introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para ... · de la prueba, siendo desde ya...

Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para

Prosthenorchis spp. basada en PCR

Ana Carolina Falla Beltrán

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá D.C., Colombia

2015

Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para

Prosthenorchis spp. basada en PCR

Ana Carolina Falla Beltrán

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Salud Animal

Director:

M.Sc, Ph.D., Biólogo. Paul Bloor

Codirectora:

MSc, MV. Claudia Brieva

Línea de Investigación:

Microbiología y Epidemiología-Animales Silvestres

Grupo de Investigación:

Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá D.C., Colombia

2015

La vida me ha enseñado que un camino se

recorre paso a paso, saboreando la

satisfacción de recoger los frutos y

aprendiendo como esquivar los obstáculos.

Porque las caídas, son solo el aviso de lo que

debemos llevar en la maleta para emprender

el siguiente viaje.

A mi Mari y mi Juan, la razón de mi existir y a

ti mamita por estar conmigo siempre.

Agradecimientos VII

Agradecimientos

A Paul Bloor, Profesor especial, Coordinador del Grupo de Biodiversidad y Recursos

Genéticos, Instituto de Genética, por su acertada dirección, sabiduría y grandes aportes

con el diseño y ejecución del trabajo.

A Claudia Brieva, Directora del Departamento de Salud Animal y Directora de la Unidad

de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) de la Facultad de

Medicina Veterinaria y de Zootecnia por la co-dirección del trabajo y su apoyo

incondicional durante toda la Maestría.

Al Programa Internacional de Conservación de Saguinus leucopus (ACOPAZOA-EAZA)

por su apoyo económico y paciencia para la presentación de este trabajo.

Al Contrato 09F y 39, entre FONAM, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia-

Universidad Nacional de Colombia y WCS, por la financiación de la fase de campo.

A WCS por colectar las muestras de vida silvestre.

A todos los profesionales y directivos de URRAS de la Universidad Nacional de

Colombia, del Centro de Recepción de Fauna y Flora Silvestres de la Secretaría Distrital

de Ambiente (SDA), del Centro de Atención y Valoración del Area Metropolitana del Valle

de Aburrá (AMVA), del Centro de Atención de Fauna Silvestre (CAFS) de la Fundación

Zoológica de Cali, del Centro de Rescate de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas

(CRFSOC) y del Centro de Montelindo de CORPOCALDAS, y, por la colaboración en la

toma de muestras de materia fecal y envío de parásitos.

VIII Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.

basada en PCR

A Rafael Torres Quin, Presidente de la Asociación Colombiana de Parques Zoológicos y

Acuarios y Gerente del Parque Jaime Duque, por su apoyo y comprensión para poder

realizar la tesis.

A Manuel Hoyos, Sebastián Arciniégas, Carolina Ibañez, Thomas Viloria y Angélica

González del Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos del Instituto de Genética,

por su compañerismo, paciencia y aportes para la realización del trabajo de laboratorio.

A Nicolás Contreras y Henry Rodríguez, estudiantes del Laboratorio 7 del Instituto de

Genética, por su apoyo para la realización de las fotos y el préstamo de equipos.

A Jimmy Vargas, Profesor Asistente, Universidad Nacional de Colombia, por su

colaboración en las fotografías e identificación del parásito.

A mi Madre y mi suegra, por cuidar a mi hija durante las extensas jornadas de trabajo.

IX

Resumen

El objetivo de este estudio fue desarrollar una prueba diagnóstica que permitiera la

identificación de Prosthenorchis sp. mediante la técnica de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR). Se recibieron 37 parásitos, identificados morfológicamente como

Prosthenorchis elegans, colectados de necropsias y cirugías de Saguinus leucopus y

Cebus albifrons, para aislar y caracterizar la secuencia de citocromo oxidasa subunidad

I (COI) específica para P. elegans, por medio del proceso de extracción de ADN,

amplificación y secuenciación, encontrando seis haplotipos ubicados en dos haplogrupos

diferentes. Se diseñaron primers específicos para la amplificación, por medio de una

PCR semi-anidada, de un fragmento de P. elegans de 178 pb, siendo altamente

sensibles para detectar P. elegans en muestras de heces de titi gris (S. leucopus) que

habían sido negativas al coprológico. Se recomienda continuar con la estandarización

de la prueba, siendo desde ya una herramienta diagnóstica y ecológica de gran utilidad

para la conservación de primates del Nuevo Mundo.

Palabras clave: Diagnóstico, parásito, genética, conservación de especies, ADN,

primates

Abstract

The goal of this study was to develop a diagnosis test to allow the identification of

Prosthenorchis sp., through the polymerase chain reaction (PCR). 37 parasites were

received, morphologically identified as Prosthenorchis elegans, collected from necropsies

and surgeries from Saguinus leucopus and Cebus albifrons, for the isolation and

X Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.

basada en PCR

characterization of the cytochrome oxidase subunit I (COI) specific for P. elegans,

through the DNA extraction, amplification and sequencing, we found six haplotypes

divided into two different haplogroups. Two specific primers were designed for the

amplification through a semi nested PCR of a 178 bp fragment of P. elegans, being highly

sensitive to detect P. elegans from white footed tamarin (S. leucopus) feces previously

negatives at coprology. We recommend to continue the standardization of the diagnostic

test, being since now a diagnosis and ecology skill of great utility for the conservation of

New World Primates.

Keywords: Diagnosis, parasite, genetics, conservation of species, DNA, primate

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XIII

Lista de tablas .............................................................................................................. XV

Lista de Abreviaturas .................................................................................................. XVI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Prosthenorchis sp. en primates: Breve revisión y perspectivas diagnósticas moleculares ..................................................................................................................... 5

Resumen ...................................................................................................................... 6 Summary ..................................................................................................................... 7 1.1 Introducción ...................................................................................................... 8 1.2 Características de Prosthenorchis ......................................................................... 9

1.2.1 Taxonomía y Morfología .......................................................................... 9 1.2.2 Aspectos epidemiológicos......................................................................... 9 1.2.3 Ciclo de vida ......................................................................................... 10 1.2.4 Transmisión y hospederos intermediarios ................................................. 11 1.2.5 Hospederos definitivos ........................................................................... 12 1.2.6 Cuadro clínico ....................................................................................... 13 1.2.7 Patogenia .............................................................................................. 13 1.2.8 Tratamiento .......................................................................................... 14

1.3 Diagnóstico de Prosthenorchis sp. ...................................................................... 15 1.4 Implicaciones para la conservación ..................................................................... 16 1.5 Pruebas de ADN para el diagnóstico de los parásitos ............................................ 17 1.6 Trabajos en Acantocéfalos ................................................................................. 20 1.7 Perspectivas de la aplicación de metodologías de ADN en el diagnóstico ................ 21 Referencias ................................................................................................................ 25

2. Mitochondrial DNA diversity in the acanthocephalan Prosthenorchis elegans in Colombia based on cytochrome C oxidase sequence ............................................... 40

Abstract ..................................................................................................................... 42 2.1. Introduction ......................................................................................................... 43 2.2 Materials and methods .......................................................................................... 45

2.2.1 Sample collection ........................................................................................ 45 2.2.2 Amplification and sequencing of DNA ........................................................... 46 2.2.3 Data Analyses ............................................................................................. 47

XII

2.3. Results ................................................................................................................ 48 2.3.1 Morphological identification ......................................................................... 48 2.3.2 Sequence variation and genetic diversity ......................................................... 48

2.4. Discussion ........................................................................................................... 50 References ................................................................................................................. 55

3. Una alternativa diagnóstica para Prosthenorchis elegans basada en el gen mitocondrial COI por medio de una PCR semi-anidada ............................................. 69

Resumen .................................................................................................................... 70 Abstract ..................................................................................................................... 71 3.1 Introducción ......................................................................................................... 72 3.2 Metodología ......................................................................................................... 75

3.2.1 Diseño de los primers ................................................................................... 75 3.2 .2 Extracción de ADN a partir de parásitos ........................................................ 76 3.2.3. Materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris) utilizada para la prueba ................ 77 3.2.4. Extracción de ADN de materia fecal .............................................................. 78 3.2.5. PCR y condiciones de la amplificación .......................................................... 79 3.2.6. Evaluación de los primers en los parásitos ..................................................... 80 3.2.7 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus ................................ 80

3.3 Resultados ............................................................................................................ 81 3.3.1 Obtención de heces de Saguinus leucopus ....................................................... 81 3.3.2 Extracción de ADN de materia fecal .............................................................. 82 3.3.3 Evaluación de los primers en los parásitos ...................................................... 82 3.3.4 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus ................................ 83

3.4 Discusión ............................................................................................................. 85 3.5 Conclusiones ........................................................................................................ 88 Referencias ................................................................................................................ 90

4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 105 4.1 Conclusiones .................................................................................................... 105 4.2 Recomendaciones ............................................................................................ 107

A. Anexo: Guía para autores capítulo 1 y 3 ......................................................... 109 1.7.1 Lista preliminar para la preparación de envíos .................................. 115 1.7.2 Aviso de derechos de autor ............................................................... 116 1.7.3 Declaración de privacidad ................................................................. 116

B. Anexo. Guía para autores Capítulo 2............................................................... 118

Lista de figuras

Pág. .

Figuras capítulo 1...............................................................................................

Figura 1.1. Prosthenorchis spp. en el intestino de un Saguinus leucopus. Foto

tomada de la necropsia de un especimen de U.R.R.A.S.............................

Figura 1. 2. Remoción quirúrgica de Prosthenorchis spp. en un Saguinus

leucopus de U.R.R.A.S........................................................................................

Figura 1. 3. Nódulos característicos de Prosthenorchis elegans, detectados

por palpación abdominal. Foto tomada de un S. leucopus de U.R.R.A.S previo

a la cirugía............................................................................................................


Figure 2.1. The photo is showing the characteristic morphology of P.

elegans................................................................................................................

Figure 2.2. SEM of Prosthenorchis elegans. A. Whole detail of the parasite. B.

Proboscide of P. elegans......................................................................................

Figure 2.3 Haplotype network of Prosthenorchis elegans. Network shows the

relationships of haplotypes A-F from a 633 bp of the COI mitochondrial gene,

described in the current study from Saguinus leucopus and Cebus albifrons.

Network is based on statistical parsimony. Small, unlabeled circles indicate

hypothetical haplotypes separated by a single nucleotide change from adjacent

sequences. Labelled ovals represent distinct haplotypes.........

Figure 2.4. NJ tree obtained for Prosthenorchis elegans isolates obtained from

Colombia based on partial cytochrome oxidase I (COI) sequence using MEGA

2 software. Bootstrap support values are provided..............................................

Figure 2.5. Distribution of haplotypes and haplogroups by locality and

individuals............................................................................................................

37

37

38

39

63

63

64

65

66

67

XIV Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.

basada en PCR

Figure 2.6 Graphic abstract..................................................................................


Figura 3.1. Diseño de primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H1 y

ProsCOI_H2.1......................................................................................................

Figura 3.2. Muestras de heces de S. leucopus utilizadas para el estudio,

distribuidas por localidad y departamento, de acuerdo a su

procedencia..........................................................................................................

Figura 3.3. Extracción de ADN de materia fecal de S. leucopus en las

muestras C2 y C3, mediante el método de sílice/guanidina

tiocianato..............................................................................................................

Figura 3.4. PCR semi-anidada probando el producto puro y diluciones 1:100 y

1:1000 del producto amplificado para el fragmento grande. Se observa doble

banda o manchas para las muestras puras y para algunas de las diluciones

1:100. Concentración del primer 0,1

µM.........................................................................................................................

Figura 3.5 Amplificación semi-anidada de materia fecal con el conjunto de

primers nuevos, diluciones 1:1000 del producto de amplificación del fragmento

de 234 pb y 0,1 µM de

primer...................................................................................................................

68

100

100

101

102

103

104

B

XV

Lista de tablas

Pág.

Tablas Capítulo 2...............................................................................................

Table 2.1. Description of Prosthenorchis elegans sequences analyzed in the

current survey......................................................................................................

Table 2.2. Haplogroups and haplotypes found in P. elegans...............................

Table 2.3. Prosthenorchis elegans haplotypes based in COI mitochondrial

gene.....................................................................................................................

Tablas Capítulo 3...............................................................................................

Tabla 3.1. P. elegans utilizados para el desarrollo de la prueba........................

Tabla 3.2. Muestras de materia fecal de Saguinus leucopus utilizadas para el

desarrollo de la prueba........................................................................................

Tabla 3.3. Tipo de muestra y diagnóstico para Prosthenorchis sp. previo a las

pruebas moleculares..........................................................................................

Tabla 3.4 Resultados de las pruebas efectuados en los parásitos con los

primers diseñados...............................................................................................

Tabla 3.5. Resultados de las pruebas semi-anidadas en las muestras de

materia fecal........................................................................................................

60

60

61

62

95

95

96

97

98

99

XVI Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.

basada en PCR

Lista de Abreviaturas

AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá

CAFS: Centro de Atención de Fauna Silvestre-Zoológico de Cali

CRFSOC: Centro de Rescate de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas

COI: Citocromo Oxidasa Subunidad I

H1: Primer ProsCOI_H1

L1: Primer ProsCOI_L1

H2: Primer ProsCOI_H2

H2.1: Primer ProsCOI_H2.1

Numts: Pseudogenes mitocondriales nucleares

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

SDA: Secretaría Distrital de Ambiente

U.R.R.A.S: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres

WCS: Wildlife Conservation Society

Introducción

Este trabajo surge con el ánimo de responder a varios interrogantes médicos y

ecológicos, dada la importancia clínica del Prosthenorchis sp. en los centros de

rescate y zoológicos de Colombia. La principal preocupación es la dificultad para

el diagnóstico y la alta mortalidad presentada en monos titi gris (Saguinus

leucopus), especie endémica de Colombia, altamente amenazada de extinción y

situada en las listas de mayor tráfico de fauna en Colombia. El diagnóstico in vivo

del género Prosthenorchis se realiza a través de coprológicos y la especie de

Prosthenorchis se atribuye intuitivamente de acuerdo a la especie hospedera; en

ocasiones signos como nódulos a la palpación abdominal son sugestivos del

parásito. Sin embargo, el coprológico, no ha mostrado ser eficiente y animales

con resultados negativos, mueren con altas cargas parasitarias de Prosthenorchis

sp. Por otra parte, la palpación abdominal requiere previa captura del animal y

de un médico veterinario experimentado en su detección, útil cuando los nódulos

intestinales son evidentes. La falta de un diagnóstico eficiente, se refleja en

tratamientos médicos y control del hospedero intermediario de forma retardada,

que junto con el estrés del cautiverio resulta en altas mortalidades.

Explorando las posibilidades diagnósticas y con el auge del diagnóstico molecular

y su alta especificidad y sensibilidad comparada con otras técnicas diagnósticas,

se encontró que para Prosthenorchis sp. no existían secuencias reportadas para

desarrollar una prueba diagnóstica basada en ADN, por lo que encontrar la

secuencia debería ser el primer paso. Por otra parte, fue relativamente difícil

2 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.

basada en PCR

poder asegurar que la especie de Prosthenorchis que íbamos a ahondar era P.

elegans, ya que la mayor parte de la literatura reciente se remite al número y

arreglo de los ganchos en la probóscide para diferenciar entre las dos especies

reportadas para primates: P. elegans y P. spirula, tarea que debe ser realizada

por expertos, utilizando técnicas especiales y una adecuada preservación de los

ganchos; solamente artículos antiguos dieron claves claras para la identificación.

El objetivo principal de este trabajo es desarrollar una prueba diagnóstica que

permita la identificación de Prosthenorchis elegans mediante la técnica de

reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los objetivos específicos son

enunciados a continuación, en donde los objetivos 1 al 4 serán abarcados en el

capítulo dos y los objetivos 5 y 6 serán abarcados en el capítulo tres: 1) Identificar

morfológicamente los parásitos recolectados corroborando que corresponden a

especies de Prosthenorchis, 2) estandarizar un protocolo para la extracción de

ADN de individuos de Prosthenorchis elegans, 3) aislar y caracterizar la

secuencia de ADN específica de Prosthenorchis elegans, 4) identificar

polimorfismos/marcadores que permitan la discriminación del género

Prosthenorchis elegans, 5) diseñar primers que permitan la amplificación

específica de la secuencia de Prosthenorchis elegans y 6) estandarizar un

protocolo para la amplificación del ADN de Prosthenorchis elegans, por medio de

la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de heces que contengan

huevos.

Por primera vez se reporta la secuencia específica para Prosthenorchis elegans y

se avanza en el desarrollo de una prueba diagnóstica molecular específica para

detectar el parásito. Igualmente, la caracterización de la diversidad genética del

parásito ofrece un sin número de hipótesis acordes con el proceso de tráfico de

fauna que se presenta con las especies de primates más afectadas, ya que el

diagnóstico se da, en la mayoría de los casos, una vez los animales han sido

3

capturados y han pasado por diferentes ambientes en donde pudieron haber

adquirido el parásito. Con este trabajo, se demuestra la utilidad del gen

mitocondrial citocromo oxidasa subunidad I (COI) para evaluar la diversidad

genética del parásito y diseñar primers específicos. Los logros para la medicina

veterinaria y la ecología son innumerables, ya que la disponibilidad de poder

realizar la identificación específica por PCR abre un campo valioso de

investigación.

Este trabajo contó con 63 parásitos de Prosthenorchis elegans, obtenidos de

centros de rescate y vida libre, a los cuales se les extrajo el ADN y se amplificó un

fragmento parcial de COI por medio de primers universales para obtener la

secuencia de COI específica del parásito. Treinta y siete de las secuencias

obtenidas permitieron estimar la diversidad genética de las muestras que pasaron

exitosamente el proceso de amplificación y secuenciación. Una vez obtenida la

secuencia, se diseñaron primers específicos para detectar el parásito, los cuales

fueron probados en los parásitos y en materia fecal sospechosa y confirmada

positiva para la presencia del parásito. Luego se realizaron pruebas con materia

fecal que había presentado resultados negativos al coprológico.

El desarrollo exitoso de los objetivos, abre las puertas a varias investigaciones

genéticas, ecológicas y médicas, siendo crucial la información que se aporta

desde este trabajo. Con una colecta en varias localidades y a largo plazo de

parásitos de Prosthenorchis se podrá ampliar el conocimiento genético a nivel de

filogenia y taxonomía. Con primers específicos del parásito se podrá investigar a

fondo acerca del hospedero intermediario en vida libre y en cautiverio, así como

los diferentes hospederos definitivos y su patogenicidad. El desarrollo de la

prueba, permitirá realizar un diagnóstico oportuno del parásito e investigar acerca

de la eficacia del uso de antiparasitarios y procedimientos quirúrgicos, utilizados

para el tratamiento contra el parásito.


basada en PCR

Los avances de este trabajo van a beneficiar ampliamente la conservación de

especies de primates del Nuevo Mundo, como Saguinus leucopus y Saguinus

oedipus, especies endémicas y altamente amenazadas de Colombia. Los

resultados permiten mejorar los protocolos médicos, beneficiosos para el

mantenimiento en cautiverio y para los procesos de liberación o reintroducción de

estas especies a su medio natural.

5

1. Prosthenorchis sp. en primates: Breve

revisión y perspectivas diagnósticas

moleculares

Formato: Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria

y de Zootecnia


basada en PCR

Prosthenorchis elegans: Breve revisión y perspectivas diagnósticas moleculares

Prosthenorchis elegans: A brief review and perspectives in molecular diagnosis

A.C. Falla1*, C.I. Brieva

2, P. Bloor

3

Resumen

La presente revisión, explora los campos de conocimiento necesarios para poder aproximarse a la

realización de un diagnóstico molecular para Prosthenorchis elegans, un acantocéfalo que se ha

caracterizado por causar altas mortalidades en primates del Nuevo Mundo en cautiverio. Se revisa la

importancia de la PCR para el diagnóstico en parasitología, contemplando algunos ejemplos en

parásitos de relevancia para la salud pública. Se nombran algunos trabajos en acantocéfalos, los cuales

se han enfocado principalmente en revisar aspectos filogenéticos y específicamente para

Prosthenorchis, ni siquiera existe una secuencia reportada. Igualmente, se revisan algunas

consideraciones con la escogencia del gen para la amplificación, la cual debe basarse en los estudios

previos sobre acantocéfalos y los ejemplos reportados en la literatura. Se analiza el caso de P. elegans,

su conocimiento y principales vacíos y controversias, para analizar los retos diagnósticos que se deben

enfrentar como la extracción de ADN en materia fecal y los inhibidores que pueden afectar la PCR. El

1 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-

Colombia 2 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 cll 45. Bogotá-

Colombia 3 Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-Colombia

*Autor para correspondencia. [email protected]

Capítulo 1 7

desarrollo de una prueba diagnóstica para P. elegans abre los campos para varias investigaciones

filogenéticas, médicas, ecológicas y epidemiológicas, que traerán beneficio para las especies de

primates afectadas y para la formulación de protocolos de manejo médico con fines de conservación.

Palabras clave: Acantocéfalos, reacción en cadena de la polimerasa, diagnóstico

Summary

This review explores knowledge necessary to develop a PCR-based approach for the diagnosis of

Prosthenorchis elegans, an acanthocephala known to cause high mortalities in New World Primates in

captivity. A review is presented regarding the importance of PCR for diagnosis in parasitology,

including some examples of parasites affecting the public health. Work on acanthocephala has mainly

focused on phylogenetic aspects, however, for Prosthenorchis, no genetic data has been reported.

Similarly, some considerations with respect to gene choice for molecular diagnosis are reviewed, based

on previous studies on acanthocephala and literature reports. The case of P. elegans is presented; its

knowledge and key gaps and controversies, as well as diagnostic challenges faced to develop a

molecular diagnostic assay are presented. The development of P. elegans diagnosis test opens fields to

new phylogenetic, medical, ecological and epidemiological research, which will benefit species of

primates affected and for developing medical protocols for conservation.

Key Words: Acanthocephala, polymerase chain reaction, diagnosis


basada en PCR

1.1 Introducción

Los acantocéfalos (Acanthocephala) son gusanos de cabeza espinosa, llamados así porque poseen una

proboscis retráctil armada con ganchos, con los cuales se adhieren al intestino del hospedero vertebrado

(Baker 2008). Son parásitos especializados del tracto digestivo de peces, aves y mamíferos,

caracterizados por tener ciclos indirectos (Simón Vicente and Simón Martín 2000). En este grupo de

parásitos se encuentra clasificado el parásito Prosthenorchis elegans. Como los demás acantocéfalos,

es un endoparásito obligado que requiere de un hospedero intermediario para desarrollar parte de su

ciclo de vida, reportado en cautiverio como la cucaracha alemana (Blatella germanica) y sin datos en

vida silvestre (Shoeb 1989). La identificación del parásito, se hace principalmente por el hospedero

que parasita, la morfología del parásito y sus lesiones características en íleon y ciego. El diagnóstico

actual, se realiza a través de la presencia de huevos en coprológicos, sin embargo se presentan falsos

negativos y los animales mueren con altas cargas parasitarias. Esto es particularmente importante,

cuando los primates que se ven afectados están amenazados de extinción como el titi gris (Saguinus

leucopus) y el titi cabeciblanco (Saguinus oedipus), especies endémicas de Colombia, los cuales

ingresan a los centros de rescate en grandes cantidades y necesitan encontrar estrategias de

conservación. Además del diagnóstico, existen varios interrogantes alrededor del parásito, como su

hospedero intermediario en vida libre, el origen de transmisión (vida libre o cautiverio), efectividad de

los tratamientos y del control, diferenciación de especies, así como su conocimiento desde el punto de

vista genético. En este artículo, ofrecemos una breve revisión de los aspectos epidemiológicos, clínicos

y diagnósticos de la especie y las perspectivas diagnósticas moleculares.

Capítulo 1 9

1.2 Características de Prosthenorchis

1.2.1 Taxonomía y Morfología

En primates se han descrito dos especies de Prosthenorchis: P. elegans y P. spirula (Dunn 1963), sin

embargo, la mayoría de reportes se centran en P. elegans. P. spirula ha sido menos reportado y se le

han asignado otros nombres como P. luehei (Thatcher and Nickol 1972) y Oncicola spirula (Tantaleán

and Chávez 2011, Tantaleán et ál. 2005). P. elegans se diferencia morfológicamente porque posee un

collar entre la probóscide y el tórax que no posee P. spirula (Machado Filho 1950). Prosthenorchis

elegans presenta dimorfismo sexual, siendo los machos más pequeños que las hembras. En

acantocéfalos se ha descrito la utilidad de la morfometría de los ganchos para diferenciar especies

(Wayland 2010), por medio de técnicas de aclaramiento para poder contar y diferenciar los ganchos.

Sin embargo, las diferencias morfológicas de los ganchos para las dos especies de Prosthenorchis son

muy sutiles (Müller 2007) y deben ser inspeccionadas por expertos. Existen ambigüedades en los

reportes literarios con respecto a la longitud de los machos y las hembras (Baker 2008), en Colombia se

reportaron medidas de 3 a 6 cm de largo para los parásitos adultos (Perez et ál. 2008), mientras que

Baker (2008) reporta que los machos miden de 20-40 mm y las hembras de 30-50 mm.

1.2.2 Aspectos epidemiológicos

Prosthenorchis elegans es el parásito de mayor importancia médica en primates del Nuevo Mundo,

especialmente en calitrichidos (Potkay 1992). P. elegans está distribuido naturalmente en Centro y Sur

América (Alfaro et ál. 2012), encontrándolo frecuentemente en especies de Saguinus, Saimiri, Ateles,

Cebus, Callicebus y Cebuella como infecciones adquiridas de su hábitat original (Kindlovits and

Kindlovits 2009). En cautiverio se ha reportado fuera de su área de distribución en zoológicos y

laboratorios (Schoeb 1989).


basada en PCR

El grado de infección y mortalidad por P. elegans suelen ser altos (Takos and Thomas 1958). En el

Parque Zoológico de Lincoln (Chicago), estaba presente en el 90% de los callitrichidos (Wolff et ál.

1990) y en el Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área Metropolitana del Valle de

Aburrá (CAV) (Antioquia-Colombia), en donde se atienden las especies de tráfico ilegal, se encontró

una infección del 26% de los primates con este parásito (Perez et ál. 2008). En el Centro de Rescate de

Fauna Silvestre del Oriente de Caldas (CRFSOC) el 17.85% (10 casos) de tití gris (S. leucopus)

presentaban P. elegans y de estos la mitad murió (Jimenez 2009). Teniendo en cuenta que no siempre

se detectan los huevos en los coprológicos, estas prevalencias podrían ser mayores.

Müller (2007) encontró mayor infección en hembras, relacionándolo posiblemente con el mayor

consumo del hospedero intermediario. Nielsen (1980) reportó mayor presentación de Prosthenorchis

elegans en adultos, mientras que Trejo-Macías y Estrada (2012), reportaron mayor presentación en

juveniles.

