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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

“DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS

INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL

MEZCAL TAMAULIPECO”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

PRESENTA:

Biól. JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

Diciembre del 2009, Reynosa (Tam.), México

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de

Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología

Genómica del Instituto Politécnico Nacional, bajo la

dirección de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona.

DIVERSIDAD GENÉTICA DE LEVADURAS INVOLUCRADAS EN LA FERMENTACIÓN DEL MEZCAL TAMAULIPECO

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA I JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

ÍNDICE

ABREVIATURAS _________________________________________________________ VI

DEDICATORIA _________________________________________________________ VII

AGRADECIMIENTOS ____________________________________________________ VIII

RESUMEN _______________________________________________________________ IX

ABSTRACT _______________________________________________________________ X

1. INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 1

2. ANTECEDENTES ________________________________________________________ 2

2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino ____________________ 2

2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio _________________ 5

2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados ________________________________ 7

2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt) ___________________________ 8

2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN (RFLP) __ 8

2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) __________ 8

2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH) _________________________________ 9

2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila ______________________________ 11

2.3.1. El jimado ________________________________________________________ 11

2.3.2. Cocción _________________________________________________________ 11

2.3.3. Molienda: obtención del mosto _______________________________________ 12

2.3.4. Fermentación _____________________________________________________ 13

2.3.5. Destilación _______________________________________________________ 13

3. JUSTIFICACIÓN ________________________________________________________ 15

4. HIPÓTESIS ____________________________________________________________ 16

5. OBJETIVO GENERAL ___________________________________________________ 16

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS _______________________________________________ 16

7. MATERIALES Y MÉTODOS ______________________________________________ 17

7.1. Levaduras ___________________________________________________________ 17

7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol ______________________________ 17

7.2. Extracción de ADN de las levaduras ______________________________________ 18

7.2.1. Identificación molecular de las levaduras _______________________________ 18

7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg _______________ 20

7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal ______________ 21

7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto ________________________________ 22


_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA II JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

7.4.1. Medios de cultivo _________________________________________________ 22

7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave ______________________________ 22

7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) ___ 23

7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco _____________________________ 24

7.5. Análisis estadístico ___________________________________________________ 25

7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC ___________ 25

7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR ___________ 26

8. RESULTADOS _________________________________________________________ 28

8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos ____________________________ 28

8.2. Identificación molecular de las levaduras __________________________________ 29

8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal _________________ 34

8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave _______________________________ 35

8.3.1. Consumo de azúcares reductores _____________________________________ 35

8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave ________________________ 36

8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores ___________________ 36

8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos ________________________________ 39

8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR ______________________________ 42

8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol ___________________________ 46

9. DISCUSIÓN ____________________________________________________________ 48

9.1. Caracterización morfológica y molecular __________________________________ 48

9.2. Diversidad fenotípica __________________________________________________ 51

9.3. Diversidad genética y productividad ______________________________________ 51

10. CONCLUSIONES ______________________________________________________ 54

11. RECOMENDACIONES _________________________________________________ 55

12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________________________ 56

13. APÉNDICE ___________________________________________________________ 60

14. GLOSARIO __________________________________________________________ 101


_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA III JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

Lista de figuras

Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como etanol,

glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae. __________________________________________ 3

Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le dan

un sabor desagradable al mezcal. _____________________________________________________ 11

Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave _______________________________________ 12

Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave __________________________________ 13

Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas __________________________________________ 13

Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado. ______________________________ 14

Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se llevo a

cabo este trabajo. _________________________________________________________________ 17

Figura 8. Esquema de la región ribosomal que involucra los genes 18S, 5.8S y 26S, además de las regiones no

codificantes ITS1 e ITS2 y la localización de los oligonucleotidos utilizados en este trabajo. ______ 19

Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras

con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___________ 20

Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13

levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo. ___ 20

Figura 11. Curva de calibración para fructosa ___________________________________________________ 24

Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC ____________________________________________________ 26

Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para

clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri

(ovalada). Objetivo 100X. __________________________________________________________ 29

Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4 utilizando

el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum

Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del

GenBank fue utilizada como grupo de salida. ___________________________________________ 32

Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor Joining.

La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-

muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como

grupo de salida. ___________________________________________________________________ 33

Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae

(S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery

(P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.). ___ 35

Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.); B)

Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E)

Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.). __________ 37


_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA IV JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces

cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia

kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.,

P.g.). ___________________________________________________________________________ 38

Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae _________ 42

Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las levaduras

Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias euclidianas. __ 43

Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T.

delbrueckii. ______________________________________________________________________ 44


Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de

distancias euclidianas. _____________________________________________________________ 45

Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras probadas

en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae). _________________________________________ 46

Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces

marxianus (K.m.) y Torulaspora delbrueckii (T.d.). ______________________________________ 47


_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA V JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

Lista de cuadros

Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp. _____ 10

Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS _____________ 23

Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las levaduras

aisladas en diferentes etapas del proceso. _______________________________________________ 28

Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos de

mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI. _____________________________ 30

Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San Carlos

(Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la

diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson. __________________________________________ 34

Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar ____________________________________________ 39

Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por HPLC. 40

Lista del apéndice

APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el que se

encuentra en el gel de agarosa de la PCR. ______________________________________________ 61

APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. _____________________________ 62

APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que tienen

células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X _________________________________ 63

APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para la elaboración

de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones. ___________________________ 72


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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VI JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

ABREVIATURAS

g Microgramos

L Microlitro

M Micromolar

A260 Absorbancia a 260 nm

A280 Absorbancia a 280 nm

ADNg Ácido desoxiribonucléico genómico

AFLPs Polimorfismos de la Longitud de los Fragmentos Amplificados.

dNTP Deoxinucleótidotrifosfato

DO Densidad óptica (nm)

EDTA Ácido etilendiaminotetracético

mg Miligramos

mL Mililitro

mM Milimolar

NH4OAc Acetato de amonio

nm Nanómetros

ºC Grados centígrados

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PDA Agar papa dextrosa

rpm Revoluciones por minuto

Taq ADN polimerasa de Thermus aquaticus.

TGY Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura


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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VII JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

DEDICATORIA

A mis padres María Guadalupe Mireles Berlanga y Pedro Arratia Arratia que siempre han

estado conmigo en las buenas y en las malas por darme la vida, su amor y sobre todo su apoyo

incondicional ya que la mejor forma de agradecerles todo lo que me han dado es con mis

logros profesionales.

Y especialmente para la Dra. Paty quien creyó en mí y por estar siempre ayudándome en cada

etapa de mi tesis por su apoyo y por no permitirme desistir en los momentos más difíciles

Gracias.


_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA VIII JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona por su asesoría para llevar a cabo este proyecto y

por creer en mí.

A mi comité revisor de tesis la M.C. María Antonia Cruz Hernández, el Dr. José Alberto

Narváez Zapata, Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez y el M.C. Víctor Moreno por sus críticas

constructivas que hicieron en cada presentación de avances.

A la M.C. Amanda Alejandra Oliva Hernández por su ayuda durante el desarrollo del trabajo

de laboratorio.

A todos mis compañeros de laboratorio Isabel, Erika, Paco, Salvador, Eliseo, Samantha,

Amanda, Elizabeth y Leandro por su amistad y compañía que siempre tuve durante mi

estancia en el laboratorio.

A la generación 2007-2009 por su amistad y apoyo durante estos dos años y por compartir su

compañerismo y amistad siempre.

Al maestro Víctor e Israel del área de servicios por su apoyo en el uso del HPLC y por su

ayuda durante la secuenciación de las muestras.

Y a todas las personas que de alguna manera directa o indirectamente contribuyeron al

desarrollo de este trabajo.

Finalmente, se agradece el apoyo económico del CONACyT, por la Beca de Estudios

otorgada, así como al Instituto Politécnico Nacional por la Beca Tesis otorgada, para la

terminación del presente trabajo. Los insumos y la movilidad fueron apoyados por los

proyectos CONACyT Básica2006-57576, y los proyectos SIP2008-0597 y SIP2009-0613,

junto con el complemento de beca (PIFI) asociada a estos proyectos del Instituto Politécnico

Nacional.


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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA IX JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

RESUMEN

El mezcal es una bebida artesanal de México con denominación de origen. A pesar de que esta

bebida tiene una importancia económica para los estados donde se elabora, hace falta realizar

más investigaciones acerca de la micoflora involucrada en la fermentación. Las levaduras son

las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir gracias a ellas la

fructosa, obtenida de la hidrólisis de la inulina al cocerse la piña de esta planta, es

transformada en etanol y otros compuestos que le dan sabor, y si bien existen varios trabajos

en la literatura que analizan la fermentación del mosto de Agave tequilana Weber var azul

(para producir tequila), son muy pocos los resultados reportados para otras especies de Agave.

En este trabajo se estudió la micoflora presente durante la fermentación de una mezcalera

tamaulipeca, y se obtuvieron 51 aislamientos, pertenecientes a 9 especies diferentes de

levaduras colectadas en diversas etapas de la fermentación, y se caracterizaron por su

capacidad de consumo de azúcares y producción de etanol a 15 aislamientos de

Saccharomyces cerevisiae, 12 de Kluyveromyces marxianus, 5 de Torulaspora delbrueckii, 6

de Pichia kluyveri, 4 de P. guillermondii, 2 de P. mexicana, 5 de Clavispora lusitaniae, 1 de

Candida parasilopsis y 1 de Zygosaccharomyces bailii. De manera relevante, todos los

aislamientos fueron capaces de producir etanol en concentraciones variables, no solamente S.

cerevisiae, lo cual indica que todas contribuyen a la fermentación alcohólica. El análisis

global genómico mediante la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales de

bandeo inter e intra especies, y si bien no fue posible determinar a priori las características

productivas de un aislamiento basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí pueden ser

utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los aislamientos,

que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la fermentación, para verificar

que la población deseada se encuentra presente en el proceso. Este trabajo constituye el primer

reporte de caracterización global molecular y productiva de las levaduras involucradas en la

producción del mezcal tamaulipeco.


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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA X JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

ABSTRACT

Mezcal is a mexican artisan liquor with denomination of origin and very unique organoleptic

characteristics. Despite the economic importance of this industry, there is a lack of of

information concerning the micoflora involved in mezcal fermentation. The yeast are

responsible for the fermentation of Agave must, converting the sugars obtained from the

thermal hydrolysis of inulin present in the “piña” (Agave stalk) to ethanol and other

compounds that confer the mezcal its unique flavor. There are several reports concerning the

characterization of must of Agave tequilana Weber var Azul (to obtain tequila), but very few

with other Agave species. In this work the fermentation of a tamaulipeca mezcalera was

sampled, and 51 isolates were obtained, belonging to 9 different species from all stages of the

fermentation, and they were molecularly identified and characterized in terms of consumption

of sugars and ethanol production. Fifteen isolates were identified as Saccharomyces

cerevisiae, 12 of Kluyveromyces marxianus, 5 of Torulaspora delbrueckii, 6 of Pichia

kluyveri, 4 of P. guillermondii, 2 of P. mexicana, 5 of Clavispora lusitaniae, one of Candida

parasilopsis and one of Zygosaccharomyces bailii. All isolates were able to produce ethanol

in variable concentration, not only S. cerevisiae, which meant that all were contributing to the

alcoholic fermentation. The global genomic analysis performed by rep-PCR allowed us to

obtain differential patterns that were inter and intraspecific, although it was not possible to

predict the productive behavior of the isolates by this analysis, nonetheless this technique can

be used for fingerprinting of the isolates and to track their presence during the fermentation.

