interacciones entre eif5a y acl5 en el desarrollo del...
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Interacciones entre eIF5A y ACL5 en
el desarrollo del xilema en
Arabidopsis thaliana
Trabajo final de Máster de
Biotecnología Molecular y Celular
de Plantas
Realizado por: Carla Almendáriz Palacios
Director: Dr. Alejandro Ferrando Monleón
Valencia, Diciembre de 2013
Abreviaturas
atm: Atmósfera
cDNA: Copy DNA (DNA copia)
Col-0: Columbia
cm: Centímetro
DHH: Desoxihipusina hidroxilasa
DHS: Desoxihipusina sintasa
DMSO: Dimetil sulfóxido
DNA: Deoxiribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico)
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético
g: gravedad
iRNA: interference RNA (RNA de interferencia)
kDa: kiloDalton
M: Molar
mg: Miligramo
mL: Mililitro
mM: Milimolar
mRNA: messenger RNA (RNA mensajero)
MS: Murashige-Skoog
nm: Nanómetro
nM: Nanomolar
p/v: Peso/Volumen
PCR: Quantitative polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)
qPCR: Quantitative polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa)
RNA: Ribonucleic acid (Ácido ribonucleico)
rpm: Revoluciones por minuto
RT-qPCR: Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa con retrotranscripción)
SDS: Sodium Dodecyl Sulphate (Dodecil sulfato sódico)
siRNA: small interference RNA (RNA de silenciamiento)
TBE: Tris Base, Ácido bórico, EDTA
TEs: Tracheal elements (Elementos traqueales)
v/v: Volumen/Volumen
Wt: Wild type, silvestre
µg: Microgramo
µL: Microlitro
µM: Micromolar
µmol m-2 s-1: Micromoles por metro cuadrado por segundo
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1
1.1 Origen del sistema vascular ....................................................................................... 1
1.2 El xilema y la muerte celular ..................................................................................... 2
1.2.1 Reguladores implicados en la diferenciación del xilema ................................ 4
1.3 eIF5A y el xilema ........................................................................................................ 7
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 9
3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 10
3.1 Material biológico .................................................................................................... 10
3.1.1 Arabidopsis thaliana ...................................................................................... 10
3.2 Manipulación y crecimiento de Arabidopsis ........................................................... 10
3.2.1 Esterilización de semillas ............................................................................... 10
3.2.2 Cultivo in vitro ............................................................................................... 10
3.2.3 Cultivo en invernadero .................................................................................. 11
3.3 Purificación y análisis de ácidos nucleicos .............................................................. 11
3.3.1 Aislamiento de RNA total de Arabidopsis ..................................................... 11
3.3.2 Electroforesis de ácidos nucleicos (DNA y RNA) ........................................... 12
3.3.3 Retrotranscripción de mRNA a cDNA de Arabidopsis ................................... 13
3.3.4 PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) .......................................................... 13
3.4 Análisis de polisomas ............................................................................................... 15
3.4.1 Elaboración de los gradientes de sacarosa ................................................... 15
3.4.2 Material vegetal ............................................................................................ 15
3.4.3 Obtención del extracto .................................................................................. 15
3.4.4 Elaboración de los perfiles de polisomas ...................................................... 16
3.4.5 Procesado de las fracciones para aislamiento de RNA ................................. 16
3.5 Técnicas de Microscopía .......................................................................................... 17
3.5.1 Recuento de tipos celulares del xilema en hipocotilos ................................. 17
3.5.2 Cortes de hipocotilo para tinción histoquímica ............................................ 18
3.5.3 Tinción histoquímica de raíces ...................................................................... 19
4. RESULTADOS ........................................................................................................... 21
4.1 Aislamiento y selección de líneas transgénicas homocigotas para siDHS en el fondo genético mutante acl5: obtención de líneas dobles transgénicas acl5siDHS ........ 21
4.2 Análisis molecular de la inducción del silenciamiento condicional de las líneas transgénicas acl5siDHS ........................................................................................... 23
4.3 Caracterización fenotípica de las líneas transgénicas siDHS y acl5siDHS. .............. 24
4.3.1 Recuento de tipos celulares de xilema en hipocotilos .................................. 24
4.3.2 Cortes de hipocotilos para tinción histoquímica ........................................... 25
4.3.3 Tinción histoquímica de raíces ...................................................................... 27
4.4 Perfil traduccional del gen SSS31 (AJAX2) en la línea acl5siDHS A.......................... 28
4.5 Análisis molecular de la expresión de los genes dianas de ACL5: ATHB8, VND6 y SAMDC4 en las línea siDHS K y acl5siDHS A. ......................................................... 29
5. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 32
6. CONCLUSIONES ....................................................................................................... 37
7. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 38
8. ANEXOS ................................................................................................................... 42
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Origen del sistema vascular
El origen y la diversificación de las plantas terrestres representan una innovación en la
historia de la vida vegetal. Los organismos vegetales evolucionaron de un conjunto
constituido por pocas células hacia uno formado por una variedad de tejidos y órganos
complejos (Kenrick and Crane, 1997). El éxito en la colonización de los ambientes
terrestres, por parte de los organismos vegetales dependió principalmente de la ubicación
de los órganos tanto en el ambiente aéreo como terrestre para poder conseguir sus
requerimientos autotróficos (Lucas et al., 2013).
Por lo tanto, los órganos de las primeras plantas, ubicados en el ambiente aéreo o en el
suelo eran nutricionalmente interdependientes y, por consiguiente, hubo una intensa
presión de selección para la evolución de un sistema de transporte entre los órganos con
el fin de permitir que todos los nutrientes esenciales para el crecimiento y el
mantenimiento celular fueran accesibles. Dentro de esta evolución hacia plantas
multicelulares, una característica importante fue el desarrollo del plasmodesmo cuyos
canales citoplasmáticos establecieron un transporte simplástico a lo largo de toda la
planta (Lucas et al., 1993) permitiendo el intercambio de nutrientes entre los diferentes
órganos de la planta. A pesar de esto, el transporte simplástico es efectivo únicamente a
través de distancias cortas por lo que el intercambio de nutrientes estaría limitado a pocas
células y el tamaño del organismo no podría ser mayor de unos pocos milímetros (Lucas et
al., 2013).
Para que las plantas pudieran superar la limitación del transporte simplástico una fuerte
selección tuvo lugar para desarrollar un tejido dispuesto entre las partes apical y basal y
localizado a través de toda la planta. Independientemente del tipo de planta, las células
de este tejido se convirtieron en compartimentos con un citoplasma simplificado y con
modificaciones en los extremos de sus paredes para poder incrementar las
conductividades intra- e inter-celulares. El desarrollo de este tejido se dio en un ambiente
que sufrió cambios dramáticos en los niveles atmosféricos de CO2, lo que llevó también al
desarrollo de la cutícula y los estomas. El grado de las modificaciones de las células de
transporte de nutrientes y agua incrementó desde las briofitas hasta las plantas con
semillas dando lugar a organismos de mayor altura (Lucas et al., 2013). De esta manera,
para solventar el problema del transporte de agua y nutrientes a larga distancia,
evolucionaron el tejido vascular: floema y xilema.
2
Uno de los ejemplos más primitivos de un tejido vascular organizado es el encontrado en
las algas pardas o feofíceas, que poseen floema pero no xilema. La evolución del xilema
ocurrió mucho después, como una obligación para el desarrollo de las plantas en la tierra
(Aloni, 2010). El floema y xilema, en las plantas terrestres primitivas, están organizados en
un patrón simple, el xilema se encuentra en el centro del tallo y el floema lo rodea; sin
embargo, con la evolución de las distintas plantas vasculares, se produjo una variedad de
organizaciones del tejido vascular (Ye, 2002).
1.2 El xilema y la muerte celular
Como se ha mencionado, los tejidos vasculares están compuestos de dos estructuras
básicas: xilema y floema. El xilema transporta agua, nutrientes y hormonas, y provee un
soporte mecánico a la planta debido a la lignificación de las paredes de las células que lo
conforman. El floema se encarga de distribuir los productos resultantes de la fotosíntesis,
y de la translocación de proteínas y mRNAs involucrados en el crecimiento y desarrollo de
la planta (Ye, 2002). El xilema maduro está compuesto de elementos conductores que
experimentan muerte celular, llamados traqueidas o elementos traqueales (TEs, por sus
siglas en inglés) y de elementos no conductores como el parénquima y las fibras. El
parénquima está constituido por células con una pared secundaria uniforme y no sufren
muerte celular, mientras que las fibras, también presentes en el floema, sí están
sometidas a este proceso y su función es fundamentalmente de soporte mecánico
(Bollhöner et al., 2012).