1.2.3 Ciclo de vida

El ciclo de vida para Prosthenorchis elegans no ha sido descrito, sin embargo, se sabe que requiere de

un hospedero intermediario como la cucaracha (Blatella germanica). En general, para los

acantocéfalos, los huevos son liberados por el acantocéfalo hembra conteniendo una larva acantor, y

salen del hospedero definitivo por las heces al medio ambiente. El hospedero intermediario ingiere los

huevos embrionados, el huevo eclosiona y se libera el acantor. El acantor liberado del huevo penetra la

pared del intestino y se ubica en el hemocele del artrópodo en donde se transforma en acantela. Luego

de un periodo de uno a tres meses se desarrolla el cistacanto que es la forma infectiva para el hospedero

Capítulo 1 11

vertebrado o definitivo (Baker 2008, Nielsen 1980). Frecuentemente, el cistacanto puede reenquistarse

en su hospedero definitivo en lugar de madurar, como ocurre con el P. elegans, donde se encuentran

parásitos adultos en el lumen intestinal del mono y cistacantos enquistados en la membrana peritoneal

(Bowman and Georgi 2009). Una vez el artrópodo es ingerido por el hospedero definitivo, se adhiere a

la pared intestinal y madura, periodo que dura de 5 a 12 semanas, completando de esta forma el ciclo

(Wolff et ál. 1990).

1.2.4 Transmisión y hospederos intermediarios

La transmisión se realiza a través de la ingestión de artrópodos infectados con cistacantos.

Aparentemente no se ha comprobado el hospedero intermediario de Prosthenorchis sp. en vida

silvestre, pero experimentalmente las cucarachas y ciertos escarabajos pueden transmitirlo. Se conoce

que la cucaracha Blatella germanica es el hospedero intermediario en cautiverio y experimentalmente

se ha podido comprobar en las cucarachas Blabera fusca y Rhyparobia maderae. La Periplaneta

americana y P. orientalis fueron refractarias a Prosthenorchis. También experimentalmente los

escarabajos Lasioderma serricone y Stegobioum paniceum sirvieron como hospederos intermediarios al

final de tres meses, mientras que el Tenebrio molitor, Tribolium confusum y Orizaephilus surinamensis

fueron refractarios (Stunkard 1965). En el dosel del bosque lluvioso tropical es común encontrar

cucarachas (Basset 2001). Sin embargo, sería importante evaluar el comportamiento alimentario de los

primates afectados en vida libre, ya que en algunas especies de calitrichidos (Saguinus fuscicollis y

Saguinus mystax) se ha visto que no es común el consumo de cucarachas y es más frecuente el

consumo de escarabajos (Wenz et ál. 2010).


basada en PCR

1.2.5 Hospederos definitivos

Es importante conocer la especificidad que tiene Prosthenorchis por el hospedero. En Colombia, se ha

encontrado que el Saguinus leucopus es uno de los primates más afectados (Jimenez 2009),

coincidiendo con los índices de tráfico de la especie. Los primates del Nuevo Mundo en los que se ha

reportado la presencia de Prosthenorchis elegans son: Alouatta villosa, Aotus nancymae, Aotus

trivirgatus, Ateles paniscus, Callicebus cupreus, Callicebus moloch, Callithrix humeralifer

chrysoleuca, Callithrix jhacchus geofroyi, Callithrix jhacchus jacchus, Cebus albifrons, Cebus apella,

Lagothrix lagotricha, Leontopitecus rosalia rosalia, Leontopithecus chrysomelas, Saguinus fuscicollis,

Saguinus imperator, Saguinus labiatus, Saguinus leucopus, Saguinus midas midas, Saguinus midas

niger, Saguinus mystax, Saguinus nigricollis, Saguinus oedipus geofroyii, Saguinus oedipus oedipus,

Saimiri boliviensis, Saimiri oerstedii y Saimiri sciureus. En monos del Viejo Mundo se ha reportado el

parásito en las siguientes especies: Pan sp., Pongo sp.; Gorilla sp.; Hylobates sp.; Macacca sp;

Periodictius sp.; Galago sp., Nycticebus coucang (Chinchilla et ál. 2010, Monteiro et ál. 2007, Nielsen

1980, Tantaleán et ál. 2005, Wolff et ál. 1990).

Como hospederos del P. spirula se han reportado primates del Nuevo Mundo: Callithrix jacchus

jacchus, Cebuella pygmaea, Cebus apella, Leontopitecus rosalia rosalia, Saguinus oedipus oedipus,

Saimiri sciureus y primates del Viejo Mundo y prosimios como Eulemur coronatus, E. mongoz, E.

fulvus, E. albifrons, E. macaco, E. mongoz, Lemur catta y Cheirogaleus major (Irwin and Raharison

2009, Tantaleán et ál. 2005).

Capítulo 1 13

1.2.6 Cuadro clínico

Para la infección con Prosthenorchis se ha descrito el síndrome agudo y el síndrome crónico. El curso

crónico se caracteriza por diarrea acuosa de varios meses de duración, acompañada de debilidad y

emaciación progresiva. El curso agudo dura menos de un día y es causado por una peritonitis

bacteriana aguda como consecuencia de la perforación de la pared intestinal (Bowman and Georgi

2009). Los signos de parasitismo por Prosthenorchis elegans son inespecíficos, siendo los más

reportados, en su orden: pérdida de peso, anorexia, debilidad, diarrea, pelaje hirsuto y depresión (Brack

2002, Cubas 1996, Jimenez 2009, Ludlage and Mansfield 2003, Pissinatti et ál. 2007, Potkay 1992,

Toft 1982). Otros signos reportados son inapetencia, dolores abdominales, deshidratación, anemia y

distensión abdominal, aunque también se reporta la ausencia de signos clínicos y complicaciones como

intususcepción y prolapso rectal (Baskin 2013, Joslin 2003, Wallach and Boever 1983). La mayoría

de autores coinciden en que la muerte se puede presentar en caso de infecciones severas o peritonitis

(Brack 2002, Cubas 1996, Jimenez 2009, Mansfield and Weston-Murphy 2009, Müller 2007, Toft

1982, Wallach and Boever 1983).

1.2.7 Patogenia

Prosthenorchis elegans entierra su probóscide entre la mucosa del íleon, ciego y colon, creando túneles

en la pared intestinal y nódulos de color amarillo de 2 a 6 mm de diámetro en la superficie serosa del

intestino (Cubas 1996, Perez et ál. 2007, Weber and Junge 2000) (Figura 1.1). Algunas referencias

describen que P. spirula se encuentra en el íleon distal y P. elegans en el ciego y colon proximal.

Nielsen (1980), especifica que P. elegans tiene una localización primaria en el área íleo-cecal, pero en

infecciones severas puede encontrarse en todo el intestino, como también se reporta en un Saimiri

sciureus (Michaud et ál. 2003). Las lesiones pueden ser desde úlceras en los sitios de adherencia en el


basada en PCR

intestino hasta perforación del mismo, con la consecuente septicemia, peritonitis y muerte (Kindlovits

and Kindlovits 2009, Weber and Junge 2000). Aunque P. spirula también penetra la pared intestinal,

no se ha asociado con peritonitis (Wallach and Boever 1983). Las infecciones severas pueden causar

bloqueo mecánico (Baskin 2013, Nielsen 1980), obstrucciones, intususcepciones, o prolapso rectal

(Toft 1982). Frecuentemente los parásitos no contribuyen directamente a la muerte del animal, pero

producen lesiones que permiten que patógenos secundarios se establezcan, resultando en el

debilitamiento y posterior muerte del primate (Takos and Thomas 1958, Toft 1982, Weber and Junge

2000). Se ha planteado un periodo de incubación de 1 a 3 meses en el hospedero definitivo (Brack

2002).

1.2.8 Tratamiento

En la actualidad los clínicos prefieren la remoción quirúrgica de los parásitos ya que la tasa de

infección y la mortalidad son altas (Figura 1.2), y los tratamientos con antihelmínticos no han dado

resultado (Perez et ál. 2008, Wolff et ál. 1990). Algunas veces es necesario la realización de varias

cirugías en el mismo animal. Igualmente, se plantea que cuando los primates siguen eliminando

huevos en las heces, puede deberse a que al momento de la cirugía el parásito se encontraba en la fase

de desarrollo de cistacanto (Wolff et ál. 1990). La cirugía puede ser complementada con tratamientos

antiparasitarios. Incluso se ha planteado, de manera extrema, la eutanasia de la colección de primates

para acabar con el parásito (Nielsen 1980). Los objetivos deben ir encaminados a romper el ciclo de

vida más que a la aplicación de un tratamiento determinado (Nielsen 1980).

Capítulo 1 15

Se sugiere que las semillas, usualmente grandes, que ingieren los calitrichidos en vida silvestre, pueden

tener un rol curativo ya que pueden arrastrar los parásitos que están cambiando de sitio de adherencia

de la mucosa, pueden dañar la adherencia inicial, o pueden causar daño al parásito, haciendo que este

muera (Garber and Kitron 1997).

1.3 Diagnóstico de Prosthenorchis sp.

Ante mortem la palpación abdominal puede detectar los nódulos característicos de la infección por

Prosthenorchis (Perez et ál. 2008), cuando estos se presentan (Figura 1.3). La comprobación se da por

medio del coprológico con técnicas de sedimentación (Wolff et ál. 1990). También pueden encontrarse

esporádicamente los gusanos en las heces (Toft 1982). La mayoría de estudios utilizan la técnica de

frotis directo, y la técnica de sedimentación, ya sea con formalina/éter (Jimenez 2009), centrifugación

con acetato etílico/formalina (Stoner 1996, Stoner and González Di Pierro 2006) o la técnica

concentrada de Ritchie (Carrasco et ál. 2008) para estimar la intensidad de la infección del parásito.

Esta técnica se emplea debido a que los huevos no flotan y las técnicas convencionales de flotación no

funcionan (Toft 1982). También se reporta el uso de la técnica de centrifugación sin solventes

orgánicos, que utiliza una filtración fuerte para asegurar la concentración de huevos y larvas (Phillips et

ál. 2004). Sin embargo, el examen de las heces da resultados variables, debido a que los animales no

eliminan huevos todos los días y pueden necesitarse varias muestras para confirmar la presencia del

parásito (Cubas 1996, Nielsen 1980, Potkay 1992, Wolff et ál. 1990). Los huevos de acantocéfalos

pueden confundirse fácilmente con los huevos de Trichuris sp. (Nielsen 1980). En el estudio de

Jiménez (2009), solo cinco tití gris (S. leucopus), de los siete que murieron, habían sido positivos por

la técnica de sedimentación mencionada.


basada en PCR

Los hallazgos típicos de necropsia, de los gusanos de cabeza espinosa, color blanco pálido o bronceado,

adheridos a la mucosa intestinal del íleon, ciego o colon, son considerados diagnósticos (Mansfield and

Weston-Murphy 2009, Toft 1982). Algunas veces se encuentran parásitos adultos en la cavidad

abdominal (Kindlovits and Kindlovits 2009). El número de gusanos por infección puede variar desde 8

a más de 30 (Potkay 1992); se han reportado incluso hasta 110 parásitos por animal (Takos and

Thomas 1958).

1.4 Implicaciones para la conservación

Recientes hallazgos sugieren que las enfermedades parasitarias son capaces de reducir el tamaño y

alterar la estructura de las poblaciones de monos amenazados de extinción como el tamarino león

dorado (Leontopithecus rosalia) (Monteiro et ál. 2007). También se ha visto que factores

demográficos (densidad), factores ambientales (estacionalidad o humedad), interacciones sociales,

clase edad-sexo, condición reproductiva, hábitat, fragmentación y dieta, influyen en las infecciones

parasitarias en primates no humanos (Vitazkova and Wade 2007). La estructura social de los primates,

en grupos cerrados, favorece la transmisión de parásitos (Stoner and González Di Pierro 2006).

Estudios sobre la reintroducción de Callithrix jacchus y Callithrix penicillata a la zona del amenazado

tamarino león dorado (Leontopithecus rosalia) en Brasil, reveló la presencia de huevos de acantocéfalo

con una prevalencia de 32% encontrándolo en todas las edades y en ambos sexos, incluso en hembras

preñadas (Dos Santos et ál. 2010).

Capítulo 1 17

Hay reportes en los que se afirma que los Prosthenorchis elegans que se han encontrado en vida

silvestre, podrían provenir de la liberación de animales procedentes del tráfico ilegal (Pissinatti et ál.

2007). Por otra parte, existe la teoría que Prosthenorchis ha sido introducido entre las colecciones

establecidas, por el ingreso de animales silvestres parasitados capturados (Weber and Junge 2000). La

transmisión de Prosthenorchis elegans en cautiverio se ve favorecida por la diversidad de especies de

primates mantenidos conjuntamente, asociado a un manejo deficiente que permite la proliferación del

hospedero intermediario (Pissinatti et ál. 2007). El tráfico de fauna que existe en algunos países como

Colombia, ha permitido encontrar bastantes reportes de Prosthenorchis sp. en los primates recién

ingresados a los centros de rescate o que ya han llevado un tiempo considerable en cautiverio. Aunque

Prosthenorchis sp. está distribuido en vida silvestre y en cautiverio, es importante encaminar estudios

de diversidad genética del parásito, distribución geográfica, cargas parasitarias y hospederos

intermediarios, ya que en Colombia es común la liberación de primates procedentes del tráfico ilegal de

especies, luego de pasar por procesos de rehabilitación en centros de rescate donde se encuentra el

hospedero intermediario y diferentes especies de primates.

1.5 Pruebas de ADN para el diagnóstico de los parásitos

Las limitaciones de los métodos basados en microscopía y serología, han guiado a los parasitólogos a

explorar las técnicas moleculares (Ndao 2009). Las pruebas basadas en ácidos nucleicos son una

alternativa sensible, rápida y no invasiva para detectar parásitos (Rodríguez 2007). Teniendo en cuenta

lo anterior, la PCR es una herramienta de gran poder para el diagnóstico de parásitos. Los tipos de

PCR más utilizados para diagnóstico son la PCR anidada, la PCR multiplex y la PCR en tiempo real

(TR-PCR) (Ndao 2009).


basada en PCR

La PCR ha sido una herramienta muy útil en parasitología ya que existen dificultades en la

identificación morfológica de los parásitos (Xiao et ál. 2004), en la detección del parásito en fases

avanzadas de la enfermedad (Pavia et ál. 2003), en la diferenciación de cadenas estrechamente

relacionadas o subespecies de parásitos, como en el caso de huevos de Taenia solium y Taenia

saginata; o en la identificación de la etiología para un síntoma específico, como el caso de una lesión

cutánea causada por Leishmania en donde hay más de 15 especies que afectan a los humanos (Barker

1989). Desde el punto de vista epidemiológico la PCR ha sido una herramienta muy poderosa, pues ha

permitido encontrar agentes en materia fecal, tejido, agua y alimento, entre otros, siendo de gran

utilidad para el control de las enfermedades (Gasser R. B. and Zarlenga 2004). Otros usos de técnicas

basadas en PCR han sido el desarrollo de vacunas y estudios de la resistencia a medicamentos (Gasser

Robin B. 1999, Prichard 1997).

Existen parásitos, como el Cryptosporidium spp., que no han podido discriminarse por especie con las

técnicas morfológicas convencionales, el análisis genético ha permitido demostrar gran cantidad de

especies dentro del género, algunas de ellas con importancia para la salud pública (Xiao et ál. 2004),

además de estudios de diversidad genética (Connelly et ál. 2013). Otras enfermedades zoonóticas

como la Leishmaniasis también han encontrado utilidad en el uso de herramientas moleculares, en

donde la sensibilidad y especificidad de la PCR están directamente relacionadas con los primers usados

para la amplificación, el número de copias del blanco de ADN que se va a amplificar, el método de

extracción de ADN utilizado, el tipo de material para analizar y el mismo protocolo de PCR (Cortes et

ál. 2004, Salam et ál. 2010).

Capítulo 1 19

Para el diagnóstico se aprovechan características de los parásitos, como en el caso de Trypanosoma

cruzi en los que el diagnóstico diferencial se hace previa identificación de un gen (unidad 1.2 kb del

H2A) que no existe en el T. rangeli (Pavia et ál. 2003). Igualmente, se han desarrollado pruebas en

tenias, para identificación de especies en roedores y carnívoros (Al-Sabi and Kapel 2011) y como

prueba diagnóstica de ADN en heces (Mathis and Deplazes 2006). Elmore et ál. (2013) identificó dos

linajes distintos de Sarcocystis sp. en zorros árticos, a través de técnicas moleculares y análisis

filogenéticos. Nichols et ál. (2003), detectó bajas densidades de ooquistes de Cryptosporidium spp. en

agua mineral natural y aguas de bebida a través de técnicas moleculares.

La utilidad de las herramientas moleculares de ADN ha sido descrita para el diagnóstico específico de

parásitos de primates como Oesophagostomum bifurcum, entendiendo la epidemiología del parásito y

guiando al descubrimiento de múltiples variantes distintas genéticamente de O. bifurcum (Gasser R. B.

et ál. 2009). Otros parásitos que están siendo estudiados por técnicas moleculares de ADN son

Entamoeba histolytica, mostrando una sensibilidad de 96% y una especificidad de 98% en la prueba de

PCR comparada con otras pruebas diagnósticas; Giardia lamblia, usada para detectar la variación

genética y diferenciar entre genotipos de G. lamblia y distinguir entre quistes vivos y muertos; Fasciola

hepática, utilizada para detectar ADN en el caracol infectado; y Opisthorchis viverrini, utilizada como

diagnóstico de huevos en heces de humanos infectados, entre otros (Weiss 1995).


basada en PCR

1.6 Trabajos en Acantocéfalos

Investigaciones filogenéticas moleculares unieron a los Rotífera con los Acantocéfalos en el phylum

Syndermata (Rotífera) (Garey et ál. 1996, Miquelis et ál. 2000), sin embargo para efectos de esta

revisión nos referimos al Phylum Acantocephala. Dentro de los acantocéfalos se ha descrito el genoma

mitocondrial completo para los siguientes parásitos Leptorhynchoides thecatus (Steinauer et ál. 2005),

Oncicola luehei (Gazi et ál. 2012), Pallisentis celatus(Pan and Nie 2013), Echinorhynchus truttae,

Paratenuisentis ambiguus y Macracanthorhynchus hirudinaceus (Weber et ál. 2013), considerando que

los genes contenidos en el genoma mitocondrial son relativamente conservados para la mayoría de

metazoarios.

Los estudios en acantocéfalos se han enfocado en investigaciones filogenéticas a través de los datos de

secuencia del gen ARN ribosomal (rRNA) 18S (García-Varela et ál. 2000, Garey et ál. 1996, Miquelis

et ál. 2000, Near T. J. 2002, Near Thomas J. et ál. 1998), ADN ribosomal nuclear de la subunidad

pequeña SSU y la subunidad grande LSU (García-Varela and Nadler 2005, García-Varela et ál. 2011);

los genes nucleares ITSs y LSU (Martinez-Aquino et ál. 2009) 5.8S y espaciador de transcripción

interna han sido usados para dilucidar controversias del género Corynosoma que afecta a mamíferos y

aves marinos (García-Varela et ál. 2005) y para diferenciar especies de acantocéfalos que afectan peces

en Taiwan (Shih et ál. 2010). Otros estudios han involucrado al gen citocromo c oxidasa subunidad 1

(cox 1), para resolver controversias taxonómicas y evaluar relaciones entre géneros de diferentes

acantocéfalos (García-Varela et ál. 2011, García-Varela and Nadler 2006, García-Varela and Pérez-

Ponce de León 2008, García-Varela et ál. 2009, Gazi et ál. 2012, O'Mahony et ál. 2004, Perrot-Minnot

2004), así como para estudios de biogeografía y detección de especies crípticas en acantocéfalos

marinos (Goulding and Sarah Cohen 2014, Steinauer et ál. 2007). Alcantar-Escalera et ál. (2013),

Capítulo 1 21

utilizan solo la citocromo c oxidasa subunidad I para conocer si los estadios larvales de Polymorphus

brevis, un acantocéfalo que afecta a aves que se alimentan de peces, son genéticamente similares y

están vinculados con los adultos. Se ha reportado que las muestras obtenidas en campo para

acantocéfalos de peces, pueden estar incompletas o presentar problemas con la forma de preservación,

lo cual puede reducir la claridad de las estructuras internas. Por esta razón se ha optado por las técnicas

moleculares para su diferenciación (Shih et ál. 2010).

Desde el punto de vista diagnóstico, los acantocéfalos no han sido suficientemente explorados

molecularmente (Hunt and Lello 2012, Perrot-Minnot 2004). Particularmente para Prosthenorchis, no

existe reporte de su secuencia ni de investigaciones moleculares sobre el género, constituyendo un gran

campo por investigar.

1.7 Perspectivas de la aplicación de metodologías de ADN en el diagnóstico

De acuerdo a la revisión anterior, está claro que el diagnóstico por ADN podría ser una alternativa

viable a los métodos existentes para la identificación de Prosthenorchis sp. Sin embargo, existen

varios desafíos para el desarrollo de una prueba molecular para Prosthenorchis. En la actualidad no

existe secuencia publicada o diversidad genética caracterizada para Prosthenorchis: dos obstáculos

importantes para el desarrollo de una prueba de ADN.

Los niveles de divergencia que se encuentran en la citocromo c oxidasa subunidad I (COI) para otras

especies, sugieren que este gen podría ser un buen candidato para la descripción de las diferencias


basada en PCR

inter-específicas e intra-específicas (Derycke et ál. 2010). Teniendo en cuenta los estudios más

recientes en acantocéfalos (Alcantar-Escalera et ál. 2013, Goulding and Sarah Cohen 2014) y el

creciente movimiento por los códigos de barra de la vida (Paz et ál. 2011), el uso de (COI), constituye

una buena alternativa para avanzar en el conocimiento genético de Prosthenorchis elegans. Además, el

éxito de primers universales utilizado en otras especies sugiere que su uso también sería posible en

Prosthenorchis sp. (Folmer et ál. 1994). Estos primers sirven para generar secuencias que pueden

contener polimorfismos específicos para poder diseñar los primers específicos. Los primers no deben

ser complementarios, es decir que se puedan unir con el mismo primer o con los otros primers usados

en las reacciones de PCR. Aunque la especificidad del primer es dependiente de la longitud del

mismo, deben ser escogidos de tal forma que una secuencia única dentro del ADN pueda ser

amplificada (Abd-Elsalam 2003). De esta forma, se debe comparar con otras secuencias de especies

cercanas a Prosthenorchis sp. y probar que los polimorfismos identificados son específicos para el

parásito.

El uso de COI también tiene limitaciones que hay que tener en cuenta a la hora de analizar las

secuencias, ya que pueden aparecer secuencias no-idénticas similares al ADN mitocondrial que pueden

amplificar con los primers universales. Estas secuencias son llamadas pseudogenes mitocondriales

nucleares (Numts), definidas como copias de genes de ADN mitocondrial o de genoma mitocondrial

casi completo que han sido trasladadas al genoma nuclear (Kim et ál. 2006, Lopez et ál. 1994). Los

pseudogenes han sido descritos en acantocéfalos (Benesh et ál. 2006), por lo que se deben evitar e

identificar en estudios que involucren COI. Estos pueden identificarse por la presencia de indeles,

mutaciones puntuales o codones de parada en el marco de lectura de la secuencia (Song et ál. 2008).

Capítulo 1 23

Adicionalmente, hay que tener en cuenta las heteroplasmias, o la ocurrencia de más de un haplotipo

dentro de un solo organismo, que se pueden presentar en las amplificaciones del ADN mitocondrial

por PCR (Frey and Frey 2004).

Otro reto para el diagnóstico por PCR es la extracción de ADN en materia fecal. En acantocéfalos, el

procedimiento para extraer ADN de la materia fecal no está descrito. Sin embargo, en la literatura se

pueden encontrar diferentes protocolos y kits para extracción de ADN de heces, para parásitos

gastrointestinales como Giardia intestinalis (Asher et ál. 2012), coccidias (Elmore et ál. 2013),

Cryptosporidium parvum (Neira et ál. 2010), Echinococcus multilocularis (Nonaka et ál. 2009),

Dientamoeba fragilis (Menghi et ál. 2006), entre otros parásitos que pueden tener implicaciones en

salud pública. Por otra parte, sabemos que los huevos de los acantocéfalos presentan cutícula doble

(Müller 2007), lo que podría ser un obstáculo para la extracción de ADN. En la literatura se encuentran

varios protocolos para la extracción de ADN de parásitos como los céstodos, ya que los embrióforos de

los huevos de céstodos son difíciles de digerir (Dinkel et ál. 1998). También hay que tener en cuenta,

que existen inhibidores de la PCR y por esto se deben adoptar medidas para evitarlos, especialmente

cuando se extrae ADN de materia fecal (Mathis and Deplazes 2006, Nonaka et ál. 2009). La materia

fecal es considerada uno de las muestras de más difícil extracción de ADN, debido a que se pueden

encontrar proteasas bacteriales, nucleasas, células de debridación, ácidos biliares, entre otros, que

actúan como inhibidores debido a efectos fisicoquímicos y enzimáticos (Wilson 1997). Se han

reportado sustancias como harina de papa (Deuter et ál. 1995) y camas magnéticas que absorben las

sustancias inhibitorias (Flagstad et ál. 1999). También se ha usado tiocianato de guanidina, mediante el

protocolo de sílica guanidina tiocianato (Boom et ál. 1990), por su actividad para la desnaturalización

de las proteínas. Igualmente, existen kits como el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) que usa una


basada en PCR

combinación de absorción y desactivación de sustancias inhibitorias (Menghi et ál. 2006, Nonaka et ál.

2009). Otro aspecto a tener en cuenta es que las heces de tamarinos son escasas y los procesos de

obtención en vida silvestre o de identificación cuando se encuentran en grupos en cautiverio puede ser

complicado, por lo que muchas veces se hace necesario la captura de individuos y la utilización de

lavados rectales para obtener la muestra. La conservación de materia fecal también es un reto, ya que

en la mayoría de reportes diagnósticos, utilizan heces frescas para el diagnóstico molecular.

Por medio de la PCR se podrá comprobar si los primers diseñados son útiles para detectar

Prosthenorchis sp. en muestras de materia fecal positiva para el parásito. Es importante que los

controles, tanto negativo como positivo, cumplan su función para evitar falsos positivos y negativos.

El próximo paso es optimizar los parámetros de amplificación de la reacción con ADN purificado. La

optimización de los componentes de la reacción (cloruro de magnesio, ADN polimerasa, nucleótido

trifosfato, y primers), la selección de la temperatura para hibridización y el tiempo de duración de cada

paso del ciclo termal influenciarán la sensibilidad y especificidad de la reacción. Luego de esto, hay

que especificar el punto de corte para determinar si la reacción es positiva o negativa, y si es necesario

determinar el rango de especificidad del ensayo (Weiss 1995). En el caso de parásitos se acostumbra a

realizar pruebas incrementando la cantidad de huevos para detectar la sensibilidad (Dinkel et ál. 1998).

La sensibilidad analítica del ensayo se debería determinar con el organismo entero, si es posible, o

puede substituirse por ADN blanco clonado o ADN genómico (Weiss 1995).