This work is to our knowledge the first report of global molecular and productive

characterization of all the yeast involved in the production of Tamaulipas´ mezcal.


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CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 1 JOSÉ MANUEL ARRATIA MIRELES

1. INTRODUCCIÓN

Las bebidas elaboradas mediante la fermentación alcohólica han sido producidas por el

hombre desde hace miles del años, acompañando el proceso de construcción de las

civilizaciones. En la actualidad su consumo genera una importante fuente de divisas para

los países que las producen. Entre las bebidas alcohólicas más importantes se tiene a la

cerveza, el vino y las bebidas destiladas como el whisky, el ron y el tequila. La cerveza es

elaborada a partir de la fermentación de cereales malteados, mientras que el vino, mezcal y

tequila son producidos por la fermentación del jugo de frutas y agave, respectivamente. La

destilación de bebidas malteadas producen el whiskey, el vino destilado produce el brandy,

la destilación de melazas de caña de azúcar fermentadas producen el ron y la destilación del

fermentado de cereales y bayas de enebro producen la ginebra. En cualquiera de los casos,

la etapa más importante en la producción de estas bebidas es la fermentación, proceso en el

cual los azucares son transformados en etanol por levaduras principalmente de la especie

Saccharomyces cerevisiae. Esta se encuentra involucrada en todas las etapas de

fermentación desde el inicio de esta hasta su terminación, siendo la más tolerante a altas

concentraciones de etanol. El tequila y el mezcal se elaboran por fermentación alcohólica

utilizando levaduras capaces de realizar la biotransformación de la glucosa a etanol y

bióxido de carbono. En México existen diferentes especies de Agave con los cuales se

elaboran bebidas alcohólicas , tales como el Agave tequilana con el cual se elabora el

tequila, Agave salmiana y Agave angustifolia con los que se elabora el mezcal, el Agave

maximiliana con el que se elabora el sotol, además de que existen otras especies como el

Dacilirium con el cual se elabora la raicilla. El proceso de elaboración del mezcal es

rudimentario y generalmente se realiza en cinco etapas: jimado, cocción, molienda,

fermentación y destilación. A pesar de que México por denominación de origen es el único

productor de mezcal y tequila, la mayoría de las investigaciones a cerca de las levaduras

involucradas en la fermentación de estas bebidas son en el tequila aunque los dos son

elaborados bajo los mismos principios, por lo que existe una escasa información de las

levaduras que participan en la fermentación del mezcal de Tamaulipas, en especial de

aquellas que le dan sus características organolépticas distintivas.


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2. ANTECEDENTES

Dada la importancia que las bebidas fermentadas presentan tanto desde el punto de vista

científico como económico, y debido al papel fundamental que juegan las levaduras y

bacterias en éste proceso, a continuación se presentan los aspectos biológicos más

importantes relacionados con la bebida alcohólica más estudiada: el vino, y la información

existente del producto más emblemático de nuestro país: el tequila. Para ello en la presente

revisión se analizan los siguientes aspectos: la bioquímica y la biología de la fermentación

alcohólica del vino; las sucesiones microbianas durante la fermentación alcohólica y su

metodología de estudio, y el proceso de elaboración del tequila y del mezcal.

2.1. Bioquímica y biología del proceso de fermentación del vino

La fermentación alcohólica por definición es el proceso bioquímico de extracción de

energía en el cual compuestos orgánicos sirven tanto de donador (piruvato) como aceptor

(NAD+) de electrones, teniendo como productos el etanol y bióxido de carbono.

C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + ∆

El alcohol etílico (etanol, C2H5OH) es producido por microorganismos (levaduras y

bacterias) durante un proceso que no requiere la participación del oxígeno (anaerobio). Este

etanol es la base de la producción de bebidas alcohólicas complejas, sin embargo, también

tiene usos como solvente industrial y como aditivo para la gasolina, entre otros. Dicha

fermentación comienza con el transporte de azúcares a través de la membrana y su

metabolización por la vía glucolítica (Embden-Meyerhof-Parnas principalmente). Las

levaduras son principalmente los microorganismos involucrados en la producción de etanol,

estos son anaerobios facultativos, lo que significa que pueden vivir sin oxigeno; cuando hay

oxigeno lo utilizan para oxidar la glucosa completamente y de esa manera obtener ATP

(respiración). En condiciones anaerobias ellas pueden transforman la glucosa en acido

pirúvico siguiendo la secuencia de reacciones que conlleva la glucólisis, como se muestra

en la figura 1.


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Figura 1. Rutas metabólicas aerobias y anaerobias de la degradación de la glucosa y su excresión como

etanol, glicerol y acetato en Saccharomyces cerevisiae.

El segundo mayor producto derivado de la fermentación alcohólica producido por S.

cerevisiae es el glicerol. Esta molécula es sintetizada a partir de la dihidroxiacetona fosfato,

un intermediario de la glucólisis. Este compuesto es reducido por la enzima Gdp

GLUCOSA

GLUCOSA 6-P

FRUCTOSA 6-P

GLICERALDEHIDO 3-PDIHIDROXIACETONA-PGLICEROL

3-P GLICERATO

FOSFOENOLPIRUVATO

PIRUVATO

OXALACETATO

ACETALDEHIDO

ETANOL

PIRUVATO

ACETATO

SERINAGLICINA

TREONINA

ACETATO

ACETIL-CoA

ALANINA

BIOMASA

BIOMASA

BIOMASA

ALANINA

BIOMASA

BIOMASA

BIOMASA

PENTOSA 5-P

BIOMASA

MEDIO

CITOSOL

α-KETOGLUTARATOSUCCINATO

OXALACETATO MALATO

MITOCONDRIA

ACETIL-CoA


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(dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato deshidrogenasa) a glicerol 3-fosfato el cual es

desfosforilado por la enzima Gpp (dependiente de NAD-glicerol 3-fosfato fosfatasa) a

glicerol el cual puede ser usado por la levadura como fuente de carbono y energía, así como

para proteger a la célula contra altas temperaturas, estrés oxidativo y estrés hiperosmotico

acumulándose intracelularmente en células que son expuestas a decreciente actividad de

agua extracelular. (Folch-Mallol et al., 2004).

Las bebidas alcohólicas son elaboradas por bioconversión o biotransformación de la

glucosa en etanol (fermentación), proceso que es llevado a cabo mediante una serie de

reacciones químicas realizadas por levaduras y bacterias específicas como parte de su

metabolismo de producción de energía, cuyo rendimiento varía según el microorganismo

involucrado y sus capacidades metabólicas específicas, como por ejemplo el trabajo

realizado por Sánchez et al., (2005) quienes compararon la secuencia glucolítica de

Debaryomyces hansenii y S. cerevisiae, observando que S. cerevisiae produjo

aproximadamente cuatro veces mas etanol que D. hansenii. La relación entre el consumo de

glucosa y la producción de etanol fue casi 3 veces más alta que en D. hansenii.

La fermentación del jugo de uva (mejor conocido como mosto) es realizada por una serie

de interacciones entre microorganismos en los cuales están involucradas bacterias,

levaduras, hongos e incluso virus, y éstas determinan el perfil ecológico de la producción y

tiene influencias positivas o negativas en el sabor del vino. La producción de etanol durante

la fermentación es principalmente llevada a cabo por la levadura Saccharomyces cerevisiae,

la cual se encuentra de manera natural en los mostos de uva (Fleet et al., 1984), y juega un

papel central debido a sus capacidades metabólicas en el proceso de fermentación de

mostos (Zagorc et al., 2001).

Las levaduras generalmente se originan de la micoflora epifítica natural de las uvas, de la

flora asociada con la superficie de los equipos de vinería y los cultivos iniciadores que son

añadidos. Los hongos filamentosos se encuentran en la producción del vino en varias etapas

durante la serie de operaciones, y su principal impacto más importante tiene lugar durante


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el cultivo, ya que pueden causar la pudrición de la cosecha, especialmente la provocada por

Botrytis cinerea (Fleet, 2003).

Un importante fenómeno ocurre con algunas cepas de levaduras, las cuales secretan

proteínas o glicoproteínas tóxicas que son letales para cepas sensibles de diferentes

especies, por lo que se han denominado levaduras killer ó zimocidas (Zagorc et al., 2001).

La actividad killer ha sido encontrada en los géneros Saccharomyces, Candida,

Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, Willopsis y

Zygosaccharomyces y han sido aisladas de muchos nichos ambientales como lagos, ríos,

frutas y vegetales así como de la fermentación de varios alimentos y bebidas. El interés

ecológico en este tipo de levaduras deriva debido a que cuando están presentes pueden

dominar el proceso de fermentación, cuando poseen características enológicas positivas

pueden ser usadas como inoculo inicial y producir una bebida de excelente calidad.

En un estudio del vino realizado por Versavaud et al. (1995) en cuanto a la diversidad

genética de S. cerevisiae, los autores concluyen que la fermentación espontánea es iniciada

por algunas especies tales como: Kloeckera apiculata, Candida famata, Rhodotorula sp.,

Metschnikowia pulcherrima y Saccharomyces cerevisise y que esta última se encuentra

presente en todas las etapas de fermentación desde el inicio hasta el final de esta. Los

autores detectaron 14 cepas killer de las cuales solamente 4 cepas fueron resistentes a la

toxina K2, y 10 fueron sensibles, mientras que las cepas asociadas fueron neutrales. La

cepa predominante fue S. cerevisiae y era del tipo killer 2 con la asociación de cepas que

generalmente eran neutrales y algunas sensibles.

2.2. Las sucesiones microbianas en el vino y sus técnicas de estudio

La calidad final del vino es determinada por toda esta gama de microorganismos los cuales

están presentes en diferentes cantidades en los mostos y que se desarrollan durante la

fermentación, determinando en gran medida la cantidad y tipos de las muchas substancias

que contribuyen en el olor, color y sabor característico de esta bebida (Fleet et al., 1984).


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Tradicionalmente la elaboración del vino es realizada de forma espontánea por las

levaduras presentes en las uvas y en los tanques o quipo de vinería. Por lo general las

especies de Hanseniaspora (y su anamorfo Kloeckera), Metschnikowia, Pichia y Candida

crecen durante las etapas tempranas de fermentación, pero comienzan a perecer conforme

progresa la fermentación y comienza a aparece en mayor proporción la especie S.

cerevisiae. Esta levadura no es predominante en la micoflora epifitica de la uva, ya que

generalmente se encuentra en concentraciones de 10 a 100 CFU/gr. Sin embargo, conforme

la fermentación avanza, aparece en mayor proporción y se incrementa hasta llegar al final

del proceso como prácticamente la única levadura presente en forma activa (Fleet, 2003).