Los TEs poseen varios tipos de células muertas funcionales en función de su grado de
maduración que incluye procesos de muerte celular y deposición de lignina: anular,
espiral, reticular y punteado. Estos tipos celulares maduran en posiciones características
dentro del protoxilema y metaxilema que son diferenciados a partir del procambium
durante la ontogenia temprana de una planta (Kubo et al., 2005; Ye, 2002). Las células del
protoxilema, conocidas como traqueidas que comúnmente tienen la forma anular y
espiral, maduran durante el crecimiento primario, antes de que los órganos hayan
elongado, y son destruidos con frecuencia por la extensión de los tejidos que los rodean.
Por el contrario, las células del metaxilema o vasos, que usualmente tienen forma reticular
y punteada, maduran durante el crecimiento secundario después de que los órganos han
completado su crecimiento y no sufren destrucción. Éstos, después de la maduración, son
perforados en ambos extremos formando una estructura hueca continua cuya pared
celular es gruesa y altamente lignificada permitiendo el transporte de nutrientes (Kubo et
al., 2005).
3
Se conoce que la muerte y el vaciado completo de los vasos del xilema es un prerrequisito
para el transporte (Bollhöner et al., 2012) y que la muerte celular precede a la lignificación
de los TEs, in vitro (Pesquet et al., 2010). En estudios realizados con cultivos celulares de
Zinnia elegans se ha demostrado que la lignificación de los TEs es un proceso postmortem,
es decir, que ocurre después de la muerte celular programada de estas células. Ensayos
realizados por Pesquet y colaboradores (Pesquet et al., 2013) demuestran que las células
del parénquima que rodean a los TEs muertos participan en la lignificación de éstos. Se ha
observado que las células del parénquima no expresan únicamente los genes biosintéticos
de monómeros de lignina, sino que también son capaces de producir y exportar
monolignoles en el apoplasto; esto sugiere que las células del parénquima del xilema
expresan genes específicos que permiten la lignificación postmortem de los TEs y que, por
lo tanto, su lignificación completa ocurre de una manera celular no autónoma (Pesquet et
al., 2013).
Figura 1. Tipos celulares de los elementos traqueales del xilema. A. Anular; B. Espiral; C. Reticular; D. Punteada
A B
C D
4
Se están empezando a conocer los componentes moleculares implicados en la iniciación y
desarrollo de la muerte celular de los vasos del xilema. La autolisis de los vasos maduros
ha sido documentada en varias especies como Zinnia, que es un buen modelo ya que
permite la diferenciación in vitro de TEs. En este sistema, mediante la aplicación de
hormonas vegetales a las células aisladas del mesófilo, se consigue un primer proceso de
diferenciación (fase I) seguido de la diferenciación en las células precursoras de TE
durante la fase II, y, finalmente, la diferenciación en los TEs, incluyendo la formación de la
pared secundaria y la muerte celular, durante la fase III (Bollhöner et al., 2012).
El primer indicio morfológico de la muerte celular en los TEs de Zinnia es el engrosamiento
de la vacuola seguido de los cambios en la permeabilidad del tonoplasto y el rápido
colapso de la vacuola deteniendo el flujo citoplásmico, evento que significa la muerte
celular. Se presume que la liberación de las enzimas hidrolíticas de la vacuola y la
activación de las enzimas del citoplasma debido a su acidificación inducen al colapso de
los orgánulos y finalmente a la degradación de los contenidos celulares (Bollhöner et al.,
2012).
1.2.1 Reguladores implicados en la diferenciación del xilema
Las auxinas y citoquininas son necesarias para la diferenciación de los TEs in vitro. Existe
evidencia de que las auxinas son el principal factor controlador y limitante para la
diferenciación tanto del xilema como del floema y se ha demostrado que las citoquininas
también participan, quizá aumentando la sensibilidad de las células a las auxinas (Aloni,
2010). Probablemente ambas hormonas están implicadas en la regulación de la activación
del cambium. Se ha demostrado que las cantidades relativas de xilema y floema están
reguladas por la concentración de auxina, una concentración alta induce la diferenciación
del xilema y floema, sin embargo, en concentraciones bajas de auxina se diferencia solo el
floema (Taiz and Zeiger, 2006). Estudios recientes han demostrado que durante el
desarrollo vascular de la raíz, se produce una interacción mutua inhibidora entre
citoquininas y auxinas que determina la posición del eje del xilema y especifica un patrón
bisimétrico de distintos dominios de señalización para ambas hormonas (Bishopp et al.,
2011). En la Figura 2 se muestra una representación esquemática del xilema de una raíz de
Arabidopsis thaliana.
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Basándose en experimentos in vitro en TEs de Zinnia, se ha observado que los
brasinosteroides podrían jugar un papel en la maduración del xilema porque se ha
demostrado que precursores de brasinosteroides se acumulan durante la diferenciación
de los TEs. Además, la inhibición de la síntesis de esta hormona en cultivos de TEs,
sometidos a la diferenciación, impide la maduración de los mismos provocando la muerte
celular (Yamamoto et al., 1997).
Utilizando el mismo sistema de Zinnia, se ha demostrado que los TEs maduros acumulan
etileno, mientras que el bloqueo de la señalización del mismo utilizando tiosulfato de
plata produce un bloqueo en la maduración de los vasos (Bollhöner et al., 2012)
Figura 2. Representación esquemática de cortes transversales y longitudinales de una raíz de Arabidopsis que muestra los diferentes tipos celulares con planos de simetría (Bishopp et al., 2011).
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Figura 3. Esquema de la formación del xilema basado en el modelo de Zhang y colaboradores (Zhang et al., 2011)
Otros resultados sugieren que las poliaminas están implicadas en diferentes procesos de
la diferenciación del xilema, incluyendo la formación de la pared celular, la maduración y
la lignificación. En concreto, se ha observado que la termoespermina tiene un papel
fundamental en la prevención de la maduración prematura y la muerte acelerada de los
vasos del xilema. La biosíntesis de esta poliamina es catalizada por la aminopropil
transferasa codificada por el gen ACAULIS5 (ACL5), que se expresa específicamente en
elementos precursores de vasos del xilema antes de la formación de la pared celular
secundaria (Vera-Sirera et al., 2010).
Los mutantes acl5, muestran una formación de la pared celular secundaria incorrecta con
una hiperproliferación de células del xilema (Hanzawa et al., 1997), así como una
expresión temprana de marcadores de muerte celular del xilema sugiriendo que la
termoespermina tiene un papel protector contra la maduración prematura y la muerte
celular acelerada (Muñiz et al., 2008). Se ha demostrado que la adición exógena de la
termoespermina inhibe casi completamente la diferenciación de los TEs de Zinnia,
posiblemente debido a una protección excesiva contra la maduración prematura de los
TEs (Bollhöner et al., 2012).
Otra poliamina, la espermidina, también está implicada en el desarrollo de xilema través
de la modulación de la actividad del factor eIF5A (Liu et al., 2008).
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1.3 eIF5A y el xilema
El factor de traducción eucariota, denominado originalmente, 5A (eIF5A por sus siglas en
inglés, eukaryotic initiation factor 5A) es una proteína ácida de bajo peso molecular
(aproximadamente 17 kDa) (Ishfaq et al., 2012), altamente conservada en los dominios
Archaea y Eucaria, pero no en Bacteria. Este último dominio tiene un factor de elongación
traduccional P (EF-P), el cual está estructuralmente y funcionalmente relacionado con
eIF5A. Se ha demostrado que eIF5A es esencial para la función celular normal de las
células eucariotas (Dias et al., 2012). Además, existen evidencias de que este factor podría
participar en la apoptosis en la medida en que se acumule en el inicio de la muerte
celular. Estudios realizados con plantas transgénicas han proporcionado evidencia de la
implicación de eIF5A en la muerte celular programada asociada no únicamente con
senescencia de las hojas, sino también con senescencia de los frutos y de los pétalos
demostrando que la pérdida de función de eIF5A conduce a un retraso en los procesos de
muerte celular (Hopkins et al., 2008).
El mecanismo preciso de funcionamiento celular de eIF5A se desconoce, pero se ha
reportado en estudios con levadura y células de mamíferos que puede reclutar
selectivamente mRNAs específicos desde el núcleo, facilitando su translocación al
citoplasma para su traducción (Hopkins et al., 2008; Liu et al., 2008). Los datos más
recientes han permitido elucidar las funciones dentro del ribosoma tanto para eIF5A como
para EF-P. En ambos casos se ha demostrado que dichos factores son necesarios para la
correcta traducción de mRNAs que codifican proteínas con tres o más prolinas sucesivas,
que en condiciones de depleción de dichos factores, inducen una parada en la elongación
de la traducción (Doerfel and Rodnina, 2013; Gutierrez et al., 2013).