Capítulo 1 25

En el caso de Prosthenorchis elegans y su diagnóstico por medio de PCR, hay que preguntarse la razón

de la no aparición de huevos en los coprológicos aun cuando los animales se encuentran severamente

infectados en la necropsia. Dinkel et ál. (1998) analiza interrogantes similares con Echinococcus

multilocularis, dando como posibles hipótesis que los gusanos no están con la suficiente madurez para

poner huevos o que los huevos no son puestos continuamente y que además, los huevos no están

distribuidos uniformemente en las heces. Sin embargo, se cree que el ADN procedente de los gusanos

también se puede llegar a detectar (Dinkel et ál. 1998).

Las oportunidades que generan los avances en el conocimiento genético de Prosthenorchis elegans, son

útiles para responder las inquietudes que generan muchos aspectos relacionados con esta especie,

como la taxonomía, caracterización genética, ciclo de vida, transmisión, hospederos intermediarios,

ecología y epidemiología. Igualmente, desde el punto de vista diagnóstico, se abre una gran cantidad

de posibilidades para la investigación en cuanto a la especificidad por el hospedero, la resistencia a los

tratamientos, la eficacia de los tratamientos, entre otros. Sin embargo, lo más importante son las

implicaciones que tiene para los planes de conservación de los primates del Nuevo Mundo que se ven

más afectados por este parásito.

Referencias

Abd-Elsalam KA. 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. Afr J Biotechnol.

2: 91-95.

Al-Sabi MN, Kapel CM. 2011. Multiplex PCR identification of Taenia spp. in rodents and carnivores.

Parasitol Res. 109: 1293-1298.


basada en PCR

Alcantar-Escalera FJ, García-Varela M, Vazquez-Dominguez E, Perez-Ponce de Leon G. 2013. Using

DNA barcoding to link cystacanths and adults of the acanthocephalan Polymorphus brevis in central

Mexico. Mol Ecol Resour. 13: 1116-1124.

Alfaro A, Morales J, Fallas S. 2012. Ileitis y colitis piogranulomatosa en un mono ardilla (Saimiri

oerstedii) asociada con Prosthenorchis elegans. . Rev Cienc Vet. 26: 81-86.

Asher A, Waldron L, Power M. 2012. Evaluation of a PCR protocol for sensitive detection of Giardia

intestinalis in human faeces. Parasitol Res. 110: 853-858.

Baker DG. 2008. Biology of Nematodes and Acanthocephalans. In Flynn's Parasites of Laboratory

Animals. [Internet]. 2a ed. Oxford, UK. Blackwell Publishing Ltd. [citado 2011 agosto 10].

Disponible en: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470344552.ch5/summary

Barker DC. 1989. Molecular approaches to DNA diagnosis. Parasitology. 99: S125-S146.

Baskin GB. 2013. Pathology on Nonhuman Primates [Internet]. Primate Info Net. Wisconsin Primate

Research Center (WPRC) Library. University of Winsconsin-Madison. [Citado 2014 Enero 8].

Disponible en: http://pin.primate.wisc.edu/research/vet/pola6-99.html

Basset Y. 2001. Invertebrates in the canopy of tropical rain forests How much do we really know?

Plant Ecol. 153: 87-107.

Benesh DP, Hasu T, Suomalainen L-R, Valtonen ET, Tiirola M. 2006. Reliability of mitochondrial

DNA in an acanthocephalan: The problem of pseudogenes. Int J Parasitology 36: 247-254.

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. 1990. Rapid

and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 28: 495-503.

Bowman DD, Georgi JR. 2009. Georgi's Parasitology for Veterinarians. Philadelphia: W.B. Saunders

Company. 451 p.

Capítulo 1 27

Brack M. 2002. Acanthocephalan infections [Internet]. EAZWV Transmissible Disease Fact Sheet.

Germany. Disponible en:

http://www.eaza.net/activities/tdfactsheets/101%20Acanthocephalan%20Infections.doc.pdf

Carrasco F, Tantaleán M, Gibson KN, Williams M. 2008. Prevalencia de helmintos intestinales de una

población de monos maquisapas silvestres Ateles belzebuth chamek en el parque nacional Manu, Perú.

Neotropical helminthology 2: 19-26.

Connelly L, Craig BH, Jones B, Alexander CL. 2013. Genetic diversity of Cryptosporidium spp. within

a remote population of Soay Sheep on St. Kilda Islands, Scotland. Appl Environ Microbiol 79: 2240-

2246.

Cortes S, Rolão N, Ramada J, Campino L. 2004. PCR as a rapid and sensitive tool in the diagnosis of

human and canine leishmaniasis using Leishmania donovani s.l.-specific kinetoplastid primers. T Roy

Soc Trop Med H. 98: 12-17.

Cubas ZS. 1996. Special Challenges of Maintaining wild Animals in Captivity in South America. Rev

sci tech Off int Epiz. 267-287

Chinchilla M, Valerio I, Gerrero OM, Sanchez R. 2010. Parasitismo intestinal en monos tití o ardilla

Saimiri oerstedii (Primates: Cebidae) de Costa Rica. Rev Ibero-Latinoam Parasitol. 69: 106-111.

Derycke S, Vanaverbeke J, Rigaux A, Backeljau T, Moens T. 2010. Exploring the Use of Cytochrome

Oxidase c Subunit 1 (COI) for DNA Barcoding of Free-Living Marine Nematodes [Internet]. PLoS

ONE 5(10): e13716. Disponible en:

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0013716#pone-0013716-g005

Deuter R, Pietsch S, Hertel S, Müller O. 1995. A method for preparation of fecal DNA suitable for

PCR. Nucleic Acids Res. 23: 3800-3801.


basada en PCR

Dinkel A, von Nickisch-Rosenegk M, Bilger B, Merli M, Lucius R, Romig T. 1998. Detection of

Echinococcus multilocularis in the definitive host: coprodiagnosis by PCR as an alternative to

necropsy. J Clin Microbiol 36: 1871-1876.

Dos Santos I, Ruiz CR, Santos CP. 2010. Helminths found in marmosets (Callithrix penicillata and

Callithrix jacchus) introduced to the region of occurrence of golden lion tamarins (Leontopithecus

rosalia) in Brazil. Vet Parasitol. 171: 123-129.

Dunn FL. 1963. Acanthocephalans and cestodes of South American monkeys and marmosets. J

Parasitol. 49: 717-722.

Elmore SA, Lalonde LF, Samelius G, Alisauskas RT, Gajadhar AA, Jenkins EJ. 2013. Endoparasites in

the feces of arctic foxes in a terrestrial ecosystem in Canada. Int J Parasitol Parasites Wildl 2: 90-96.

Flagstad O, Røed K, Stacy JE, Jakobsen KS. 1999. Reliable noninvasive genotyping based on

excremental PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol. Mol Ecol. 8: 879-883.

Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of

mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol

Biotechnol 3: 294-299.

Frey JE, Frey B. 2004. Origin of intra-individual variation in PCR-amplified mitochondrial cytochrome

oxidase I of Thrips tabaci (Thysanoptera: Thripidae): mitochondrial heteroplasmy or nuclear

integration? Hereditas. 140: 92-98.

Garber PA, Kitron U. 1997. Seed Swallowing in Tamarins: Evidence of a Curative Function or

Enhanced Foraging Efficiency? Int J of Primatol. 18: 523-538.

García-Varela M, Nadler SA. 2005. Phylogenetic relationships of Palaeacanthocephala

(Acanthocephala) inferred from SSU and LSU rDNA gene sequences. J Parasitol 91: 1401-1409.

Capítulo 1 29

García-Varela M, García-Prieto L, Rodriguez RP. 2011. Molecular identification and first description

of the male of Neoechinorhynchus schmidti (Acanthocephala: Neoechinorhynchidae), a parasite of

Trachemys scripta (Testudines) in Mexico. Parasitol Int 60: 433-439.

García-Varela M, Cummings MP, Perez-Ponce de Leon G, Gardner SL, Laclette JP. 2002.

Phylogenetic analysis based on 18S ribosomal RNA gene sequences supports the existence of class

Polyacanthocephala (acanthocephala). Mol Phylogenet Evol 23: 288-292.

García-Varela M, Aznar FJ, Perez-Ponce de Leon G, Pinero D, Laclette JP. 2005. Molecular phylogeny

of Corynosoma Luhe, 1904 (Acanthocephala), based on 5.8S and internal transcribed spacer sequences.

J Parasitol 91: 345-352.

García-Varela M, Perez-Ponce de Leon G, de la Torre P, Cummings MP, Sarma SS, Laclette JP. 2000.

Phylogenetic relationships of Acanthocephala based on analysis of 18S ribosomal RNA gene

sequences. J Mol Evol 50: 532-540.

García-Varela M, Nadler SA. 2006. Phylogenetic relationships among Syndermata inferred from

nuclear and mitochondrial gene sequences. Mol Phylogenet Evol 40: 61-72.

García-Varela M, Pérez-Ponce de León G. 2008. Validating the Systematic Position of Profilicollis

Meyer, 1931 and Hexaglandula Petrochenko, 1950 (Acanthocephala: Polymorphidae) Using

Cytochrome C Oxidase (cox 1). J Parasitol. 94: 212-217.

García-Varela M, Pérez-Ponce de León G, Aznar FJ, Nadler SA. 2009. Systematic Position of

Pseudocorynosoma and Andracantha (Acanthocephala, Polymorphidae) Based on Nuclear and

Mitochondrial Gene Sequences. J Parasitol. 95: 178-185.

Garey JR, Near TJ, Nonnemacher MR, Nadler SA. 1996. Molecular evidence for Acanthocephala as a

subtaxon of Rotifera. J Mol Evol 43: 287-292.

Gasser RB. 1999. PCR-based technology in veterinary parasitology. Vet Parasitol. 84: 229-258.

Gasser RB, Zarlenga DS. 2004. Molecular Systematic and Diagnosis. Vet Parasitol. 125: 69-92.


basada en PCR

Gasser RB, Gruither JM, Polderman AM. 2009. The utility of molecular methods for elucidating

primate-pathogen relationships-the Oesophagostomum bifurcum example. In: Huffman MA, Chapman

CA, eds. Primate Parasite Ecology. The dynamics and study of host-parasite relationships. Cambridge.

Cambridge University Press. p. 47-62

Gazi M, Sultana T, Min GS, Park YC, García-Varela M, Nadler SA, Park JK. 2012. The complete

mitochondrial genome sequence of Oncicola luehei (Acanthocephala: Archiacanthocephala) and its

phylogenetic position within Syndermata. Parasitol Int. 61: 307-316.

Goulding TC, Sarah Cohen C. 2014. Phylogeography of a marine acanthocephalan: lack of cryptic

diversity in a cosmopolitan parasite of mole crabs. J Biogeogr. 41: 965-976.

Hunt PW, Lello J. 2012. How to make DNA count: DNA-based diagnostic tools in veterinary

parasitology. Vet Parasitol. 186: 101-108.

Irwin MT, Raharison JL. 2009. A review of the endoparasites of the lemur of Madagascar. Malagasy

Nature. 2: 66-93.

Jimenez LD. 2009. Identificación de parásitos gastrointestinales en monos "Titi gris" (Saguinus

leucopus) del Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas (CRFSOC). [Tesis de

Pregrado]. [Bogotá-Colombia] Universidad Nacional de Colombia.

Joslin JO. 2003. Primates. Vet Rec. 161: 234-236.

Kim JH, Antunes A, Luo SJ, Menninger J, Nash WG, O'Brien SJ, Johnson WE. 2006. Evolutionary

analysis of a large mtDNA translocation (numt) into the nuclear genome of the Panthera genus species.

Gene. 366: 292-302.

Kindlovits A, Kindlovits LM. 2009. Enfermidades Parasitárias. Rio de Janeiro: L.F. Livros de

Veterinária Ltda. 535 p.

Capítulo 1 31

Lopez JV, Yuhki N, Masuda R, Modi W, O'Brien SJ. 1994. Numt, a recent transfer and tandem

amplification of mitochondrial DNA to the nuclear genome of the domestic cat. J Mol Evol. 39: 174-

190.

Ludlage E, Mansfield K. 2003. Clinical Care and Diseases of the Common Marmoset (Callithrix

jacchus). Comparative Med. 53: 369-382.

Machado Filho DA. 1950. Revisão do gênero Prosthenorchis Travassos, 1915 (Acanthocephala).

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 1950. p. 495-545.

Mansfield K, Weston-Murphy H. 2009. Zoo Med 2008: Primate Medicine (2009) [Internet]. [Citado

2011 Noviembre 10]. Disponible en: http://ocw.tufts.edu/Content/60/lecturenotes/896102

Martinez-Aquino A, Reyna-Fabian ME, Rosas-Valdez R, Razo-Mendivil U, de Leon GP, García-

Varela M. 2009. Detecting a complex of cryptic species within Neoechinorhynchus golvani

(Acanthocephala: Neoechinorhynchidae) inferred from ITSs and LSU rDNA gene sequences. J

Parasitol 95: 1040-1047.

Mathis A, Deplazes P. 2006. Copro-DNA tests for diagnosis of animal taeniid cestodes. Parasitol Int 55

Suppl: S87-90.

Menghi CI, Gatta CL, Makiya R, Cesar Méndez O. 2006. Detección molecular de Dientamoeba fragilis

en heces: eliminación de los inhibidores de la DNA polimerasa. Parasitología Latinoamericana. 61:

146-151.

Michaud C, Tantalean M, Ique C, Montoya E, Gozalo A. 2003. A survey for helminth parasites in feral

New World non-human primate populations and its comparison with parasitological data from man in

the region. J Med Primatol. 32: 341-345.

Miquelis A, Martin JF, Carson EW, Brun G, Gilles A. 2000. Performance of 18S rDNA helix E23 for

phylogenetic relationships within and between the Rotifera-Acanthocephala clades. C R Acad Sci III.

323: 925-941.


basada en PCR

Monteiro R, Dietz J, Raboy B, Beck B, Vleeschower K, Baker A, Martins A, Jansen A. 2007. Parasite

community interactions: Trypanosoma cruzi and intestinal helminths infecting wild golden lion

tamarins Leontopithecus rosalia and golden-headed lion tamarins L. chrysomelas (Callitrichidae, L.,

1766). Parasitol Res. 101: 1689-1698.

Müller B. 2007. Determinants of the diversity of intestinal parasites communities in sympatric New

World Primates (Saguinus mystax, Saguinus fuscicollis, Callicebus cupreus). [Tesis de Doctorado].

[Hochschule Hannover- Germany]. Tierärztliche Hochschule Hannover.

Ndao M. 2009. Diagnosis of Parasitic Diseases: Old and New Approaches. Interdiscip Perspect Infect

Dis. 15 p. Disponible en: http://www.hindawi.com/journals/ipid/2009/278246/cta/

Near TJ. 2002. Acanthocephalan phylogeny and the evolution of parasitism. Integr Comp Biol. 42:

668-677.

Near TJ, Garey JR, Nadler SA. 1998. Phylogenetic Relationships of the Acanthocephala Inferred from

18S Ribosomal DNA Sequences. Mol Phylogenet Evol. 10: 287-298.

Neira P, Muñoz N, Stanley B, Gosh M, M.J. R. 2010. Cryptosporidium parvum en gastrópodos

silvestres como bioindicadores de contaminación fecal en ecosistemas terrestres. Rev Chil Infect. 27:

211-218.

Nichols RA, Campbell BM, Smith HV. 2003. Identification of Cryptosporidium spp. oocysts in United

Kingdom noncarbonated natural mineral waters and drinking waters by using a modified nested PCR-

restriction fragment length polymorphism assay. Appl Environ Microbiol 69: 4183-4189.

Nielsen DH. 1980. Prosthenorchis elegans infection in a primate colony. Proc Am Assoc Zoo Vet.

113-116.

Capítulo 1 33

Nonaka N, Sano T, Inoue T, Teresa Armua M, Fukui D, Katakura K, Oku Y. 2009. Multiplex PCR

system for identifying the carnivore origins of faeces for an epidemiological study on Echinococcus

multilocularis in Hokkaido, Japan. Parasitol Res. 106: 75-83.

O'Mahony EM, Bradley DG, Kennedy CR, Holland CV. 2004. Evidence for the hypothesis of strain

formation in Pomphorhynchus laevis (Acanthocephala): an investigation using mitochondrial DNA

sequences. Parasitology. 129: 341-347.

Pan TS, Nie P. 2013. The complete mitochondrial genome of Pallisentis celatus (Acanthocephala) with

phylogenetic analysis of acanthocephalans and rotifers. Folia Parasitol (Praha). 60: 181-191.

Pavia P, Cuervo C, Montilla M, Nicholls S, Puerta C. 2003. Diseño y estandarización de una prueba de

PCR para la detección específica de Trypanosoma cruzi / PCR design and standardization for

Trypanosoma cruzi specific detection. Infectio. 7: 129-135.

Paz A, González M, Crawford AJ. 2011. Códigos de barra de la vida: Introducción y perspectiva. Acta

biol. Colomb. 16: 161-176.

Perez J, Ramirez DM, Hernandez CA. 2007. Prosthenorchis sp. en tities grises (Saguinus leucopus).

Revisión de tema. Ces Med Vet Zootec. 2: 51-57.

Perez J, Ramirez M, Hernandez CA. 2008. Remoción quirúrgica del parásito intestinal Prosthenorchis

sp. en un mono titi gris (Saguinus leucopus) en cautiverio. Rev Colomb Cienc Pec. 21: 608-613.

Perrot-Minnot M-J. 2004. Larval morphology, genetic divergence, and contrasting levels of host

manipulation between forms of Pomphorhynchus laevis (Acanthocephala). Int J Parasitol. 34: 45-54.

Phillips KA, Haas ME, Grafton BW, Yrivarren M. 2004. Survey of the gastrointestinal parasites of the

primate community at Tambopata National Reserve, Peru. J Zool. 264: 149-151.

Pissinatti L, Pissinatti A, Burity CHF, Mattos Jr DG, Tortelly R. 2007. Ocorrência de Acanthocephala

em Leontopithecus (Lesson, 1840), cativos: aspectos clínico-patológicos. Callitrichidae-Primates. Arq

bras med vet zoo. 59: 1473-1477.


basada en PCR

Potkay S. 1992. Diseases of the Callitrichidae: A review. J Med Primatol. 21: 189-236.

Prichard R. 1997. Application of molecular biology in veterinary parasitology. Vet Parasitol 71: 155-

175.

Rodríguez R. 2007. The epidemiology of Taenia spp. and cisticercosis in Ecuador. [Tesis de

Doctorado]. [Flandes-Bélgica]. Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent.

Salam MA, Mondal D, Kabir M, Ekram ARMS, Haque R. 2010. PCR for diagnosis and assessment of

cure in kala-azar patients in Bangladesh. Acta trop. 113: 52-55.

Schoeb TR. 1989. Diseases of Laboratory Primates [Internet]. University of Alabama-Birmingham.

[Citado 2013 Junio 15]. Disponible en: http://netvet.wustl.edu/species/primates/primate2.txt)

Shih HH, Chen HY, Lee CY. 2010. Acanthocephalan Fauna of Marine Fish in Taiwan and the

Differentiation of Three Species by Ribosomal DNA Sequences. Taiwania. 55: 123-127.

Simón Vicente F, Simón Martín F. 2000. Acantocéfalos, pentastómidos e hirudíneos. In: Cordero del

Campillo M. y Rojo Vásquez FA eds. Parasitología Veterinaria. Madrid: McGraw Hill -

Interamericana. 124-133

Song H, Buhay JE, Whiting MF, Crandall KA. 2008. Many species in one: DNA barcoding

overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified. P Natl

Acad Sci. 105: 13486-13491.

Steinauer ML, Nickol BB, Orti G. 2007. Cryptic speciation and patterns of phenotypic variation of a

highly variable acanthocephalan parasite. Mol Ecol. 16: 4097-4109.

Steinauer ML, Nickol BB, Broughton R, Orti G. 2005. First sequenced mitochondrial genome from the

phylum Acanthocephala (Leptorhynchoides thecatus) and its phylogenetic position within Metazoa. J

Mol Evol. 60: 706-715.

Capítulo 1 35

Stoner KE. 1996. Prevalence and Intensity of Intestinal Parasites in Mantled Howling Monkeys

(Alouatta palliata) in Northeastern Costa Rica: Implications for Conservation Biology. Conserv Biol.

10: 539-546.

Stoner KE, González Di Pierro AM. 2006. Intestinal Parasitic Infections in Alouatta Pigra in Tropical

Rainforest in Lacandona, Chiapas, Mexico: Implications for Behavioral Ecology and Conservation. In:

Estrada A, Garber PA, Pavelka MSM, Luecke L, eds. New Perspectives in the Study of Mesoamerican

Primates. Springer. US. p. 215-240

Stunkard HW. 1965. New intermediate hosts in the life cycle of Prosthenorchis elegans (Diesing,

1851), an acanthocephalan parasite of primates. J Parasitol. 51: 645-649.

Takos MJ, Thomas LJ. 1958. The Pathology and Pathogenesis of Fatal Infections Due to an

Acanthocephalid Parasite of Marmoset Monkeys. Am J Trop Med Hyg. 7: 90-94.

Tantaleán M, Chávez J. 2011. Presencia de Oncicola sp. (Acanthocephala) en Atelocynus microtis

(Canidae) de la Reserva de Biosfera de Manu, Madre de Dios, Perú. Rev Peru Biol. 18: 135-136.

Tantaleán M, Sánchez L, Gómez L, Huiza A. 2005. Acantocéfalos del Perú. Rev Peru Biol. 12: 83-92.

Thatcher VE, Nickol BB. 1972. Some Acanthocephalans from Panama and Colombia. P Helm Soc

Wash. 39: 245-248.

Toft JD. 1982. The Pathoparasitology of the Alimentary Tract and Pancreas of Nonhuman Primates: A

review. Vet Pathol 19: 44-92.

Trejo-Macías G, Estrada A. 2012. Risk factors connected to gastrointestinal parasites in mantled

Alouatta palliata mexicana and black howler monkeys Alouatta pigra living in continuous and in

fragmented rainforests in Mexico. Curr Zool. 58: 375-383.

Vitazkova SK, Wade SE. 2007. Effects of Ecology on the Gastrointestinal Parasites of Alouatta pigra.

Int J Primatol. 28: 1327-1343.


basada en PCR

Wallach JD, Boever WJ. 1983. Primates. In: Wallach JD, Boever WJ. Diseases of Exotic Animals.

Medical and Surgical Management. Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1159 p.

Wayland MT. 2010. Proboscis profiler: a tool for detecting acanthocephalan morphotypes. Syst

Parasitol 76: 159-167.

Weber M, Junge R. 2000. Identification and treatment of Moniliformis clarki (Acanthocephala) in

cotton-topped tamarins (Saguinus oedipus). J Zoo Wildlife Med. 31: 503-507.

Weber M, Wey-Fabrizius AR, Podsiadlowski L, Witek A, Schill RO, Sugar L, Herlyn H, Hankeln T.

2013. Phylogenetic analyses of endoparasitic Acanthocephala based on mitochondrial genomes suggest

secondary loss of sensory organs. Mol Phylogenet Evol 66: 182-189.

Weiss JB. 1995. DNA probes and and PCR for Diagnosis of Parasitic Infections. Clin Microbiol Rev.

8: 113-130.

Wenz A, Heymann EW, Petney TN, Hf T. 2010. The influence of human settlements on the parasite

community in two species of Peruvian Tamarin. Parasitology 137: 675-684.

Wilson IG. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 63:

3741-3751.

Wolff PL, Pond J, Meehan T. 1990. Surgical removal of Prosthenorchis elegans form six species of

Callitrichidae. Proceedings American Association of Zoo Veterinarians. United States. p. 103-106.

Xiao L, Fayer R, Ryan U, Upton SJ. 2004. Cryptosporidium Taxonomy: Recent Advances and

Implications for Public Health. Clin Microbiol Rev. 17: 72-97.

Capítulo 1 37

Figuras Capítulo 1

Figura 1.1. Prosthenorchis spp. en el intestino de un Saguinus leucopus. Foto tomada de la necropsia

de un especimen de U.R.R.A.S


basada en PCR

Figura 1. 2. Remoción quirúrgica de Prosthenorchis spp. en un Saguinus leucopus de U.R.R.A.S

Capítulo 1 39

Figura 1. 3. Nódulos característicos de Prosthenorchis elegans, detectados por palpación abdominal.

Foto tomada de un S. leucopus de U.R.R.A.S previo a la cirugía.

2. Mitochondrial DNA diversity in the

acanthocephalan Prosthenorchis elegans in

Colombia based on cytochrome C oxidase

sequence

Sometido a: International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife

Capítulo 2 41

Mitochondrial DNA diversity in the acanthocephalan Prosthenorchis elegans in Colombia

based on cytochrome C oxidase sequence

Ana Carolina Falla a*

, Claudia Brieva a, Paul Bloor

b

a Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Carrera 30 #

45-03 Edificio 481, Bogotá DC 111321, Colombia

b Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos, Instituto de Genética, Universidad Nacional de

Colombia, Carrera 30 # 45-03 Edificio 426, Bogotá DC 111321, Colombia

* Corresponding author: Ana Carolina Falla, Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia, [email protected], Tel.: +57-1-8106654, +57-3006628396, Cra 74A #

168A-85 Interior 20 Apto. 202, Bogotá DC, Colombia, 111156.

E-mail addresses: [email protected] (C. Falla), [email protected] (C. Brieva),

[email protected] (P. Bloor),

E-mail addresses: [email protected] (C. Falla), [email protected] (C. Brieva),

[email protected] (P. Bloor),


basada en PCR

Abstract

Prosthenorchis elegans is an acanthocephalan affecting New World Primates in the wild in South

America and in captivity around the world. P. elegans contributes to high mortality in tamarins in

captivity and it presents difficulties of diagnosis and treatment, since coprologic exams are often

negative in animals severely infected at the death; also the control of cockroaches (the intermediate

host in captivity) is very difficult. The first description of sequence information and genetic diversity

is presented for Prosthenorchis elegans based on analysis of partial cytochrome oxidase subunit I

(COI) gene sequence from 37 parasites from Saguinus leucopus and Cebus albifrons from rescue

centres for wild animals and from the wild. Six hundred and thirty-three bp of COI was obtained for all

parasites analysed. Six distinct haplotypes were identified which grouped into one of two well-

supported mtDNA lineages. No association between haplogroup/haplotype, holding facility and

species was found. This study confirms the utility of mitochondrial gene COI as a marker to detect

genetic diversity in acanthocephalan and to identify species. Illegal wildlife trade, stress and releases

of primates into the wild could have implications on the genetic diversity of the parasite and

conservation of the species. Further research is necessary, analyzing larger size samples from the wild

and captivity in different primate hosts and the intermediate host for P. elegans.

Keywords: acanthocephala, Prosthenorchis elegans, cytochrome c oxidase subunit I, endoparasite,

Saguinus leucopus, Cebus albifrons

Capítulo 2 43

2.1. Introduction

Prosthenorchis sp. belongs to the acanthocephala phylum or group of thorny-headed worms,

endoparasites living part of their life in arthropods and part in the digestive tract of vertebrates (Baker,

2008). It is of importance in New World Primates, where it is the cause of high mortality in captive

individuals, especially in callitrichids species (Garber and Kitron, 1997; Martin, 1978; Potkay, 1992).