Generalmente las cepas de Hanseniaspora (Kloeckera), Candida y Metschnikowia inician

la fermentación y éstas se originan de las uvas. Algunas veces las especies Pichia,

Issatchenkia y Kluyveromyces pueden tener crecimiento en estas etapas y llegan a alcanzar

hasta 106 o 10

7 CFU/ml a la mitad de la fermentación, pero empiezan a declinar hasta

morir, durante este tiempo S. cerevisiae se vuelve predominante (107-10

8 CFU/ml) y

continua la fermentación hasta que esta termina (Fleet, 2003).

La producción de etanol por S. cerevisiae es considerado el factor que gobierna el

crecimiento microbiano e influencia a las especies no-Saccharomycetaceas durante la

fermentación. Por lo general las especies Hanseniaspora (Kloeckera), Candida,

Metschnikowia, Pichia, Issatchenkia y Kluyveromyces se encuentran en el jugo y no son

tolerantes al etanol cuando este supera 5 a 7 % , lo cual explica que declinen y mueran

conforme avanza la fermentación, poco después de iniciada la etapa exponencial del

proceso (Fleet, 2003).

Las levaduras nativas son requeridas para la producción del vino en específicos ambientes

característicos de cada región (Araujo et al., 1998). Los autores concluyen que las especies

de S. cerevisiae y S. rouxii son las especies que prevalecen durante la fermentación del vino

en el estado de Zulia (Venezuela).


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Las presencia de bacterias también tienen influencias positivas (y negativas, dependiendo

de las especies presentes) en la producción de bebidas alcohólicas. Estas contribuciones

pueden ser moderadas por interacciones con levaduras. Los dos grupos principales de

bacterias que son importantes en la microbiología del vino son las bacterias acidolácticas y

las bacterias acidoacéticas (Fleet, 2003). Dentro de las bacterias acidolácticas los géneros

Lactobacillus y Pediococcus son las más relevantes y junto con Oenococcus oeni conducen

la fermentación maloláctica. Mientras que entre las bacterias acidoacéticas se encuentran

Acetobacter aceti, Pasteurianus y Gluconobacter oxidans. Esta fermentación es siempre

negativa dentro del proceso de producción de vino.

La fermentación maloláctica es la segunda fermentación más importante que ocurre en

muchos vinos generalmente de 2 a 3 semanas después de la terminación de la fermentación

alcohólica. La principal bacteria responsable de esta fermentación es O. oeni, durante esta

fermentación funciona para incrementar la acidez del vino por transformación del acido

málico en acido láctico aumentando el sabor y complejidad del vino (Fleet, 2003).

La mayoría de los estudios para identificar las especies de levaduras que aparecen en el

proceso de fermentación generalmente están basados en la morfología comparativa,

cultivos e identificación utilizando algunos criterios bioquímicos, la fisiología y la genética

convencional de estas especies pero estas técnicas son tardadas y generalmente solo se

puede identificar hasta el nivel de género. Es por eso que en algunos estudios se han

utilizado técnicas basadas en el ADN.

Las principales técnicas empleadas para identificar levaduras de la fermentación se

describen a continuación, haciendo énfasis en su utilización en vino y tequila.

2.2.1. Electroforesis en gel de campos pulsados

La metodología de campos pulsados permite analizar el ADN genómico de levaduras para

diferenciar en una misma especie, si los microorganismos analizados son iguales (clones) o

no (policlonales). La técnica consiste en una variación de la electroforesis hecha en un gel

de agarosa, en donde la orientación del campo eléctrico a través del gel se cambia


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periódicamente, en vez de mantenerse constante. Esto permite que fragmentos grandes de

ADN se separen por tamaño, en forma efectiva. Esta técnica fue usada por Versavaud et al.

(1995) para identificar la diversidad genética de cepas nativas de S. cerevisiae.

2.2.2. Polimorfismo del ADN mitocondrial (ADNmt)

Esta técnica está basada en el contenido de G+C existente en el ADN nuclear (ADNn) en

comparación con el del ADN mitocondrial, el ADNn tiene aproximadamente un 40% de

contenido de G+C mientras que el ADNmt tiene solamente el 20 % por lo tanto, si se

utilizan enzimas de corte específico para regiones ricas en G+C puede separarse debido a

que el ADNn sería cortado en pequeños fragmentos no detectables en el gel de agarosa

mientras que el ADNmt produciría fragmentos de mayor tamaño detectables en el gel de

agarosa. En un estudio realizado por Sabate et al. (1998) se analizó la diversidad de cepas

de S. cerevisiae en la fermentación de vino usando esta técnica, y encontraron una gran

diversidad de cepas nativas de S. cerevisiae. Concluyen que S. cerevisiae es la

predominante durante la fermentación sin embargo en algunos otros estudios tienden a

confundirla y clasificarla incorrectamente como S. bayanus.

2.2.3. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción del ADN

(RFLP)

La técnica de RFLP se basa en el polimorfismo del ADN cuando es digerido con enzimas

de restricción, lo cual visualizado en un gel de electroforesis, produce un patrón de bandas

polimórficas de diferentes tamaños. Debido a que los cortes generados con estas enzimas

difieren entre un organismo y otro por la distancia entre el sitio de corte, Zagorc et al.

(2001), usaron esta técnica para identificar levaduras zimocidas (killer) de aislamientos de

levaduras de vino.

2.2.4. Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP)

Esta técnica combina el uso de la PCR y los RFLP, y consiste en cortar el ADN con dos

enzimas de restricción, una de corte frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los

fragmentos se les ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas,


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se amplifica por PCR probando diferentes combinaciones de complementariedad del

oligonucleótido con el sitio de restricción, con lo cual se puede disminuir o aumentar el

número de bandas amplificadas y comparar su polimorfismo generado. Una ventaja

especial de esta técnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una

sola reacción, por lo que deben visualizarse en un gel de poliacrilamida de alta resolución.

Esta técnica fue usada para comparar las levaduras del genero Saccharomyces de mostos de

agave (Flores-Berrios et al., 2005). Los autores encontraron cuatro diferentes especies de

este género (S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, y S. paradoxus) y el agrupamiento de

los aislamientos de acuerdo al proceso de donde fueron aisladas.

2.2.5. Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Con esta técnica se pueden analizar células o tejidos completos, para la cual son

primeramente fijados e hibridados con sondas específicas para los genes 18S o 28S del

ADNr marcadas con algún fluorocromo. Posteriormente las células marcadas pueden verse

a un microscopio óptico de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células

completas se hibridan se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN,

amplificación por PCR y clonación. Xufre et al. (2006) utilizaron esta técnica para analizar

poblaciones dinámicas de levaduras en mostos de uva a nivel laboratorio. En su estudio

muestran la identificación exacta mediante esta técnica de las especies presentes en la

fermentación y concluyen que las especies Candida stellata, Torulaspora delbrueckii y

Kluyveromyces spp. Deben también ser tomadas en cuentas como inóculos iniciales ya que

tienen influencias positivas en el sabor del vino.

En el cuadro 1 se muestran a las principales levaduras y bacterias que han sido identificadas

en los mostos de uva y de agave con las diferentes técnicas moleculares descritas

anteriormente. En el se presentan las diferentes etapas de fermentación en el cual aparecen

estas especies y como al transcurrir el tiempo y pasar las diferentes fases de fermentación la

mayoría de las especies que se encuentran en los mostos desaparecen permaneciendo

solamente las mas aptas a altas concentraciones de etanol.


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Cuadro 1. Levaduras y bacterias que han sido identificadas de mostos de Vitis vinifera y de Agave spp.

Microorganismo

Tipo de mosto Etapa de fermentación Fermentación

maloláctica Autor

Uva Agave Exponencial

temprana

Exponencial

tardía Estacionaria

Kloeckera XXX XXX XX X Ø Ø 1,3,7,11,13

Torulopsis stellata XXX XX X Ø Ø 1

Saccharomyces

cerevisiae

X X XX XXX XXX Ø 1,2,3,4,5,6,

7,8,9,10,11

,12,13

S. bayanus Ø X X XX XX Ø 8,9

S. pastorianus Ø X X XX XX Ø 9

S. paradoxus Ø X X XX XX Ø 9

S. rouxii X Ø X XX XX Ø 4

Hanseniaspora XXX Ø X Ø Ø Ø 3,6,10

Metschnikowia XXX Ø X Ø Ø Ø 3,7

Torulaspora XX X Ø Ø Ø Ø 10,12

Candida sp XXX X X Ø Ø Ø 3,6,7,10,11

,13,12

Rhodotorula XX X X Ø Ø Ø 7,12

Cryptococcus XX Ø X Ø Ø Ø 6

Pichia XXX X X Ø Ø Ø 3,6,10

Willopsis XX Ø X Ø Ø Ø 6

Kluyveromyces XXX X X Ø Ø Ø 3,6,10,12

Debaryomyces XXX X X Ø Ø Ø 6,12

Zygosaccharomyces XX Ø X Ø Ø Ø 6

Issatchenkia XX X X Ø Ø Ø 3,12

Lactobacillus X Ø X X XX XXX 3

Pediococcus X Ø X X XX XXX 3

Oenococcus X Ø X X XX XXX 3

Acetobacter X Ø X X XX XXX 3

Gluconobacter X Ø X X XX XXX 3

Ø. Ausente, X. Escaso, XX. Moderado, XXX. Abundante.

Tomado de: 1Fleet et al., (1984),

2Zagorc et al,. (2001),

3Fleet (2003),

4Araujo et al., (1998),

5Sánchez et al.,

(2005), 6Versavaud et al., (1995),

7Cronwright et al., (2002),

8Sabate et al., (1998),

9Flores-Berrios et al.,

(2005), 10

Xufre et al., (2006), 11

Arrizon et al., (2006), 12

Jacques et al., (2006), 13

Fiore et al., (2005).

Otra técnica rápida que ha sido usada recientemente es el polimorfismo en la conformación

de cadena sencilla (SSCP) la cual ha mostrado ser una técnica muy poderosa logrando

encontrar diferencias en especies las cuales tiene un cambio en un solo nucleótido. Esta

técnica puede ser usada con fragmentos relativamente cortos de aproximadamente 200 pb

(Qui-Ming et al., 2008), y permite encontrar diferencias en algunas especies de

Saccharomyces y Candida debido a la migración de fragmentos amplificados de la región

ITS1 e ITS2 en un gel de acrilamida.


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2.3. El proceso de elaboración del mezcal y tequila

El mezcal y el tequila son bebidas alcohólicas elaboradas en México por fermentación y

destilación del jugo de algunas plantas de Agave tales como A. salmiana, A. angustifolia, A.

tequilana y A. potatorum (Flores et al., 2005). El mezcal es una bebida alcohólica regional

obtenida por destilación y fermentación de mostos preparados directa y originalmente con

los azucares extraídos de las piñas maduras del Agave, las cuales son previamente cocidas

para hidrolizar los azúcares, y son sometidas a fermentación alcohólica, con inóculos

espontáneos o comerciales de levaduras. Generalmente el proceso es dividido en cinco

diferentes fases: el jimado, el cocimiento de la piña, la extracción del mosto, la

fermentación y la destilación.