Este factor sufre varias modificaciones post-traduccionales: acetilación, fosforilación,
ubicuitinación e hipusinación (Dias et al., 2012; Ishfaq et al., 2012; Łebska et al., 2010) . En
relación con la modificación por hipusinación, eIF5A es la única proteína conocida que
contiene el aminoácido modificado ‘hipusina’, que resulta de la modificación
postraduccional de una lisina por un grupo químico derivado de la poliamina espermidina
(Park et al., 1984). Esta modificación postraduccional, esencial para la actividad de eIF5A
(Schnier et al., 1991), ocurre mediante un proceso enzimático en dos etapas. En la primera
reacción, dependiente de NAD+, la enzima desoxihipusina sintasa (DHS) añade un grupo 4-
amino-butilo desde la espermidina al residuo de lisina (Lys 50 en humanos) de eIF5A,
dando como resultado la desoxihipusina. Esta etapa es reversible. Posteriormente, el
grupo 4-amino-butilo es hidroxilado por acción de la enzima desoxihipusina hidroxilasa
(DHH), formando la hipusina. Este paso bloquea a eIF5A en su forma activa y es
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irreversible (Park, 2006).
Figura 4. Activación post-traduccional de eIF5A (Thompson et al., 2004)
En los mamíferos eIF5A está presente en dos isoformas eIF5A1 y eIF5A2. eIF5A1 se
expresa de forma constitutiva en todos los tejidos (Ishfaq et al., 2012). En levaduras
también se encuentran dos genes para eIF5A (TIF51A y TIF51B) y se requiere al menos un
gen funcional para la viabilidad celular y el crecimiento; además, se ha determinado que
condiciones de aerobiosis inducen la expresión de TIF51A mientras que en condiciones
anaerobias sólo se expresa TIF51B (Schnier et al., 1991). En Arabidopsis, la
correspondiente familia multigénica está compuesta por tres genes que presentan
diferentes perfiles de expresión y que codifican tres proteínas muy similares en el extremo
N-terminal, en donde tiene lugar la modificación por hipusinación, pero con menor
conservación de homología en la zona C-terminal, dominio con capacidad de unión a RNA,
por lo que se piensa que este extremo daría la especificidad a cada una de las isoformas
(Hopkins et al., 2008).
La ruta dependiente de eIF5A se ha demostrado que es esencial para el desarrollo vegetal,
ya que tanto la desactivación génica de la enzima de hipusinación DHS así como las de los
genes que codifican eIF5A resultan letales durante los procesos de embriogénesis y
gametogénesis (Feng et al., 2007; Pagnussat et al., 2005).
Estudios recientes con AteIF5A1 han demostrado su participación durante la
diferenciación del xilema. La sobreexpresión de este gen aumenta el desarrollo del xilema
y su supresión la reduce, hecho que sugiere su papel esencial en el proceso de formación
del xilema. Se ha demostrado un incremento tanto en el xilema primario como secundario
en los tallos de plantas de sobreexpresión de AteIF5A1 (Liu et al., 2008).
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2. OBJETIVOS
Como se ha descrito en el apartado anterior, existen datos previos publicados que
demuestran que la pérdida de función de ACL5 produce una hiperproliferación de células
del xilema y defectos en la maduración del mismo debido a una aceleración en el proceso
de muerte celular programada. De manera opuesta, el silenciamiento de eIF5A en
Arabidopsis produce una reducción de la vasculatura, y un retraso en los procesos de
muerte celular.
Partiendo de estas premisas, con este trabajo se pretende responder a las siguientes
preguntas:
1. ¿Es posible complementar los fenotipos del xilema que genera la pérdida de función de
ACL5 mediante la disminución de la actividad de eIF5A? Y viceversa, ¿podría la
mutación acl5 aliviar el fenotipo de reducción de vasculatura generado por el
silenciamiento de eIF5A?
2. Conociendo algunos de los factores implicados en la ruta dependiente de ACL5 en el
proceso de diferenciación del xilema, ¿se ubica la actividad dependiente de eIF5A en la
misma ruta de señalización que ACL5 o participa de modo independiente en dicho
proceso?
10
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material biológico
3.1.1 Arabidopsis thaliana
En este trabajo se utilizó el ecotipo de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como
genotipo silvestre. Además se utilizaron semillas transgénicas de Arabidopsis de genotipo
acl5 que fueron transformadas con la construcción de silenciamiento de DHS (siDHS),
generada previamente en el laboratorio, que permite la desactivación génica condicional
por RNA de interferencia para el gen DHS. Partimos de semillas T2 dobles transgénicas
acl5siDHS generadas en el laboratorio que fueron utilizadas como se describe en el
apartado de Resultados para obtener semillas transgénicas T3 homocigotas. También se
utilizaron plantas transgénicas homocigotas de Arabidopsis transformadas con la
construcción de silenciamiento de DHS (siDHS), previamente obtenidas en el laboratorio.
3.2 Manipulación y crecimiento de Arabidopsis
3.2.1 Esterilización de semillas
Aproximadamente 100 semillas se trataron con una solución de 300 µL de etanol al 70%
(v/v) y Tritón X-100 al 0,05% (v/v) durante 5 minutos en agitación. A continuación se
centrifugaron las semillas a 13000 rpm en una microfuga Sartorius 1-14 durante 30
segundos y se eliminó el sobrenadante, añadiendo posteriormente el mismo volumen de
etanol al 96% (v/v) y se incubaron durante 5 minutos en agitación. Seguidamente, se
tomaron las semillas en suspensión mediante micropipeta y se colocaron sobre papel de
filtro de 7x4 cm previamente autoclavado, dejándose evaporar el etanol en la cabina de
flujo laminar durante 15 minutos. Una vez secas las semillas, se procedió a la siembra
directa en placas.
3.2.2 Cultivo in vitro
El medio sólido empleado para el cultivo de Arabidopsis fue el medio MS (Murashige-
Skoog), de composición 2,45 g/L de sales MS (Duchefa Biochemie) y 6mM MES,
ajustándose el pH a 5.7 con KOH. Se añadió 1% de Phyto Agar para su solidificación
(Duchefa Biochemie). El medio fue esterilizado en autoclave a 1 atm de presión y 120 °C
de temperatura durante 20 minutos. Cuando fue necesario, una vez que el medio estaba
enfriado por debajo de 50 °C, se añadió dexametasona a una concentración de 10 µM a
partir de stock 0.1 mM en DMSO para inducir la desactivación génica de DHS (para el
control negativo se añadió el mismo volumen de DMSO al medio) o higromicina a 15
11
µg/mL a partir de solución stock 50 µg/mL en agua estéril. Las placas se conservaron a 4 °C
hasta su uso.
El cultivo in vitro se llevó a cabo en posición horizontal utilizando placas Petri de 9 cm de
diámetro. Las placas se sellaron con cinta porosa (Micropore). Las semillas se
estratificaron en placa a 4 °C durante 3 días en oscuridad, tras los cuales pasaron a una
cámara de cultivo in vitro a 22 °C ± 1 °C de temperatura, en condiciones de fotoperiodo de
día largo (16 h de luz de intensidad 110 µmol m-2 s-1).
3.2.3 Cultivo en invernadero
El cultivo de Arabidopsis en invernadero se realizó en alveolos de poliestireno. Estos se
rellenaron con una mezcla de 50% turba, 25% vermiculita y 25% perlita. La siembra se
realizó directamente en los alveolos, y a continuación pasaron a la cámara de
estratificación, en la cual permanecieron en oscuridad durante 3 días a 4 °C de
temperatura. Una vez pasado ese tiempo, el crecimiento se produjo en fitotrón en las
mismas condiciones del apartado anterior.
El tratamiento de las plantas con dexametasona en invernadero se realizó pulverizando
con una solución de composición 2 µM dexametasona y 0.015% (v/v) silwet preparada a
partir de una solución stock de 25 mM dexametasona en etanol absoluto. Para los
tratamientos control se utilizó la misma solución pero sustituyendo la dexametasona por
el mismo volumen de etanol.
3.3 Purificación y análisis de ácidos nucleicos
3.3.1 Aislamiento de RNA total de Arabidopsis
Se partió de unos 100 mg (peso fresco) de plántulas de Arabidopsis previamente
cultivadas in vitro en medio, suplementado con dexametasona cuando fue necesario. Este
material vegetal se pulverizó con el mortero en presencia de nitrógeno líquido para evitar
la degradación de los RNAs y se almacenó en tubos estériles de 1.5 mL a -80 °C hasta su
uso.