Mortality in animals results from secondary bacterial infection due the lesions caused by the adult

parasite in the intestinal tract of the definitive host (Takos and Thomas, 1958; Toft, 1982). Two

species have been recognized for nonhuman primates on the basis of morphological differences: P.

elegans and P. spirula (Pissinatti et al., 2007). Differentiation of the two species is based mainly on

differences in the number and arrangement of hooks on the proboscide (Müller, 2007; Stunkard, 1965),

and the presence of a collar between the proboscide and the body in P. elegans (Machado Filho, 1950).

Infection with the parasite is a serious problem for the management of primate species in captivity.

The species has been reported in the wild in New World primates and some carnivores of South

America and in captivity around the world, affecting several species of primates in zoos, rescue centres

and laboratories (Perez et al., 2007; Schoeb, 1989). Efficient control is, in part, dependent on reliable

epidemiologic information, which implies the accurate identification of the parasite as well as its early

identification. For species-specific diagnosis of Prosthenorchis elegans, current diagnostic methods are

unsatisfactory. Currently, the diagnosis of Prosthenorchis elegans is based on the detection of eggs by

microscopic observation of fecal samples or coprological examination. This technique lacks both

sensitivity and specificity, since eggs of most members of the genus are morphologically


basada en PCR

indistinguishable and are shed intermittently (Machado Filho, 1950). Where infection is identified,

treatments appear to be ineffective (Jimenez, 2009; Johnson-Delaney, 2009; Nielsen, 1980) with

surgical removal being the best option.

The application of DNA based analyses has provided unique insights into genetic diversity where they

have revealed cases of cryptic diversity (Steinauer et al., 2007), i.e., the identification of distinct

evolutionary lineages where morphological differentiation is low (Varcasia et al., 2006). Such

approaches are also useful in parasite diagnosis, where they can potentially contribute to the accurate

detection of species (Al-Sabi and Kapel, 2011). Molecular based DNA approaches for the differential

diagnosis of parasites have been developed for numerous species (Ndao, 2009); polymerase chain

reaction (PCR) based assays, using oligonucleotide primers derived from species-specific sequences,

providing the greatest sensitivity. While numerous studies have published sequence data for

acanthocephalans (García-Varela et al., 2013; Pinacho-Pinacho et al., 2014; Westram et al., 2011), so

far, no sequence data has been published for the genus Prosthenorchis, thus its phylogenetic

relationship with other acanthocephala or genetic variation within species is unknown. In addition, the

absence of genetic information for Prosthenorchis presents an obstacle to the development of

molecular-based diagnostic tools for the genus.

The present study aimed to provide the first analysis of mtDNA genetic diversity in P. elegans. The

primary objectives were to: 1) obtain the first DNA sequence of the mitochondrial cytochrome oxidase

subunit I (COI) gene specific to P. elegans and 2) provide the first description of intra-specific

Capítulo 2 45

diversity among different isolates obtained from primate hosts in Colombia. This information will help

pave the way to the development of molecular-based diagnostic tools for the detection of P. elegans as

well as furthering research into the life cycle, intermediate hosts and epidemiological aspects of the

species.

2.2 Materials and methods

2.2.1 Sample collection

A total of 37 adult parasites were used for this study. All parasites were collected opportunistically

from the intestines of primates. Twenty-two were obtained from four captive wild individuals of

Saguinus leucopus and 13 collected from a single captive wild individual of Cebus albifrons held

within wildlife rescue facilities in Colombia. In addition, two adult parasites were obtained from two

wild-caught individuals of S. leucopus collected by the Wildlife Conservation Society – Colombia.

Full details of parasites analysed are given in table 2.1. Adult parasites were either obtained during

post-mortem examination or surgical intervention carried out by qualified veterinarians following

ethical practices and according to the surgical procedure described in Perez et al. (2008). All post-

mortem examinations were carried out on individuals that died of natural causes. Adult parasites were

stored in either 10% formaldehyde (10 samples) or absolute ethanol (27 samples). Samples received in

formaldehyde were washed three times in saline solution and placed in absolute ethanol for long-term

storage. The parasites were stored at -20 C until processing. Morphology of adult parasite was

examined under a dissecting stereoscope and an electron microscope.


basada en PCR

2.2.2 Amplification and sequencing of DNA

Total DNA was isolated from adult parasites using protocols of proteinase K digestion and

silica/guanidinium thiocyanate extraction or standard phenol-chloroform extraction and ethanol

precipitation. For silica DNA extraction, samples were digested overnight at 55°C using 2.0 mg/ml

proteinase K in lysis buffer (EDTA 0.5 M, Tris 10 mM, NaCl 100 mM, SDS buffer 2% and Triton X-

100 0.5%). Binding buffer (GuSCN 5 M, NaCl 25 mM and Tris 50 mM) and silica suspension (Sigma-

Aldrich, 0.5 to 10 microns particle size) were added, incubated for 3 h at room temperature and spun at

15,000 rpm for 2 min to pellet the silica. The supernatant was removed and the silica pellet was washed

twice using wash buffer (ethanol 50% v/v, NaCl 125 mM, EDTA 1 mM, and Tris 10 mM). The silica

pellet was dried at room temperature and DNA was recovered using ultra-pure water.

A fragment of 703 base pairs (bp) of the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI) gene was amplified

using the forward primer 5'- CTAATCATAARGRTATYGG - 3' and reverse primer 5'-

TAAACYTCAGGRTGACCAAARAAYCA - 3' modified from Folmer et al. (1994). M13 sequence

(M13REV or M13[-21]) was added to the 5’end of each primer in order to facilitate sequencing.

Polymerase chain reactions (PCRs) were carried out in a final reaction volume of 35 µL containing 1 ×

PCR reaction buffer [75 mM Tris-HCl, 20 mM (NH4)2SO4, 0.01% (v/v) Tween 20; Fermentas], 2.0

mM MgCl2, 0.2 mM of each dNTP, 0.875 U recombinant Taq polymerase (Fermentas) and 0.5 µM of

each primer. After an initial denaturation steps of 2 min at 94°C, 34 cycles of 30 sec at 94°C, 30 sec at

48°C and 60 sec at 72°C were followed by a final extension of 72ºC for 1 min. PCR products were

purified by agarose gel extraction using spin columns (MinElute Gel Extraction Kit – Qiagen;

Zymoclean Gel DNA Recovery Kit – Zymo Research) and sequenced using Big-Dye (Applied

Capítulo 2 47

Biosytems) cycle sequencing reactions with the M13REV or M13(-21) sequencing primers.

Sequencing products were run on an ABI 3500 Genetic Analyzer automated sequencer (Applied

Biosytems). Resulting sequence traces were checked and edited using the program CodonCode

Aligner ver. 4.2. (CodonCode Corporation; www.codoncode.com). Six hundred and thirty-three bases

of reliable COI gene sequence was obtained from all individuals analysed.

2.2.3 Data Analyses

Sequences were aligned using “Clustal W” (Thompson et al., 1994) as implemented within the

program BioEdit ver. 7.0 (Hall, 1999) and translated into amino acid sequences using the program

MEGA ver. 5 (Tamura et al., 2011) to check for the presence of premature stop codons. There were no

premature stop codons, insertions, or deletions, and therefore pseudogenes were not suspected. Final

alignment resulted in 633 bp of homologous sequence for all adult parasites. A single site exhibited

heteroplasmy in five parasites from the same individual. This site was removed from analyses.

Phylogenetic relationships among sequences were estimated using maximum parsimony (MP) and

neighbor-joining (NJ) methods. MP analyses (un-weighted) were performed in PAUP* version 4.0b10

(Swofford, 1998) with 1,000 bootstrap samples from the sequence data (heuristic search, 10 random

addition replicates). NJ analyses were carried out with the program MEGA ver. 5 (Tamura et al., 2011)

assuming a K2P distance between sequences and confidence determined by bootstrap (1,000

iterations). In addition, relationships among sequences were also estimated by an unrooted parsimony

network based on a statistical parsimony procedure (Templeton et al., 1992) using the 95% probability

of parsimony criterion to connect sequences using the program TCS ver. 1.21 (Clement et al., 2000).

http://www.codoncode.com/


basada en PCR

2.3. Results

2.3.1 Morphological identification

All parasites were reviewed by stereoscope, confirming the morphological identification of

Prosthenorchis sp, cylindrical body with creases along its length, and a proboscis armed with hooks.

However, only one of the articles found provided clarity on stereoscope differentiation between P.

elegans and P. spirula (Machado Filho 1950), the two species reported for primates: detection of the

number and arrangement of proboscis hooks, described by some authors (Baker 2008, Müller 2007),

requires other specialized methodologies (Wayland 2010). The distinguishing characteristic between

the two species at the stereoscope level was the presence of a collar, formed by folds, between the body

and the proboscis of P. elegans (Machado Filho 1950) (Figure 2.1). No morphometric analyses were

performed on parasites because preservation methods resulted in distorted morphology. In addition,

the proboscis were reversed and the hooks broken in most Prosthenorchis evaluated as a result of

opportunistic nature of the sampling. However, it should be noted that the hooks were more evident in

parasites of shorter length. In electron microscopy pictures you can see the details of the parasite and

hooks present in the proboscis (Fig. 2.2).

2.3.2 Sequence variation and genetic diversity

The final alignment of 633 pb partial COI sequence contained 11 variable sites (all parsimony

informative) resulting in six distinct haplotypes (Table 2.2, Fig. 2.3). Three variable sites (49, 274 and

293) resulted in changes in amino acid. All three amino acid changes corresponded to fixed differences

Capítulo 2 49

separating the two main haplogroups detected (see later). Uncorrected divergence among sequences

was 0.0-1.6% . None of the sequences matched with acanthocephalan sequences available in GenBank.

The MP and NJ trees provided evidence of two well-supported groupings (hereinafter referred to as

haplogroups I and II) (Fig. 2.3). The unrooted parsimony network (Fig 2.4) revealed that at least eight

mutational steps separate haplogroups I and II. Differentiation is generally low among the remaining

haplotypes (maximum three mutational steps between neighboring haplotypes). Haplogroup I was

formed by haplotypes C, D, E, F and haplogroup II by haplotypes A and B (Table 2.3).

No association was found between haplogroup, species or holding facility (Fig 2.5). Haplogroup I was

present in all holding facilities and both species (with the exception of S. leucopus 3 from AMVA).

Haplogroup II was present in both species (with the exception of S. leucopus 1 from URRAS and in S.

leucopus 6 from Puerto Berrío-Antioquia). The haplogroup II was predominant in AMVA (five

samples vs two samples) and haplogroup I was predominant in URRAS (17 vs 10 samples).

Haplogroup I was the most abundant haplogroup, being found in 21 adult parasites followed by

haplogroup II being found in 16 parasites.

No association was detected between holding facility and haplotype, with individual haplotypes shared

between individuals from distinct rescue centres with the exception of haplotype B and E which were

only found in URRAS. Haplotype A and C were most frequently found. Furthermore, even distinct

haplogroups and individual haplotypes were found to be shared between species, with the exception of

haplotype D which was only detected in a single parasite from a single wild-caught S. leucopus. The

haplotype D was absent in Cebus albifrons. All the haplotypes were present in Saguinus leucopus. In

AMVA the haplotype A was predominant, with haplotypes C and F with frequencies of one. In


basada en PCR

URRAS haplotype C was the predominant haplotype (n=10) followed by haplotype A (n=7) haplotype

E (n=5), and haplotypes B (n=3) and F (n=2). Haplotype diversity detected was not the same among

individuals, with some individuals containing 5 haplotypes (C. albifrons and S. leucopus 5) and others

containing 1 (S. leucopus 3). Furthermore, both haplogroups were detected within the same individual

(for example, S. leucopus 5 contained three parasites from haplogroup I and two parasites from

haplogroup II).

2.4. Discussion

One of the biggest challenges in this study was the identification of the species of Prosthenorchis.

From morphological point of view, most published reports describe slight differentiation between P.

elegans and P. spirula based on the number and arrangement of hooks on the proboscis (Baker, 2008;

Müller, 2007). As parasites were collected opportunistically and sent without any prior collection and

storage protocol, most specimens displayed an inverted proboscis and presented broken hooks. As

such, it was almost impossible to obtain an accurate hook count by conventional methods, with the

need for specialized clearance methods to perform this procedure (Alcantar-Escalera et al., 2013;

Wayland, 2010). Machado Filho (1950), however, provided an alternative method to discriminate

between the two species in which the presence of a collar in P. elegans, can be used to separate P.

elegans from P. spirula. The authors recommend this morphological characteristic to recognize P.

elegans for future studies. For future studies we recommend the use of sample collection protocols that

preserve the morphological characters of the species. This should include the careful removal of

parasites from the host tissue in such a way as not to damage taxonomically important characters, with

the removal of the front end and back end of the parasite for morphological analysis following the

Capítulo 2 51

methodology by Alcantar-Escalera et al. (2013), the remaining tissue should be preserved in absolute

ethanol for molecular analysis. It would also be interesting to carry on morphometry using the tool

proposed by Wayland (2010).

The DNA extraction fenol-cloroform protocol had good results, however the silice protocol was more

efficient with samples conserved in formol. The silice protocol has shown be effective to recover DNA

from museum samples, being valuable for samples degradated (Rohland et al., 2010).

The study provides the report of sequence data for a member of the genus Prosthenorchis. Although

the determination of the phylogenetic position of Prosthenorchis was not an objective of the present

study, a Blast search of the GenBank data base clearly grouped the sequences reported here within the

Acanthocephala. With this study, sequence data from Prosthenorchis is made available to scientific

community, permitting studies on biology, ecology and diagnosis of infection. The importance of these

tools has been highlighted by Criscione et al. (2005), with three main uses: 1) identification of known

species in which life stages are morphologically indistinguishable, 2) elucidation the life cycle of the

parasites, and 3) investigation of species morphologically similar but genetically distinct (cryptic

species).

One of the most important findings of this study was the presence of two mitochondrial DNA lineages

(corresponding to haplogroups I and II) of Prosthenorchis elegans, confirming one more time the

utility of COI as a mitochondrial gene to describe genetic diversity below the species level in

acanthocephalans (Alcantar-Escalera et al., 2013). There is no clear explanation for the origin of the

two mtDNA lineages. One possible explanation is that the distinct mtDNA lineages detected here


basada en PCR

originated in different species or in the same species but in different geographical areas but were

subsequently mixed as primates carrying different haplotypes/haplogroups were also mixed in the same

holding facilities. The alimentary habits of the definitive host and the presence of the intermediate host

as part of the diet are fundamental to acquire the infection. Since the consumption of the intermediate

host in the wild or in captivity may occur in different times, the definitive host may carry adult

Prosthenorchis from different environments taking into account that studies on longevity of other

acanthocephalans showed a life span of 50 to 365 days (Kennedy, 1985). Clearly, analysis of parasites

from wild caught individuals from throughout the species distribution is required if actual patterns of

distribution of genetic diversity within Prosthenorchis elegans as well as possible causes are to be

understood. Also is possible that the lineages could come from wildlife and captivity.

Gaps in knowledge on intermediate hosts limit interpretation of the current findings, however the

presence of different haplotypes in one individual could be related to the consumption of different

intermediate hosts in the wild, during the pet trade and in the rescue centers. The illegal trade of

wildlife is an important problem at both local and international level, because pathogens may be

transmitted between regions and species. The pathogenicity is a factor that needs to be taken into

account, since the magnitude of the health risk could be potentiated for the ability of the parasite to

persist in an environment (Gomez and Aguirre, 2008). Prosthenorchis elegans is a parasite found in

wildlife and in captivity; however mortality has only been reported in captivity, where increased stress

seems to be relevant to the deleterious effects on the host (Jimenez, 2009). Stress in captivity must be

present because the illegal trade includes inappropriate methods of capture, transport, housing and

feeding. When the animals arrive at rescue centers they have already suffered from elevated levels of

stress having shared spaces with humans, pets and other animals.

Capítulo 2 53

Although most of the sequences were obtained from parasites from URRAS located in Bogotá, the

sequences from CAV of Medellín shared four of the haplotypes present in Bogotá. Since the S.

leucopus , is the most trafficked primate species in Colombia, and most of the P. elegans were obtained

from this species, it is important to better understand the distribution of genetic diversity of P. elegans

in this species throughout its natural distribution (Tolima, Caldas, Antioquia and Bolivar) (Roncancio

et al., 2011). In addition, Bogota is not within the natural distribution of S. leuocopus. Thus all

individuals present in in Bogotá are the consequence of illegal trade in this species. The White-fronted

capuchin (C. albifrons) has a broad distribution in Colombia and Latin America, however it coexists in

some areas with S. leucopus. The white-fronted capuchin included in this study, was an old female

that has lived a long time in captivity, and it was rejected by its co-specifics. It is most likely that this

individual acquired the parasite at the centre. The genetic diversity found in P. elegans is most likely

an under representation of haplotypes found in the wild. It is interesting that in a same definitive host

there were several haplotypes, confirming that infection of definitive host with multiple haplotypes is

common and is related with the presence in the intermediate host (Gesy et al., 2014).

As suggested by Gesy et al. (2014) analysis of haplotypes from definitive and intermediate hosts from

the same locality could help to find similarities between haplotypes and to detect the rank of action for

each haplotype. Likewise, more samples are required to strengthen the findings reported here.

Prosthenorchis elegans could be important in a threatened species like S. leucopus. The species has

suffered severe declines in available habitat and habitat that is available is severely fragmented,

increasing population densities (Roncancio et al., 2013). This situation is likely to lead to conditions

that result in increased stress which in turn could result in high mortality in the future as consequence


basada en PCR

of P. elegans infection. In addition, this primate has been involved in several release or reintroduction

programs possible creating even more interaction between the parasites and intermediate hosts in

captivity and wild life. Being such a threatened primate species, elucidating the mechanisms to combat

Prosthenorchis will bring positive consequences for the conservation of the species and other species

threatened such as Saguinus oedipus, Callithrix pygmaea, Cebus albifrons, Cebus apella,

Leontopithecus sp., etc.

If the presence of parasites from distinct haplogroups is the result of bringing together animals from

different geographical origins then this could have severe consequences for management practices.

Independent of the presence or absence of geographical structure in S. leucopus, the distribution of the

two parasite lineages may need to be taken into account when considering liberations. Each lineage

could represent the delicate balance between host-parasite interactions that could be disrupted if

liberated animals incorporate a parasite lineage previously not present in the natural populations.

Finally, the present study is the first report of genetic diversity for P. elegans. As such it provides an

important baseline to develop molecular diagnosis tools and pharmacology treatment, helpful for the

management of New World primates in captivity. Furthermore, it provides useful information to help

clarify species identification of the parasite, the intermediate host in the wild and all the ecological

processes affecting its interaction. All the research performed will help to develop protocols for future

liberation programs of primates and for sanitary requirements in the importation and exportation of

primates. Most importantly, this information generated in this study will help jump start in situ

research on how the parasite affects small populations in fragmented habitat.

Capítulo 2 55

Acknowledgements

Funding resources were provided by the International Conservation Programme for Saguinus leucopus

(EAZA, ACOPAZOA) and Agreement 09F and 39 between FONAM, Universidad Nacional de

Colombia and WCS. Samples were provided by: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales

Silvestres -Universidad Nacional de Colombia (URRAS), Centro de Atención y Valoración del Area

Metropolitana del Valle de Aburrá (AVMA) y Wildlife Conservation Society-Colombia (WCS).

Credits for some photos to Dr. Jimmy Vargas and Nicolás Contreras.

References

Al-Sabi, M.N., Kapel, C.M., 2011. Multiplex PCR identification of Taenia spp. in rodents and

carnivores. Parasitol Res. 109, 1293-1298.

Alcantar-Escalera, F.J., García-Varela, M., Vazquez-Dominguez, E., Perez-Ponce de Leon, G., 2013.

Using DNA barcoding to link cystacanths and adults of the acanthocephalan Polymorphus

brevis in central Mexico. Molecular Ecol Resour. 13, 1116-1124.

Baker, D.G., 2008. Biology of Nematodes and Acanthocephalans. In Flynn's Parasites of Laboratory

Animals. 2a ed. Oxford, UK. Blackwell Publishing Ltd.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470344552.ch5/summary

Clement, M., Posada, D., Crandall, K.A., 2000. TCS: a computer program to estimate gene

genealogies. Mol Ecol. 9, 1657-1659.

Criscione, C.D., Poulin, R., Blouin, M.S., 2005. Molecular ecology of parasites: elucidating ecological

and microevolutionary processes. Mol Ecol. 14, 2247-2257.


basada en PCR

Garber, P.A., Kitron, U., 1997. Seed Swallowing in Tamarins: Evidence of a Curative Function or

Enhanced Foraging Efficiency? Int J Primatol. 18, 523-538.

García-Varela, M., Pérez-Ponce de León, G., Aznar, F.J., Nadler, S.A., 2013. Phylogenetic relationship

among genera of Polymorphidae (Acanthocephala), inferred from nuclear and mitochondrial

gene sequences. Mol Phylogenet Evol. 68, 176-184.

Gesy, K.M., Schurer, J.M., Massolo, A., Liccioli, S., Elkin, B.T., Alisauskas, R., Jenkins, E.J., 2014.

Unexpected diversity of the cestode Echinococcus multilocularis in wildlife in Canada. Int J

Parasitol Parasites Wildl. 3, 81-87.

Gomez, A., Aguirre, A.A., 2008. Infectious diseases and the illegal wildlife trade. Ann N Y Acad Sci.

1149, 16-19.

Hall, T., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for

Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95 - 98.

Jimenez, L.D., 2009. Identificación de parásitos gastrointestinales en monos "Titi gris" (Saguinus

leucopus) del Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas (CRFSOC).

Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.

Johnson-Delaney, C.A., 2009. Parasites of captive nonhuman primates. Vet Clin North Am Exot Anim

Pract. 12, 563-581.

Kennedy, C.R., 1985. Regulation and dynamics of acanthocephalan populations, In: Crompton,

D.W.T., Nickol, B.B. (Eds.). Byology of the Acanthocephala. Cambridge University Press,

Carmbridge, UK, pp. 385-469.

Machado Filho, D.A., 1950. Revisão do gênero Prosthenorchis Travassos, 1915 (Acanthocephala).

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 1950, pp. 495-545.

Capítulo 2 57

Martin, D.P., 1978. Primates, In: Me, F. (Ed.) Zoo and Wild Animal Medicine. W.B. Saunders

Company, Philadelphia London Toronto, pp. 523-552.

Müller, B., 2007. Determinants of the diversity of intestinal parasites communities in sympatric New

World Primates (Saguinus mystax, Saguinus fuscicollis, Callicebus cupreus). Hochschule

Hannover, Germany. Tierärztliche Hochschule Hannover.

Ndao, M., 2009. Diagnosis of Parasitic Diseases: Old and New Approaches. Interdiscip Perspect Infect

Dis. 2009, 15.

Nielsen, D.H., 1980. Prosthenorchis elegans infection in a primate colony. 1980. Proc Am Assoc Zoo

Vet. 113-116.

Perez, J., Ramirez, D.M., Hernandez, C.A., 2007. Prosthenorchis sp. en tities grises (Saguinus

leucopus). Revisión de tema. Ces Med Vet Zootec. 2, 51-57.

Perez, J., Ramirez, M., Hernandez, C.A., 2008. Remoción quirúrgica del parásito intestinal

Prosthenorchis sp. en un mono titi gris (Saguinus leucopus) en cautiverio. Rev Colomb Cienc

Pec. 21, 608-613.

Pinacho-Pinacho, C.D., Sereno-Uribe, A.L., García-Varela, M., 2014. Morphological and molecular

data reveal a new species of Neoechinorhynchus (Acanthocephala: Neoechinorhynchidae) from

Dormitator maculatus in the Gulf of Mexico. Parasitol Int. 63, 763-771.

Pissinatti, L., Pissinatti, A., Burity, C.H.F., Mattos Jr, D.G., Tortelly, R., 2007. Ocorrência de

Acanthocephala em Leontopithecus (Lesson, 1840), cativos: aspectos clínico-patológicos.

Callitrichidae-Primates. Arq Bras Med Vet Zoo. 59, 1473-1477.

Potkay, S., 1992. Diseases of the Callitrichidae: A review. J Med Primatol. 21, 189-236.

Rohland N, Siedel H, Hofreiter M. 2010. A rapid column-based ancient DNA extraction method for

increased sample throughput. Mol Ecol Resour. 10: 677-683.


basada en PCR

Roncancio, N., Acosta, A., García, L., Ríos, C., 2013. Distribución potencial y disponibilidad de

hábitat del tití gris (Saguinus leucopus): un primate endémico de Colombia y en peligro de

extinción En: Primates Colombianos en Peligro de Extinción, In: Defler, T., Stevenson, P.,

Bueno, M., Guzman, C. (Eds.) Primates Colombianos en Peligro de Extinción. Asociación

Primatológica Colombiana. , Bogotá, Colombia, pp. 217-234.

Schoeb, T.R., 1989. Diseases of Laboratory Primates. University of Alabama-Birmingham. [Citado

2013 Junio 15]. http://netvet.wustl.edu/species/primates/primate2.txt)

Steinauer, M.L., Nickol, B.B., Orti, G., 2007. Cryptic speciation and patterns of phenotypic variation of

a highly variable acanthocephalan parasite. Mol Ecol. 16, 4097-4109.

Stunkard, H.W., 1965. New intermediate hosts in the life cycle of Prosthenorchis elegans (Diesing,

1851), an acanthocephalan parasite of primates. J Parasitol. 51, 645-649.

Swofford, D.L. 1998. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods) version 4.

In Sinauer Associates (Sunderland, Massachusetts, USA).

Takos, M.J., Thomas, L.J., 1958. The Pathology and Pathogenesis of Fatal Infections Due to an

Acanthocephalid Parasite of Marmoset Monkeys. Am J Trop Med Hyg. 7, 90-94.

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S., 2011. MEGA5: Molecular

evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum

parsimony methods. Mol Biol Evol. 28, 2731-2739.

Templeton, A.R., Crandall, K.A., Sing, C.F., 1992. A cladistic analysis of phenotypic associations with

haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. III.

Cladogram estimation. Genetics. 132, 619-633.

Capítulo 2 59

Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of

progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap

penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.

Toft, J.D., 1982. The Pathoparasitology of the Alimentary Tract and Pancreas of Nonhuman Primates:

A review. Vet Pathol. 19, 44-92.

Varcasia, A., Lightowlers, M.W., Cattoli, G., Cancedda, G.M., Canu, S., Garippa, G., Scala, A., 2006.

Genetic variation within Taenia multiceps in Sardinia, Western Mediterranean (Italy). Parasitol

Res. 99, 622-626.

Wayland, M.T., 2010. Proboscis profiler: a tool for detecting acanthocephalan morphotypes. Syst

Parasitol. 76, 159-167.

