de

sedimentación para los objetos involucrados en la separación celular y de partículas

inertes de partículas de látex que pueden emular las condiciones de separación, es

necesario escoger las tasas de flujo adecuadas para enriquecer vacuolas parasitóforas,

para lo cual se buscan las tasas de flujo optimas en la celda Step-Splitt, como se verá a

continuación. Para lo cual se realiza un seguimiento de la estabilidad hidrodinámica a

diferentes flujos para escoger un flujo optimo en la separación de estos organelos

aplicando el criterio de diámetro crítico.

3.3 Estabilidad hidrodinámica y tasas de flujo.

Antes de buscar las tasas de flujo óptimas en la separación mediante el criterio de

diámetro crítico (Ecuación 1-17), se realiza el montaje experimental adecuado (Figura

3.2) el cual está compuesto por cuatro bombas de precisión Harvard® y Kit Scientific

Syringe Pump® que inyectan de manera constante a la celda Step Splitt (Figura 2.43)


solución salina caracterizada (Ver tablas 2-3,2-4) y células en suspensión infectadas con

Leishmania amazonensis, las cuales son cargadas con el floróforo Naranja de Acridina,

con la finalidad de hacer posible un seguimiento del paso de las células por la celda

haciendo uso de un microscopio Zeiss Axiovision® y un registro de la traza de

florescencia mediante micrografías de florescencia adquiridas con el sistema adquisición

de imágenes Axio-observer®, el cual permite realizar un perfil de fluorescencia para las

dos tasas de flujo total.

Figura 3-2 Montaje con la Celda Step-Splitt para verificar estabilidad con células infectadas marcadas con un

fluoróforo con tres tasas de flujo determinadas.

En este caso se escogieron dos tasas de flujo “limite” una alta de 10

y otra baja de 1

, sobre las cuales se evalúa la estabilidad y junto al criterio de diámetro critico se acota

como lo veremos más adelante la sección del flujo adecuado para el enriquecimiento de

vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis de tamaño superior a .

bajo condiciones experimentales (Tabla 3-3) ya planteadas como: tasas de flujo a la

entrada ′ , tasas de flujo en la salida , un espesor de la zona de

transporte de , de en la zona ISP y de en la zona de salida

OSP.

79

Tabla 3.3 Flujos en las entradas y salidas para los casos experimentales de interés.

Analizando el flujo más alto de , bajo las condiciones experimentales

anteriormente planteadas se verifica el comportamiento hidrodinámico durante el

transporte de las células infectadas en la parte central de la celda de separación (Figura

3-3).

Figura 3-3 Visualización bajo el microscopio de Florescencia del paso de las partículas en la celda de separación para 10 ml/h, derecha de la imagen se muestra la intensidad de fluorescencia con respecto a la variación del ancho del canal


La medida de intensidad de fluorescencia en función del ancho de la celda (Figura 3-4)

se obtiene mediante el programa de análisis de imágenes ImageJ®, en esta medida se

puede observar un aumento significativo en el pico de intensidad hacia la región central

de la celda, mientras que se hace insignificante hacia las paredes, lo que es coherente

con el hecho de que las células se mueven a una mayor velocidad en el centro y a una

menor conforme se acercan a las paredes, lo anterior permite evidenciar que el fluido que

se transporta laminarmente bajo una distribución parabólica tipo Poiseuille (Figura 3-4).

Figura 3-4 Superposición del perfil de fluorescencia a un flujo de 10ml/h en la celda Step-Splitt, el centro del

canal con respecto al ancho de la celda se nota con la línea roja.

En vista que experimentalmente se evidencia en la celda bajo un flujo total de un

comportamiento estable, a continuación se plantea bajo condiciones de fronteras

impuestas por el experimento, una solución numérica de la ecuación de continuidad

(Ecuación 3.5)

(3.5)

Esta ecuación es resuelta para el dominio computacional de la celda Step-Splitt (Figura

2-40) realizando un proceso de: a) Mallado, b) Planteamiento de condiciones de frontera

y c) solución por iteración, obteniéndose una solución para cada elemento del espacio de

la ecuación de continuidad (Apéndice 2).