La extracción de RNA se realizó mediante el kit “Real total RNA spin plants and fungi kit”
de REAL (Durviz), siguiendo las instrucciones del fabricante, con las que al final del
protocolo se obtienen aproximadamente 300-500 ng/µL de RNA por cada muestra
procesada en un volumen final de 60 µL.
12
Seguidamente, se midió tanto la concentración de RNA en cada muestra, como la relación
de absorbancia 260nm/280nm (indica la relación RNA/proteína en la muestra) y
260nm/230nm (indica la relación RNA/polisacáridos), obteniéndose información sobre el
grado de pureza de la muestra, mediante el aparato ND 100 Spectrophotometer
(NanoDrop).
A continuación se procedió a limpiar la muestra de polisacáridos, realizándose una
precipitación con LiCl. Para ello, se adicionó 1 volumen de LiCl 6 M a la muestra de RNA y
se incubó durante al menos 1 hora (preferiblemente varias horas) en hielo. A continuación
se centrifugó en una microfuga Eppendorf 5430 R durante 15 minutos a 13000 rpm a 4 °C.
Se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado con etanol al 70%, centrifugando
posteriormente 5 minutos a 13000 rpm en una microfuga Sartorius 1-14. Se eliminó el
sobrenadante y se dejó secar el precipitado. Finalmente se resuspendió con 60 µL de agua
estéril.
Posteriormente se volvió a medir la concentración de RNA en la muestra, así como las
relaciones de absorbancia, detectándose un aumento de A260nm/A230nm hasta valores
cercanos o superiores a 2. La integridad de las muestras de RNA se comprobó mediante
electroforesis.
3.3.2 Electroforesis de ácidos nucleicos (DNA y RNA)
En el caso de DNA, se utilizaron geles de agarosa al 1% mezclada con tampón de
electroforesis TBE (90 mM Tris, 90 mM ácido bórico y 2 mM EDTA, pH 8.4) y disuelta por
calentamiento en microondas. A la mezcla del gel, una vez había disminuido la
temperatura, se añadió una gota de una solución de bromuro de etidio al 0,07%
(AppliChem). Una vez finalizada la electroforesis, para la visualización del DNA se utilizó un
transiluminador de luz ultravioleta (UV) a 254 nm de longitud de onda (Uvitec). El tampón
añadido para la carga de las muestras fue 6x DNA Loading Dye (Fermentas). El marcador
de peso molecular utilizado fue λ/HindIII (Fermentas).
En el caso de electroforesis para RNA se utilizó en todo momento material y tampones
autoclavados a 1 atm de presión y 120 °C de temperatura durante 40 minutos, para
desactivar a las RNAsas. Así mismo, el instrumental utilizado para la electroforesis fue
lavado previamente con SDS 1% y agua estéril. Los geles utilizados fueron de agarosa al
1.3% en 1x TBE. La visualización de estos geles se realizó en las mismas condiciones que
los de DNA.
Como tampón de carga se utilizó 2x RNA Loading Dye (Fermentas).
13
3.3.3 Retrotranscripción de mRNA a cDNA de Arabidopsis
Para el paso de mRNA a cDNA se utilizó “PrimeScriptTM RT reagent kit – Perfect Real
Time” (Takara), siguiendo el protocolo para “SYBR Green assay”. La reacción se realizó en
un volumen total de 10 µL, conteniendo:
- 2 µL 5x PrimeScript Buffer
- 0.5 µL PrimeScript RT enzyme Mix I
- 0.5 µL Oligo dT Primer 50 µM
- 1 µg aproximado de RNA total
- H2O hasta 10 µL finales.
El tratamiento a aplicar a la mezcla fue de 15 minutos a 37 °C, 5 segundos a 85 °C (para
desactivación térmica de la enzima) y posterior conservación a 4 °C. Tras ello, el cDNA
molde se diluyó 1:10 con agua destilada libre de nucleasas.
3.3.4 PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)
Para realizar las qPCRs se utilizó el kit “SYBR Premix Ex Taq – Perfect Real Time” (Takara).
Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos “MicroAMp Fast Optical 96-Well
reaction plate with barcode” (Applied Biosystems). Cada reacción se realizó en un
volumen de 10 µL que contenían:
- 5 µL Master Mix 2x
- 2.6 µL H2O
- 0.4 µL cDNA molde
- 2 µL cebadores (1 µL forward 10x + 1 µL reverse 10x)
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para las diferentes qPCRs realizadas así
como las concentraciones apropiadas validadas previamente en el laboratorio, se
encuentran recogidos en la Tabla 1.
14
Tabla 1. Secuencias de los cebadores empleados en las reacciones de PCR cuantitativa a tiempo real.
Gen Hebra Secuencia (5’-3’) Concentración final
(nM)
DHS Directa CTCACAGGTTTGGTCTCTCTTTG 300
Reversa GTTCTGCTAAAACCGTTAAGGTATAC 900
PDF2 Directa TCAACATCTGGGTCTTCACTTAGC 300
Reversa GATGCAATCTCTCATTCCGATAGTC 900
LUC Directa TGGCAGAAGCTATGAAACGA 300
Reversa ATAAATAACGCGCCCAACAC 900
SSR31 Directa GATGAAGTGGGTGACAGAAATATG 300
Reversa GCACATGGTGGGAACAAAGC 900
ATHB8 Directa CAACAGCTAATCCGCGAATGT 500
Reversa TCTACACCTGCGGTTCTGGAA 500
VND6 Directa CCCGGGAATGCAAGTTGAT 500
Reversa TCCTGTCCCTCTTCCACATAACTC 500
SAMDC4 Directa GCTCCGGAACCGTCGTTT 500
Reversa TCCTCCGGCGAAGCCTAT 500
El equipo utilizado fue el termociclador de PCR cuantitativa “7500 Fast-Real Time”
(Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron las siguientes:
- 1 ciclo de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos
- 40 ciclos de:
Desnaturalización: 15 segundos a 95 °C
Hibridación de los cebadores: 30 segundos a 55 °C
Extensión: 30 segundos a 60 °C
- 1 ciclo para las curvas de disociación:
15 segundos a 95 °C
1 minuto a 60 °C
15 segundos a 95 °C
Con los resultados de la qPCR, se realizó una medida relativa de la expresión génica. Para
ello, los niveles de transcrito a estudiar se referenciaron al gen de expresión constitutiva
PDF2 (Czechowski et al., 2005) y a los respectivos controles negativos mediante el método
de 2ΔΔCt (Livak and Schmittgen, 2001) empleando el programa informático 7500 Software
v2.0.4 (Applied Biosystems). Las eficiencias comparables de amplificación para cada pareja
de cebadores fueron previamente determinadas en el laboratorio.
15
3.4 Análisis de polisomas
3.4.1 Elaboración de los gradientes de sacarosa
Las soluciones para la elaboración de los gradientes son:
- Solución A (sacarosa 10%)
10% sacarosa
40 mM Tris-HCl pH 8.4
20 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mg/mL Cicloheximida
5 µg/mL Cloramfenicol
- Solución B (sacarosa 60%)
60% sacarosa
40 mM Tris-HCl ph 8.4
20 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mg/mL Cicloheximida
5 µg/mL Cloramfenicol
Se prepararon 50 mL de cada solución. El equipo de análisis de polisomas tiene
automatizada la elaboración de 6 tubos de 11 mL del 10% al 60% de sacarosa.
3.4.2 Material vegetal
Se partió de aproximadamente 300 mg de tejido vegetal fresco a partir de plántulas de
Arabidopsis previamente cultivado in vitro durante 13-14 días, en medio MS
suplementado con dexametasona cuando fue necesario. Este tejido se pulverizó con el
mortero en presencia de nitrógeno líquido para evitar la degradación de los mRNA y se
almacenó en tubos estériles de 2 mL a -80 °C para su posterior procesamiento.
3.4.3 Obtención del extracto
Cada 300 mg de material fresco pulverizado se mezclaron con 1 mL de tampón de
extracción:
- 0.2 M Tris-HCl pH 9
- 0.2 M KCl
- 5 mM EGTA
- 0.035 M MgCl2
- 4 %Tritón X-100
16
- 1 % DOC
- 5 mM DTT
- 80 ng/µL Cicloheximida
- 50 ng/µL Cloramfenicol
- 0.5 mg/mL Heparina
Se incubaron las muestras durante 15 minutos en hielo invirtiendo ocasionalmente hasta
que se descongelaran completamente. Posteriormente, se centrifugaron durante 15
minutos a 16000 g a 4 °C, de ser necesario se repitió la centrifugación, hasta que se
obtuvo un sobrenadante libre de restos celulares. Se recogió el sobrenadante de cada
muestra
3.4.4 Elaboración de los perfiles de polisomas
En la parte superior de cada uno de los tubos del gradiente de sacarosa se cargaron 300 µL
de las muestras. Se ultracentrifugaron los tubos a 4 °C durante 3 horas 40 minutos a
210000 g. Seguidamente se observaron los perfiles utilizando el sistema Density Gradient
Fractionation System de Teledyne Isco, Inc.