Westram, A.M., Baumgartner, C., Keller, I., Jokela, J., 2011. Are cryptic host species also cryptic to

parasites? Host specificity and geographical distribution of acanthocephalan parasites infecting

freshwater Gammarus. Infect Genet. Evol. 11, 1083-1090.


basada en PCR

Tablas Capítulo 2

Table 2.1. List of Prosthenorchis elegans sequences analyzed in the current survey

Samples Host Locality* Source

Date

of Collection Collection Storage**

9 Saguinus leucopus 1 URRAS-Bogotá Rescue centre <2011 Unknown Absolute ethanol

13 Cebus albifrons URRAS-Bogotá Rescue centre 2011 Necropsy Absolute ethanol

7 Saguinus leucopus 2 AMVA-Medellín Rescue centre 2011 Surgery 10% Formaldehyde

1 Saguinus leucopus 3 AMVA-Medellín Rescue centre 2010 Surgery 10% Formaldehyde

5 Saguinus leucopus 5 URRAS-Bogotá Rescue centre 2010 Surgery Absolute ethanol

2 Saguinus leucopus 6 WCS- Puerto Berrío Wild 2013 Necropsy 10% Formaldehyde

* URRAS: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres, Universidad Nacional de Colombia;

AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá; WCS: Wildlife Conservation Society-Colombia

**Sample storage prior to receipt

Capítulo 2 61

Table 2.2. Prosthenorchis elegans haplotypes based in COI mitochondrial gene

Haplotype freq (N) ID Position

49 90 108 156 186 225 274 293 345 447 561

A 13 #12-A31-2 A C G G A T C C C A G

B 3 #15-A58b-1 . . . . . . . . T . .

C 12 #11-A04-1 G T C T . C A T . G A

D 1 #16-A62-3 G T C T . . A T . G A

E 5 #11-A03-1 G . C T . C A T . G A

F 3 #12-A45-2 G . C T G C A T . G A


basada en PCR

Table 2.3. Haplogroups and haplotypes found in P. elegans

Parasite ID Host Source Institution* Haplogroup Haplotype

A3 S. leucopus 1 Captivity URRAS I E

A4 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C








A15 C. albifrons Captivity URRAS II A



A19 C. albifrons Captivity URRAS II B


A21 C. albifrons Captivity URRAS I C

A22 C. albifrons Captivity URRAS I F




A27 C. albifrons Captivity URRAS I E


A30 C. albifrons Captivity URRAS II B

A31 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A





A45 S. leucopus 2 Captivity AMVA I F

A46 S. leucopus 2 Captivity AMVA I C


A53 S. leucopus 5 Captivity URRAS II A



A58a S. leucopus 5 Captivity URRAS I F

A58b S. leucopus 5 Captivity URRAS II B

61 S. leucopus 6 Wild- Puerto Berrío WCS I C

62 S. leucopus 6 Wild- Puerto Berrío WCS I D

Capítulo 2 63

Figuras Capítulo 2

Figure 2.1. The photo is showing the characteristic morphology of P. elegans


basada en PCR

Figure 2.2. SEM of Prosthenorchis elegans. A. Whole detail of the parasite. B. Proboscide of P. elegans

B A

Capítulo 2 65

Figure 2.3 Haplotype network of Prosthenorchis elegans. Network shows the relationships of haplotypes A-F

from a 633 bp of the COI mitochondrial gene, described in the current study from Saguinus leucopus and Cebus

albifrons. Network is based on statistical parsimony. Small, unlabeled circles indicate hypothetical haplotypes

separated by a single nucleotide change from adjacent sequences. Labelled ovals represent distinct haplotypes..


basada en PCR

Figure 2.4. NJ tree for Prosthenorchis elegans isolates obtained from Colombia based on partial cytochrome

oxidase I (COI) sequence using MEGA 2 software. Bootstrap support values are provided

11-A11-1

21-A28-1

11-A14-1

21-A24-1

11-A12-1

16-A61-3

15-A54-1

21-A21-1

11-A04-1

11-A08-1

11-A05-1

12-A46-2

11-A10-1

11-A03-1

11-A13-1

21-A27-1

15-A57-1

21-A22-1

12-A45-2

15-A58a-1

16-A62-3

12-A41-2

21-A15-1

15-A58b-1

21-A19-1

21-A30-1

15-A53-1

12-A31-2

21-A25-1

12-A32-2

21-A20-1

21-A17-1

21-A26-1

12-A34-2

12-A36-2

13-A47-2

21-A16-1

63

63

52

100

Haplogroup I

Haplogroup II

B

A

A

C

D

F

E

Capítulo 2 67

Figure 2.5. Distribution of haplotypes and haplogroups by locality and individuals.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I II I I II I II II I

URRAS URRAS URRAS AMVA AMVA WCS

C. albifrons S. leucopus

1

S. leucopus 5 S. leucopus 2 S. leucopus

3

S. leucopus

6

F

E

D

C

B

A


basada en PCR

Figure 2.6 Graphic abstract

Capítulo 3 69

3. Una alternativa diagnóstica para

Prosthenorchis elegans basada en el gen

mitocondrial COI por medio de una PCR

semi-anidada

Formato: Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia


basada en PCR

Una alternativa diagnóstica para Prosthenorchis elegans. basada en el gen

mitocondrial COI por medio de una PCR semi-anidada

An alternative for the diagnosis of Prosthenorchis elegans based on the mitochondrial

gen COI through a seminested PCR

A.C. Falla4*, C.I. Brieva

5, P. Bloor

6

Resumen

Prosthenorchis elegans es un acantocéfalo que afecta a primates del Nuevo Mundo en

cautiverio y en vida silvestre. El parásito adulto se adhiere al ciego, colon e íleon del

primate causando granulomas inflamatorios, en algunos casos peritonitis y muerte, debido

a contaminación bacteriana secundaria. El ciclo de vida de P. elegans necesita de un

hospedero intermediario, que en cautiverio se sabe que es la cucaracha alemana (Blatella

germanica). Su diagnóstico coprológico no ha sido consistente, ya que frecuentemente

4 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll

45. Bogotá-Colombia 5 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 cll

45. Bogotá-Colombia 6 Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-Colombia

*Autor para correspondencia. [email protected]

Capítulo 3 71

mueren individuos con altas cargas parasitarias y coprológicos negativos. El objetivo de

este estudio es avanzar en el desarrollo de una prueba diagnóstica por PCR para P. elegans

en materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris). Se trabajó con muestras de parásitos

provenientes de S. leucopus y Cebus albifrons (mono cariblanco), así como muestras de

materia fecal de titi gris. Los parásitos se utilizaron previamente para obtener la secuencia

de citocromo oxidasa subunidad I (COI) (Capítulo 2). Las secuencias se alinearon para

diseñar primers específicos, los cuales fueron probados en el parásito y en muestras de

materia fecal procedentes de 25 individuos de Saguinus leucopus. El protocolo descrito

permitió la detección más eficiente de P. elegans comparada con otras técnicas

diagnósticas. El desarrollo de la prueba traerá grandes beneficios para las especies de

primates afectadas y su conservación, mejorando el diagnóstico y el seguimiento

terapéutico. Además abrirá las puertas a varias investigaciones ecológicas,

epidemiológicas y farmacológicas.

Palabras clave: Acantocéfalos, endoparásito, diagnostico, PCR, Saguinus leucopus

Abstract

Prosthenorchis elegans is an acanthocephalan affecting captive and wild New World

Primates. The adult worm attaches to cecum, colon and ileon causing inflammatory

granuloms, in some cases peritonitis and death, due to secondary bacterial contamination.

The life cycle of P. elegans needs an intermediate host, known in captivity to be the

german cockroach (Blatella germanica). Coprologic diagnosis has been difficult and


basada en PCR

unreliable, since individuals often die with high numbers of parasites and negative

coprologics. The goals of this study was to develop a diagnostic test based on PCR for P.

elegans in fecal material of Saguinus leucopus (white footed tamarin) based on previously

obtained partial mitochondrial COI gene sequence. Sequences of COI (chapter 2) were

aligned with available sequences for other acanthocephalan and species-specific primers

designed. Primers were tested in 25 fecal samples from S. leucopus using semi-nested

PCR. The current protocol allowed more effective noninvasive detection of the presence

of P. elegans compared with more traditional techniques. The development of this test will

bring great benefits to species of primates affected by this parasite, improving the

diagnosis and the therapeutic monitoring. Furthermore, this test will open the doors to

further research into aspects of ecology, epidemiology and pharmacology.

3.1 Introducción

Actualmente se han desarrollado pruebas diagnósticas basadas en la técnica de la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de parásitos de importancia en salud

pública y para la producción pecuaria, demostrando así, las ventajas de la PCR sobre la

microscopía convencional (Carneiro et ál. 2013, ten Hove et ál. 2007) y sobre el

inmunodiagnóstico (Ndao 2009), ya que no depende de la inmunocompetencia del

hospedero ni de la presentación histórica de la enfermedad. La exploración de pruebas

basadas en PCR puede ser de utilidad para el manejo de animales silvestres en cautiverio y

para planes de conservación que involucren protocolos médicos para liberación y

Capítulo 3 73

reintroducción (Almberg et ál. 2012); así como para la detección de patógenos en vida

silvestre, y para la epidemiología y ecología de las infecciones en vida libre.

Prosthenorchis elegans es un parásito que tiene implicaciones para la conservación de

especies de callitrícidos amenazados de extinción como Leontopithecus rosalia (tamarino

león dorado) de Brasil (Dos Santos et ál. 2010) y Saguinus leucopus (titi gris) de

Colombia (Perez et ál. 2007), entre otros. Lo anterior, debido a que causa altas

mortalidades en cautiverio, posiblemente asociado al estrés generado por situaciones como

el tráfico de fauna y el hacinamiento en centros de rescate (Jimenez 2009), todo ello

potenciado con la presencia del hospedero intermediario, la cucaracha alemana (Blatella

germanica), necesaria para cumplir el ciclo de vida del parásito, siendo común encontrarla

en condiciones de cautiverio. El problema reportado para Prosthenorchis radica en su

difícil diagnóstico, puesto que los animales mueren con altas cargas parasitarias, que no

han sido detectadas por los métodos rutinarios de coprológico. Igualmente, el reporte de

tratamientos farmacológicos no ha sido consistente, y los parásitos tienen que ser extraídos

quirúrgicamente, cuando logran detectarse nódulos a la palpación abdominal (Perez et ál.

2008).

De acuerdo al conocimiento del autor, no existen reportes en la literatura acerca de

aspectos genéticos para Prosthenorchis sp. El aislamiento y caracterización de la

secuencia específica de Prosthenorchis constituye un gran avance para comenzar a


basada en PCR

explorar alternativas para el área diagnóstica (capítulo 2). Los estudios genéticos para

otros acantocéfalos se han centrado más en estudios filogenéticos y de caracterización

molecular (García-Varela and Nadler 2005, García-Varela et ál. 2011, García-Varela et ál.

2005, García-Varela and González-Oliver 2008, García-Varela et ál. 2012, García-Varela

et ál. 2002), que en su potencial diagnóstico. Recientemente, Alcantar-Escalera et ál.

(2013) logró relacionar los cistacantos y parásitos adultos de Polymorphus brevis, sin

embargo es poco usual utilizar estudios con propósitos diagnósticos.

Si se observa más a fondo lo que pasa con Prosthenorchis, su hallazgo tanto en vida

silvestre como en cautiverio y la diferente patogenicidad que se evidencia en esos

ambientes, surgen una gran cantidad de interrogantes en torno al papel que está jugando el

parásito en poblaciones naturales y las implicaciones que puede traer la liberación de

primates con cargas parasitarias caracterizadas por amplia diversidad genética (capítulo 2).

Por otro lado, al evaluar caso a caso especies en peligro de extinción, en donde muchas

veces la pérdida de hábitat hace que se concentren densidades más altas de individuos en

fragmentos pequeños, como el caso de Saguinus leucopus (Roncancio et ál. 2011), vale la

pena investigar lo que sucede con las poblaciones de parásitos, ya que está reportado que

dichas condiciones podrían afectar la reproducción de sus hospederos y en caso de ocurrir

mortalidad, podrían incluso causar la extinción de las especies (Pérez et ál. 2006).

Capítulo 3 75

En este estudio se propone una alternativa diagnóstica para la detección de P. elegans en

materia fecal, a través de la implementación de una PCR semi-anidada basada en la

amplificación de un fragmento específico de citocromo oxidasa subunidad 1 (COI).

3.2 Metodología

La prueba consistió en una PCR semi-anidada en extracciones de ADN de parásitos

adultos y de materia fecal de monos titi gris (Saguinus leucopus), en donde se diseñaron

tres primers específicos. Los dos primeros primers sirvieron para amplificar un

fragmento externo "outer" de COI, para utilizarlo como templete de una segunda

amplificación. En la amplificación semi-anidada se utilizó el mismo primer de inicio de la

amplificación anterior con un tercer primer para obtener un fragmento interno "inner" más

corto de COI.

3.2.1 Diseño de los primers

Para el diseño de los primers se utilizaron 37 secuencias de parásitos adultos de

Prosthenorchis elegans, identificados morfológicamente de acuerdo a Machado Filho

1950. Las secuencias correspondían a un fragmento parcial del gen mitocondrial COI,

caracterizadas en Falla et ál (capítulo 2). Se identificaron los sitios más conservados entre

las secuencias obtenidas de P. elegans y se realizaron alineamientos con secuencias de

otros parásitos acantocéfalos cercanos de acuerdo a GenBank, como Oncicola sp.,

Macracanthorhynchus_ingens, Macracanthorhynchus hirudinaceus, Mediorhynchus


basada en PCR

gallinarum, Mediorhynchus sp., Moniliformis sp., Oligacanthorhynchus sp., identificando

polimorfismos específicos a P. elegans. Se utilizó el programa Primer3 (Rozen and

Skaletsky 2000, Untergasser et ál. 2012) para diseñar primers que amplificaran regiones

cortas (entre 120 a 200 pb). Se seleccionaron los primers ProsCOI_L1: 5’-GTT TTG GTT

ATT ACC AGT GTC CA-3’, ProsCOI_H1: 5’-CGA AGC TAA CAC AGA AGA AAC

C-3’ y ProsCOI_H2: 5’-TCT CAA ATC TCA CCC CCA TA-3’, con el fin de realizar una

PCR semi-anidada. Un fragmento “outer” de 236 pb fue amplificado con los primers

ProsCOI_L1 y ProsCOI_H2. Un fragmento “inner” de 178 pb fue amplificado con los

primers ProsCOI_L1 y ProsCOI_H1. Todos los primers fueron seleccionados por ser

específicos para Prosthenorchis elegans en el extremo 3’ pero diferentes con lo que

respecta a otras especies. También se modificó el primer ProsCOI_H2 para generar otra

alternativa con menor temperatura de anillamiento: ProsCOI_H2.1: 5’-TCA AAT CTC

ACC CCC ATA-3’ (Figura 3.1) .

3.2 .2 Extracción de ADN a partir de parásitos

Se realizaron extracciones de ADN de ocho parásitos con el método de sílice

guanidina/tiocianato (Boom et ál 1990), seis de ellos habían sido previamente utilizados

para la obtención de la secuencia de P. elegans. Así mismo, se utilizaron extracciones de

ADN de siete parásitos, previamente utilizados para la caracterización de la secuencia

(capítulo 2), los cuales fueron utilizados como controles positivos en las diferentes

pruebas y están identificados con la letra "A" en la Tabla 3.1.

Capítulo 3 77

3.2.3. Materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris) utilizada para la prueba

Con el objetivo de evaluar los primers en materia fecal se utilizaron muestras de 25

individuos de Saguinus leucopus, 13 muestras de materia fecal procedentes de animales de

vida silvestre y 12 muestras de animales de cautiverio (Tabla 3.2). Las muestras fueron

remitidas en etanol absoluto (una parte de la muestra por nueve partes de etanol absoluto)

y correspondían a materia fecal en 14 casos y a lavados rectales en 11 casos (Tabla 3.2).

El protocolo de muestreo de los lavados rectales consistió en instilar 10 ml de solución

salina vía sonda rectal y recuperar el volumen, diluyéndolo luego en etanol absoluto 1:10,

este protocolo fue utilizado cuando la materia fecal no pudo obtenerse fresca, dado el

nerviosismo de la especie en los animales de cautiverio y la dificultad de obtener muestras

en el caso de animales de vida silvestre. Las muestras fecales en cautiverio fueron tomadas

por el autor y las muestras en vida silvestre fueron remitidas por Wildlife Conservation

Society (WCS). Las muestras se recolectaron durante los años 2011 a 2013 y fueron

almacenadas a -20°C hasta su análisis.

De las 25 muestras de materia fecal, se seleccionaron 10 muestras que eran positivas, ya

sea por coprológico, necropsia e histopatología; 6 sospechosas de tener Prosthenorchis, ya

que los primates presentaron nódulos a la palpación abdominal pero habían sido negativas

al coprológico; y 9 muestras negativas al parásito por examen coprológico (Tabla 3.3).

Las muestras positivas correspondieron a individuos silvestres, de las cuales seis fueron


basada en PCR

positivas por coprológico, una por necropsia, una por histopatología y dos positivas por

necropsia e histopatología, procedentes de individuos que murieron después de la captura.

3.2.4. Extracción de ADN de materia fecal

Para la extracción de ADN de materia fecal se tomó una porción de 3 mm

aproximadamente y de los lavados rectales se tomó parte del sedimento. Todas las

muestras de materia fecal fueron extraídas por el método de sílice/guanidina tiocianato

(Boom et ál. 1990). Para el protocolo de sílice/guanidina tiocianato se usó el buffer de

unión (GuSCN 5 M, NaCl 25 mM and Tris 50 mM) y suspensión de sílice (Sigma-Aldrich,

tamaño de partícula 0.5 a 10 micrones), incubados por 3 horas a temperatura ambiente o

por una hora a 55°C y centrifugados a 15,000 rpm por 2 min para formar un sedimento

(pellet) de sílice. Se removió el sobrenadante y el pellet de sílice fue lavado dos veces

usando buffer (ethanol 50% v / v, NaCl 125 mM, EDTA 1 mM, y Tris 10 mM). El pellet

de sílice se dejó secar a temperatura ambiente y el ADN fue recuperado usando el buffer

de recuperación (Tris-HCl 10 mM and EDTA pH 9 0.5 mM). Para visualizar las

extracciones se realizaron geles de agarosa al 0,8%.

Se realizaron dos ensayos con el fin de asegurar y ajustar la metodología para la extracción

de ADN de materia fecal, en el primer ensayo se realizó extracción de la totalidad de la

muestra dividida en varias porciones y en el segundo se utilizaron sólo dos extracciones

tomando una parte de la muestra. Para el primer ensayo se escogieron tres muestras: C1

que era una muestra de materia fecal en etanol de un animal con nódulos a la palpación

Capítulo 3 79

abdominal pero negativo a coprológico; C2 que era un lavado rectal en etanol de un animal

positivo a Prosthenorchis sp. por necropsia e histopatología y negativo al coprológico; y

C3 que era una muestra de materia fecal en etanol positiva al examen coprológico. Todas

las muestras tuvieron una extracción positiva en la electroforesis (se observó la presencia

de ADN de alto peso molecular). Se utilizó como control positivo una extracción de ADN

del parásito. Para el segundo ensayo, luego de verificar los resultados del primer ensayo,

se utilizaron solo dos repeticiones de cada muestra, con el fin de eliminar posibles errores

humanos en el procedimiento. De esta forma, se procesaron en total 25 muestras de

materia fecal procedentes de S. leucopus: C1 y C3 (11 repeticiones), C2 (5 repeticiones), y

C4-C25 (2 repeticiones).

3.2.5. PCR y condiciones de la amplificación

Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 35-µL conteniendo 1

× PCR DreamTaq buffer, 2.0 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0.875 U DreamTaq y

0.5 µM de cada primer. Las condiciones del ciclo utilizadas con los primers ProsCOI_L1,

ProsCOI_H2 y ProsCOI_H1 fueron: 2 min a 94ºC seguido por 34 ciclos de 30 s a 94ºC, 30

s a 55ºC, 1 min a 72ºC y 1 min a 72 ºC. También se probó con 0,1 µM de cada primer.

Las condiciones del ciclo utilizadas con los primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H2.1 y

ProsCOI_H1 fueron las ya mencionadas, exceptuando que la temperatura de anidación fue

de 53ºC para el fragmento "outer" y la temperatura de anidación para el fragmento "inner"


basada en PCR

fue de 56 ºC. Se preparó un gel de agarosa al 2% para visualizar los productos de

amplificación, utilizando 5 µL de la muestra.

3.2.6. Evaluación de los primers en los parásitos

Se realizaron diluciones de las extracciones de ADN 1:10, 1:50 y 1:100 y se realizaron

amplificaciones utilizando los primers diseñados. Los controles positivos utilizados

fueron extracciones de ADN de adultos de P. elegans previamente secuenciadas (capítulo

2). Los controles negativos consistieron en la adición de agua en lugar de ADN. Se

realizaron pruebas con los primers de forma independiente y con los primers de forma

anidada. Los primers utilizados con los parásitos fueron ProsCOI_L1, ProsCOI_H2 y

ProsCOI_H1.

3.2.7 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus

Se realizaron amplificaciones con el ADN extraído de las heces de Saguinus leucopus, los

primers se probaron de forma independiente y luego se realizó la amplificación semi-

anidada, con las condiciones de amplificación mencionadas anteriormente. Igualmente, se

realizaron diluciones del ADN de las heces 1:10 y 1:50 y se realizaron múltiples pruebas

para probar las condiciones de la amplificación, incluyendo controles positivos y

negativos. También se realizaron diluciones de los productos de la amplificación del

fragmento "outer" 1:100 y 1:1000 previa amplificación del fragmento "inner". Se

montaron controles positivos y al menos dos controles negativos en todas las

Capítulo 3 81

amplificaciones. Para visualizar las amplificaciones se realizaron geles de agarosa al 2%,

utilizando 5 µL del producto amplificado. Se seleccionaron al azar 16 amplificaciones, las

cuales fueron sometidas a purificación y secuenciación para confirmar la identidad de los

resultados. Para purificar, se preparó un gel de agarosa al 1,5% con el objetivo de cortar

banda. Las bandas fueron purificadas con columnas de centrifugación (ZimocleanTM,

MinElute©) de acuerdo a las instrucciones. Los productos de PCR purificados fueron

secuenciados usando el Kit terminator BigDye 3.1 (Applied Biosytems) y los productos se

corrieron en un analizador de secuencias automático ABI 3500 Genetic Analyzer (Servicio

de Secuenciación y Análisis Molecular, Instituto de Genética, Universidad Nacional de

Colombia, Bogotá).

3.3 Resultados

3.3.1 Obtención de heces de Saguinus leucopus

Para el desarrollo de la prueba se escogieron muestras que habían sido positivas o

sospechosas de tener Prosthenorchis sp. y muestras negativas desde el punto de vista de

sintomatología y coprológico con resultados negativos (Tabla 3.3), incluyendo muestras

de todas las localidades para cautiverio y vida silvestre utilizadas para este estudio. De

esta forma se obtuvo también una representación por sexo que resultó ser equitativa para el

estado de desarrollo biológico adulto y juvenil. Se procesaron muestras de cuatro centros

de rescate y tres localidades de vida silvestre, logrando representar tres de los cuatro

departamentos en los cuales está distribuido el titi gris en forma natural (Figura 3.2).


basada en PCR

3.3.2 Extracción de ADN de materia fecal

Se logró visualizar la extracción de las 25 muestras procesadas, sin importar el tipo de

muestra, el tiempo de haber sido colectadas o la metodología empleada en este estudio

para la extracción. En el ensayo inicial, en donde se trató de extraer la mayor cantidad de

ADN posible por medio de gran cantidad de repeticiones de la misma muestra, se

obtuvieron unas buenas extracciones (Figura 3.3), que al compararlas con el control

positivo mostraban el mismo tamaño de banda obtenido para el parásito. El siguiente

ensayo, utilizó solamente una parte de la muestra utilizando dos repeticiones de cada

muestra y se logró visualizar en el gel, al menos una de las repeticiones. Las únicas

muestras en las que no se visualizó extracción para ninguna de las repeticiones en los geles

fueron la C9 y la C18.

3.3.3 Evaluación de los primers en los parásitos

La evaluación inicial en los parásitos permitió probar los primers, así como detectar

algunos inconvenientes antes de probar el procedimiento en materia fecal. De las

diluciones realizadas del ADN del parásito, la única que no salió a la amplificación fue la

dilución 1:100 (datos no mostrados), por lo que indistintamente se probó con el ADN puro

o las otras dos diluciones (1:10 y 1:50). Inicialmente se realizó la prueba amplificando

cada uno de los fragmentos y luego se realizó la PCR semi-anidada con las extracciones

del parásito. En la tabla 3.4 se pueden observar los resultados que se obtuvieron para las

diferentes pruebas efectuadas con los parásitos, evidenciando en general resultados

positivos, especialmente con el fragmento "inner" y en la PCR semi-anidada. Se presentó

Capítulo 3 83

una contaminación en el control negativo del primer "outer" posiblemente porque el

laboratorio y las pipetas se encontraban en mantenimiento, y se realizó en una misma sala

el Post-PCR y la preparación de PCR, que para la prueba semi-anidada requería trabajar

con los productos de la primera amplificación en una sala separada. Para corregir la

contaminación, se desecharon todas las alícuotas del proceso, se utilizaron puntas con

filtro y se trabajó en sala separada, con cambio constante de guantes. Sin embargo el

primer reverso del fragmento "outer" apareció contaminado en varias amplificaciones y

utilizando diferentes alícuotas del mismo, por lo que se solicitaron nuevos primers. Se

observó la presencia de primer dimer en las amplificaciones iniciales, los cuales dejaron

de ser observados al disminuir la cantidad de primer de la mezcla maestra de 0,5 µM a 0,1

µM. Adicionalmente se presentaron dos bandas en la amplificación semi-anidada, lo que

hizo necesario probar diluciones 1:100 y 1:1000 de los productos de amplificación del

fragmento grande, estandarizando una dilución de 1:1000 del producto de amplificación

inicial.

3.3.4 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus

Para la amplificación de ADN en materia fecal se probaron los primers ProsCOI_L1 (L1)-

ProsCOI_H2 H2) para el fragmento "outer" y ProsCOI_L1 (L1)- ProsCOI_H1(H1) para el

fragmento "inner", de forma independiente. Solamente se tuvieron en cuenta aquellas

pruebas en los que los controles negativos y positivos validaron la prueba, obteniendo solo

cinco muestras positivas, dos muestras para el fragmento "outer" (C14 y C15) y tres

muestras para el fragmento "inner" (C1, C2 y C3).


basada en PCR

Se realizó la PCR semi-anidada, tomando los productos de amplificación del fragmento

"outer" de 236 pb (L1-H2) y sometiéndolo a una nueva amplificación (L1-H1). Se probó

con el producto puro y con diluciones 1:100 y 1:1000. Además se probaron las muestras

C1, C2 y C3, que teniendo en cuenta el tipo de muestra y las consideraciones expuestas en

la tabla 3.3, es posible que tuvieran diferentes concentraciones de ADN del parásito. Para

las muestras C1, materia fecal procedente de un animal con nódulos a la palpación

abdominal, se obtuvieron bandas más fuertes que para las otras muestras, siendo las

diluciones 1:1000 las más recomendadas para evitar bandas dobles o manchas (Figura 3.4).