2.3.1. El jimado

En esta etapa es en la cual se cortan las pencas (Fig. 2) para dejar solo la piña, la cual

después es rasurada para eliminar la raíz y todo lo que le pueda dar sabor desagradable al

mezcal. Una vez obtenida la piña se lleva al horno de cocción.

Figura 2. La figura muestra la recolección de las piñas y su posterior raspado o jimado de las partes que le

dan un sabor desagradable al mezcal.

2.3.2. Cocción

La cocción se lleva a cabo para hidrolizar o transformar la inulina, el principal polisacárido

presente en la piña de las plantas de agave. La inulina es convertida en azúcares libres,

principalmente fructosa, para su posterior fermentación (Mancilla y Margalli 2002). A la


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reacción que ocurre durante el calentamiento de las piñas de agave se le denomina reacción

de Maillard, y es un conjunto de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y

azúcares reductores cuando este se calienta aunque no sea a altas temperaturas. Los

productos mayoritarios de estas reacciones son moléculas cíclicas y poli cíclicas, que

aportan sabor y aroma al mezcal y tequila. La cocción se realiza en un horno construido a

partir de un agujero cavado en la tierra (Fig. 3) y recubierto con piedras al rojo vivo

después de haber colocado en su fondo las piñas, ó en autoclaves industriales.

Figura 3. Horno de cocción en el suelo de las piñas de agave

2.3.3. Molienda: obtención del mosto

La molienda tiene como finalidad hacer que los monosacáridos obtenidos en la cocción

estén más disponibles a la acción microbiana, así como a la captación de microorganismos

del medio para favorecer la fermentación. La molienda se lleva a cabo generalmente

utilizando un “trapiche” (Fig. 4). Este esta hecho de madera con 2 troncos unidos

simulando los engranes, y dos troncos largos amarrados que son jalados por dos caballos.

En versiones industrializadas, molinos de martillo o de tornillo sinfín realizan la extracción

del mosto.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula


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Figura 4. Trapiche rústico con el cual se muelen las piñas de agave

2.3.4. Fermentación

Es el proceso en el que las levaduras transforman los monosacáridos del Agave en etanol

por medio de la fermentación alcohólica. Esta operación se lleva a cabo en tinas abiertas, de

madera (Fig. 5) durante un tiempo aproximado de ocho a diez días, tomando en

consideración la temperatura ambiente. Puede usarse como inóculo el remanente de la

fermentación anterior que se deja en el fondo, o inocular con cepas de levaduras

comerciales.

Figura 5. Tanque de fermentación rústico en Tamaulipas

2.3.5. Destilación

En esta operación se efectúa la separación del alcohol del resto del mosto fermentado

aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullición. El etanol, debido a su estructura


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molecular, tiene un punto de ebullición más bajo que el agua (78.5 o

C a nivel del mar), por

lo tanto, se separa de ésta al alcanzar esta temperatura. El dispositivo utilizado para la

destilación tradicional es el alambique (Fig. 6) Este equipo está conformado por cuatro

elementos fabricados en cobre debido a su alta conductividad térmica, de tal forma que

facilita la transferencia de calor calentándose y enfriándose fácilmente alcanzando así la

temperatura apropiada de separación. En versiones industriales, se puede utilizar una torre

de platos. Durante la destilación también se separan otros compuestos volátiles tales como

el acetaldehído, etil acetato, metanol, n-propanol, isobutanol, alcohol amílico y alcoholes

superiores (Arrizon et al., 2006).

Figura 6. Destilador rustico utilizado para destilar el mosto fermentado.

Todas estas etapas determinarán la calidad final del producto a obtener, sin embargo, se

sabe que las más importantes son la fermentación y la destilación.


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3. JUSTIFICACIÓN

Las levaduras son las responsables de la fermentación de los mostos de Agave, es decir

gracias a ellas la fructosa que se encuentra en la piña de esta planta es transformada en

etanol y otros compuestos que le dan sabor al mezcal y al tequila, sin embargo las mayoría

de las investigaciones que se han realizado acerca de las bebidas alcohólicas que se

elaboran en México son sobre el tequila y esta información no puede ser extrapolada al

mezcal ya que no utilizan las mismas plantas de Agave.

México por denominación de origen es el único productor de mezcal el cual tiene una

importancia económica para los estados donde se elabora, además de ser una bebida típica

artesanal del país por lo que hace falta realizar más investigaciones acerca de las levaduras

que se encuentran involucradas en la fermentación del mezcal.

En Tamaulipas el mezcal se elabora en los municipios de San Carlos, Jiménez, Bustamante,

Palmillas, Miquihuana, Méndez, San Nicolás, Jaumave y Cruillas este deja importantes

ganancias económicas para los productores. Como en todos los productos de producción

bebidas alcohólicas, la levadura S. cerevisiae es la mas importante durante el proceso de

fermentación, de ahí la importancia de aislar levaduras con una alta productividad de

etanol que podrían ser utilizadas como inoculo inicial para producir un mezcal con

excelente calidad ayudando a los productores a competir mejor en el mercado. En este

trabajo se propone realizar una caracterización genética de levaduras aisladas durante la

fase exponencial de producción de mezcal, y determinar si existe una relación entre los

niveles de productividad de etanol y el perfil genético determinado a nivel genómico.


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4. HIPÓTESIS

La productividad de etanol de una población de levaduras está relacionada con su

diversidad genética.

5. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar genética y productivamente a las levaduras involucradas en la fermentación

del mezcal.

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar genéticamente y caracterizar morfológicamente a las levaduras presentes

en los mostos de mezcal tamaulipeco.

Caracterizar la productividad alcohólica de las levaduras.

Caracterizar la diversidad genética de las levaduras mediante una técnica de análisis

global de su ADN.

Correlacionar la diversidad genética de las levaduras con su productividad.


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7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1. Levaduras

Las levaduras utilizadas en este trabajo pertenecen a la colección del Laboratorio de

Biotecnología Industrial y fueron aisladas de fermentaciones de la vinata en el ejido “El

Palmar” en el municipio de San Nicolás Tamaulipas donde se produce el mezcal. La

imagen de satélite (Fig. 7) muestra la localización de dicha vinata.

Figura 7. Ubicación geográfica del Ejido El Palmar lugar donde se colectaron las levaduras con la que se

llevo a cabo este trabajo.

Un total de 51 aislamientos fueron obtenidos los cuales fueron primeramente caracterizados

de acuerdo a la forma de la célula separándolas de esta manera en dos grupos: morfología

redonda u ovalada (Cuadro 2) y las cuales fueron aisladas de diferentes etapas de la

fermentación, la cual fue caracterizada por la concentración de azúcares presentes en el

momento del muestreo, con lo cual les fue asignada una clave.

7.1.1. Conservación de las levaduras en glicerol

Todas los aislamientos fueron crecidos hasta la mitad de la fase exponencial en caldo YPF,

y se diluyó con glicerol estéril hasta una concentración final de glicerol del 86%, y

almacenadas a -70 °C.


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7.2. Extracción de ADN de las levaduras

Las cepas se cultivaron en medio YPDA (Extracto de levadura 5 g L-1

; peptona 3 g L-1

;

glucosa 20 g L-1

; agar 20 g L-1) y se colocaron en el agitador orbital durante 18 horas a 30

°C y 250 rpm. Se utilizó el protocolo de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda

(1985) con las siguientes modificaciones: Se colocaron de 40 a 50 mg de la muestra de

levaduras en tubos eppendorf estériles y se sumergieron en nitrógeno líquido por 20

minutos, posteriormente se maceraron con un pistilo estéril. Se agregó 500 µl de solución

amortiguadora de extracción (200 mM de Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM de

EDTA y 0.5% de SDS) y se incubó por 10 minutos, posteriormente se añadieron 500 µl de

fenol-cloroformo mezclando en vortex por 5 minutos y se centrifugó a 13,000 rpm durante

30 minutos. La fase acuosa fue transferida a otro tubo adicionando 400 µl de cloroformo

frío mezclando durante un minuto seguido de centrifugación a 13,000 rpm por 5 minutos y

transfiriendo a un nuevo tubo, adicionando 8 µl de RNAsa e incubando a 37 °C,

posteriormente se adicionan 500 µl de isopropanol frío mezclando por inversión ligera e

incubando a -20 °C por 15 minutos y centrifugando por 5 minutos a 13,000 rpm, el

sobrenadante fue desechado y se agregaron 500 µl de etanol al 70% mezclando por

inversión y centrifugando, de igual manera el sobrenadante fue desechado y el tubo fue

colocado boca abajo en papel secante para que se evaporara el etanol durante

aproximadamente 30 minutos. La pastilla fue re suspendida en 50 µl de agua estéril. El

ADN obtenido fue visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™ 10X.

7.2.1. Identificación molecular de las levaduras

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue utilizada para

amplificar regiones utilizadas para identificar a nivel de especie a las levaduras utilizadas

en este trabajo. En Saccharomyces cerevisiae como en todos los hongos existen cuatro

regiones de ADNr (5S, 5.8S, 18S y 26S) y están agrupados en arreglos de cabeza a cola

formando un grupo sencillo que se ubica en el cromosoma 12. Los genes 18S y 26S se

encuentran separados por los espaciadores internos (ITS) (Fig. 8) los cuales no son

secuencias codificantes excepto por los genes pequeños 5S y 5.8S (Montrocher et al. 1998).


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Figura 8. Esquema de la región ribosomal elaborado con la secuencia Saccharomyces cerevisiae

(EU649672) que involucra las regiones 18S (SSrDNA), 5.8S y 26S (LSrDNA), además de las regiones no

codificantes ITS1 e ITS2, la localización de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo y el tamaño de los

fragmentos esperados.

La amplificación por PCR de estas regiones mostró una similaridad en el tamaño de las

bandas que para la región 26S las cuales fueron de aproximadamente 800 pb mientras que

en el caso de la región ITS mostró más diferencias encontrando bandas que iban desde 500

hasta 800 pb (Fig. 9 y 10).

Se amplificó la región 26S y la ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg utilizando los oligonucleótidos

reportados por White et al., (1990): NL1 (5’ GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) y

NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’) para la región 26S y los oligonucleótidos ITS1

(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) para

la región ITS1-5.8S-ITS2. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Perkin Elmer

GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en un

volumen final de 25 μl, utilizando 1 μl del ADN, 2.5 μl de Buffer 10X, 0.75 μl de cloruro

de magnesio de 25 mM, 0.2 μl de dNTPs 10 mM, 1 μl de cada uno de iniciadores 5 μM y

0.2 μl de la enzima Taq DNA polimerasa 5 U/5μl y completando el volumen a 25 μl con

agua milliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de desnaturalización por

5 min a 94ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94ºC, 30 seg a 59 ºC para ITS o 63 ºC para 26S y 1

min a 72ºC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 10 min a 72ºC. Posteriormente

los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% mezclando 5 μl del

producto de PCR con 3 μl de SyberGold™ y depositándolos en el gel el cual se corrió en

una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad a 100V por 30 min. De igual manera los

productos de PCR fueron visualizado en un gel de agarosa al 1.0% teñido con SyberGold™

10X, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D (Figs. 8 y 9).