Las diferentes fracciones del gradiente generadas por el equipo se recogieron en tubos
estériles de 1.5 mL en volúmenes de 1 mL. Debido a que el gradiente es de
aproximadamente 11 mL, se recogieron 11 fracciones. Según las condiciones establecidas
en el equipo, el flujo es de 1 mL/minuto que corresponde a 1 cm en el avance del papel.
Por lo tanto, se recogieron las fracciones de 1 mL cada minuto.
3.4.5 Procesado de las fracciones para aislamiento de RNA
Tras la recolección de 11 fracciones de 1 mL cada una, se procesaron 0.5 mL de cada una
de las mismas para extraer el RNA total guardándose la mitad de la fracción a -80 °C como
réplica experimental.
A cada fracción (0.5 mL) se le añadieron 50 µL de una solución de SDS 5% con 0.2 M EDTA.
Se mezcló bien por inversión o vórtex suave. Se agregó 1 volumen (0.5 mL) de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), se mezcló bien por inversión y vórtex. Se
centrifugaron las fracciones 1 – 2 minutos a 13000 rpm en una microfuga Sartorius 1-14.
Se recogieron 450 µL de la fase acuosa de cada fracción, y se transfirieron a tubos estériles
de 1.5 mL. Se añadió 1 mL de etanol 96 % a cada tubo y se mezcló bien por inversión. Se
centrifugaron las fracciones durante 30 minutos a 13000 rpm en una microfuga Sartorius
1-14.
17
Se descartó el sobrenadante y se dejó secar el precipitado. Se resuspendió el precipitado
en 60 µL de agua estéril y se añadió un volumen de LiCL 6 M. Se mezcló bien y se dejó
precipitar por lo menos durante 1 hora (preferiblemente varias horas) en hielo.
Posteriormente, se centrifugó durante 15 minutos en una microfuga Eppendorf 5430 R a
13000 rpm a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. Se añadieron 150 µL de etanol 70% y se
centrifugaron las fracciones durante 5 minutos a 13000 rpm en una microfuga Sartorius 1-
14. Se eliminó el sobrenadante y se dejó secar el precipitado. Finalmente se resuspendió
con 20 µL de agua estéril.
Tras el procesado de las fracciones, se comprobó la integridad del RNA mediante un gel de
electroforesis.
3.5 Técnicas de Microscopía
3.5.1 Recuento de tipos celulares del xilema en hipocotilos
3.5.1.1 Material vegetal
Se utilizaron plantas de Arabidopsis cultivadas in vitro durante 2 meses en medio MS,
adicionado dexametasona de ser necesario, a las cuales se les extrajo el hipocotilo.
3.5.1.2 Solución de maceración
Se preparó la solución de maceración de la siguiente manera: ácido acético 50% (v/v) y
peróxido de hidrógeno 3 % (v/v), se aforó con agua estéril.
3.5.1.3 Preparación de las muestras
Se depositaron los hipocotilos en 1 mL de solución de maceración colocada en tubos
estériles de 1.5 mL. Se maceró durante 4 horas a 95 °C cuidando de mantener siempre el
volumen de la solución de maceración. Posteriormente se retiró la solución y se lavó dos
veces con agua estéril. Se añadió 1 mL de agua estéril y 150 µL de una solución de Na2CO3
0.5 M, para poder neutralizar. Se comprobó el pH con tirillas. Se retiró la solución y se lavó
tres veces más con agua. Finalmente se resuspendió con 50 µL de agua estéril y se
conservaron los hipocotilos a 4 °C hasta su uso.
18
3.5.1.4 Visualización
Se disgregaron los hipocotilos mediante pipeteo, de esta solución se colocaron 10 µL
sobre un portaobjetos y se tiñeron con 10 µL de calcoflúor 0.01% en agua (p/v). Se colocó
el cubreobjetos y se observó en un microscopio Nikon Eclipse E600 utilizando una lámpara
de fluorescencia UV Nikon y se fotografiaron las células con una cámara Nikon DS-Ri1. Por
cada planta analizada se fotografiaron por lo menos 100 células.
3.5.2 Cortes de hipocotilo para tinción histoquímica
3.5.2.1 Material vegetal
Se utilizaron plantas de Arabidopsis cultivadas in vitro durante 2 meses en medio MS,
adicionando dexametasona de ser necesario, a las cuales se les extrajo el hipocotilo.
3.5.2.2 Solución de fijación
La solución de fijación utilizada fue FAE y se preparó de la siguiente manera: formaldehído
3.7% (v/v), ácido acético glacial 5% (v/v) y etanol 50% (v/v), se aforó con agua estéril.
3.5.2.3 Fijación e inclusión en parafina de los hipocotilos
Se colocó cada hipocotilo en 500 µL de FAE colocado en tubos estériles de 1.5 mL. Se
colocaron los tubos en una bomba a vacío Edwards y se infiltraron hasta que el FAE
comenzó a bullir. Se dejaron en reposo las muestras durante 5 minutos y se repitió la
infiltración dos veces más. Se incubaron los hipocotilos durante toda la noche a 4 °C.
Se incluyeron los hipocotilos en parafina utilizando el procesador de tejidos Leica TP1020
que lo realiza automáticamente.
3.5.2.4 Formación de bloques de parafina y cortes
Se formaron los bloques de parafina en un equipo Leica EG1150 H de cada uno de los
hipocotilos y se dejaron solidificar en un equipo Leica EG1150 C a 4 °C. Se guardaron a
esta temperatura hasta su uso. Se cortaron los bloques con un grosor de 10 µm utilizando
un microtomo Microm HM330 . Se colocaron los cortes sobre portaobjetos de poli-lisina.
Se dejaron las muestras toda la noche a 40 °C para que se fijen en parafina utilizando el
equipo Paltonic de Selecta. Se guardaron los portaobjetos a 4 °C hasta su uso.
3.5.2.5 Desparafinado
Se desparafinaron los cortes de acuerdo al siguiente procedimiento:
- 10 minutos en Histoclear (el histoclear debe eliminarse)
- 10 minutos en Histoclear (el histoclear puede reciclarse)
- 2 minutos en etanol 100%
19
- 2 minutos en etanol 75% (v/v)
- 2 minutos en etanol 50% (v/v)
- 2 minutos en etanol 25% (v/v)
- 2 minutos en agua
Se dejaron secar los cortes y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
3.5.2.6 Tinción de los cortes
Se tiñeron los cortes utilizando una solución de floroglucinol, específico para lignina,
preparada de la siguiente manera: floroglucinol 0.16 M, etanol 16% (v/v) HCl 7.4% (v/v).
Se utilizaron 3 gotas de la solución de floroglucinol en cada portaobjeto.
3.5.2.7 Visualización
Se observaron los cortes en campo claro utilizando un microscopio Nikon Eclipse E600 y se
fotografiaron las células con una cámara Nikon DS-Ri1.
3.5.3 Tinción histoquímica de raíces
3.5.3.1 Material vegetal
Se utilizaron plantas de Arabidopsis cultivadas in vitro durante 7 días en medio MS,
adicionando dexametasona de ser necesario.
3.5.3.2 Deshidratación y rehidratación de las raíces
Se extrajeron las plántulas con cuidado para no romper la raíz y se depositaron en frascos
de plástico que contenían metanol acidificado preparado de la siguiente manera: 10 mL
de metanol, 2 mL de HCl (37%) y 38 mL de agua estéril. Se incubaron las muestras durante
15 minutos a 55-57 °C. Posteriormente se eliminó el metanol acidificado y se agregó
solución básica; 7% NaOH (p/v) en etanol 60% (v/v) y se incubaron 15 minutos a
temperatura ambiente. Seguidamente se rehidrataron las muestras reemplazando la
solución anterior primero con etanol 40% (v/v), después con etanol 20% (v/v) y finalmente
con etanol 10% (v/v) , incubando las muestras durante 10 minutos en cada solución.
3.5.3.3 Tinción y desteñido
Se eliminó el etanol 10% y se tiñeron las plántulas con una solución de fucsina básica
0.05% (p/v) durante 5 minutos. Posteriormente se destiñeron las muestras con etanol
70% (v/v), eliminando la solución de fucsina. Se incubaron durante 10 minutos. Para
rehidratarlas se eliminó el etanol 70% (v/v) y se agregó etanol 10% (v/v) y se incubaron
20
durante 20 minutos. Finalmente se eliminó el etanol 10% y se agregó una solución de
etanol 10% (v/v) y glicerol 50% (v/v) y se incubaron las muestras durante 30 minutos.