En esta ocasión no se obtuvo primer dimer, por lo que la concentración de 0,1 µM se

considera apropiada. Con el resto de extracciones de ADN (C4-C25) se realizó la primera

amplificación para el fragmento "outer", luego se hicieron diluciones 1:1000 del producto

de amplificación y se realizó la PCR del fragmento "inner". Solamente se obtuvo una

muestra negativa (C19) en las dos repeticiones, lo cual fue comprobado con el nuevo

conjunto de primers ProsCOI_L1(L1), ProsCOI_H2.1(H2.1) y ProsCOI_H1(H1) en

donde se pudo verificar la repetibilidad de las pruebas (Tabla 3.5). En la figura 3.5 se

puede observar un ejemplo de la PCR semi-anidada con los nuevos primers. Se enviaron a

secuenciar 16 muestras purificadas cortando banda, como se describe en la metodología,

para verificar la identidad de los resultados, confirmando P. elegans en todas las

secuencias. Por medio de la prueba se pudo confirmar la sospecha (nódulos a la

palpación) de P. elegans en seis casos, confirmar los resultados de coprológico, necropsia

e histopatología en 10 casos, y encontrar falsos negativos en 8 casos de los evaluados. De

esta forma, solamente una de las 25 muestras analizadas tuvo un resultado negativo.

Capítulo 3 85

3.4 Discusión

La materia fecal es considerada uno de las muestras de más difícil extracción de ADN,

principalmente porque se pueden encontrar inhibidores de la PCR debido a efectos

fisicoquímicos y enzimáticos (Wilson 1997). En otros estudios se han utilizado kits como

el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) que usa una combinación de absorción y

desactivación de sustancias inhibitorias (Menghi et ál. 2006, Nonaka et ál. 2009). Sin

embargo, la metodología de sílice/guanidina tiocianato, permitió obtener excelentes

resultados a un costo más bajo, debido a su habilidad de evitar los inhibidores de PCR

(Boom et ál. 1990, Boom et ál. 2000). Por otra parte, las muestras analizadas, llevaban

de dos a tres años desde que se tomaron y se logró extraer ADN, aún cuando en la mayoría

de los estudios utilizan heces frescas (Khademvatan et ál. 2013). Podría ser recomendable

centrifugar las muestras para tomar el sedimento antes de realizar la extracción.

Los primers diseñados, descritos en la metodología, obedecieron a una PCR semi-anidada,

buscando incrementar la sensibilidad y especificidad de una PCR convencional

(McPherson 2000). El segundo set de primers fue más específico, logrando resultados

más limpios y evitando bandas dobles. La PCR semi-anidada incrementó notablemente la

sensibilidad en la detección de P. elegans en todas las pruebas realizadas, con los dos sets

de primers. La alta sensibilidad de la PCR semi-anidada se ha demostrado con otros

parásitos como Taenia solium en donde se compararon los resultados con una prueba de


basada en PCR

oro estándar (Mayta et ál. 2008), que en nuestro caso aún no se tiene. Es importante tener

controles positivos y negativos a la hora de realizar la prueba (Prichard 1997), puesto que

al trabajar con productos amplificados, se corre mayor riesgo de contaminación cruzada

(da Silva et ál. 2013). El problema de contaminación en las PCRs y las posibles formas de

resolverla ha sido objeto de discusión, desde que se reportó por primera vez en 1988 (Borst

et ál. 2004). De acuerdo a las descripciones de Borst et ál. (2004), la contaminación que

se observó en nuestro estudio, una vez superada la contaminación inicial y cambiados los

primers, fue ocasionada por la contaminación de una muestra, ya que no se observó en la

totalidad de las muestras.. Esto puede haber sido generado, en nuestro estudio, porque las

muestras de los controles positivos no fueron diluidas, lo que pudo haber generado una

gran cantidad de amplicones por tratarse de ADN extraído directamente del parásito y

probablemente ocurrió una contaminación hacia la muestra contigua. Son numerosos los

artículos que se encuentran en la literatura para lograr reconocer y resolver los posibles

falsos positivos que se presentan (Neumaier et ál 1998). Literatura reciente describe el uso

de Uracilo-N-Glycosilasa en la PCR anidada, lo cual degrada los amplicones que se han

generado previamente (Sharma et ál. 2013). Aunque la contaminación estuvo presente,

no fue constante en todas las pruebas y la repetibilidad de los resultados junto con la

obtención de controles negativos para el fragmento "inner" son razones suficientes para

descartar una contaminación generalizada. Aunque en las pruebas que se realizaron se

tuvieron todas las precauciones para que no ocurriera la contaminación, se recomienda

adicionalmente trabajar con diluciones del control positivo desde un comienzo, montar un

pequeño número de muestras por prueba y utilizar otras metodologías como la utilización

de un solo tubo o un solo paso (da Silva et ál. 2013). Para los falsos negativos, que

Capítulo 3 87

generalmente ocurren por errores de pipeteo o por inhibición, se recomienda incorporar un

control interno como indicador de la eficiencia de la reacción (Ballagi-Pordany and Belak

1996) y realizar dos repeticiones por muestra, desde la extracción hasta la amplificación

anidada. Sin embargo la repetibilidad de los resultados y la obtención de controles

negativos en cada prueba son importantes para valorar la especificidad de los primers.

El registro de primer dimer en las amplificaciones iniciales, pudo deberse al exceso de

primer (McPherson 2000), lo cual fue confirmado con la desaparición de estos al disminuir

la cantidad de primer de 0,5 µM a 0,1 µM. Para el fragmento "outer" las bandas

obtenidas fueron muy tenues, posiblemente debido a que había muy poco ADN o estaba

contaminado con inhibidores. Se esperaba obtener resultados negativos de las muestra

C17 a la C25, ya que no presentaron signos clínicos compatibles con Prosthenorchis sp.,

ni hallazgos de laboratorio positivos, lo que demuestra la alta sensibilidad de la prueba

para detectar bajas cantidades de ADN (Mens et ál. 2007).

En este estudio se evidencia la presencia de P. elegans en vida libre en Colombia, en las

localidades de Puerto Berrío-Antioquia, Norcasia-Caldas y Puerto Rico-Bolivar. Es

necesario evaluar localidades de Tolima, para revisar la presencia del parásito en su área

de distribución (Roncancio N. et ál. 2013). Igualmente, las muestras analizadas

procedentes de cautiverio representan a cuatro centros de rescate distribuidos en Medellín,

Caldas y Bogotá, demostrando la distribución amplia del parásito. La alta presencia de P.


basada en PCR

elegans en dos centros de rescate en Bogotá son el reflejo del tráfico de fauna que se vive

con la especie, en donde los titi gris son trasladados desde sus zonas naturales hacia estos

centros, pasando por varios eventos estresantes y por escenarios en donde pueden estar

adquiriendo éste y otros patógenos.

Se demostró la alta sensibilidad de la prueba al detectar Prosthenorchis elegans en materia

fecal que había sido negativa al coprológico y en cuyos animales no se detectó ningún

signo clínico característico de Prosthenorchis. Igualmente se confirmaron casos de

nódulos a la palpación abdominal que habían salido negativos al coprológico. La

sensibilidad también se demostró en la capacidad de la prueba para detectar ADN de tejido

del parásito o de los huevos en lavados rectales, en los cuales, en condiciones de cargas

parasitarias bajas, sería probablemente imposible detectarlo en un coprológico. Aunque

no se corrieron ensayos con otros parásitos (Dinkel et ál. 1998), se sabe que algunas de las

muestras habían sido positivas a Strongyloides sp. en el examen coprológico, demostrando

así la especificidad de la prueba.

3.5 Conclusiones

El presente estudio, muestra una alternativa diagnóstica explorada por primera vez para

Prosthenorchis sp. y constituye una línea base para encaminar más investigaciones en

torno al perfeccionamiento de la prueba como diagnóstico. Con los resultados obtenidos

Capítulo 3 89

se confirma la presencia de Prosthenorchis elegans en cautiverio y en vida libre en la

especie titi gris (Saguinus leucopus).

Sería importante establecer el punto de corte en el que la prueba es sensible, tanto con

huevos como con tejido parasitario. Así mismo, estudiar los diferentes estadios de ciclo de

vida del parásito, para establecer su sensibilidad diagnóstica y estudiar los métodos de

transmisión. Se recomienda ampliar el número de muestras y probar con materia fecal

procedente de otras especies. Adicionalmente, es recomendable incorporar en la

metodología medidas para evitar la contaminación cruzada.

Esta prueba no solamente constituye un gran avance para el diagnóstico de la enfermedad

en Saguinus leucopus, sino que abre un gran campo de investigación para probar en

muestras de otros primates y en los hospederos intermediarios. El ciclo de vida del

parásito podrá ser esclarecido con mayor propiedad, no solamente en cautiverio sino en

vida silvestre, dilucidando de esta forma los interrogantes en la ecología del parásito. Esta

prueba constituye una gran herramienta para poder ahondar en las implicaciones de la

infección por Prosthenorchis elegans e investigar sobre perspectivas terapéuticas y de

control. Igualmente, sería importante encaminar estudios epidemiológicos

correlacionando los fragmentos de bosque donde habita el primate con asentamientos

humanos y hospederos intermediarios. Con el desarrollo de esta prueba se ven

beneficiados primates altamente amenazados de Colombia y otros países de Centro y Sur

América, al poder complementar los protocolos y planes de conservación encaminados a

preservar las especies y su ecosistema.


basada en PCR

Agradecimientos

Este proyecto contó con el apoyo y financiación del Contrato 09F y 39 de FONAM,

Universidad Nacional de Colombia y Wildlife Conservation Society y del Programa

Internacional de Conservación de Saguinus leucopus (EAZA y ACOPAZOA). Especiales

agradecimientos al Centro de Atención y Valoración del AMVA, al CAFS de la Fundación

Zoológica de Cali, al CRFSOC de CORPOCALDAS, al CRFFS de la Secretaría Distrital

de Ambiente y a la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres de la

Universidad Nacional de Colombia por el envío de parásitos y la colaboración en la toma

de las muestras de materia fecal. Igualmente, a Wildlife Conservation Society por el envío

de las muestras de vida silvestre.

Referencias

Alcantar-Escalera FJ, García-Varela M, Vazquez-Dominguez E, Perez-Ponce de Leon G. 2013.

Using DNA barcoding to link cystacanths and adults of the acanthocephalan Polymorphus brevis

in central Mexico. Mol Ecol Resour. 13: 1116-1124.

Almberg ES, Cross PC, Dobson AP, Smith DW, Hudson PJ. 2012. Parasite invasion following

host reintroduction: a case study of Yellowstone's wolves. Philos Trans R Soc Lond B Biol

Sci. Oct 19; 367(1604):2840-51.

Ballagi-Pordany A, Belak S. 1996. The use of mimics as internal standards to avoid false negatives

in diagnostic PCR. Mol Cell Probes. 10: 159-164.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22966139

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22966139

Capítulo 3 91

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. 1990.

Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28: 495-503.

Boom R, Sol C, Weel J, Lettinga K, Gerrits Y, van Breda A, Wertheim-Van Dillen P. 2000.

Detection and quantitation of human cytomegalovirus DNA in faeces. J Virol Methods. 84: 1-14.

Borst A, Box AT, Fluit AC. 2004. False-positive results and contamination in nucleic acid

amplification assays: suggestions for a prevent and destroy strategy. Eur J Clin Microbiol Infect

Dis. 23: 289-299.

Carneiro TR, Peralta RHS, Pinheiro MCC, Oliveira SMd, Peralta JM, Bezerra FSM. 2013. A

conventional polymerase chain reaction-based method for the diagnosis of human schistosomiasis

in stool samples from individuals in a low-endemicity area. Mem Inst Oswaldo Cruz. 108: 1037-

1044.

da Silva MA, Pedrosa Soares CR, Medeiros RA, Medeiros Z, de Melo FL. 2013. Optimization of

single-tube nested PCR for the diagnosis of visceral leishmaniasis. Exp Parasitol. 134: 206-210.

Dinkel A, von Nickisch-Rosenegk M, Bilger B, Merli M, Lucius R, Romig T. 1998. Detection of

Echinococcus multilocularis in the definitive host: coprodiagnosis by PCR as an alternative to

necropsy. J Clin Microbiol. 36: 1871-1876.

Dos Santos I, Ruiz CR, Santos CP. 2010. Helminths found in marmosets (Callithrix penicillata and

Callithrix jacchus) introduced to the region of occurrence of golden lion tamarins (Leontopithecus

rosalia) in Brazil. Vet Parasitol. 171: 123-129.

García-Varela M, Nadler SA. 2005. Phylogenetic relationships of Palaeacanthocephala

(Acanthocephala) inferred from SSU and LSU rDNA gene sequences. J Parasitol. 91: 1401-1409.

García-Varela M, García-Prieto L, Rodriguez RP. 2011. Molecular identification and first

description of the male of Neoechinorhynchus schmidti (Acanthocephala: Neoechinorhynchidae), a

parasite of Trachemys scripta (Testudines) in Mexico. Parasitol Int. 60: 433-439.


basada en PCR

García-Varela M, Aznar FJ, Perez-Ponce de Leon G, Pinero D, Laclette JP. 2005. Molecular

phylogeny of Corynosoma Luhe, 1904 (Acanthocephala), based on 5.8S and internal transcribed

spacer sequences. J Parasitol. 91: 345-352.

García-Varela M, González-Oliver A. 2008. The Systematic Position of Leptorhynchoides

(Kostylew, 1924) and Pseudoleptorhynchoides (Salgado-Maldonado, 1976), Inferred From Nuclear

and Mitochondrial DNA Gene Sequences. J Parasitol. 94: 959-962.

García-Varela M, Aznar FJ, Rodríguez RP, Pérez-Ponce de León G. 2012. Genetic and

Morphological Characterization of Southwellina hispida Van Cleave, 1925 (Acanthocephala:

Polymorphidae), a Parasite of Fish-Eating Birds. Comp Parasitol. 79: 192-201.

García-Varela M, Cummings MP, Pérez-Ponce de León G, Gardner SL, Laclette JP. 2002.

Phylogenetic analysis based on 18S ribosomal RNA gene sequences supports the existence of class

polyacanthocephala (acanthocephala). Mol Phylogenet Evol. 23: 288-292.

Jimenez LD. 2009. Identificación de parásitos gastrointestinales en monos "Titi gris"

(Saguinus leucopus) del Centro de Rehabilitación de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas

(CRFSOC). [Tesis de Pregrado]. [Bogotá-Colombia] Universidad Nacional de Colombia.

Khademvatan S, Rahim F, Tavalla M, Abdizadeh R, Hashemitabar M. 2013. PCR-based molecular

characterization of Toxocara spp. using feces of stray cats: a study from Southwest Iran. PLoS One

8: e65293.

Machado Filho DA. 1950. Revisão do gênero Prosthenorchis Travassos, 1915

(Acanthocephala). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 1950. p. 495-545.

Mayta H, Gilman RH, Prendergast E, Castillo JP, Tinoco YO, García HH, Gonzalez AE, Sterling

CR. 2008. Nested PCR for specific diagnosis of Taenia solium taeniasis. J Clin Microbiol. 46:

286-289.

McPherson MJ, Moller SG. 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford, UK. 288 p.

Capítulo 3 93

Menghi CI, Gatta CL, Makiya R, Cesar Méndez O. 2006. Detección molecular de Dientamoeba

fragilis en heces: eliminación de los inhibidores de la DNA polimerasa. Parasitol latinoam. 61:

146-151.

Mens P, Spieker N, Omar S, Heijnen M, Schallig H, Kager PA. 2007. Is molecular biology the best

alternative for diagnosis of malaria to microscopy? A comparison between microscopy, antigen

detection and molecular tests in rural Kenya and urban Tanzania. Trop Med Int Health. 12: 238-

244.

Ndao M. 2009. Diagnosis of Parasitic Diseases: Old and New Approaches. Interdiscip Persp Infect

Dis. 2009: 15.

Neumaier M, Braun A, Wagener C, Molecular. 1998. Fundamentals of quality assessment of

molecular amplification methods in clinical diagnostics. Clin Chem. 44: 12-26.

Nonaka N, Sano T, Inoue T, Teresa Armua M, Fukui D, Katakura K, Oku Y. 2009. Multiplex PCR

system for identifying the carnivore origins of faeces for an epidemiological study on

Echinococcus multilocularis in Hokkaido, Japan. Parasitol Res. 106: 75-83.

Perez J, Ramirez DM, Hernandez CA. 2007. Prosthenorchis sp. en tities grises (Saguinus

leucopus). Revisión de tema. CES Med Vet Zootec. 2: 51-57.

Perez J, Ramirez M, Hernandez CA. 2008. Remoción quirúrgica del parásito intestinal

Prosthenorchis sp. en un mono titi gris (Saguinus leucopus) en cautiverio. Rev Colomb Cienc Pec.

21: 608-613.

Pérez J, Meneguz P, Dematteis A, Rossi L, Serrano E. 2006. Parasites and Conservation Biology:

The ‘Ibex-Ecosystem’. Biodivers Conserv. 15: 2033-2047.

Prichard R. 1997. Application of molecular biology in veterinary parasitology. Vet Parasitol. 71:

155-175.

Roncancio N, Acosta A, García L, Ríos C. 2013. Distribución potencial y disponibilidad de hábitat

del


basada en PCR

tití gris (Saguinus leucopus): un primate endémico de Colombia y en peligro de extinción. In:

Defler T, Stevenson P, Bueno M, Guzman C, eds. Primates Colombianos en Peligro de Extinción.

Bogotá, Colombia: Asociación Primatológica Colombiana. p. 217-234

Roncancio NJ, Rojas W, Defler T. 2011. Densidad poblacional de Saguinus leucopus en

remanentes de bosque con diferentes características físicas y biológicas. Mastozool neotrop. 18:

105-117.

Rozen S, Skaletsky H. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist

programmers. Methods Mol Biol. 132: 365-386.

Sharma N, Talwar A, Nautiya SC, Kaushik R, Singh A, Singh AP, Shaw JK, Dixit S, Singh RK.

2013. Nested-PCR and Uracil-N-Glycosylase-significant approach to prevent amplicon

contamination in tuberculosis PCR performing laboratories. Arch Appl Scie Res. 5: 177-179.

ten Hove R, Schuurman T, Kooistra M, Möller L, van Lieshout L, Verweij JJ. 2007. Detection of

diarrhoea-causing protozoa in general practice patients in The Netherlands by multiplex real-time

PCR. Clin Microbiol Infec. 13: 1001-1007.

Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG. 2012.

Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40: e115.

Wilson IG. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol.

63: 3741-3751.

Capítulo 3 95

Tablas Capítulo 3

Tabla 3.1. P. elegans utilizados para el desarrollo de la prueba

Institución* Especie ID** Procedencia Ciudad

URRAS S. leucopus 1 B1 Cautiverio Bogotá

URRAS C. albifrons B15 Cautiverio Bogotá

URRAS C. albifrons B21 Cautiverio Bogotá

AMVA S. leucopus 2 B31 Cautiverio Medellín

AMVA S. leucopus 3 B47 Cautiverio Medellín

CAFS S. leucopus 4 B49 Cautiverio Cali

URRAS S. leucopus 5 B55 Cautiverio Bogotá

WCS S. leucopus 6 B60 Vida Silvestre Puerto Berrío-Antioquia

URRAS S. leucopus 1 A2 Cautiverio Bogotá



URRAS S. leucopus 1 A 11 Cautiverio Bogotá



URRAS C.albifrons A19 Cautiverio Bogotá

* URRAS: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres-Universidad

Nacional de Colombia, AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá, CAFS: Centro

de Atención de Fauna Silvestre-Fundación Zoológica de Cali, WCS: Wildlife Conservation

Society

** La letra A corresponde a los controles positivos y la letra B corresponde a las nuevas

extracciones de ADN


basada en PCR

Tabla 3.2. Muestras de materia fecal de Saguinus leucopus utilizadas para el desarrollo de

la prueba

ID Marca Año

Colecta Edad Sexo Procedencia Localidad Departamento Origen

Coordenadas Muestra

* N W

26 C2 2013 Adulto Macho WCS Puerto Berrío

Antioquia Vida

Silvestre 06º33'20,2

" 074º35'0,4" LR


Antioquia Vida

Silvestre 06°31'47,9

" 074°34'43,6

" MF

13 C9 2012 Juvenil Hembra WCS Norcasia Caldas Vida


" 074°45'04,8

" MF**

23 C10 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Berrío

Antioquia Vida


" 074º35'0,4" LR


Antioquia Vida


" 074º35'0,4" LR


Antioquia Vida


" 074º35'0,4" MF

33 C13 2013 Juvenil Hembra WCS Puerto Berrío

Antioquia Vida


" 074°34'43,6

" LR

42 C14 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Rico Bolivar Vida


" 074°12'03,8

" MF


Antioquia Vida


" 074°34'43,6

" MF

43 C16 2013 Adulto Macho WCS Puerto Rico Bolivar Vida


" 074°12'03,8

" MF


Antioquia Vida


" 074º35'0,4" LR



" 074°12'03,8

" MF



" 074°12'03,8

" MF

6071 C4 2012 Adulto Hembra URRAS Bogotá Cundinamarc

a Cautiverio

MF

8471 C23 2012 Adulto Macho URRAS Bogotá Cundinamarc

a Cautiverio

LR

9003 C25 2012 Adulto Macho URRAS Bogotá Cundinamarc

a Cautiverio

LR

3783 C8 2012 Adulto Hembra SDA Bogotá Cundinamarc

a Cautiverio

MF

9539 C6 2012 Juvenil Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio

LR

2318 C7 2011 Adulto Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio

MF

4366 C17 2012 Adulto Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio

MF

2237 C22 2012 Adulto Macho CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio

MF

5099 C1 2012 Adulto Macho AMVA Medellín Antioquia Cautiverio

MF

7186 C5 2012 Juvenil Hembra AMVA Medellín Antioquia Cautiverio

LR

6054 C21 2012 Adulto Hembra AMVA Medellín Antioquia Cautiverio

LR

7285 C24 2012 Adulto Macho AMVA Medellín Antioquia Cautiverio

LR

*Los tipos de muestras que se recibieron correspondieron a materia fecal (MF) y lavado

rectal (LR) una parte en nueve partes de etanol

**La muestra venía con muy poco o nada de etanol

Capítulo 3 97

Tabla 3.3. Selección de muestras para evaluar los primers diseñados para Prosthenorchis

elegans

Procedencia Origen ID Prosthenorchis Nódulos a la palpación Coprológico Necropsia Histopatología

Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C10 +

x


X


x X


x

Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C14 +

x


x

Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C16 +

x


x X


x

Norcasia-Caldas Vida Silvestre C9 +

x

AMVA-Medellín Cautiverio C1 ? x

URRAS-Bogotá Cautiverio C4 ? x

AMVA-Medellín Cautiverio C5 ? x

CRFSOC-Caldas Cautiverio C6 ? x

CRFSOC-Caldas Cautiverio C7 ? x

SDA-Bogotá Cautiverio C8 ? x

CRFSOC-Caldas Cautiverio C17 -

Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C18 -

Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C19 -

Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C20 -

AMVA-Medellín Cautiverio C21 -

CRFSOC-Caldas Cautiverio C22 -

URRAS-Bogotá Cautiverio C23 -

AMVA-Medellín Cautiverio C24 -

URRAS-Bogotá Cautiverio C25 -


basada en PCR

Tabla 3.4 Resultados de las pruebas efectuados en los parásitos con los primers diseñados

ID 1

2

3

4

L1H2 L1H1

L1H2 L1H1

L1H2 L1H1

Semi-anidada

B1 Positivo Positivo

Positivo Positivo

Negativo Positivo B15 Positivo Positivo

Positivo Negativo

Negativo Positivo

B21

Negativo Positivo

B31

Positivo Positivo

Positivo

B47

Positivo Negativo

Positivo

B49

Negativo Leve positivo

B55 Negativo Negativo

Positivo Positivo

Negativo Positivo B60

Negativo Positivo

A2 Positivo Positivo

Positivo Positivo A3 Positivo Positivo

Positivo Positivo

A4 Positivo Positivo

Positivo Positivo A 11

A12 A14

Negativo Positivo

Positivo

A19 Leve positivo Positivo Positivo

*El número corresponde a la prueba realizada.

Capítulo 3 99

Tabla 3.5. Resultados de las pruebas semi-anidadas en las muestras de materia fecal

ID L1H2-L1H1

L1H2-L1H1

L1-H2.1-L1H1

L1-H2.1-L1H1

Diagnóstico previo*

Tipo de muestra Procedencia

C1

Positivo Positivo Sospechoso MF AMVA-Medellín

C2 Positivo

Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-

Antioquia

C3 Positivo

Positivo Positivo Positivo MF Puerto Berrío-

Antioquia

C4

Positivo Positivo

Sospechoso MF URRAS-Bogotá

C5

Positivo Positivo Positivo Sospechoso LR AMVA-Medellín

C6

Positivo Positivo

Sospechoso LR CRFSOC-Caldas

C7

Positivo Positivo Positivo Sospechoso MF CRFSOC-Caldas

C8

Positivo Positivo

Sospechoso MF SDA-Bogotá

C9

Positivo Positivo

Positivo MF Norcasia-Caldas

C10

Positivo Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-

Antioquia

C11

Positivo Positivo

Positivo LR Puerto Berrío-

Antioquia

C12

Positivo Positivo Positivo Positivo MF Puerto Berrío-

Antioquia

C13

Positivo Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-

Antioquia

C14

Positivo Positivo Positivo Positivo MF Puerto Rico-Bolivar

C15

Positivo Positivo

Positivo MF Puerto Berrío-

Antioquia

C16

Positivo Positivo

Positivo MF Puerto Rico-Bolivar

C17

Positivo Positivo Positivo Negativo MF CRFSOC-Caldas

C18**

Positivo Positivo Positivo Negativo LR

Puerto Berrío-Antioquia

C19

Negativo Negativo Negativo Negativo MF Puerto Rico-Bolivar

C20

Positivo Negativo Positivo Negativo MF Puerto Rico-Bolivar

C21

Positivo Positivo Positivo Negativo LR AMVA-Medellín

C22

Positivo Positivo Positivo Negativo MF CRFSOC-Caldas

C23

Positivo Positivo Positivo Negativo LR URRAS-Bogotá

C24

Positivo Positivo Positivo Negativo LR AMVA-Medellín

C25

Positivo Positivo Positivo Negativo LR URRAS-Bogotá

*Diagnóstico previo: Positivo (coprológico, necropsia y/o histopatología), sospechoso (nódulos a la palpación

abdominal) y negativo si no había indicio de tener Prosthenorchis.