Los productos de PCR fueron purificados con el Kit comercial Wizard SV and PCR clean

up System de Promega para su posterior secuenciación. La imagen obtenida de cada una de


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las regiones amplificadas se muestra a continuación donde además se puede observar el

tamaño del fragmento obtenido el cual para la región 26S fue de aproximadamente 800 pb,

mientras que para la región ITS1-5.8S-ITS2 fue de entre 300 y 700 pb.

Figura 9. Amplificación por PCR de la región 26S M. marcador de peso molecular, muestras 1-16 levaduras

con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

Figura 10. Productos de PCR de la región ITS1-5.8-ITS2 M. marcador de peso molecular, muestras 1-13

levaduras con morfología redonda, 1-35 levaduras con morfología ovalada, C. control negativo.

7.2.2. Secuenciación de la región 26S e ITS1-5.8S-ITS2 del ADNg

Los fragmentos amplificados por PCR una vez que ya habían sido purificados se procedió a

su secuenciación utilizando el secuenciador automático de capilar ABI Prism (Applied

800pb

800pb

800pb

700pb

300pb

700pb

700pb 300pb


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Biosystem Modelo 3130) con los siguientes oligonucleótidos: NL1

(5’GCATTCAATAAGCGGAGGAAAAG3’) forward para la región 26S, y el ITS1

(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’) forward para la región ITS. Las reacciones de

secuenciación se realizaron como sigue. Los productos de PCR purificados fueron

nuevamente amplificados utilizando la siguiente reacción: 4 μl de Buffer big dye v 3.1 5X,

1 μl de iniciador, 4 μl de Big dye v 3.1 ready mix, 2 μl del producto de PCR, 9 μl de agua

esteril milliq para un volumen final de 20 μl. Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo de 96

°C por 1 minuto, seguido de 25 ciclos a 96 °C 10 segundos, 59 °C para los ITS o 63 °C

para los 26S y 60 °C durante 4 min. Posteriormente la reacción de secuenciación fue

purificada adicionando 2 μl de EDTA 125mM, 2 μl de NaOAC 3M pH 5.2 y 50 μl de

etanol absoluto Merck mezclando suavemente e incubando a -20 °C durante 20 minutos y

centrifugando a 14000 rpm por 15 minutos a 4 °C, se hizo un segundo lavado con 70 μl de

etanol al 70% mezclando, incubando y centrifugando como en el paso anterior, secando la

pastilla utilizando un termo-mixer (Eppendorf) durante aproximadamente 30 minutos,

posteriormente fueron secuenciadas en el Área de Biotecnología del CBG.

Una vez obtenidas las secuencias, estas se alinearon en la base de datos BLAST del NCBI

para su comparación e identificación, se seleccionaron las secuencias de referencia con las

cuales tenían similitud, posteriormente se elaboraron los árboles de distancias génicas con

las dos regiones usando el método Neighbor-Joining Saitou et al (1987) con un bootstrap

de 1000 replicas, la distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum

Composite Likelihood, también se estimo la divergencia evolutiva entre secuencias usando

el método Maximum Composite Likelihood dato no mostrado, todo este análisis

filogenético fue elaborado en el programa MEGA4 (Tamura et al., 2007).

7.3. Cálculo de los índices de diversidad de la fermentación del mezcal

Para conocer la diversidad de las especies y poblaciones involucradas en la fermentación

del mezcal, se calcularon los índices de diversidad y dominancia de Simpson, así como el

índice de Shannon, de acuerdo a las siguientes fórmulas:

Índice de dominancia de Simpson

D´= (n/N)2


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Índice de diversidad de Simpson

D= 1/(n/N)2

Donde N= Número total de variedades presentes de todas las especies

n = Número de variedades por especie

Índice de diversidad de Shannon

H = - (pi) * ln (pi)

Donde pi = Proporción de variedades de la especie i respecto al total de variedades

presentes de todas las especies, es decir, la abundancia relativa de variedad ni/N, donde:

ni = Número de variedades de la especie i

N = Numero de todas las variedades de todas las especies

7.4. Fermentaciones modelo en medio de mosto

7.4.1. Medios de cultivo

Los aislamientos se activaron en el medio de cultivo rico YPFA (extracto de levadura 5 g,

peptona 3 g, fructosa 20 g y agar 20 g) aforando hasta un litro con agua destilada y se

calento por aproximadamente 15 min. o hasta que se tornara translúcido, se esterilizó por

15 min a 121 oC, y se vació en cajas petri de 9 cm de diámetro. Cada aislamiento fue

sembrado por duplicado en cajas petri.

Para preparar el inóculo de los experimentos, se tomó una asada del aislamiento reactivado

en YPFA, y se inoculó en 30 mL del medio YPF (sin agar) colocado en un matraz de 200

mL.

7.4.2. Preparación del medio de mosto de agave

Con el fin de estudiar el sistema de fermentación del mezcal bajo condiciones de vinata, se

preparó un medio de cultivo basado en mosto fresco de agave, el cual fue filtrado y

centrifugado a 7000 pm por 15 minutos, y debido a que su concentración inicial de azúcares


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


reductores fue de 170 g L-1

, fue diluido con agua estéril hasta alcanzar una concentración de

100 g L-1

de azúcar, se le agregó 1 g L-1

de sulfato de amonio (NH4)2 SO4 y se esterilizó

para matar a los microorganismos presentes. Los experimentos se llevaron a cabo en tubos

falcon de 50 ml y por duplicado añadiendo la cepa la cual fue crecida en el medio líquido

midiendo la concentración con el uso de un espectrofotómetro a una D.O. de 0.05 y

aforando hasta 30ml con mosto el cual contenía 1 g L-1

de (NH4)2SO4 como fuente de

nitrógeno y colocándolas en una estufa a 30 °C durante 60 horas (tiempo de cosecha).Se

cuantificó la concentración de azúcar residual en cada experimento utilizando el método del

DNS, y la biomasa por peso seco. Se utilizo la prueba de ANOVA para escoger levaduras

que representaran a cada uno de los grupos formados por la comparación de medias en el

programa SAS.

7.4.3. Cuantificación de azucares reductores por DNS (ácido 3,5-

dinitrosalicílico)

El método DNS se basa en la reducción del acido 3,5-dinitrosalisilico (el cual se encuentra

de color amarillo naranja) por la glucosa y/o fructosa al acido 3-amino-5-nitrosalisilico (de

color rojo obscuro) (Miller, 1959), cuya presencia puede detectarse por la lectura de la

absorbancia. La solución DNS esta compuesta por 5 g de hidróxido sodio; 5 g de ácido 3,5-

dinitrosalicílico; 2.5 g de bisulfito de sodio y 1 g de fenol en cristales completando a 500

mL de agua y evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15

horas de su preparación. Posteriormente se realizó una curva patrón (Fig. 11) con diferentes

concentraciones de fructosa que va desde 0 a 1.2 g L-1

como se muestra en el cuadro 2 a

continuación:

Cuadro 2. Concentración de fructosa y curva de calibración obtenida para el método del DNS

No. De dilución Concentración

de fructosa

Agua

(ml)

Fructosa

(mL)

0 0 0.500 0

1 0.2 0.475 0.025

2 0.4 0.450 0.050

3 0.6 0.425 0.075

4 0.8 0.400 0.100

5 1 0.375 0.125

6 1.2 0.350 0.150


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


_________________________________________________________________________

Figura 11. Curva de calibración para fructosa

El análisis se efectúo en un tubo de ensayo conteniendo 0.5 ml de reactivo DNS y 0.5 ml de

la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la curva patrón,

incubándose a 100 °C durante 10 minutos; enfriando por 10 minutos en hielo, agregando 5

ml de agua estéril y determinando la absorbancia a 570 nm (Miller, 1959).

7.4.4. Cuantificación de la biomasa por peso seco

La concentración celular se determinó por el método de peso seco, esta técnica permite la

estimación de la biomasa total de cada levadura. Para ello se pesaron tubos Falcon de 50

mL limpios y secos, y se les agregó 30 mL del medio YPF e inoculó con la levadura a

probar, y se corrió la fermentación durante 60 h, después de lo cual se centrifugó a 2500

rpm por 15 min y se colectó el sobrenadante, y el tubo con la pastilla celular se secó a a 50

°C por 24 h, se colocó en un desecador por 12 h más, y se pesó el tubo con la muestra seca,

restándole el peso del tubo limpio como se observa en la fórmula. Este método puede

llevarse en paralelo con el de espectrometría, con el fin de obtener la correlación entre D.O.

y concentración en biomasa por peso seco (Alfermann et al., 1997). La fórmula utilizada se

muestra a continuación:

Donde:

y = 0.1545xR² = 0.9954

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.00 0.50 1.00 1.50

Ab

sorb

anci

a 5

70

nm

Concentración de fructosa (g L-1)


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Pf = peso final de la muestra en el tubo

P0 = peso del tubo

V = Volumen de la muestra

PS = peso seco del mosto

7.5. Análisis estadístico

Se analizaron los resultados de biomasa y consumo de azúcares reductores utilizando una

prueba ANOVA con un diseño experimental completamente al azar, y comparando las

medias obtenidas por la prueba de la Diferencia Mínima Significativa (LSM por sus siglas

en inglés) en el programa SAS y el programa Excel. De los resultados obtenidos por la

prueba de LSM se escogieron las medias que fueran significativamente diferentes para

analizar su productividad de manera fina por cromatografía de líquidos de alta resolución

(HPLC por sus siglas en inglés), y estos datos se utilizaron para realizar el cálculo de los

parámetros de productividad y rendimiento de cada una de las levaduras analizadas en este

estudio.

7.6. Cuantificación de azúcares consumidos y etanol producido por HPLC

Para la cuantificación tanto del consumo de azúcares del mosto (glucosa y fructosa) como

para la del etanol producido, las muestras a las 60 h que fueron centrifugadas para remover

cualquier resto celular o fibra del medio de mosto, se filtraron 3 mL utilizando una

membrana de 0.20 μm, y se inyectaron 20 l de la muestra en un equipo de HPLC (Agilent

1100 seriesTM

) equipado con una columna BioRadTM

Aminex HPX (300 X 7.8 ml). La fase

móvil se preparó con agua milliQ y ácido sulfúrico al 0.005 M con un flujo de 0.5 mL min-1

con un tiempo de analisis de 30 min, a una temperatura de 35ºC y se midió la absorbancia a

190 nm. Las curvas de calibración se prepararon con concentraciones de 1 a 15 g L-1

,

haciéndose la regresión lineal para la cual el cuadrado de coeficiente de correlación de

Person (R2) no debió ser menor a 0.95 (Fig.12). A continuación se muestran las curvas de

concentración del compuesto vs el área bajo la curva del cromatograma correspondiente:


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Glucosa Fructosa

Etanol

Figura 12. Curvas de calibracion para HPLC

7.7. Determinación de la diversidad genética de las levaduras por rep-PCR

Una de las técnicas reportadas para la caracterización de la diversidad genética de una

población con varias especies es la rep-PCR, que se basa en la utilización de

oligonucleótidos degenerados universales, los cuales amplifican regiones repetidas del

genoma, y que visualizadas en un gel de agarosa produce un patrón de bandas característico

de especie analizada. Para esto a partir del resultado de los árboles de distancias generados

con el programa MEGA4 y el resultado obtenido del HPLC se escogieron los aislamientos

que presentaron mayor producción de etanol, separándolos en 3 grupos por especie: el de

las Saccharomyces cerevisise, el grupo de las Kluyveromyces marxianus y el grupo de las