3.5.3.4 Visualización
Se montaron las muestras en glicerol al 50% (v/v) en portaobjetos de poli-lisina y se
observaron en un microscopio Leica TCS SL espectro confocal HCX PL APO objetivo
40/1.25 – 0.75 oil CS.
21
4. RESULTADOS
4.1 Aislamiento y selección de líneas transgénicas homocigotas para siDHS en el
fondo genético mutante acl5: obtención de líneas dobles transgénicas acl5siDHS
En el presente trabajo se partió de una colección de semillas transgénicas T2 que incluían
una construcción para silenciar el gen DHS (siDHS) en el fondo genético acl5 de
Arabidopsis que habían sido obtenidas previamente en el laboratorio. El objetivo de
obtener estas plantas dobles transgénicas acl5siDHS es poder realizar estudios para
comprender posibles relaciones de epistasis entre ambas rutas durante la diferenciación
de la vasculatura en Arabidopsis.
La desactivación génica condicional de DHS se consigue gracias a la generación de un RNA
de interferencia dirigido contra la zona 3’UTR tras la adición de dexametasona (Figura 5).
La razón de emplear un sistema condicional de desactivación génica o silenciamiento para
DHS (siDHS) reside en que dicho gen es esencial durante el proceso de gametogénesis en
planta (Feng et al., 2007) probablemente por causar disfunción en la actividad del factor
de traducción eIF5A que también es esencial en dicho proceso.
Como se muestra en la Figura 6, la construcción insertada en la planta consta, entre otras
secuencias, de los sitios attB1 y 2 generados durante la clonación mediante sistema
Gateway, del gen de resistencia a higromicina, y de la secuencia específica diana para
DHS, además del cassette de expresión del factor de transcripción híbrido sintético LhGR
capaz de unirse al promotor pOp6 sólo en presencia de dexametasona (Wielopolska et al.,
2005). La adición de la dexametasona permitirá la activación transcripcional del promotor
divergente pOp6 que simultáneamente genera una horquilla de RNAi para DHS y la
expresión del gen que codifica la proteína delatora GUS.
Figura 6. Construcción insertada en las plantas mutantes acl5 de Arabidopsis mediante agroinfiltración en planta
Figura 5. Esquema ilustrativo de la unión del siRNA a su diana situada en la región 3’UTR del mRNA de DHS
5’UTR DHS
Diana
3’UTR
22
Gracias a la presencia del gen de resistencia a la higromicina en la construcción insertada,
es posible realizar la selección de las plantas transgénicas en función de la resistencia a
dicho antibiótico cuando crecen en un medio en presencia de éste (Figura 7). Así pues,
tras la agroinfiltración de los mutantes acl5 (T0), se obtiene un grupo de semillas de las
que un porcentaje menor al 1% serán resistentes al antibiótico. De estas plantas
resistentes (T1), se obtienen semillas T2, de las cuales se seleccionarán aquellas líneas que
segregan de forma 3:1 (resistentes:sensibles) en medio con higromicina. Al sembrar las
semillas provenientes de esta generación (plantas T3), 1/3 de éstas serán 100% resistentes
y, por tanto, homocigotas para el transgén.
Figura 7. Esquema ilustrativo de la selección de plantas transgénicas homocigotas
Este trabajo se inició a partir de 11 líneas independientes T2, sembrándose alrededor de
60 plantas por línea cuya segregación a la resistencia a higromicina se debía comprobar
para identificar líneas homocigotas. De estas 11 líneas, 7 cumplieron la segregación ¼ AA
no resistentes a higromicina y ¾ Aa, aa: resistentes a higromicina. Alrededor de 16 plantas
resistentes a higromicina de cada una de estas líneas fueron llevadas al invernadero para
obtener semillas T3 para la identificación de plantas homocigotas. Las semillas T3
obtenidas se cultivaron in vitro en placas Petri en medio MS suplementado con
higromicina en las que también se colocaron alrededor de 10 semillas del fenotipo
silvestre (Wt Col-0) como control negativo. Se obtuvieron 6 líneas independientes 100%
23
resistentes a higromicina. Las líneas transgénicas T3 para la inserción de siDHS en el fondo
genético acl5 que finalmente se seleccionaron fueron las siguientes: A, C, D, E, G e I.
4.2 Análisis molecular de la inducción del silenciamiento condicional de las líneas
transgénicas acl5siDHS
La experiencia previa con las construcciones para silenciamiento condicional en el
laboratorio, que sugería cierta variabilidad en la respuesta al tratamiento con
dexametasona, obligó a un análisis de las líneas transgénicas homocigotas aisladas para
comprobar dicha respuesta transcripcional y seleccionar así las líneas optimizadas para
silenciamiento condicional. Para realizar el análisis de la inducción del silenciamiento
dependiente de dexametasona, se crecieron plantas de cada una de las líneas dobles
transgénicas acl5siDHS seleccionadas, así como del genotipo silvestre en placas Petri. El
crecimiento se produjo durante 7 días in vitro en medio MS y posteriormente se pasaron
durante 3 días a medio MS con dexametasona para inducir el silenciamiento, o MS sin
dexametasona (control negativo). Pasados los 3 días, se recogió el material y se procesó
para realizar el análisis de expresión génica mediante RT-qPCR. En este caso, se utilizaron
los cebadores de DHS para estudiar la disminución de los niveles de mRNA en las plantas
inducidas con dexametasona, así como los cebadores del gen PDF2 como gen
normalizador (Czechowski et al., 2005). Los resultados de la RT-qPCR se muestran en la
Figura 8.
Figura 8. Expresión relativa del gen DHS en plantas silvestres (Wt Col-0) y transgénicas (acl5siDHS)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Wt A C D E G I
Exp
resi
ón
Re
lati
va
Líneas acl5siDHS
DHS
- Dexametasona
+ 10 µM Dexametasona
24
A partir de los datos de silenciamiento condicional del gen DHS, se seleccionaron las líneas
A, E y G, para continuar el trabajo porque mostraron una mayor capacidad de
silenciamiento dependiente de dexametasona.
4.3 Caracterización fenotípica de las líneas transgénicas siDHS y acl5siDHS.
Debido a que una de las características principales del mutante acl5 es un defecto vascular
en el xilema, los experimentos planteados para poder determinar una posible interacción
génica entre eIF5A y ACL5 se centraron en analizar el xilema.
4.3.1 Recuento de tipos celulares de xilema en hipocotilos
Para realizar el recuento de los tipos celulares del xilema se utilizaron plantas silvestres,
mutantes acl5, las líneas de silenciamiento de DHS (siDHS) H, M y K; y las líneas acl5siDHS
A, E y G; crecidas en MS adicionando dexametasona de ser necesario. En la Figura 5 se
muestran los resultados de las líneas silvestre, acl5, siDHS K y acl5siDHS A. Los resultados
de las líneas restantes se muestran en el Anexo 1.
Figura 9. Recuento de tipos celulares de xilema en hipocotilos en plantas silvestres (Wt Col-0) y transgénicas (siDHS
línea K y acl5siDHS línea A). –D: MS sin adicionar dexametasona, +D: MS con 10 M dexametasona
Como ya se ha documentado en la literatura, y se puede apreciar en la Figura 9, el
mutante acl5 presenta un mayor número de células de tipo espiral y una reducción en el
tipo de células maduras punteadas debido a una aceleración en el proceso de muerte
celular que impide la correcta deposición de lignina. En las líneas transgénicas de
0
20
40
60
80
100
120
Wt -D Wt +D K -D K +D acl5 -D acl5 +D A -D A +D
Tipos Celulares del Xilema
Punteado
Reticular
Espiral
Anular
25
silenciamiento de DHS (línea K en la Figura 9), lo que observamos es una reducción en el
número de células de xilema en el hipocotilo, y prácticamente la totalidad de éstas tiene
completada su maduración con una extensa deposición de lignina siendo casi todas del
tipo punteado. En las plantas dobles transgénicas acl5siDHS línea A, lo que observamos al
aplicar la dexametasona es una tendencia a revertir el fenotipo de acl5 provocando un
incremento en el número de células punteadas del xilema y una reducción en los tipos
espirales. Por lo tanto, el silenciamiento de DHS permite complementar parcialmente los
defectos de acl5 recuperando parcialmente la proporción de los elementos traqueales
encontrada en acl5 hacia la proporción que presenta el genotipo silvestre.