Efectuando la solución por medio del software CFD Fluent® de la ecuación de

continuidad con 1000 iteraciones y empleando un mallado con dimensiones máximas y

mínimas para cada elemento de la malla con respectivos máximos y mínimos de

y , unidos por 135.624 puntos de 5µm de resolución (ver Apéndice 2) y

utilizando la velocidad media de 1,5 mm/s se puede observar el comportamiento

0 v

81

parabólico que toma el fluido al interior del canal lo que está de acuerdo con lo observado

experimentalmente.

Figura 3-5 Perfil parabólico en la simulación para la geometría planteada

Dado que experimentalmente aun no es posible obtener imágenes de un corte

transversal de la celda en los de espesor del canal y observar desde una vista

lateral el comportamiento del flujo in situ, la simulación mediante el paquete CFD Fluent®

hace evidente el comportamiento laminar del fluido para las condiciones experimentales

planteadas (Figura 3-6)

Figura 3-6. Visualización del comportamiento laminar del fluido bajo en los 360 de espesor en la celda de

separación bajo las condiciones experimentales propuestas.


Observando esta Figura 3-6 en la parte superior se puede observar el comportamiento

estable de las entradas y salidas, donde se hace evidente la formación de una especie

de planos transportadores, los cuales poseen correspondencia con el gradiente de

velocidad observado en la parte inferior para el canal completo; donde la velocidad es

más alta hacia las paredes y se reduce hacia el centro del mecanismo de separación.

Cuando se realiza el seguimiento de las trazas de fluorescencia para una tasa de flujo de

, se encuentra que las células se des-focalizan del centro de la celda para

acercarse más hacia las paredes (Figura 3-7), de manera que se encuentra que a mayor

flujo total las partículas se focalizaran alejándose de las paredes de la celda, lo que

puede ser benéfico en la separación.

Figura 3-7 Visualización bajo el microscopio de Florescencia del paso de las partículas en la celda de separación para 1 ml/h, reconstrucción del perfil en la localización de la medida en la celda de separación.

De manera que observando este cambio en el comportamiento del flujo en el canal se

tomará la tasa de 1 ml/h como límite inferior para la búsqueda del flujo total que optimice

83

la separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis, de manera que

ahora en la última sección de este trabajo, utilizando el criterio de diámetro crítico, se

reporta el flujo total más eficiente entre el intervalo de 1 y 10 ml/h.

3.4 Separación de vacuolas parasitóforas de Leishmania

amazonensis.

Cuando se realizan separaciones a nivel experimental es de ayuda conocer teóricamente

la tasa de flujo en la cual todos los cuerpos celulares saldrán solamente por y la tasa

en la que todo el material saldrá únicamente por para luego bajo el conocimiento de

los parámetros físicos de la muestra, buscar la tasa óptima para lograr separación de

células. En este caso se utiliza la definición de diámetro crítico (Ecuación 1-17),

Expresión que está escrita en términos de parámetros ya encontrados: la dimensión de la

celda, características físicas como densidad del fluido transportador junto a tamaño y

densidad de los cuerpos celulares en separación. De manera que conociendo estos

parámetros se puede calcular el dímetro crítico para el cual dichos objetos celulares

empezaran a salir por realizando una comparación entre el diámetro critico y el valor

real en µm para células con un tamaño y densidad particular a una tasa de flujo total

dada; de manera que según esos parámetros si los cuerpos celulares en

cuestión estos saldrán por a y si por el contrario por medio de la variación de las tasas de

flujo en el canal se llega a que los cuerpos saldrán por . El objetivo es

efectuar separaciones de vacuolas parasitóforas de los otros objetos biológicos, el

tamaño real de las vacuolas parasitóforas de Leishmania amazonensis encontrado por

microscopia de fluorescencia y reportado en el capitulo anterior corresponde a un rango

de 7 a 20 , de manera se toma el tamaño promedio de 13,5 µm. Para una tasa de flujo

de 10ml/h siguiendo el criterio de igualdad entre el diámetro critico y real, se encuentra

que macrófagos infectados, sin infección y vacuolas parasitóforas saldrán todas por

(Tabla 3-4). Los valores de diámetro critico fueron encontrados utilizando una hoja

dinámica de Excel y comprobados mediante un programa implementado en C++ por

(Vargas.2012).