Torulaspora delbreckii, realizando esta técnica con cada grupo como se muestra a

continuación. El ADNg de las levaduras fue sometido a esta técnica usando los

oligonucleótidos REPIR-1 (5’IIIICGICGICATCIGGC3’) y REP2-I

(5’ICGICTTATCIGGCCTAC3’) de acuerdo a Hierro et al., 2004. Las condiciones de

y = 307.67xR² = 0.9976

0

1000

2000

3000

4000

5000

0 10 20

Are

a

Concentración de glucosa (g L-1)

y = 1058.8xR² = 0.9949

0

5000

10000

15000

20000

0 10 20

Are

a

Concentración de fructosa (g L-1)

y = 35.501xR² = 0.9966

0

100

200

300

400

500

600

0 10 20

Are

a

Concentración de etanol (g L-1)


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


amplificación fueron 2.5 μl de buffer 10X, 1.5 μl de MgCl 25mM, 0.5 μl de dNTPs 10mM,

2.5 μl de cada oligonucleótido 5 μM, 0.5 μl de la enzima Taq polimerasa 5u/5 μl y 1 μl de

ADN para un volumen final de 25 μl, las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo de 94

°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 47 °C por 1 min, 65 °C

por 4 min, además de una extensión final a 72 °C por 7 minutos. Los productos de PCR

fueron mezclados con SyberGold™10X y corridos en un gel de agarosa al 2% en una

cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad durante 4 horas a 90V y visualizados en un

transiluminador, grabando la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM

1D y

posteriormente vinculándolas con los árboles de distancias generados anteriormente.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


8. RESULTADOS

8.1. Caracterización morfológica de los aislamientos

Los 51 aislamientos de levadura obtenidos fueron clasificados de acuerdo a su origen y

etapa de fermentación (Cuadro 3). La caracterización preliminar de los mostos se realizó

midiendo los grados Brix, y esto nos permitió caracterizar la etapa de fermentación en la

que se encontraba el mosto, y por lo tanto de acumulación potencial de alcohol.

Cuadro 3. Origen y características del mostos de mezcal (ejido “El Palmar” Tamaulipas) y de las

levaduras aisladas en diferentes etapas del proceso.

Aislamiento Etapa de

fermentación

Azúcar o Brix

Morfología

microscópica

C.l.4AN1, P.g.4AN2, C.l.4AN3, P.k.4AN5,

C.l.4AN6, P.g.4AN7, K.m.4D2, K.m.4D3,

K.m.4D4, K.m.4D5, P.k.4D6, P.k.4D7,

K.m.4Y2, S.c.4Y3, C.l.4Y4, P.k.4Y6

Trapiche 20.8° Ovaladas

T.d.1AN2, T.d.1AN1, P.m.1AN3, C.l.1AN4,

T.d.1AN5, K.m.1AN6, T.d.1AN9, S.c.1D1,

K.m.1D5, C.p.1Y7, P.k.1Y10, K.m.1Y11,

P.g.1Y12, P.g.1Y15, P.k.1Y16, K.m.1Y1,

K.m.1Y9, P.m.1Y14, T.d.1D2

Inicial 13.2° Redonda

S.c.D2, S.c.D3, S.c.D4, S.c.D5, S.c.D6,

Z.b.3Y1, S.c.3Y2, S.c.3Y3, S.c.3Y4, S.c.3Y5,

S.c.3Y8

Final 10° Redonda

S.c.mosca3, S.c.mosca1, S.c.mosca6,

K.m.mosca7, K.m.mosca5

Drosophila

melanogaster

(moscas)

ND Ovaladas

Nota: las claves finales de los aislamientos fueron asignadas una vez conocida su identidad molecular, y se

utilizan desde este cuadro para facilitar el análisis de resultados.

Los aislamientos que se encontraban en la etapa de trapiche tuvieron en general una

morfologia ovalada, ademas de que en esta etapa y en la inicial fue donde se observó la

mayor diversidad siendo K. marxianus la que aparece en mayor número de aislamientos,


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


mientras que S. cerevisiae se encuentra en baja frecuencia, ya que esta levadura

generalmente se encuentra en los tanque de fermentacion o en las cubetas donde es

colectado el mosto recien molido; sin embargo, ya que esta levadura es tolerante a altas

concentraciones de etanol, aumenta su frecuencia, desplazando a las demas especies de

levaduras al final del proceso, por lo que la diversidad disminuye conforme transcurre la

fermentación.

En cuanto a la caracterización microscópica, se observaron dos morfologías (redonda y

ovalada) principales, y las cuales sirvieron para realizar una clasificación preliminar de los

aislamientos (fig. 13).

Figura 13. Microfotografías digitales de levaduras con su principal diferencia utilizada en este trabajo para

clasificarlas morfológicamente. A) Saccharomyces cerevisiae (redonda) y B) Pichia kluyveri (ovalada).

Objetivo 100X.

Dada la baja resolución de esta determinación cualitativa, se procedió a realizar la

identificación molecular de los aislamientos, utilizando para ello la secuencia de

fragmentos ribosomales, que es una técnica ampliamente utilizada y reportada.

8.2. Identificación molecular de las levaduras

Los 51 aislamientos fueron identificados por la secuencia de dos diferentes regiones

ribosomales encontrando de esta manera nueve especies diferentes de levaduras y

asignándoles entonces claves colocando las iniciales y el punto de aislamiento de cada

levadura ya identificada (Cuadro 4), quedando de la siguiente manera: 15 Saccharomyces

cerevisiae (S.c.), 12 Kluyveromyces marxianus (K.m.), 5 Torulaspora delbrueckii (T.d.), 6


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Pichia kluyveri (P.k.), 4 P. guillermondii (P.g.), 2 P. mexicana (P.m.), 5 Clavispora

lusitaniae (C.l.), 1 Candida parapsilosis (C.p.) y 1 Zygosaccharomyces bailii (Z.b.)

Cuadro 4. Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S de los mostos

de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI.

Clave Identificación con ITS Valor E Identidad

% Identificación con 26S Valor E

Identidad

% Identificación

S.c.D2 S. cerevisiae ( EU145764) 0 98 S. cerevisiae ( EF192587) 0 99 S. cerevisiae

S.c.D3 S. cerevisiae ( EU145764) 0 88 S. cerevisiae ( EU884435) 0 100 S. cerevisiae



S.c.D6 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae

S.c.3Y3 S. cerevisiae ( EF457565) 0 98 S. cerevisiae ( EU556320) 0 99 S. cerevisiae

S.c.3Y5 S. cerevisiae ( EU145764) 0 97 S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae




S.c.1D1 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae


S.c.mosca3 -- -- -- S. cerevisiae ( EU884435) 0 99 S. cerevisiae



K.m.1Y1 K.marxianus (AY939806) 0 97 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus

K.m.1Y9 -- -- -- K.marxianus ( GQ121696) 0 97 K.marxianus

K.m.1AN6 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU439449) 0 99 K.marxianus

K.m.1D5 K.marxianus ( AF543841) 0 99 K.marxianus ( EU439450) 0 99 K.marxianus

K.m.1Y11 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU439450) 0 98 K.marxianus





K.m.4Y2 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU019219) 0 98 K.marxianus

K.m.mosca7 K.marxianus ( AF543841) 0 97 K.marxianus ( EU019219) 0 99 K.marxianus

K.m.mosca5 K.marxianus ( AF543841) 0 98 K.marxianus ( EU019219) 0 97 K.marxianus

T.d.1AN2 T. delbrueckii ( D89589) 0 98 T. delbrueckii ( EU879962) 0 96 T. delbrueckii

T.d.1D2 T. delbrueckii (EF568083) 0 98 T. delbrueckii ( EU879961) 0 98 T. delbrueckii

T.d.1AN1 -- -- -- T. delbrueckii ( EU879961) 0 97 T. delbrueckii

T.d.1AN5 T. delbrueckii ( X80275) 0 100 T. delbrueckii ( EU879961) 0 99 T. delbrueckii

T.d.1AN9 T. delbrueckii ( X80675) 0 100 T. delbrueckii ( EU879961) 0 99 T. delbrueckii

Z.b.3Y1 Z. bailii (X84640) 1E-106 93 Z. bailii ( AJ966343) 0 99 Z. bailii

C.p.1Y7 C. parapsilopsis (EU564205) 0 99 C. parapsilopsis (EU605804) 0 99 C. parapsilopsis

P.m.1AN3 -- -- -- P. mexicana (AM397863) 0 99 P. mexicana

P.m.1Y14 P. mexicana (AB365477) 0 98 P .mexicana (EU809452) 0 98 P.mexicana

P.g.1Y12 P.guillermondii (EF15140) 0 98 P.guillermondii EU177574) 0 98 P.guillermondii

P.g.1Y15 P.guillermondii (AM160625) 0 98 P.guillermondii (EU177574) 0 98 P.guillermondii

P.g.4AN2 P.guillermondii (EF151440) 0 94 P.guillermondii (EU177574) 0 98 P.guillermondii

P.g.4AN7 P.guillermondii (EU568993) 0 98 P.guillermondii (EU177574) 0 99 P.guillermondii

C.l.1AN4 C. lusitaniae (AY321469) 0 96 -- -- -- C. lusitaniae


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Cuadro 4. Continuación… Levaduras identificadas por secuenciación de las regiones ITS1-5.8S-ITS2 y 26S

de los mostos de mezcal tamaulipeco utilizando el programa BLAST del NCBI.

Clave Identificación con ITS Valor E Identidad

% Identificación con 26S Valor E

Identidad

% Identificación

C.l.4AN1 -- -- -- C .lusitaniae (AY894825) 0 96 C .lusitaniae

C.l.4AN3 C. lusitaniae ( AY321469) 1E-165 98 C. lusitaniae (AY894824) 0 98 C. lusitaniae

C.l.4Y4 C.lusitaniae ( AY149777) 4E-170 99 C.lusitaniae (EU669469) 0 98 C.lusitaniae

C.l.4AN6 C. lusitaniae ( EF136370) 2E-149 94 -- -- -- C.lusitaniae

P.k.1Y10 P. kluyveri (DQ104732) 0 97 P. kluyveri (EU268643) 0 99 P. kluyveri

P.k.1Y16 P. kluyveri ( DQ104732) 3E-140 90 P. kluyveri (EU373464) 0 93 P. kluyveri

P.k.4AN5 P.kluyveri ( DQ104732) 0 97 P.kluyveri ( EU268643) 0 98 P.kluyveri

P.k.4D6 P. kluyveri ( DQ104732) 0 97 P. kluyveri ( EF116919) 0 99 P. kluyveri

P.k.4D7 P. kluyveri ( DQ104732) 0 98 P. kluyveri ( EU373464) 0 99 P. kluyveri

P.k.4Y6 P. kluyveri ( DQ104732) 0 97 P. kluyveri ( EU268643) 0 98 P. kluyveri

Una vez obtenida la identidad de cada una de la levadura y con secuencias de referencia de

la página del NCBI (GenBank) mediante el algoritmo blast, se elaboraron árboles de

distancias génicas para cada una de las regiones secuenciadas, encontrando que, para la

región 26S, todas las levaduras se agrupaban por especie, obteniéndose los nueve grupos

(en números romanos) a los que pertenecía cada levadura (Fig. 14). El grupo I pertenece a

la especie S. cerevisiae, el II son las pertenecientes a T. delbrueckii, el grupo III a Z. bailii,

en el grupo IV se encuentra K. marxianus, en el V se encuentra C.parasilopsis, en el VI se

agrupan las P. mexicana, en el grupo VII se encuentra P. guilliermondii, el grupo VIII

muestra a C. luitaniae mientras que en el grupo IX se encuentran las levaduras P.kluyveri y

se presentan de esta manera en los dos árboles de distancias mostrados a continuación.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 14. Árbol de distancias obtenido de la región 26S de ADNr generado en el programa MEGA 4

utilizando el metodo Neighbor Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum

Composite Likelihood y un re-muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del

GenBank fue utilizada como grupo de salida.