4.3.2 Cortes de hipocotilos para tinción histoquímica
La tinción histoquímica de los cortes de hipocotilos se realizó utilizando plantas silvestres,
mutantes acl5, las líneas de silenciamiento siDHS H, K y M y las líneas dobles transgénicas
acl5siDHS A, E y G; crecidas en MS adicionando dexametasona, de ser necesario. Los
resultados de las líneas silvestre (Wt Col-0), acl5, siDHS K y acl5siDHS A se muestran en la
Figura 10 en la página siguiente. Los resultados de las líneas restantes se encuentran en el
Anexo 2.
26
Wt
acl5
siDHS K
acl5siDHS A
- Dexametasona + Dexametasona
Figura 10. Tinción histoquímica de cortes de hipocotilo en plantas silvestres (Wt Col-0) y
transgénicas (siDHS línea K y acl5siDHS línea A). La barra equivale a 100 m.
Con esta técnica se confirmó que la mutación acl5 provoca un incremento en la
vasculatura y por el contrario, el silenciamiento de DHS produce una drástica reducción
del xilema. Los dobles mutantes acl5siDHS aparentemente mantienen el patrón de acl5 en
cuanto al incremento del xilema.
27
4.3.3 Tinción histoquímica de raíces
Para realizar la tinción histoquímica de raíces se utilizaron plantas silvestres, mutantes
acl5, la línea siDHS M y la línea acl5siDHS A; crecidas en MS adicionando dexametasona,
de ser necesario. Los resultados obtenidos del patrón de organización del xilema en la
zona proximal de la raíz (zona de elongación y diferenciación), visualizados mediante
proyecciones de microscopía confocal, se muestran en la Figura 11.
Estos estudios mediante tinción de raíces con fucsina básica confirmaron los resultados
obtenidos con la tinción histoquímica con floroglucinol de los cortes de hipocotilos en lo
que respecta al volumen de tejido xilemático. Además se pudo comparar el número de
haces vasculares de las muestras, determinando que los mutantes acl5 y acl5siDHS
tratados con dexametasona poseen un mayor número de haces que el fenotipo silvestre y
más desorganizados, y que posiblemente los haces vasculares en las plantas de
silenciamiento de DHS son más pequeños que en el control sin tratar o respecto al
silvestre.
Figura 11. Tinción histoquímica de raíces en plantas silvestres (Wt Col-0) y transgénicas (siDHS línea M y acl5siDHS
línea A). –D: MS sin adicionar dexametasona, +D: MS con 10 M dexametasona. La barra equivale a 16 m.
Wt –D siDHS M -D siDHS M +D acl5 -D acl5siDHS A+D
++++D
28
4.4 Perfil traduccional del gen SSS31 (AJAX2) en la línea acl5siDHS A
La complementación parcial del fenotipo de acl5 mediante el silenciamiento de DHS, nos
hizo pensar en la posibilidad de que su acción estuviese mediada por facilitar la traducción
del gen AJAX2, que como se ha descrito en la literatura, es un mRNA con uORFs cuya
traducción está comprometida en el mutante acl5 ya que se sabe que mutaciones en cis
en dichas secuencias uORFs complementan el defecto de acl5. Para evaluar esta
posibilidad realizamos un estudio mediante perfiles de polisomas del perfil traduccional
de AJAX2 en Arabidopsis. En la Figura 12 se muestran los resultados del perfil de
polisomas del gen AJAX2 de las muestras con fenotipo silvestre y acl5siDHS crecidas en MS
con y sin dexametasona.
Con este resultado se pudo observar que utilizando esta técnica no es posible determinar
diferencias en cuanto al perfil traduccional del gen AJAX2. Hay que resaltar que esta
técnica, por razones desconocidas, no permite caracterizar alteraciones traduccionales
que deberían ser aparentes para AJAX2 en el mutante acl5 frente a plantas silvestres con
lo que no podemos llegar a conclusiones definitivas con este estudio.
Figura 12. Perfil de polisomas de SSS31 en plantas silvestres (Wt Col-0) y transgénicas (acl5siDHS)
29
4.5 Análisis molecular de la expresión de los genes dianas de ACL5: ATHB8, VND6
y SAMDC4 en las línea siDHS K y acl5siDHS A.
Con el fin de realizar una aproximación molecular a la posible relación entre ACL5 y eIF5A
se analizaron las expresiones de genes diana de ACL5: ATHB8, VND6 y SAMDC4. La
expresión de estos genes se encuentra desreprimida en el mutante acl5. Dos de ellos,
ATHB8 y VND6 están relacionados con el proceso de formación del xilema;
específicamente con su identidad y diferenciación, respectivamente. SAMDC4 es una
enzima que cataliza la formación de S-adenosilmetionina descarboxilada (SAMdc),
sustrato requerido por las aminopropiltransferasas para la biosíntesis de espermidina,
espermina y termoespermina en Arabidopsis (Cui et al., 2010). Los resultados de la
expresión de ATHB8 en las líneas silvestres, acl5, siDHS K y acl5siDHS A mediante RT-qPCR
se muestran en la Figura 13.
Figura 13. Expresión relativa del gen ATHB8 en plantas silvestres (Wt Col-0) y
transgénicas (siDHS línea K y acl5siDHS línea A)
Posteriormente se realizó el mismo análisis en la líneas siDHS H y M y en las líneas
acl5siDHS E y G. Los resultados de la expresión de los genes ATHB8, VND6 y SAMDC4 se
muestran en las Figuras 14, 15 y 16 para esas líneas transgénicas.
0
1
2
3
4
5
6
7
Wt acl5 siDHS K acl5siDHS A
Exp
resi
ón
Re
lati
va
ATHB8
- Dexametasona
+ 10 µM Dexametasona
30
Figura 14. Expresión relativa del gen ATHB8 en plantas transgénicas (siDHS H y M y acl5siDHS E y G)
Figura 15. Expresión relativa del gen VND6 en plantas transgénicas (siDHS H y M y acl5siDHS E y G)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
siDHS H siDHS M acl5siDHS E acl5siDHS G
Exp
resi
ón
Re
lati
va
ATHB8
- Dexametasona
+ 10 µM Dexametasona
0
1
2
3
4
5
6
siDHS H siDHS M acl5siDHS E acl5siDHS G
Exp
resi
ón
Re
lati
va
VND6
- Dexametasona
+ 10 µM Dexametasona
31
Figura 16. Expresión relativa del gen SAMDC4 en plantas transgénicas (siDHS H y M y acl5siDHS E y G)
De acuerdo con los resultados obtenidos se pudo determinar que no existen diferencias
entre acl5 y acl5siDHS (con y sin dexametasona) en cuanto a los niveles de expresión de
genes diana de ACL5, por lo que la actividad de eIF5A podría darse mediante otro
mecanismo de acción independiente de la regulación transcripcional dependiente de
ACL5.
0
5
10
15
20
25
30
siDHS H siDHS M acl5siDHS E acl5siDHS G
Exp
resi
ón
Re
lati
va
SAMDC4
- Dexametasona
+ 10 µM Dexametasona
32
5. DISCUSIÓN
Como se mencionó en la Introducción, las auxinas y citoquininas son hormonas esenciales
en la especificación del xilema. En este sentido, se conoce que los tejidos vasculares son
inducidos y controlados por un movimiento polarizado de auxinas a lo largo de la planta
(Aloni, 2010). Estudios realizados en raíces por Aloni y colaboradores (Aloni et al., 2006),
sugieren que los haces del xilema son inducidos por corrientes alternas de
concentraciones altas frente a concentraciones bajas de auxinas. Las concentraciones
altas de auxinas inducen la formación de vasos de protoxilema; y por el contrario,
concentraciones bajas de auxinas inducen los haces de floema, los cuales están siempre
separados y ubicados en la periferia del cilindro vascular. A nivel molecular, un flujo de
salida alto de auxinas en el eje del xilema promueve la expresión del gen ATHB8,
involucrado en la identidad del xilema, y promueve la especificación de protoxilema
(Bishopp et al., 2011). A su vez ATHB8 regula a un factor de transcripción, VND6, que
regula la expresión de genes necesarios para el desarrollo del xilema, los cuales codifican
una variedad de proteínas asociadas con la formación de la pared celular secundaria de los
elementos traqueales, como las celulosa sintasas, y con la muerte celular programada,
como las nucleasas y proteasas (Kubo et al., 2005). Puesto que VND6 participa tanto en la
diferenciación como en la muerte celular, es necesario un equilibrio de su actividad para
poder completar la diferenciación de los elementos traqueales antes de que se dé su
muerte celular (Ohashi-Ito et al., 2010).