Tabla 3-4 Diámetros críticos y diámetros reales para una tasa de 10 ml/h, todo el material sale por

Para este caso se emplean tasas de flujo en las entradas y salidas bajo condiciones

experimentales específicas ilustradas en la Figura 3-8

Figura 3-8 condiciones en la celda de separación para que todas la población celular salga por

De manera análoga para un flujo de 1 ml/h se encuentra mediante la (Ecuación 1-17) los

valores para el diámetro crítico (Tabla 3-5), en donde se encuentra que los valores del

diámetro crítico son menores que el diámetro real de cada una de las poblaciones

celulares involucradas en la separación, de manera que los cuerpos celulares saldrán

todos por (Figura 3-9).

Los diámetros reales de los cuerpos celulares fueron medidos para macrófagos y

vacuolas que provienen de cultivos 48 horas post-infección, junto a macrófagos sin

infección, de manera que para calcular estos diámetros es necesario tener en cuenta el

historial de preparación, manejo y mantenimiento de los cultivos celulares.

85

Tabla 3-5 Diámetros críticos y diámetros reales para una tasa de 1 ml/h, todo el material sale por

Bajo las condiciones experimentales ilustradas en la Figura 3-9 el flujo total al ser menor

permitirá que las células en suspensión tengan una mayor movilidad a través del espesor

del canal, dando un tiempo suficiente para que se sedimenten hasta alcanzar la salida b.

Figura 3-9 condiciones en la celda de separación para que todas la población celular salga por

En los tres casos anteriores se puede evidenciar que el diámetro crítico para estas

poblaciones celulares tiende a aumentar conforme se incrementa el flujo total en la celda

de separación, se debe encontrar una tasa de flujo que permita la separación de

vacuolas de ,

Calculando el valor de diámetro critico mediante la ecuación 1-17 (la cual incorpora las

propiedades de los cuerpos celulares), se encuentra que para un flujo de 8 ml/h se

tendrá un enriquecimiento de vacuolas parasitóforas de mayor tamaño - a partir de


13,6µm – por la salida b, dejando a las vacuolas de menor tamaño y células infectadas y

no infectadas enteras salida por (Tabla 3-6).

Este resultado se basa en con zonas de separación , ,

donde para el flujo total de se emplean tasas a las entradas y salidas

y respectivamente (Figura 3-10).

Tabla 3.6 Criterio de diámetro crítico para las poblaciones celulares de interés a un flujo de .

Figura 3-10 condiciones en la celda de separación para que vacuolas parasitóforas de mayor tamaño salgan

por

Con el hallazgo de la tasa volumétrica de flujo que optimiza la separación de la vacuola

parasitófora de Leishmania, resta para trabajos futuros buscar un control más específico

de la muestra en la celda de separación

87

4 Conclusiones.

El conocimiento de parámetros físicos como: Tamaño, densidad y forma en los

cuerpos celulares, ayuda a optimizar el proceso de separación; conjugando éstos

parámetros con una caracterización completa tanto del fluido transportador como

de la celda utilizada.

La optimización de la ruptura celular de la vacuola parasitófora de Leishmania

amazonensis es un proceso de importancia para lograr compartimentos viables

para la separación celular y su posterior estudio, de manera que el desarrollo de

métodos que permitan cuantificar el impacto físico sobre la membrana del

macrófago optimizan el proceso de selección.

La densidad es un parámetro preponderante para determinar la movilidad de cada

una de estas poblaciones celulares en el canal de separación, donde se

encuentra que vacuolas y macrófagos sin infección tendrán una mayor movilidad

transversal y una menor movilidad para macrófagos infectados dado su aumento

en volumen.