S.c.mosca3

S.c.3Y2

S.c.mosca6

S.c.D3

S.c.D4

S.c.D5

S.c. D6

EU556339 Saccharomyces cerevisiae

S.c.3Y5

S.c.D2

S.c.3Y3

S.c.3Y4

S.c.3Y8

S.c.1D1

S.c.4Y3

S.c.mosca1

T.d.1AN1

T.d.1AN2

T.d.1AN5

EU879961 Torulaspora delbrueckii

T.d.1AN9

T.d.1D2

Z.b.3Y1

AJ966343 Zygosaccharomyces bailii

EU439450 Kluyveromyces marxianus

K.m.1AN6

K.m.mosca7

K.m.1Y1

K.m.4D2

K.m.4D5

K.m.4D3

K.m.4D4

K.m.4Y2

K.m.1D5

K.m.1Y11

K.m.mosca5

K.m.1Y9

C.p.1Y7

EU605804 Candida parapsilosis

P.m.1AN3

EU809452 Pichia mexicana

P.m.1Y14

EU177574 Pichia guilliermondii

P.g.1Y15

P.g.4AN7

P.g.1Y12

P.g.4AN2

C.l.4AN1

AY894825 Clavispora lusitaniae

C.l.4AN3

C.l.4Y4

AY305665 Pichia kluyveri

P.k.1Y10

P.k.1Y16

P.k.4AN5

P.k.4D6

P.k.4D7

P.k.4Y6

FJ360521 Neurospora crassa

100

79

100

100

41

100

100

100

65

65

100

36

98

100

65

65

100

52

99

97

65

88

100

0.000.020.040.060.080.100.120.14

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 15. Árbol de distancias génicas generado de la región ITS1-5.8S-ITS2 con el método Neighbor

Joining. La distancia evolutiva fue calculada usando el método Maximum Composite Likelihood y un re-

muestreo de 1000 replicas. Una cepa de Neurospora crassa tomada del GenBank fue utilizada como grupo de

salida.

EU145764 Saccharomyces cerevisiae

S.c.D3

S.c.4Y3

S.c.D5

S.c.3Y8

S.c.3Y2

S.c3Y3

S.c.3Y4

S.c.3Y5

S.c.D2

S.c.D4

T.d.1AN2

AB469378 Torulaspora delbrueckii

T.d.1D2

K.m.1Y1

K.m.4D2

EF568057 Kluyveromyces marxianus

K.m.4D3

T.d.1AN5

K.m.mosca5

K.m.1AN6

K.m.1D5

K.m.1Y11

K.m.4D5

K.m.4Y2

T.d.1AN9

K.m.mosca7

K.m.4D4

Z.b.3Y1

X84732 Zygosaccharomyces bailii

K.m.1Y9

P.k.4AN5

P.k.4D6

P.k.4D7

DQ104732 Pichia kluyveri

P.k.1Y10

P.k.4Y6

P.k.1Y16

P.m.1Y14

EF568069 Pichia mexicana

P.g.4AN2

EF151440 Pichia guilliermondii

P.g.4AN7

P.g.1Y12

P.g.1Y15

C.l.4Y4

AY321469 Clavispora lusitaniae

C.l.4AN3

C.l.1AN4

C.l.4AN6

C.p.1Y7

FM172980 Candida parapsilosis

FJ360521 Neurospora crassa

99

99

99

95

88

61

98

74

63

33

29

97

67

65

74

43

89

49

49

18

18

0.000.050.100.150.200.25

I

II

III

IV

V

VI

IX

VII

VIII


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Para la región ITS1-5.8S-ITS2 (Fig. 15), aunque también se formaron los nueve grupos,

algunas de las levaduras de los géneros Kluyveromyces y Torulaspora no se agruparon

correctamente con su secuencia de referencia, como es el caso de los aislamientos

T.d.1AN9 y T.d.1AN5 (Fig. 15) las cuales pertenecen al género Torulaspora y se agrupan

con el género Kluyveromyces, además estas dos levaduras obtuvieron un 99% de identidad

con su secuencia de referencia en el algoritmo blast. La levadura K.m.1Y9 también se salió

del grupo de Kluyveromyces colocándose con Zygosaccharomyces en un grupo diferente,

fuera de los 9 previamente identificados.

8.2.1. Diversidad de especies durante la fermentación del mezcal

Para la caracterización de la diversidad ecológica del proceso de producción del mezcal, se

consideraron todas las etapas de la fermentación, comenzando por el trapiche donde se

aislaron 5 especies (16 variedades), en la etapa inicial 8 especies (24 variedades) y en la

final 2 especies (5 variedades) (Cuadro 5). El índice de diversidad también indica que esta

fue mayor en la etapa inicial. El hecho de que la mayor diversidad se encuentre en las

primeras etapas de fermentación es debido probablemente a la alta concentración de

azúcares y poco etanol en el mosto durante esas etapas (Cuadro 5).

Cuadro 5. Caracterización de la diversidad ecológica por etapas de la fermentación del mezcal de San

Carlos (Tamaulipas) mediante su la riqueza de especies (S), el índice de diversidad de Shannon (H), y la

diversidad (D) y dominancia (D´) de Simpson.

Variables Etapas de la fermentación

Trapiche Inicial Final

S 5 8 2

H 1.49 1.87 0.30

D 5.22 6.9 1.5

D’ 0.19 0.15 0.67

Es claro por el índice de dominancia que, al final de la fermentación, un solo tipo de

población (S. cerevisiae) predomina en esta etapa.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


8.3. Fermentaciones en medio de mosto de Agave

8.3.1. Consumo de azúcares reductores

La cuantificación de los azúcares reductores en los mostos durante las fermentaciones

demostró que, a las 60 horas, que fue el punto final muestreado para todos los aislamientos

ya solo se encontraran pequeñas concentraciones de de azúcar en algunos casos.

Figura 16. Consumo de azucares reductores en el mosto después de 60 horas (A) Saccharomyces cerevisiae

(S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia kluyvery (P.k.),

(E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).

0

20

40

60

80

100

120

g L

-1

A

0

20

40

60

80

100

120

g L

-1

B

0

20

40

60

80

100

120

g L

-1

C

020406080

100120

g L-1

D

0

20

40

60

80

100

120

g L-1

E

0

20

40

60

80

100

120

g L-1

F


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


El consumo fue diferencial para cada aislamiento, y se puede destacar a la levadura S.c.D5,

la cual utilizó el 88 % de los azucares, además de presentar un rápido crecimiento durante

las primeras horas de inoculación (Fig. 16). En general, la mayoría de las S. cerevisiae

tuvieron un buen consumo y crecimiento en el medio de mosto de Agave (Cuadro 6).

8.3.2. Crecimiento de las levaduras en mostos de Agave

Los aislamientos que consumieron la mayor cantidad de azúcar demostraron ser también

los que obtuvieron mayor peso seco por consiguiente fueron los que tuvieron el mayor

crecimiento, siendo los aislamientos de S. cerevisiae los que alcanzaron hasta un peso seco

de 4.8 g L-1

, mientras que los aislamientos de Pichia spp no alcanzaron el 1 g L-1

. Esto

demuestra la gran variabilidad en su capacidad de consumir los azucares presentes en el

mosto (Fig. 17).

8.3.3. Análisis del consumo especifico de azúcares reductores

Se realizó el cálculo del consumo de azúcares reductores por unidad de biomasa, como un

parámetro que indicara la capacidad específica de utilización de la fuente de carbono de

cada uno de los aislamientos en el medio de mosto de agave, y como se puede apreciar en

la Figura 18, al utilizar este parámetro, es posible observar diferencias en las capacidades

de consumo de cada uno de los aislamientos en todas las especies aisladas, lo cual indica

que existen diferencias metabólicas en cada población, que pudieran ser aprovechadas en el

mejoramiento de la fermentación.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 17. Biomasa producida por cada levadura en el mosto de agave. A) Saccharomyces cerevisiae (S.c.);

B) Kluyveromyces marxianus (K.m.); C) Torulaspora delbrueckii (T.d.); D) Pichia kluyvery (P.k.); E)

Clavispora lusitaniae (C.l.); F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m.) y (P.g.).

0

1

2

3

4

5

g L-1

A

0

1

2

3

4

5

g L-1

B

0

1

2

3

4

5

g L-1

C

0

1

2

3

4

5

g L-1

D

0

1

2

3

4

5

g L-1

E

0

1

2

3

4

5

g L-1

F


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 18. Consumo especifico obtenida a las 60 horas por cada una de las levaduras. (A) Saccharomyces

cerevisiae (S.c.), (B) Kluyveromyces marxianus (K.m.), (C) Torulaspora delbrueckii (T.d.), (D) Pichia

kluyvery (P.k.), (E) Clavispora lusitaniae (C.l.), (F) Pichia mexicana y Pichia guillermondii (P.m., P.g.).

01020304050607080

g- AZ/

g- X

A

01020304050607080

g- AZ/

g X

B

01020304050607080

g- AZ/

g- X

C

01020304050607080

g- AZ/

g- X

D

01020304050607080

g- AZ/

g- X

E

01020304050607080

g- AZ/

g- X

F


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Los datos de consumo específico de azúcares reductores fueron utilizados para realizar un

análisis de varianza, el cual arrojó los siguientes resultados:

Cuadro 6. ANOVA del consumo especifico de azúcar

Fuente GL Suma de

cuadrados

Cuadrado

medio F-Valor Pr > F

Modelo 53 44549.06627 840.54842 20.94 <.0001

Error 150 6020.04706 40.13365

Total correcto 203 50569.11333

Alfa 0.05

Error de grados de libertad 150

Error de cuadrado medio 40.13365

Valor crítico de t 1.97591

Diferencia menos significativa 8.8513

A partir de los resultados obtenidos con el ANOVA y el agrupamiento con la prueba de

Diferencias Menos Significativas (LSM) dado a que se observaron diferencias, se decidió

pasar todas las muestras por HPLC para de esta manera encontrar sus diferencias a nivel de

producción de etanol de cada uno de los aislamientos.