Por otro lado, se ha demostrado en Arabidopsis que las citoquininas regulan
negativamente la diferenciación del protoxilema. Estudios realizados por Mähönen y
colaboradores (Mähönen et al., 2006), muestran que la señalización de citoquininas es
necesaria para promover y mantener las identidades celulares distintas del protoxilema y
que en la ausencia de la señalización de estas hormonas, la única identidad
predeterminada es la de protoxilema. Se ha observado, que durante la embriogénesis y el
crecimiento temprano de la raíz, plantas mutantes en los receptores de citoquininas
muestran un patrón radialmente simétrico de diferenciación celular; en el cual todas las
células vasculares se diferencian como protoxilema (Bishopp et al., 2011).
Entre estas dos hormonas se produce una interacción mutua inhibidora. Se ha mostrado
recientemente que el transporte de citoquininas a través del floema es una importante
fuente de estas hormonas en el procambium y que su alta señalización en las células del
procambium induce la exprexión y localización de proteínas PIN. Por otro lado, una fuerte
señalización de auxinas en la posición del protoxilema promueve la expresión de AHP6,
inhibidor de señalización de citoquininas. La manipulación del transporte o de la
33
señalización de auxinas o citoquininas desplaza el límite entre estos dominios hormonales
(Bishopp et al., 2011).
En la Figura 17 se muestra un modelo de la actividad de las auxinas y citoquininas en el
desarrollo del xilema.
En el recuento de tipos celulares del xilema en hipocotilos, los mutantes acl5 se
caracterizaron por un elevado número de células del protoxilema, con respecto al
resultado obtenido en las plantas silvestres. Este fenotipo ha sido descrito en estudios
realizados previamente, en los cuales se demuestra que ACL5 es requerido para la
correcta especificación del xilema a través de la regulación del tiempo de vida de los
elementos del xilema, posiblemente mediado por auxinas y su inducción de ATHB8 y
consecuentemente de VND6 que, como se ha mencionado, además de regular genes que
codifican proteínas involucradas en la formación de la pared celular secundaria, también
regula la expresión de proteínas asociadas con muerte celular. Es decir, que el fenotipo de
muerte celular acelerada y falta de deposición de lignina de los elementos traqueales que
presenta acl5 provoca un desarrollo incompleto de los vasos (Muñiz et al., 2008). Este
incremento en el protoxilema también puede ser evidenciado mediante tinción
histoquímica de los cortes de hipocotilo y en la tinción de las raíces de acl5, en los cuales
se observa un notable aumento en el volumen del xilema. Este resultado concuerda con lo
observado por Yoshimoto y colaboradores (Yoshimoto et al., 2012), quienes demostraron
que en acl5 existe un efecto inductor de la diferenciación de los vasos del protoxilema.
Este efecto se debe a que la termoespermina podría ser un factor antagonista a las
auxinas en la regulación del patrón del tiempo y espacio de la diferenciación del
protoxilema. Por lo tanto, en acl5 la termoespermina es muy necesaria para limitar el
Figura 57. Efecto de las auxinas y citoquininas en el desarrollo del xilema. Las líneas discontínuas reflejan funciones parcialmente caracterizadas. CKs citoquininas; AUX auxinas; PC procambium; PX protoxilema; MX metaxilema
34
efecto inductor de las auxinas en la diferenciación del xilema que además de provocar un
aumento en el volumen del protoxilema, regulan negativamente a las citoquininas
mediante AHP6 produciendo que la mayoría de las células vasculares se diferencien como
protoxilema.
Un posible modelo sobre lo que podría estar ocurriendo en el mutante acl5 se muestra en
la Figura 18.
Figura 18. Modelo del desarrollo del xilema en acl5 que presenta hiperacumulación de células de Px incompletamente
diferenciadas
Por el contrario, en la tinción histoquímica de los cortes y de raíces de las líneas siDHS
crecidas en MS con dexametasona, el volumen del xilema se ve reducido drásticamente,
como ya ha sido descrito por Liu y colaboradores (Liu et al., 2008), al provocar la ausencia
de eIF5A. Este efecto puede ser el resultado de un incremento en la regulación negativa
que tienen las citoquininas sobre la diferenciación del protoxilema, sugiriendo que eIF5A
podría actuar reprimiendo esta regulación negativa. De esta manera, el procambium
presente en las líneas siDHS sería diferenciado en una mínima proporción en protoxilema,
debido a una excesiva regulación negativa de las citoquininas. Con el resultado del
recuento de los tipos celulares del xilema se determinó que la mayoría del protoxilema
diferenciado madura completamente convirtiéndose en células punteadas. El aumento en
el número de células lignificadas puede ser el resultado de una posible represión ejercida
por eIF5A sobre la maduración de los elementos traqueales, ya sea directamente o
mediante la interacción con otros elementos como las auxinas. Otra posibilidad es que al
reducir la actividad de eIF5A, se produzca un retraso en la muerte celular, dando tiempo a
que las células del protoxilema maduren completamente. La posible actividad de eIF5A en
el desarrollo del xilema se representa en la Figura 19.
35
Figura 19. Modelo del desarrollo del xilema en siDHS que presenta reducción
de células de xilema completamente diferenciadas en MX.
Finalmente, en el recuento de los tipos celulares del xilema en la doble transgénica
acl5siDHS cuando es crecida en MS adicionando dexametasona, se observa una reversión
parcial del fenotipo hacia una planta silvestre. Sin embargo, en la tinción histoquímica de
los cortes de hipocotilo y en la tinción de raíces no se observan diferencias entre
acl5siDHS y acl5, sugiriendo que la señal de auxinas se conserva alta debido a la ausencia
de ACL5, provocando un incremento en el volumen del protoxilema. A pesar de esto, el
silenciamiento de DHS que causaría un retraso en la muerte celular, permite que más
células del xilema, que las encontradas en acl5, puedan llegar a su maduración.
A pesar de que los resultados del análisis molecular de la expresión de los genes diana de
ACL5: ATHB8, VND6 y SAMDC4 en las líneas acl5siDHS no mostraron una diferencia en
cuanto a su nivel de expresión con respecto a acl5, no se deben descartar posibles
alteraciones en el patrón de localización de expresión de estos genes para poder afirmar
que el mecanismo de acción es independiente de la regulación transcripcional
dependiente de ACL5.
Tomando en cuenta el conocimiento previo y los resultados obtenidos en este trabajo se
propone un modelo hipotético sobre las funciones de eIF5A y ACL5 en el desarrollo del
xilema mostrado en la Figura 20, según el cual, las actividades de ambas proteínas
afectarían probablemente a los mismos procesos a través de mecanismos independientes.
Por un lado eIF5A reprimiría la regulación negativa de las citoquininas sobre la
diferenciación del protoxilema y ejercería una represión sobre la maduración de los
elementos traqueales, directa o indirectamente. Por otro lado ACL5 es requerido para la
regulación del tiempo de vida de los elementos del xilema y limitaría el efecto inductor de
las auxinas en la diferenciación de este tejido vascular.
36
Figura 20. Modelo hipotético del papel de las funciones de
eIF5A y ACL5 en el desarrollo del xilema
37
6. CONCLUSIONES
1. La pérdida de actividad de ACL5 produce alteraciones opuestas a la desactivación de
DHS durante el proceso de diferenciación y maduración del xilema en hipocotilos y raíz.
2. La desactivación conjunta de ACL5 y DHS mantiene un patrón similar a la mutación acl5
en cuanto al incremento del xilema, pero presenta una reversión parcial del fenotipo
de acl5 en los recuentos de elementos traqueales. Existe por lo tanto una
complementación mutua entre ambas pérdidas de función durante el desarrollo del
xilema.
3. La actividad de eIF5A durante el desarrollo del xilema parece actuar de manera
independiente de la ruta regulada por ACL5.
4. El mecanismo de acción de ambas rutas podría explicarse mediante una modulación de
procesos controlados por las hormonas auxinas y citoquininas que se llevaría a cabo de
modo independiente por ACL5 y eIF5A
38
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42
8. ANEXOS
Anexo 1
Figura 21. Recuento de tipos celulares de xilema en hipocotilos en plantas silvestres (Wt Col-0) y transgénicas (siDHS
líneas H, K y M y acl5siDHS líneas A, E y G). –D: MS sin adicionar dexametasona, +D: MS con 10 M dexametasona
0
20
40
60
80
100
120
WT -D WT +D H -D M -D K -D K +D acl5 -D acl5 +D A -D A +D E -D E +D G -D G +D
Tipos celulares de xilema
Punteado
Reticular
Espiral
Anular
43
Anexo 2
siDHS H
acl5siDHS E
acl5siDHS G
N.D.
- Dexametasona + Dexametasona
Figura 22. Tinción histoquímica de cortes de hipocotilo en plantas transgénicas (siDHS líneas H y acl5siDHS líneas E y
G). La barra equivale a 100 m. N. D.: No Determinado