Para efectos de un modelo futuro el parámetro de forma debe ser analizado más

a fondo, dado que no se contará después de una ruptura celular con formas

completamente esféricas, lo que puede generar una mayor precisión en un

modelo de separación.

La miniaturización de la celda es un proceso de importancia en la optimización de

la separación cuando en ésta se involucran muestras de alta dilución, lo que

permite extender el uso de esta celda a casos a otros modelos celulares (células

de Schwann).

Se encontró experimentalmente y por medio de una simulación que a un flujo total

10 ml/h se conserva estabilidad hidrodinámica en el canal, observándose en el

espesor de 360 µm efectos hidrodinámicos a los descritos por la teoría. A la vez


que se evidencia un perfil de velocidades parabólico garantizando estabilidad

hidrodinámica.

Para empezar a obtener enriquecimientos de vacuolas parasitóforas en la celda

de separación construida se debe trabajar con un flujo total de 8 ml/h, a tasas de

flujo 0,2 en la entrada y 0,5 en la salida, donde vacuolas de 14 a 20 µm saldrán

por la B y de 7 a 14µm saldrán por A.

89

5 Recomendaciones

Se aconseja con el fin de lograr separaciones de material biológico aún más

específico, experimentar con el método de separación Step-Splitt acoplado a otro

tipo de campo: por ejemplo un campo acústico.

Para la construcción de la celda de separación es deseable contar con materiales

totalmente compatibles con muestras biológicas, que sean esterilizables; para lo

cual deben se recomienda seguir la construcción de canales en vidrio, buscando

resinas y pegamentos que sean durables en el tiempo impidiendo fugas de

muestra.

En este caso se construyó una celda de separación enfocada a la separación de

dos especies celulares de interés en nuestro grupo de investigación, sin embargo

si la separación se quiere realizar de una manera más específica y en menor

tiempo, es posible aumentar los flujos de separación aumentando el largo de la

celda de 30.74mm a el doble, es decir buscar un tipo de celda más especifico

enfocado a disminuir el problema de la dilución de la muestra.

Es aconsejable la búsqueda de elementos que mejoren la ruptura celular de la

membrana del macrófago, durante ésta se pueden generar cambios geométricos

que alejan a los cuerpos celulares de una forma esférica.

6 Anexo 1: Solución numérica de las ecuaciones que caracterizan el movimiento de un fluido.

En el desarrollo del trabajo se modelo el comportamiento del flujo en la celda de

separación, donde el tratamiento matemático que se involucra en la dinámica de un fluido

es algo complejo debido a la presencia de múltiples escalares, campos vectoriales y

tensoriales, para ello se analiza la dinámica del fluido y el transporte de partículas en

sentido longitudinal de la celda mediante la solución numérica de las ecuaciones que

gobiernan el fluido bajo condiciones de frontera impuestas por un dominio computacional,

obtenido en el desarrollo del trabajo. De manera que las ecuaciones de movimiento que

gobiernan a un fluido son (Landau 1959), (Bruss 2011):

Ecuación de continuidad

La ecuación de continuidad expresa la conservación de la masa, para encontrar esta

ecuación se tiene en cuenta el cambio de densidad en el fluido como función del espacio

y el tiempo al interior de una región Ω (Figura 3.2), la masa total en esta región se

puede expresar como una integral de volumen sobre la densidad (Ec 3.6)

Figura 3-2 Representación de la densidad de corriente fluyendo por una región .

92 Título de la tesis o trabajo de investigación

(3.6)

Dado que no puede aparecer o desaparecer masa espontáneamente solo varia

debido al flujo de masa a través de la superficie de la región , la densidad de

corriente de masa es definida como la densidad de masa por el flujo de masa

por unidad de área en (3.7):

= (3.7)

Diferenciando la integral de volumen (3.6)

(3.8)

O una integral de superficie sobre de la densidad de corriente de masa

ecuacion (3.7).

Utilizando el teorema de Gauss para el campo vectorial

(3.9)

Con las ecuaciones (3.8) y (3.9) se observa que la integral de superficie es

análoga a la integral de volumen.