**La muestra C18 fue positiva a Strongyloides sp.


basada en PCR

Figuras Capítulo 3

Figura 3.1. Diseño de primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H1 y ProsCOI_H2

ProsCOI_L1 ----GTTTTGGTTATTACCAGTGTCCA-----------------------

ProsCOI_H1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------

Prosthenorchis_elegans_004E7_1 TTAGGTTTTGGTTATTACCAGTGTCCATGGTGTTTCTAATAGTCTCTATG

Prosthenorchis_elegans_004WO_1 TTAGGTTTTGGTTATTACCAGTGTCCATGGTGTTTATAATAGTCTCTATG

Oncicola TTAGGTTTTGACTACTTCCAGTTTCTATGACGTTTATAATAATGTCCCTG

Macracanthorhynchus_ingens TTAGGTTTTGATTACTTCCTATCTCATTGGTCTTTTTGATGCTATCTATG

Macracanthorhynchus_hirudinace TTAGATTTTGGTTACTTCCTACTTCGTTGATGTTTTTGATGGTGTCTATG

Mediorhynchus_gallinarum TTAGATTCTGGTTATTGCCTTGTTCATTGGTATTGATGATAATATCTATG

Mediorhynchus_sp. TTAGATTTTGATTGTTACCTGTGGCTTTAGGGTTATTATTAATATCAATA

Moniliformis TTAGGTTTTGGCTCCTTCCAGCATCATTGGCGGTTTTTTTAGCATCTTTG

Mediorhynchus TTAGTTTTTGATTACTTCCTATTTCTTTGGTTATTATAGTTATATCTATG

Oligacanthorhynchus TTAGATTCTGACTACTTCCCGTATCATTGGTGATGTTCACTCTGTCTGTA

ProsCOI_L1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------

Prosthenorchis_elegans_004E7_1 CTAACAGGTGGGTCTGGTTCTGGGTGGACTATTTATCCTCCTTTGAGTAG

Prosthenorchis_elegans_004WO_1 CTAATAGGTGGGTCTGGTTCTGGGTGGACTATTTATCCTCCTTTGAGTAG

Oncicola ATGATAGGGGGTTCTGGTTCAGGGTGGACTATTTACCCTCCTTTAAGTAG

Macracanthorhynchus_ingens CTTACAGGGGGTGCAGGAACAGGGTGAACTATTTACCCTCCTTTGAGCAC

Macracanthorhynchus_hirudinace TTTGTTGGCGGAGCTGGGACCGGGTGAACTATCTATCCTCCACTGAGTAG

Mediorhynchus_gallinarum ATTTCAGGTGGTGCTGGTGCTGGGTGGACAATGTATCCTCCATTAAGTGG

Mediorhynchus_sp. GTATCAGGTGGAGCTGGTGCTGGATGAACTATGTATCCTCCGTTAAGGTC

Moniliformis CTTATTGACGGGGCTGCTACAGGATGGACTTTGTATCCTCCCCTAAGGTC

Mediorhynchus CTATCTGGGGGAGCTAGAGCAGGTTGGACAATATATCCTCCTTTGAGGTC

Oligacanthorhynchus CTTGTAGATGGGGCAGGTGCAGGGTGAACTTTTTATCCTCCCTTGAGGGG

ProsCOI_L1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------

Prosthenorchis_elegans_004E7_1 GTGGGCCTATAGAAGTGGGCTGTCTGTGGATTTAATAGTTTTGGCTTTAC

Prosthenorchis_elegans_004WO_1 GTGGGCCTATAGAAGTGGGCTGTCTGTGGATTTAATAGTTTTGGCTTTAC

Oncicola GTGGGTTTATAGAAGTGGAGCATCTGTGGATTTGATGGTTTTAGCCTTAC

Macracanthorhynchus_ingens TAGGATTTACAGGAGAGGGGTGTCTGTAGACTTAATAGTGCTGTCATTAC

Macracanthorhynchus_hirudinace GGGGGAGTTCAGTGGGGGAGTTTCAGTTGATTTTATAGTTTTATCTTTAC

Mediorhynchus_gallinarum CTATGGGTACAGATCTGGAATTTCTATAGATTTGATGGTTTTAGCCCTTC

Mediorhynchus_sp. TTATGGGTTTAGATCTGGGGTTAGTATAGATTTATTGGTCTTATCTTTGC

Moniliformis CTATGGGTTTAGCAGGGGGATTTCTGTTGATCTAATGATCTTGTCCCTCC

Mediorhynchus TTATGGATTTAGATCTGGTGTGTCTATAGATTTAATAATTTTATCTCTTC

Oligacanthorhynchus GGCATCTTTTAGAAGGGGGATTTCAATAGATTTAGCTATTTTATCCCTTC

ProsCOI_L1 --------------------------------------------------

ProsCOI_H1 ----------GGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCG------------------

ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------

Prosthenorchis_elegans_004E7_1 ATGTGGCGGGGGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCGGTGAATTTGGTGTCTACT

Prosthenorchis_elegans_004WO_1 ATGTGGCGGGGGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCGGTGAATTTGGTGTCTACT

Oncicola ATGTGGCGGGTATTTCATCTGTATTAGCTTCTGTGAATCTGATGGCCACT

Macracanthorhynchus_ingens ATGTGGCGGGTTTATCTTCTATTCTTGCCTCTGTTAACATAATTTCTACA

Macracanthorhynchus_hirudinace ATGTAGCTGGGCTTTCTTCTATTTTAGCTTCTGTTAATATGATCTCCACT

Mediorhynchus_gallinarum ATGTAGCAGGTATTTCATCAGTTTTGGCTTCTGTGAATATGATTTCAACT

Mediorhynchus_sp. ATGTGGCAGGTATTTCTTCTGTTCTTGCTTCGGTAAATATAGTATCAACT

Moniliformis ATGTAGCCGGATTGTCATCTATTTTAGCTTCTATTAATATAATATCTACA

Mediorhynchus ATGTAGCTGGGGTGTCTTCTATTTTAGCTTCTGTAAATGTAATCTCTACT

Oligacanthorhynchus ATCTTGCAGGTATTTCTTCTATTTTGGCATCTGTAAACATAATTACCACT

ProsCOI_L1 ---------------------------------------

ProsCOI_H1 ---------------------------------------

ProsCOI_H2.1 --------------------TATGGGGGTGAGATTTGA-

Prosthenorchis_elegans_004E7_1 GTGTGAGGAGCGTGTAAGGATATGGGGGTGAGATTTGAG

Prosthenorchis_elegans_004WO_1 GTGTGAGGGGCGTGTAAGGATATGGGGGTGAGATTTGAG

Oncicola GTATGGGGTGCATGTAGTGATAGTGGGGTAAGTTTTGAG

Macracanthorhynchus_ingens GTTTGGGGAACATATAAAGTTAGAGGTGTGAGTTTTGAA

Macracanthorhynchus_hirudinace GTTTGAGGATGTTGTAAAGCAAATAATATCGGTTTTGAA

Mediorhynchus_gallinarum ATTTGTGGGGTGTACTTTCAAGTAGGGTTGAGCTTTGAG

Mediorhynchus_sp. ATTTGTGGGTCTTATAGTGAGTTCGGTTTACGCTTTGAA

Moniliformis GTATGGGGGGTATATAAAGAGATGGGGGTGAGTGTTGAG

Mediorhynchus ATTTGAGGGGTATTTGCTGAGGCAGGGCTGCGTTTTGAA

Oligacanthorhynchus GTATGGGGGAGGACAGCTGGAATGGGGGTGAGATTAGAG

Capítulo 3 101

Figura 3.2. Muestras de heces de S. leucopus utilizadas para el estudio, distribuidas por

localidad y departamento, de acuerdo a su procedencia.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Medellín Puerto Berrío Puerto Rico Norcasia Victoria Bogotá

Antioquia Bolivar Caldas Cundinamarca

Cautiverio

Vida Silvestre


basada en PCR

Figura 3.3. Extracción de ADN de materia fecal de S. leucopus en las muestras C2 y C3,

mediante el método de sílice/guanidina tiocianato.

Capítulo 3 103

Figura 3.4 PCR semi-anidada probando el producto puro y diluciones 1:100 y 1:1000 del

producto amplificado para el fragmento grande. Se observa doble banda o manchas para

las muestras puras y para algunas de las diluciones 1:100. Concentración del primer 0,1

µM.


basada en PCR

Figura 3.5 Amplificación semi-anidada de materia fecal con el conjunto de primers

nuevos, diluciones 1:000 del producto de amplificación del fragmento de 234 pb y 0,1 µM

de Primer.

B

Conclusiones y Recomendaciones 105

4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones

Al inicio de este trabajo se desconocía la especie de Prosthenorchis en la que se iba a

trabajar, sin embargo, luego de una extensa búsqueda de literatura antigua, se pudo

encontrar una característica morfológica para distinguir entre las dos especies de

Prosthenorchis reportadas para primates: P. elegans y P. spirula, comprobando que

todos los parásitos obtenidos correspondían a P. elegans y que el collar presente entre la

probóscide y el cuerpo del parásito es la forma más fácil de diferenciar morfológicamente

esta especie. Las extracciones de ADN de los parásitos se lograron estandarizar

utilizando el método de sílice tiocianato/guanidina y el método de fenol cloroformo. Sin

embargo, el método de sílice permitió extraer ADN de los parásitos que habían sido

conservados en formol. La problemática para poder llegar a un proceso final de

secuenciación de todas las extracciones realizadas posiblemente fue la forma de

conservación previa a la llegada al laboratorio, puesto que los parásitos fueron

colectados oportunísticamente por las entidades colaboradoras.

Se logró aislar y caracterizar una secuencia parcial de 633 pb de COI en base a 37

secuencias analizadas. Se identificaron 11 sitios variables resultando en seis haplotipos

distintos agrupados en dos haplogrupos diferentes. Los haplotipos y haplogrupos no

estuvieron relacionados con el hospedero definitivo ni con la localización geográfica de

su colecta, sin embargo se logró encontrar una gran diversidad de haplotipos en

Saguinus leucopus y Cebus albifrons en cautiverio. Por el contrario, aunque solamente

se evaluaron dos muestras, en vida silvestre se encontraron dos haplotipos y uno de


basada en PCR

ellos estaba ausente en las poblaciones en cautiverio. Estos resultados, además de que

dejan visualizar las consecuencias del tráfico de fauna, también sugieren que se debe

tener cuidado con las liberaciones de individuos y la diversidad genética del parásito.

Se identificaron polimorfismos específicos para Prosthenorchis elegans que permiten

diferenciarlo de las otras especies de acantocéfalos reportadas en Gen Bank. Gracias a

estos polimorfismos fue posible diseñar primers específicos para el desarrollo de la

prueba. De esta forma, se diseñaron unos primers específicos para el parásito, que

permitieron amplificar el ADN de P. elegans en heces, los cuales fueron modificados en

dos bases para hacer más específica la reacción.

La estandarización de la prueba comenzó desde la extracción de ADN en heces, para

lograr la amplificación del fragmento seleccionado, utilizando un protocolo basado en

sílice guanidina/tiocianato. La prueba consistió en una PCR semi-anidada, en donde la

mezcla maestra tenía una concentración de primers de 0,1 µM y en una primera reacción

se obtuvo un fragmento de 234 pb con una temperatura de anidación de 53°C. Los

productos de esa reacción fueron diluidos 1:1000 y se sometieron a una nueva reacción

con los primers para obtener un fragmento de 178 pb, utilizando la misma concentración

de primers y una temperatura de anidación de 56°C. Se lograron obtener resultados

repetibles en todas las pruebas analizadas, encontrando ausencia del parásito, en solo

una de las 25 muestras analizadas. La prueba fue sensible para detectar ADN en

lavados rectales y muestras tomadas hace más de dos años, superando los resultados

obtenidos por medio de coprológicos.

El campo investigativo que se abre con los resultados aquí reportados, se considera de

gran magnitud para dilucidar muchos de los vacíos en torno a la especie y muchos

interrogantes acá generados. Con la secuencia del parásito y el diseño de los primers

específicos, se podrán realizar pruebas en materia fecal de otras especies de primates,

en posibles hospederos intermediarios en vida libre y en cautiverio, en diferentes

estadios del parásito, con el fin de contribuir a la ecología y epidemiología del parásito

para describir el ciclo de vida de Prosthenorchis elegans, sus hospederos intermediarios

en vida libre y su forma de transmisión. Igualmente, el campo de la medicina se ve

Conclusiones y Recomendaciones 107

beneficiado, presentando una alternativa diagnóstica altamente sensible, clave para

efectuar medidas preventivas y terapéuticas oportunas. Teniendo en cuenta la alta

prevalencia que se presenta en individuos de Saguinus leucopus y otras especies

amenazadas, las implicaciones que tiene para la conservación son de gran beneficio

para las especies afectadas.

4.2 Recomendaciones

Se recomienda obtener más secuencias de parásitos de P. elegans, así como de P.

spirula para profundizar en el estudio de la diversidad genética del parásito. Las

muestras deberían obtenerse tanto de vida libre como en cautiverio, tratando de abarcar

un amplio número de hospederos definitivos y localidades geográficas representativas de

su distribución. Sería muy importante realizar estudios comportamentales en vida libre,

detectando los hospederos intermediarios consumidos y realizando pruebas para

corroborar los artrópodos que están actuando en el ciclo de vida. Igualmente, podrían

aislarse secuencias basadas en otro gen para hacer estudios comparativos con los datos

encontrados.

Es aconsejable explorar otras técnicas de PCR, como la PCR en tiempo real, o incluso la

PCR anidada pero logrando realizar las dos reacciones de amplificación en un mismo

tubo, para no manipular productos de amplificación que puedan estar contaminando las

muestras generando falsos positivos. Se recomienda incorporar un control interno a la

prueba de tal forma, que se verifique la eficacia de la reacción de PCR. Igualmente es

importante realizar pruebas de sensibilidad para establecer el punto de corte en el que la

prueba detecta el ADN. Una vez sea superado el problema de contaminación, se pueden

realizar gran cantidad de estudios de prevalencia del parásito en vida libre y en

cautiverio. Así mismo, correlacionar la diversidad genética con el desarrollo de la prueba,

podría dar luces para estudios de patogenicidad y estudios evolutivos basados en los

parásitos analizados.


basada en PCR

Es importante incorporar estos resultados a los protocolos de liberación de especies

amenazadas, de tal forma que no se intervenga en la diversidad natural de las especies,

lo que puede traer consecuencias para la supervivencia de las especies a largo plazo, al

alterar el equilibrio y la diversidad genética que hay en el parásito, hospederos

intermediarios y hospederos definitivos.

Anexos 109

A. Anexo: Guía para autores capítulo 1 y 3

NSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

ISSN 0120-2952

La Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia publica reportes de caso y

artículos científicos, de revisión y de opinión de todas las áreas de la medicina veterinaria y la

zootecnia.

Para el envío de artículos a consideración del comité editorial de la revista es indispensable

cumplir con los siguientes requisitos:

1. Los artículos deben ser inéditos y no deben haber sido publicados o sometidos a consideración

en otras revistas o publicaciones técnico-científicas (excepto cuando hayan sido publicados como

tesis de grado o como resumen en un congreso). Enviar simultáneamente un mismo artículo a

consideración de dos o más revistas es una falta grave a la ética académica.

2. Los autores transfieren los derechos de publicación a la revista, tanto en su versión impresa

como en línea, incluyendo esta última las diferentes bases de datos en las que se encuentre

indexada la revista.

3. La publicación del artículo debe haber sido aprobada por todos los coautores (si los hubiese) y

por las autoridades responsables de la institución donde se llevó a cabo la investigación.

4. El documento debe cumplir a cabalidad con las instrucciones para autores establecidas por el

comité editorial descritas en el presente documento. Los artículos que no se ajusten a estas

pautas serán devueltos los autores sin haber sido considerados para evaluación.

Los artículos que sean aceptados para evaluación serán enviados a un mínimo de dos pares

académicos reconocidos para su evaluación. En caso de una decisión dividida por parte de los

evaluadores, será el editor o el comité editorial en pleno quien determine la inclusión o el rechazo

del documento. Si los artículos son aceptados para publicación, los autores deberán corregirlos de

acuerdo con las observaciones de los pares y el comité editorial dentro del tiempo otorgado para

ello. Las observaciones que no sean aceptadas por los autores deberán contar con un sustento

apropiado que será evaluado por el editor correspondiente. El editor y el comité editorial se

reservan el derecho de rechazar o aceptar los materiales enviados para su publicación.

TIPOS DE CONTRIBUCIÓN


basada en PCR

La revista acepta los siguientes tipos de contribuciones originales:

• Artículo científico: artículo científico original que presenta los resultados de investigaciones que

se rigen bajo el método científico. Típicamente consta de cuatro partes esenciales: introducción,

metodología (materiales y métodos), resultados y discusión (presentados en secciones

individuales o en una sola) y conclusiones.

• Reporte de caso: reporte de un caso clínico de relevancia, ya sea por ser el primero en su

contexto específico o por sus características particulares que lo hacen de interés para la

comunidad científica y por ende publicable.

• Artículo de revisión: revisión crítica de un tema específico desde una perspectiva analítica,

interpretativa y crítica del autor, que recurre siempre a fuentes originales. Se recomienda solo

para autores con experiencia investigativa demostrada en el tema. Idealmente una revisión debe

presentar un resumen crítico de las investigaciones hasta ahora realizadas y proponer nuevos

temas por investigar.

• Ensayo científico: reflexiones críticas de un autor que presenta su visión y juicio sobre un tema

científico.

REMISIÓN DE MANUSCRITOS

Las contribuciones pueden ser enviadas en español, inglés o portugués, al correo

electró[email protected] una vez el manuscrito cumpla con las normas de

presentación aquí descritas; en respuesta, los autores recibirán el Formato de Información

Personal, que deberá ser diligenciado para cada uno de los autores y enviado al mismo correo

electrónico, y el Formato de Autorización de Publicación, que deberá ser firmado por todos los

autores y devuelto en físico a la oficina de la revista: Unidad de Extensión, Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D. C. Cra. 30 con Cll 45.

FORMATO

El texto del artículo debe enviarse en MS-Word®, sin incluir tablas o figuras, las cuales deben

presentarse en archivos separados. Se recomienda que el texto no tenga más de 30.000

caracteres sin espacios o 20 páginas en tamaño carta numeradas consecutivamente en el lado

inferior derecho, con márgenes de 2,5 cm por cada lado, con fuente Times New Roman, tamaño

de 12 puntos a doble espacio, , y cada línea del documento deberá estar enumerada

consecutivamente (en MS-Word®: Diseño de página/Números de línea/Continua).

Las tablas y las figuras (fotografías, gráficos, dibujos, esquemas, diagramas de flujo, diagramas

de frecuencia, etc.) deberán enumerarse consecutivamente en números arábigos, y además de

enviarse insertadas en un archivo MS-Word® deberán incluirse los archivos originales (por

ejemplo jpg o MS-Excel®), de acuerdo con el programa con el que hayan sido elaboradas. Todas

las tablas y figuras deben haber sido citadas en el texto.

Título y autores

El título del artículo se debe presentar en español (o portugués) e inglés, en negrilla y centrado. Si

incluye nombres científicos se deberá usar la nomenclatura indicada anteriormente (sistema

binomial). Bajo el título se escriben los nombres y apellidos de los autores de la siguiente manera:

iniciales de los nombres (con punto), seguidos del primer apellido completo, sin títulos académicos

ni cargos laborales y separando cada autor con una coma. El autor para correspondencia debe

identificarse con un asterisco. Como pie de página debe indicarse la filiación institucional de cada

autor incluyendo la dirección, ciudad y país, y la dirección de correo electrónico del autor para

correspondencia.

Resumen y palabras clave

Los artículos deben incluir un resumen en español (o portugués) y uno en inglés, de no más de

250 palabras. El resumen debe registrar brevemente todas las partes del documento: los

mailto:[email protected]

Anexos 111

propósitos del estudio o investigación, materiales y métodos (selección de los sujetos del estudio

o animales de laboratorio; métodos de observación y de análisis), resultados y discusión

(consignando información específica o datos y su significancia estadística siempre que sea

posible), y las conclusiones principales. Deberán destacarse las observaciones y aspectos más

novedosos y relevantes del estudio.

Las palabras clave (máximo cuatro) son términos para indexación del artículo en las bases de

datos y los buscadores de Internet. Estas deben identificar el contenido del artículo y se deben

colocar después del resumen en su correspondiente idioma. Para seleccionar las palabras clave

del documento, se sugiere consultar y usar los descriptores del tesauro agrícola multilingüe

Agrovoc, creado por la FAO, el cual abarca terminología de la agricultura, silvicultura, pesca,

medioambiente y temas afines (http://aims.fao.org/website/Search/sub) o los Descriptores en

Ciencias de la Salud

(http://decs.bvs.br/E/homepagee.htm y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=mesh).

Estas herramientas permiten seleccionar las palabras clave adecuadas para que el artículo sea

difundido de forma más efectiva en Internet.

Introducción

Debe presentar una breve revisión de los trabajos previos relacionados con el tema por investigar

y finalizar con la justificación y los objetivos de la investigación. La introducción no incluirá datos o

conclusiones del trabajo que se está publicando.

Materiales y métodos

En esta sección se deben describir de forma clara, concisa y secuencial, los materiales (animales,

implementos de laboratorio) utilizados en desarrollo del trabajo, además de los procedimientos o

protocolos seguidos y el diseño experimental escogido para el tratamiento estadístico de los

datos. La información aquí consignada debe permitir a otros investigadores reproducir el

experimento en detalle. Este apartado puede tener subtítulos y no debe incluir ningún resultado ni

discusión de los hallazgos.

Resultados

En esta sección se deben describir los resultados en orden lógico y de manera objetiva y

secuencial, apoyándose en las tablas y figuras. Este apartado puede también incluir subtítulos y

no debe discutir los datos presentados.

Discusión

La discusión debe ser una síntesis de la confrontación de los datos obtenidos en el estudio con

respecto a la literatura científica relevante que además interprete las similitudes o los contrastes

encontrados. Se enfocará hacia la interpretación de los hallazgos experimentales y no repetirá los

datos presentados en la introducción ni la información suministrada en los resultados. Las

secciones correspondientes a resultados y discusión pueden combinarse en una sola.

Conclusiones

En esta sección se relacionan los hallazgos más relevantes de la investigación, es decir, aquellos

que constituyan un aporte significativo para el avance del campo temático explorado, además de

considerar un direccionamiento sobre futuras investigaciones.

Agradecimientos

Si se considera necesario, se agradecen contribuciones importantes en cuanto a la concepción,

financiación o realización de la investigación: financiadores, especialistas, firmas comerciales,

entidades oficiales o privadas, asociaciones de profesionales y operarios de campo y laboratorio.

Tablas

- Se deben evitar las tablas demasiado grandes. Si se tienen muchos datos en una tabla,

se recomienda dividirla en dos o más.

- Cada tabla debe tener un título corto y explicativo en la parte superior, sin abreviaturas.

http://aims.fao.org/website/Search/sub

http://decs.bvs.br/E/homepagee.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=mesh


basada en PCR

- No deben emplearse líneas verticales para separar las columnas y, por tanto, debe

existir suficiente espacio entre ellas.

- Cualquier explicación esencial para entender la tabla debe presentarse como una nota

en la parte inferior de esta.

- Los encabezados de columna deben ser breves pero suficientemente explicativos.

- Cada tabla debe haber sido referenciada en el texto.

Figuras

- Las gráficas deben ser a una sola tinta con porcentajes de negro para las variaciones de

las columnas, las líneas de las curvas deben ser de color negro, punteadas o continuas

usando las siguientes convenciones: ▲, ■, ●, ♦, ◊, ○, □, ∆.

- En caso de fotografías o mapas (originales o escaneados) estos deben enviarse en

archivos independientes, en formato tiff o jpg con un mínimo de 600 dpi de resolución y

adicionalmente dentro de un archivo MS-Word® en el que se incluya su título (corto y

explicativo) en la parte inferior.

- Al igual que las tablas, deben enumerarse con números arábigos en forma consecutiva,

y debe hacerse referencia en el texto a cada una de las figuras presentadas.

Nomenclatura

- Las unidades deben expresarse de acuerdo con el Sistema Métrico Decimal (SI).

- Los autores aceptarán la normatividad colombiana, así como la trazada por

el International Code of Botanical Nomenclature, el International Code of Nomenclature of

Bacteria, y el International Code of Zoological Nomenclature.

- Toda la biota (cultivos, plantas, insectos, aves, mamíferos, peces, etc.) debe estar

identificada en nomenclatura binomial (nombre científico), a excepción de los animales

domésticos comunes.

- Todos los medicamentos, biocidas y demás sustancias de uso comercial deben

presentar el nombre de su principio activo principal o nombre genérico.

- Para la nomenclatura química se usarán las convenciones determinadas por

la International Union of Pure and Applied Chemistry así como por la Comission on

Biochemical Nomenclature.

Referencias

La citación de referencias bibliográficas que sustentan frases dentro del texto se debe ceñir a las

normas de estilo del Council of Science Editors (CSE) algunas de las cuales se muestran a

continuación: dentro del texto se hará uso del sistema “autor(es) año” si se trata de uno o dos

autores: (Jiménez 2009), (Pineda y Rodríguez 2010); si la publicación citada tiene tres o más

autores, se cita el apellido del primer autor acompañado de la expresión latina et ál. sin cursivas:

(Bernard et ál. 2003). Si se citan varias referencias seguidas, deberán organizarse en orden

alfabético, separadas por punto y coma (;): (Hänsel y Gretel 1990; Hergé et ál. 1983). Si el autor o

autores se citan directamente en el texto se utiliza la misma notación pero con el año entre

paréntesis: Wagner (1982) encontró que el agua es vida, mientras que Vivaldi y Pergolessi (1988)

Anexos 113

afirman lo contrario; los investigadores Magendie et ál. (1845) descubrieron que los perros tienen

cuatro patas. Las referencias bibliográficas completas van al final del artículo en orden alfabético

de autores; si en la lista de referencias se citan varias publicaciones del mismo autor o autores se

listan en orden cronológico desde la más antigua hasta la más reciente.

Las contribuciones que no cumplan con las normas de estilo bibliográfico serán devueltas sin ser

consideradas para evaluación.

Para obtener más ejemplos sobre el sistema de citación del Council of Science Editors (CSE)

recomendamos remitirse a los siguientes enlaces:

http://www.scientificstyleandformat.org/Tools/SSF-Citation-Quick-Guide.html

Libros

Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P. 1990. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 8th ed.

New York: Pergamon Press. 1811 p.

Capítulos de libro

Diaz GJ. 2001. Naturally occurring toxins relevant to poultry nutrition. In: Leeson S, Summers JD

editores. Scott’s Nutrition of the Chicken. 4th ed. Guelph: University Books. p. 544-591.

E-Book

Rollin, BE. 1998. The unheeded cry: animal consciousness, animal pain, and science [Internet].

Ames(IA): Iowa State University Press. [Citado 2008 agosto 9]. Disponible en:

http://www.netlibrary.com.

Artículo de revista

Hepworth PJ, Nefedov AV, Muchnik IB, Morgan KL. 2010. Early warning for hock burn in broiler

flocks. Avian Pathol. 39:405-409.

Nota: se deben anotar las iniciales de todos nombres que tengan los autores. Los nombres de las

revistas se deben registrar en su forma abreviada; para consultar el nombre abreviado de las

revistas sugerimos consultar el ISI Journal Title Abbreviations.

Artículo de revista publicada en Internet

Leng F, Amado L, McMacken R. 2004. Coupling DNA supercoiling to transcription in defined

protein systems. J Biol Chem [Internet]. [citado 2007 July 24]; 279(46):47564-47571. Disponible

en: http://www.jbc.org/cgi/reprint/279/46/47564

Otras fuentes de información

Memorias de eventos

Cheeke PR. 2010. Agricultural and pharmaceutical applications of Chilean soapbark tree (Quillaja

saponaria) saponins. In: 8th International Symposium on Poisonous Plants; 2009 mayo 4-8, João

Pessoa, Paraíba, Brazil, p. 38.

http://www.scientificstyleandformat.org/Tools/SSF-Citation-Quick-Guide.html

http://www.efm.leeds.ac.uk/~mark/ISIabbr/A_abrvjt.html


basada en PCR

Tesis

Murcia HW. 2010. Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in

vitro de aflatoxina B1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro especies

de aves. [Tesis de maestría]. [Bogotá, Colombia] Universidad Nacional de Colombia.

NORMAS DE ESTILO

• Se debe redactar en voz activa (se evaluaron dos metodologías, y no: dos metodologías fueron

evaluadas) y en forma impersonal, es decir, tercera persona del singular (se encontró, y no:

encontré o encontramos).

• En cuanto a los tiempos verbales, el uso común es el pasado para la introducción,

procedimientos y resultados, y el presente para la discusión.

• En general, se recomienda evitar el uso del gerundio. Recurra a esta forma verbal sólo para

indicar dos acciones simultáneas; en los demás casos, redacte diferente la frase (reemplazar: un

protocolo fue establecido, minimizando el efecto negativo..., por: se estableció un protocolo con el

cual se minimizó el efecto negativo...).

• Las letras cursivas o itálicas se usan para los nombres científicos (sistema binomial) y palabras o

expresiones en idioma extranjero.

• El significado de las siglas y abreviaturas debe explicarse cuando se mencionan por primera vez

en el texto. Posteriormente, se debe usar solamente la sigla o abreviatura.

• Las siglas no tienen forma plural; este se indica en las palabras que la acompañan: las ONG,

dos ELISA.

• Las abreviaturas del SI no deben ir con punto, en plural o en mayúscula: 1 kg, 25 g, 10 cm, 30 m,

etc. Las abreviaturas más usadas en esta revista son las siguientes:

km kilómetro

m metro

cm centímetro

mm milímetro

µm micrómetro

nm nanómetro

kg kilograno

g gramo

mg miligramo

µg microgramo

ng nanogramo

l litro

ml mililitro

µl microlitro

m mol

M molar

mM milimolar

µM micromolar

N normal

ppm partes por millón (1 x 10-6)

Anexos 115

ppb partes por billón (1 x 10-9)

cpm cuentas por minuto

dpm desintegraciones por minuto

s segundos

min minutos

h hora

sc subcutáneo

im intramuscular

ip intraperitoneal

iv intravenoso

po oral

• Entre el valor numérico y el símbolo debe ir un espacio: 35 g (no 35g), p > 12 (no p>12); excepto

para los signos: °C, %, +, - (estos dos últimos cuando indican positivo y negativo). Ejemplos: 99%,

+45, -37.

• En una serie de medidas, el símbolo va al final: hileras a 3, 6 y 9 m, o 14, 16 y 18%).

• La barra oblicua (/) es un signo lingüístico que en alguno de sus usos significa “por”: tres

perros/perrera, 4 tabletas/día, 2 l/matera, 10 frutos/rama. Uno de sus usos no lingüísticos es

expresar los cocientes de magnitudes y unidades de medida: 80 km/h, 10 ml/min, 10°C/h.

• Uno de los usos no lingüísticos del punto (·) es indicar la multiplicación de dos cantidades, caso

en que se coloca separado de éstas y a media altura: 6 · 3 = 18; 2 · (x + y) = 30.

• El punto (.) se usa para separar los miles y la coma (,) se usa para separar decimales.

• Las unidades que se basan en nombres se usan en minúsculas: un siemens (con algunas

excepciones como cuando el símbolo se deriva de un nombre propio: °C, grados Celsius).

1.7.1 Lista preliminar para la preparación de envíos

Como parte del proceso de envíos, los autores están obligados a comprobar que su envío cumpla

todos los elementos que se muestran a continuación. Se devolverán a los autores aquellos envíos

que no cumplan estas directrices.

1. El envío no ha sido publicado previamente ni se ha enviado previamente a otra revista (o se ha

proporcionado una explicación en Comentarios al / a la editor).

2. El archivo enviado está en formato Microsoft Word.

3. Se han añadido direcciones web para las referencias donde ha sido posible.

4. El texto tiene interlineado doble; el tamaño de fuente es 12 puntos; se usa cursiva en vez de

subrayado (exceptuando las direcciones URL); y todas las ilustraciones, figuras y tablas están en

archivos independientes, segun el programa en que fueron creados.

5. El texto cumple con los requisitos bibliográficos y de estilo indicados en las Normas para autores,

que se pueden encontrar en la sección "Acerca de la revista".

6. Si esta enviando a una sección de la revista que se revisa por pares, tiene que asegurase que las

instrucciones enAsegurando de una revisión a ciegas) han sido seguidas.


basada en PCR

1.7.2 Aviso de derechos de autor

FORMATO AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN Por la cual los autores confieren a la dirección

editorial de la Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia (ISSN 0120-2952)

autorización para publicación de manuscritos inéditos y originales sometidos para su publicación,

de acuerdo a los siguientes criterios: a) Somos los autores intelectuales del manuscrito, que éste

es inédito, es decir, que no ha sido remitido, aceptado o publicado en otras revistas o

publicaciones técnico-científicas impresas ni electrónicas y aceptamos que sea publicado en la

Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia en caso de ser aprobado. b) El

contenido total o parcial del manuscrito remitido no será sometido para su publicación en otra(s)

revista(s) durante la duración de los procesos de evaluación por pares y edición de la Revista de

la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. c) Todos los autores han leído la versión

definitiva del artículo presentado y se hacen responsables por todos los conceptos e información

de texto e imágenes allí contenidos ante la Universidad Nacional de Colombia y ante terceros. La

dirección editorial de la Revista no se hace responsable por la veracidad y autenticidad de dicha

información, ni será responsable de dirimir conflictos relacionados con la autoría del manuscrito.

d) El artículo sometido a consideración del Comité Editorial de la Revista de la Facultad de

Medicina Veterinaria y de Zootecnia cumple las normas establecidas en la política de publicación

y las instrucciones a los autores. En caso contrario el manuscrito será rechazado hasta no haber

acogido la totalidad de la normativa de presentación de manuscritos. e) Los autores se dan por

informados que el proceso de arbitraje y edición del artículo puede tomar varios meses y que su

recepción no implica ni la aprobación ni la publicación del mismo. f) Una vez terminado el proceso

de evaluación los autores se comprometen a atender y consolidar, estrictamente en los plazos de

tiempo establecidos por el editor, todas las observaciones, correcciones o sugerencias hechas por

los pares evaluadores del artículo y por el editor. Durante el proceso de corrección de estilo y

edición, se verificará la consolidación de las observaciones de los evaluadores, razón por la cual,

en caso de encontrar que no han sido integradas al documento, éste no será publicado hasta que

sus autores no las consoliden; sin embargo, en caso de que alguna(s) de las correcciones

formuladas por los pares evaluadores no puedan ser adicionadas a la versión definitiva del

artículo, los autores podrán sustentar sus razones al editor de la revista en el oficio de remisión

del artículo definitivo. g) La totalidad de los autores aprueba la publicación del documento

completo en sus versiones impresa y digital, lo que incluye las diferentes bases de datos en los

que la Revista es y será incluida para promover su visibilidad. h) Los autores conocen que la

autorización incluye la posibilidad para la Revista de comercializar la publicación a través de los

canales tradicionales y de Internet, o cualquier otro medio conocido, y aceptan que la autorización

de publicación se hace a título gratuito, por lo tanto renuncian a recibir remuneración alguna por la

publicación, distribución, comunicación pública y cualquier otro uso que se haga en los términos

en que la obra es publicada. i) La Revista se compromete a indicar siempre la autoría de sus

contenidos incluyendo el nombre de los autores y la fecha de publicación. De igual forma, los

autores se comprometen a citar los trabajos publicados en esta publicación de acuerdo con los

estándares internacionales de citación, incluyendo el nombre completo o abreviado de la Revista

(Rev. Med. Vet. Zoot. )

1.7.3 Declaración de privacidad

Los nombres y direcciones de correo-e introducidos en esta revista se usarán exclusivamente

para los fines declarados por esta revista como los procesos de indexación ante Publindex de

Anexos 117

Cociencias y no estarán disponibles para ningún otro propósito u otra persona. Toda la

información estará a cargo del Coordinador Editorial.


basada en PCR

B. Anexo. Guía para autores Capítulo 2

INTERNATIONAL JOURNAL FOR PARASITOLOGY: PARASITES AND WILDLIFE Sponsored by the Australian Society for Parasitology

AUTHOR INFORMATION PACK

GUIDE FOR AUTHORS .

INTRODUCTION The International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife (IJP:PAW) publishes the

results of original research on parasites of all wildlife, invertebrate and vertebrate.

This includes free-ranging, wild populations, as well as captive wildlife, semi-

domesticated species (e.g. reindeer) and farmed populations of recently domesticated

or wild-captured species (e.g. cultured fishes). Articles on all aspects of wildlife

parasitology are welcomed including taxonomy, biodiversity and distribution,

ecology and epidemiology, population biology and host-parasite relationships. The

impact of parasites on the health and conservation of wildlife is seen as an important

area covered by the Journal especially the potential role of environmental factors, for

example climate. Also important to the journal is 'one health' and the nature of

interactions between wildlife, people and domestic animals, including disease

emergence and zoonoses.

Types of articles The principal form of publication is the full-length article which contains substantial,

original research. The journal accepts brief reports that have similar subject scope as

the full-length article, but do not merit a full-length publication. In addition, the

journal commissions articles with emphasis on shorter, focused reviews of topical and

emerging issues as well as strategically important subjects. The journal encourages

critical comment and debate on matters of current controversy in the area of parasites

and wildlife via "Current Opinions".

Contact details for submission General enquiries prior to submission should be directed to the Editorial Office:

[email protected]

Submission Submission to this journal proceeds totally online at http://ees.elsevier.com/ijppaw

and you will be guided stepwise through the creation and uploading of your files. The

system automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is

used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files

Anexos 119

are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are

needed for further processing after acceptance. All correspondence, including

notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail

removing the need for a paper trail. The final pdf should be no larger than 5 MB.

If file size cannot be reduced to less than 10 MB, the author should contact the

IJPPAW Editorial Office for instructions ([email protected]). Required Information:

Name, affiliation, email, telephone and fax numbers and mail address information for

one corresponding author.

This must be the same person nominated as corresponding author on the manuscript

title page and this person must submit the manuscript on-line.

The corresponding author, through the web access, is responsible for actions with

respect to each paper. E-mail prompts will be delivered only to the corresponding

author. Articles can also be tracked by the corresponding author via the online

system.

Name and affiliations of all other authors.

Cover letter is mandatory for all submissions and should address the novelty,

significance of the work.

Order of files

Manuscript should contain (in order) Title, Authors and addresses, Corresponding

Author and address, Abstract, Keywords. In numbered sections: 1. Introduction; 2.

Materials and methods; 3. Results; 4.Discussion; then Acknowledgements;

References; Legends to Figures. Tables with their legends (in

separate or combined files, numbered, in order). Figures (in separate files); preferred

formats: JPEG, EPS or PDF. Supplementary and multimedia files.

Format

The preferred format for the text is Microsoft Word. The title page, abstract and text

should be formatted with line numbers. The manuscript should be formatted to A4

size paper, in English, double spaced and with 2 cm margins.

Further journal requirements

During submission you will also have to confirm that all authors have read the

manuscript and accept responsibility for its contents and agree to an 'Ethics in

Publishing' document.

Referees Please submit, with the manuscript, the names, addresses and e-mail addresses of 3

potential referees. Note that the Editors retain the sole right to decide whether or not

the suggested reviewers are used.

PREPARATION The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as

possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the

article. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When

preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual

table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align

columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of

conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:

http://www.elsevier.com/guidepublication. Note that source files of figures, tables and

text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text.

To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spell-check" and

"grammar-check" functions.


basada en PCR

Article structure Subdivision - numbered sections

Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be

numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section

numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer

to 'the text'. Any subsection may be given a brief heading. Each heading should

appear on its own separate line. Introduction

State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a

detailed literature survey or a summary of the results. Material and methods

Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already

published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be

described. Results

Results should be clear and concise. For brief reports, the Results and Discussion

sections need to be combined. Discussion

This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A

combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive

citations and discussion of published literature. Conclusions

The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,

which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion

section. Appendices

This journal does not publish appendices. Information should be included within the

manuscript text or provided as supplementary material.

Essential title page information • Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems.

Avoid abbreviations and formulae where possible. • Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a

double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses

(where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a

lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the

appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the

country name and, if available, the e-mail address of each author. • Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages

of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that phone numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up to date by the corresponding author.

• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the

article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent

address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which

the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address.

Superscript Arabic numerals are used for such footnotes. Abstract

A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the

purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is

Anexos 121

often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this

reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and

year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if

essential they must be defined at their first mention in the abstract itself. The

maximum length of the abstract is 300 words.

Graphical abstract A Graphical abstract is mandatory for this journal. It should summarize the contents

of the article in a concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide

readership online. Authors must provide images that clearly represent the work

described in the article. Graphical abstracts should be submitted as a separate file in

the online submission system. Image size: please provide an image with a minimum

of 531 × 1328 pixels (h × w) or proportionally more. The image should be readable

at a size of 5 × 13 cm using a regular screen resolution of 96 dpi. Preferred file types:

TIFF, EPS, PDF or MS Office files. See http://www.elsevier.com/graphicalabstracts for

examples.

Authors can make use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure the

best presentation of their images also in accordance with all technical requirements:

Illustration Service.

Highlights Highlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet

points that convey the core findings of the article and should be submitted in a

separate file in the online submission system. Please use 'Highlights' in the file name

and include 3 to 5 bullet points (maximum 85 characters, including spaces, per bullet

point). See http://www.elsevier.com/highlights for examples.

Keywords Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using British

spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for

example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly

established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing

purposes.

Abbreviations Avoid the use of abbreviations, but if necessary, authors should use the list (click here

to see list) as a guide to those terms that need not be given in full, or define each

abbreviation on first use.

Acknowledgments Authors should provide confirmation of consent from persons acknowledged in

manuscripts for example personal communications. This can be provided in a covering

letter or by e-mail to the editorial office.

Units Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of

units (SI). If other units are mentioned, please give their equivalent in SI.

Database linking Elsevier encourages authors to connect articles with external databases, giving their

readers oneclick access to relevant databases that help to build a better

understanding of the described research. Please refer to relevant database identifiers

using the following format in your article: Database: xxxx

(e.g., TAIR: AT1G01020; CCDC: 734053; PDB: 1XFN). See

http://www.elsevier.com/databaselinking

for more information and a full list of supported databases.

Footnotes


basada en PCR

Footnotes should only be used in tables. Indicate each footnote in a table with a

superscript lowercase letter.

Artwork Electronic artwork General points

• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.

• Embed the used fonts if the application provides that option.

• Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New

Roman, Symbol, or

use fonts that look similar.

• Number the illustrations according to their sequence in the text.

• Use a logical naming convention for your artwork files.

• Provide captions to illustrations separately.

• Size the illustrations close to the desired dimensions of the printed version.

• Submit each illustration as a separate file.

A detailed guide on electronic artwork is available on our website:

http://www.elsevier.com/artworkinstructions You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats

If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application (Word,

PowerPoint, Excel) then

please supply 'as is' in the native document format.

Regardless of the application used other than Microsoft Office, when your electronic

artwork is

finalized, please 'Save as' or convert the images to one of the following formats (note

the resolution

requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given

below):

EPS (or PDF): Vector drawings, embed all used fonts.

TIFF (or JPEG): Color or grayscale photographs (halftones), keep to a minimum of

300 dpi.

TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a

minimum of 1000 dpi.

TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale), keep to a

minimum of

500 dpi. Please do not:

• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); these

typically have a

low number of pixels and limited set of colors;

• Supply files that are too low in resolution;

• Submit graphics that are disproportionately large for the content. Color Artwork

Illustrations of all kinds should be listed together under ′ Legend to Figures′ numbered

consecutively

and their positions indicated in the text. Figures should be high quality, of an

adequate size to ensure

clarity, and letters and numbers should be at least 4 mm in height. Magnification

should be indicated

Anexos 123

by inclusion of a scale bar in the figure and its value should be indicated on the figure

or in the legend.

Each figure should be obvious from its file name. If images have been altered,

describe the nature of

changes made and software used. This information should be included in the ′

Materials and methods′ section of the manuscript.

Illustration services Elsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/illustrationservices) offers

Illustration Services to authors preparing to submit a manuscript but concerned about

the quality of the images accompanying their article. Elsevier's expert illustrators can

produce scientific, technical and medicalstyle images, as well as a full range of charts,

tables and graphs. Image 'polishing' is also available, where our illustrators take your

image(s) and improve them to a professional standard. Please visit the website to find

out more. Figure captions

Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a

description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum

but explain all symbols and abbreviations used.

Tables Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place

footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase

letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data

presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article.

References Correct references are the responsibility of the author. Please ensure that all

references cited in the text are included in the reference list.

References in the text start with the name of the author(s), followed by the

publication date in brackets, e.g. 'Combes (2001) has shown the importance of ...', or

'... has been described (Combes, 2001; Kumar et ál., 2004) ...', using date order.

More than one paper from the same author in the same year must be identified by the

letters a, b, c, etc., placed after the year of publication. In the text, when referring to

a work by two authors, use (Sangster and Dobson, 2002) or for more than two

authors, the name of the first author should be given followed by et ál.

The references in the reference list should be in alphabetical order. References to

journal articles should contain names and initials of all author(s), year of publication,

article title, abbreviation of the name of the journal, volume number and page

numbers.

Unpublished data, personal communications and papers ′ in preparation′ or ′

submitted′ , abstracts (whether published or not) and these should not be listed in the

references (but may be incorporated at the appropriate place in the text); work "in

press" may be listed only if it has been accepted for publication. Personal

communications must be accompanied by a letter or e-mail from the named

person(s) giving permission to quote such information. References to books should

also include the title (of series and volume), initials and names of the editor(s) and

publisher and place of publication. Examples:

Combes, C., 2001. Parasitism. The ecology and evolution of intimate interactions.

University of Chicago Press, Chicago and London.

Kumar, N., Cha, G., Pineda, F., Maciel, J., Haddad, D., Bhattacharyya, M.K.,

Nagayasu, E., 2004.


basada en PCR

Molecular complexity of sexual development and gene regulation in Plasmodium

falciparum. Int. J. Parasitol. 34, 1451-1458.

Pettersson, E.U., Ljunggren, E.L., Morrison, D.A., Mattsson, J.G., in press. Functional analysis and localisation of a delta-class glutathione S-transferase from Sarcoptes

scabiei. Int. J. Parasitol. Sangster, N.C., Dobson, R.J., 2002. Anthelmintic resistance.

In: Lee, D.L. (Ed.), The biology of nematodes. Taylor and Francis, London and New

York, pp. 531-567. Citation in text

Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list

(and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full.

Unpublished results and personal communications are not recommended in the

reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in

the reference list they should follow the standard reference style of the

journal and should include a substitution of the publication date with either

'Unpublished results' or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press'

implies that the item has been accepted for publication. Web references

As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last

accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a

source publication, etc.), should also be given. Web references to published articles

can be included in the reference list. Other web references such as software

programs, databases and individual web pages, should have the reference details

included at the appropriate place within the text. Journal abbreviations source

Journal names should be abbreviated according to the NLM catalogue:

http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html.

Video data Elsevier accepts video material and animation sequences to support and enhance your

scientific research. Authors who have video or animation files that they wish to submit

with their article are strongly encouraged to include these within the body of the

article. This can be done in the same way as a figure or table by referring to the video

or animation content and noting in the body text where it should be placed. All

submitted files should be properly labeled so that they directly relate to the video file's

content. In order to ensure that your video or animation material is directly usable,

please provide the files in one of our recommended file formats with a preferred

maximum size of 50 MB. Video and animation files supplied will be published online in

Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com Please

supply 'stills' with your files: you can choose any frame from the video or animation or

make a separate image. These will be used instead of standard icons and will

personalize the link to your video data. For more detailed instructions please

visit our video instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.

AudioSlides The journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their

published article.

AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online

article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their

research in their own words and to help readers understand what the paper is about.

More information and examples are available at http://www.elsevier.com/audioslides.

Authors of this journal will automatically receive an invitation e-mail to create an

AudioSlides presentation after acceptance of their paper.

Anexos 125

Supplementary data For non-integrated supplementary files, a footnote should be typed on the title page

of the manuscript: ′ Note: Supplementary data associated with this article. A copy of

supplementary material should be submitted at the same time as the manuscript.

Preferred formats are Microsoft Office for text or graphics and AVI for movie files.

Maximum size of files is 10 MB. If files cannot be reduced to 10MB, authors should

contact the IJPPAW Editorial Office at [email protected]. Please submit the

supplementary data as one file containing all the supplementary figures and tables.

Submission checklist The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending

it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of

any item. Ensure that the following items are present:

One Author designated as corresponding Author:

• E-mail address

• Full postal address

• Telephone and fax numbers

• Keywords

• All figure captions

• All tables (including title, description, footnotes)

Further considerations

• Manuscript has been "spellchecked" and "grammar-checked"

• References are in the correct format for this journal

• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa

• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources

(including the

Web).

AFTER ACCEPTANCE Use of the Digital Object Identifier The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic

documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is

assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The

assigned DOI never changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document,

particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full

bibliographic information. The correct format for citing a DOI is shown as follows (example taken from a document in the journal Physics Letters B):

doi:10.1016/j.physletb.2010.09.059

If you use the DOI to create hyperlinks to documents on the web, they are

guaranteed never to change.

Online proof correction Corresponding authors will receive an e-mail with a link to our online proofing system,

allowing annotation and correction of proofs online. The environment is similar to MS

Word: in addition to editing text, you can also comment on figures/tables and answer

questions from the Copy Editor. Web-based proofing provides a faster and less error-

prone process by allowing you to directly type your corrections, eliminating the

potential introduction of errors.

If preferred, you can still choose to annotate and upload your edits on the PDF

version. All instructions for proofing will be given in the e-mail we send to authors,

including alternative methods to the online version and PDF. We will do everything

possible to get your article published quickly and accurately - please upload


basada en PCR

all of your corrections within 48 hours. It is important to ensure that all corrections

are sent back to us in one communication. Please check carefully before replying, as

inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely

your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article

if no response is received.

Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a personalized link

providing 50 days free access to the final published version of the article on

ScienceDirect. This link can also be used for sharing via email and social networks. For

an extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form which is

sent once the article is accepted for publication. Both corresponding and co-authors

may order offprints at any time via Elsevier's WebShop

(http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/offprints). Authors requiring printed

copies of multiple articles may use Elsevier WebShop's 'Create Your Own Book' service

to collate multiple articles within a single cover

(http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/booklets).

Additional information Submission of sequence data to databases

Novel nucleotide or protein sequence data must be deposited in the GenBank™ , EMBL

or DDBJ databases and an accession number obtained before the paper can be

accepted for publication.

Submission to any one of the collaborating databanks is sufficient to ensure entry in

all. The accession number should be included as a footnote on the title page of the

manuscript: 'Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in

the GenBank™ , EMBL and DDBJ databases under the accession number(s)'. If

requested the database will withhold release of data until publication. The

usual method for submitting sequence data is by the World Wide Web to either

GenBank (via BankIt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/), EMBL (via WebIn:

http://www.ebi.ac.uk/subs/allsubs.html) or to DDBJ (via SAKURA:

http://sakura.ddbj.nig.ac.jp/). Special types of submissions, such as genomes, bulk

submissions, segmented sets, and population/phylogenetic/mutation studies, can be

more easily prepared with the Sequin programme (available from the above Web

sites). Authors are encouraged by the databases to update their entries as the need

arises. GenBank/DNA sequence linking. In order for automatic links to be made between

papers and GenBank, authors should type the accession number in bold, underlined

text. Letters in the accession number should always be capitalised. (See the

example). When published they will appear in normal type. Example: ′ GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-

cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and

a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)′ . Additionally, any multiple

alignments of nucleotide or protein data must be submitted to a recognised database

and must also receive a unique accession number. The accession number can appear

in the text in the relevant section of the Results, as: ′ Alignment files are available by

anonymous FTP from FTP.EBI.AC.UK in directory/pub/databases/embl/align or via the

EMBLALIGN database via SRS at http://srs.ebi.ac.uk; under accession(s)′ . The usual

method for submitting alignments is by the World Wide Web to the European

Bioinformatics Institute (via Webin- Align: http://www.ebi.ac.uk). Microarray data, in

MIAME-compliant format, should be submitted to ArrayExpress

(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) or GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Anexos 127

Accession identifiers relating to the data should be provided in the manuscript text. Policy on bioinformatics papers. In silico analysis: The following guidelines apply to

papers that exclusively use in silico analysis or rely heavily on this approach for

analysis and conclusions. Such papers should address a significant biological issue or

issues. Bioinformatic data should be supported by novel or published biological data.

Work would typically use information from a number of databases and even from a

number of parasite or host species and use a number of analytical methods. Types of ′

metaanalysis′ are encouraged either across a wide range of parasites or, say,

at a number of points in a metabolic or signalling pathway or an immune cascade. In

silico analysis may be especially suitable for review articles. Guidelines for reporting of protein identifications using mass spectrometry

The following information should be provided for protein or peptide identifications

using mass spectrometry: 1. The program, and version number, used to create peak

lists and the parameters used in the creation of the list.

2. The program, and version number, of the program used for database searching.

Parameters used for searching should be specified, including, but not limited to,

precursor-ion mass tolerance, fragmention mass tolerance, modifications allowed for,

missed cleavages and enzymes used in protein cleavage.

3. The name and version number of the sequence database used in searches. If a

custom-made database is used then complete information on the origin of the

sequences and database size should be disclosed. Given the dependence of scoring on

database size, the use of a small database, or one excluding contaminants, should be

justified. 4. A short description of the methods use to interpret the significance of

search results, including any statistical analysis, confidence thresholds and other

values specific to judging the certainty of the identification.

5. For large-scale experiments a false-positive determination should be reported. This

may be the result of randomized database searches or other approaches.

6. Each protein identification should include the accession number, score generated by

the search algorithm used, sequence coverage and the number of unique peptide

sequences assigned in the protein identification.

7. Single peptide identifications should include an annotated MS/MS spectrum showing

fragment assignments together with the peptide sequence, precursor mass, charge

and error.

8. Identifications arising from peptide mass fingerprinting should include an annotated

mass spectrum. The number of matched peaks, the number of unmatched peaks and

the sequence coverage should also be reported along with all parameters and

thresholds used to analyse the data. This includes mass accuracy, resolution,

calibration methods, contaminant exclusions along with the scoring scheme used and

measure of the false-positive rate. Author inquiries

For inquiries relating to IJPPAW please contact the Managing Editor of IJPPAW at:

[email protected]. You can track accepted articles at

http://www.elsevier.com/trackarticle and set up e-mail alerts to inform you of when

an article's status has changed. Also accessible from here is information on copyright,

frequently asked questions and more. Contact details for questions arising after

acceptance of an article, especially those relating to proofs, will be provided by the

publisher. © Copyright 2014 Elsevier | http://www.elsevier.com

introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para ... · de la prueba, siendo desde ya...

Documents