(3.10)

De manera que si los integrados son idénticos, se obtiene la ecuación de

continuidad:

Apéndice 93

(3.11)

La ecuación de Navier Stokes.

La segunda ecuación que gobierna el movimiento del fluido es la ecuación de Navier-

Stokes, que es una ecuación de movimiento para un campo de velocidades Euleriano

relacionado con la conservación del momento y la densidad de momentum , la

derivación es similar a la ecuación de continuidad, considerando la i-esima componente

del momento total Ω dentro de una forma región arbitraria Ω, la tasa de cambio de

momento está dado por Ω :

(3.12)

La tasa de cambio del momento en la región Ω esta bajo la acción de fuerzas dadas

por la segunda ley de Newton, estas fuerzas se dividen como fuerzas que actúan

en el interior de la región Ω (fuerzas eléctricas y gravitacionales) y fuerzas de

contacto como la presión y la viscosidad. De manera que la i-esima componente

del momento puede ser escrita como:

(3.13)

Para cada una de estas componentes según el caso hay una integral de volumen o de

superficie la cual es diferenciada para obtener la ecuación de Navier-Stokes:

(3.14)

6.1 Solución numérica de las ecuaciones de Navier-Stokes

que la velocidad del fluido es mucho más pequeña que la velocidad del sonido (ondas de

presión), por lo que se cuenta dentro del canal con un fluido incompresible, de manera

que la densidad es constante en el espacio y en el tiempo, así que la ecuación (3.11)

de continuidad se escribe como:


(3.15) De igual manera teniendo en cuenta en el canal se cuenta con flujo un estacionario,

viscoso, y Newtoniano, dado por las propiedades del fluido encontradas

experimentalmente la ecuación de Navier-Stokes que es resuelta numéricamente es de

la forma:

( )

(3.16)

Donde es la velocidad del fluido, es la viscosidad cinemática y la carencia de efectos

de superficie permite el uso de una presión modificada . La ecuación (3.15)

es una ecuación de conservación, la ecuación (3.16) puede ser vista como una ecuación

de transporte que representa en este caso transporte de momento lineal a través de un

dominio computacional, si se asume que y son constantes, para un flujo

tridimensional, se generan cuatro ecuaciones diferenciales con cuatro incógnitas y

de manera que la ecuación de continuidad para su solución numérica es de la forma:

Mientras que la ecuación de momento (3.16), para ser solucionada se divide en las tres

coordenadas, quedando una ecuación para el momento en en términos de las

variables antes mencionadas:

Momento en

Momento en

Momento en

Apéndice 95

Proceso de solución numérico

Para la solución de estas últimas cuatro ecuaciones se utiliza un paquete CDF, para

solucionarlas numéricamente en este caso se utiliza el paquete de dinámica de fluido

FLUENTTM , el proceso de solución se sintetiza en los siguientes cuatro numerales:

1. Dominio Computacional: Se toma el dominio computacional, creado a partir del

diseño y construcción de la celda S-Splitt, y dicho dominio se divide en celdas, las cuales

pueden ser pensadas como elementos de volumen en donde las ecuaciones de

continuidad son resueltas, este proceso se denomina mallado (Figura 3-3).

Figura 3-3 División del dominio computacional en celdas de volumen

2. Condiciones de frontera: Se especifica en el dominio computacional las caras donde

se inician las condiciones iniciales para la solución (Figura 3-4)

Figura 3-4 a) elección de las coordenadas en donde se inicia la solución en el dominio


b) Proceso de ubicar las caras sobre el dominio computacional.

3. Tipo de Fluido: se define el tipo de fluido y sus propiedades, para ello se tomaron las

propiedades encontradas para la solución salina, en el capitulo anterior.

4. Iteración: se inicia la solución de las ecuaciones al interior de la geometría, utilizando

las ecuaciones de continuidad y momento.

Apéndice 97


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iván camilo navarrete quecano · con el hallazgo de estos parámetros y con criterios de...

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