8.4. Capacidad fermentativa de los aislamientos

Las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae resultaron ser, como era esperado,

las que producen la mayor cantidad de etanol, sin embargo todas las especies de levaduras

probadas también lo produjeron, siendo los aislamientos de los géneros Kluyveromyces y

Torulaspora los que presentaron un buen nivel (cuadro 6), por lo tanto estos tres géneros

fueron seleccionados para ser analizadas por rep-PCR. La levadura S.c.mosca3 fue la que

presento el mayor consumo de azúcar y fue por lo tanto la de mayor producción de etanol

alcanzando hasta 90 g L-1

a diferencia de Pichia mexicana P.m1Y14 la cual solamente

produjo 2.8 g L-1

de etanol.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Cuadro 7. Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos obtenidos por

HPLC.

Aislamiento

Consumo de azúcar y producción

de etanol

g L-1

Biomasa

g L-1

Consumo ó producción

específica

g g-1

YEtOH/Azuc

Glucosa Fructosa Etanol Glucosa Fructos

a Etanol

S.c.D5 7.11 25.28 72.73 4.32 1.65 5.85 16.83 2.25

S.c.1D1 6.08 11.98 31.50 1.33 4.57 9.01 23.69 1.74

S.C.3Y5 8.28 27.25 58.81 3.15 2.63 8.65 18.67 1.65

S.c. 4Y3 8.99 36.83 43.05 3.68 2.44 10.01 11.70 0.94

S.c. 3Y8 8.82 37.16 26.78 2.93 3.01 12.68 9.14 0.58

S.c.3Y4 9.19 37.10 57.13 3.98 2.31 9.32 14.35 1.23

S.c. D4 9.34 33.80 46.80 3.82 2.45 8.85 12.25 1.08

S.c. 3Y3 9.36 38.91 49.10 3.65 2.56 10.66 13.45 1.02

S.c. mosca1 9.97 40.01 38.74 4.8 2.08 8.33 8.07 0.78

S.c.3Y2 9.72 28.83 70.28 3.15 3.09 9.15 22.31 1.82

S.c. mosca6 9.91 31.92 51.30 3.25 3.05 9.82 15.78 1.23

S.c. mosca3 10.13 58.91 90.03 3.3 3.07 17.85 27.28 1.30

S.c.D2 9.72 16.46 58.14 3.65 2.66 4.51 15.93 2.22

S.c. D6 9.90 33.25 64.41 4.42 2.24 7.52 14.57 1.49

S.c. D3 10.13 44.35 64.05 3.3 3.07 13.44 19.41 1.18

K.m.4D2 5.88 15.05 48.55 1.4 4.20 10.75 34.68 2.32

K.m.4D5 7.54 26.61 32.42 1.27 5.94 20.95 25.52 0.95

K.m.1Y11 6.94 22.99 28.33 1.53 4.53 15.03 18.52 0.95

K.m.4D4 6.97 23.67 28.75 1.38 5.05 17.15 20.83 0.94

K.m.1AN6 7.62 26.19 32.30 1.93 3.95 13.57 16.74 0.96

K.m. mosca7 8.10 32.25 28.12 1.87 4.33 17.25 15.04 0.70

K.m. 4D3 6.61 13.26 3.89 1.45 4.56 9.14 2.68 0.20

K.m. 1D5 8.33 28.65 37.31 1.93 4.32 14.84 19.33 1.01

K.m. 1Y9 8.02 19.94 50.05 1.73 4.64 11.53 28.93 1.79

K.m. mosca5 5.44 20.89 4.90 1.62 3.36 12.90 3.03 0.19

K.m. 4Y2 7.88 26.81 6.14 1.78 4.42 15.06 3.45 0.18

K.m. 1Y1 7.95 23.42 7.32 1.85 4.30 12.66 3.96 0.23


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Cuadro 7. Continuación….Consumo de azucares y producción de etanol de cada uno de los aislamientos

obtenidos por HPLC

Aislamiento

Consumo de azúcar y producción

de etanol

g L-1

Biomasa

g L-1

Consumó producción

específica

g g-1

YEtOH/Azuc

Glucosa Fructosa Etanol Glucosa Fructosa Etanol

T.d.1AN1 6.00 19.28 29.86 1.68 3.57 11.48 17.77 1.18

T.d.1D2 9.43 46.23 60.25 3.22 2.93 14.36 18.71 1.08

T.d.1AN2 8.41 40.54 54.86 3.02 2.78 13.42 18.17 1.12

T.d. 1AN9 6.49 21.05 32.94 1.45 4.47 14.52 22.72 1.20

T.d. 1AN5 8.84 34.46 4.58 1.68 5.26 20.51 2.73 0.11

P.k.1Y10 7.16 21.54 34.30 2.03 3.53 10.61 16.90 1.20

P.k. 1Y16 4.06 12.26 3.12 1.17 3.47 10.48 2.66 0.19

P.k. 4AN5 8.59 23.14 33.66 1.87 4.59 12.37 18.00 1.06

P.k. 4Y6 7.21 9.59 8.36 1.63 4.42 5.89 5.13 0.50

P.k. 4D6 10.47 0.00 3.89 1.98 5.29 0.00 1.96 0.37

P.k. 4D7 7.60 25.09 31.37 2.28 3.33 11.00 13.76 0.96

C.l.1AN4 4.13 18.05 20.79 1.12 3.69 16.12 18.56 0.94

C.l.4AN3 6.14 21.85 24.17 1.45 4.24 15.07 16.67 0.86

C.l.4AN1 4.68 21.43 19.40 1.47 3.19 14.58 13.20 0.74

C.l.4AN6 4.21 14.43 6.75 0.95 4.44 15.19 7.10 0.36

C.l. 4Y4 4.00 15.46 25.71 1.7 2.35 9.10 15.13 1.32

P.g.4AN2 5.51 17.56 28.12 1.23 4.48 14.28 22.86 1.22

P.g. 4AN7 2.37 7.48 5.19 1.72 1.38 4.35 3.02 0.53

P.g.1Y15 3.33 18.53 4.55 1.3 2.57 14.25 3.50 0.21

P.g.1Y12 7.77 0.00 32.00 1.35 5.75 0.00 23.71 4.12

P.m.1AN3 1.38 1.66 26.39 0.97 1.43 1.71 27.20 8.67

P.m.1Y14 1.00 0.14 2.49 1.25 0.80 0.11 1.99 2.18

Z.b. 3Y1 2.44 34.19 56.73 2.5 0.98 13.67 22.69 1.55

C.p. 1Y7 8.88 5.61 4.97 1.52 5.84 3.69 3.27 0.34

Como puede observarse en el cuadro 6, en relación a la producción específica de etanol en

S. cerevisiae, los aislamientos varían entre valores de 8 hasta 27 g g-1

en éste parámetro, lo

cual desde el punto de vista de la fermentación es relevante, especialmente a la hora de

seleccionar un inóculo para el proceso de producción del mezcal. En este aspecto, el

aislamiento S.c.mosca3 es el más promisorio.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


8.5. Diversidad genética de levaduras por rep-PCR

Las levaduras se clasificaron de acuerdo al patrón de bandas obtenido con la técnica de

análisis global de ADN utilizado (rep-PCR), la cual fue rápida y reproducible, a excepción

de las levaduras S.c.D3 y S.c.D5 de las cuales no fue posible lograr amplificación.

Figura 19. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo S. cerevisiae

Además, de los resultados obtenidos del rep-PCR se elaboró una matriz binaria de ausencia

presencia tomando la presencia de una banda como 1 y la ausencia como 0, posteriormente

de los resultados obtenidos se elaboro un árbol de distancias utilizando el programa

Statistica (fig. 19). Para el género Saccharomyces se obtuvieron 5 patrones rep-PCR, lo

cual fue un indicador de la diversidad genética dentro de esta especie como se puede

apreciar gráficamente en la fig. 19, en los que el análisis matemático es capaz de separarlos

en 10 distintos grupos, y la levadura S.c.mosca3 fue única en su patrón separándose en una

sola rama. En los resultados de las fermentaciones resultó ser la mejor en términos de

producción de etanol y consumo de azucares reductores.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Distancia de ligamiento

Figura 20. Dendrograma obtenido de la matriz de ausencia presencia de bandas del rep-PCR de las

levaduras Saccharomyces cerevisiae utilizando el programa Statistica y el método de distancias

euclidianas.

En base a estos resultados, la técnica rep-PCR fue capaz de separar a las levaduras de

diferentes especies y posiblemente también entre cepas, ya que el patrón de rep-PCR

concuerda con los arboles de distancias genéticas (Figs. 14 y 15).

Para las levaduras del grupo K.marxianus y T.delbrueckii (Fig. 21) se observaron 6

patrones de rep-PCR, y donde la mayoria de las K.marxianus tienen el mismo patrón, sin

embargo, la levadura K.m. 1Y9 es ligeramente diferente a las demas esta diferencia es

posiblemente la que provoca que en el árbol de distancias esta levadura se salga de su

grupo. Adicionalmente la levadura K.m.1Y11 no presentó amplificación por lo tanto no

presenta las secuencias de union a estos oligonucleotidos, las levaduras K.m.1Y1, K.m.1D5

y K.m.4D4 presentaron bandas semejante entre ellas.

Para el caso de T.delbrueckii la mayoría presenta diferencias aunque con pocas bandas ya

que T.d.1AN2 y T.d.1D2 presentan dos bandas del mismo tamaño pero T.d.1D2 presenta

ademas otras dos bandas mas pequeñas. En las levaduras T.d.1AN5 y T.d.1AN9 se

observan dos bandas igual que en el caso de las Kluyveromyces y a la misma altura, esto

UPGMA

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5


S.c.3Y8

S.c.3Y4

S.c.mos3

S.c.3Y5

S.c.1D1

S.c.D5

S.c.D3

S.c.3Y2

S.c.3Y3

S.c.mos1

S.c.D6

S.c.D4

S.c.mos6

S.c.4Y3

S.c.D2


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


explica el por qué de que estas levaduras se agrupen en el la rama de las Kluyveromyces ya

que su patron rep-PCR es muy parecido, pudiendo llegar a pensar que se trata de la misma

especie sin embargo como ya se menciono anteriormente estas levaduras presentan un 99%

de identidad con su cepa de referencia (Cuadro 4). La levadura T.d.1AN1 no pudo ser

amplificada.

Figura 21. Patrón obtenido utilizando la técnica rep-PCR para las levaduras del grupo K. marxianus y T.

delbrueckii.

De igual manera que con S. cerevisiae, de los resultados obtenidos del rep-PCR de K.

marxianus y T. delbrueckii se elaboro una matriz de ausencia presencia seguido de el árbol

de distancias utilizando el programa Statistica con el método de Distancias Euclidianas

(Fig. 22) encontrándose 7 diferentes ramas que marcan las diferencias que existen entre las

cepas de Kluyveromyces marxianus y de Torulaspora delbrueckii.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________




Kluyveromyces marxianus y Torulaspora delbrueckii utilizando el programa Statistica y el método de

distancias euclidianas.

Finalmente se compararon los arboles obtenidos de la matriz binaria, el patrón de bandas

obtenido por rep-PCR y la producción de etanol de cada una de las levaduras.

Las levaduras que en el arbol de distancias génicas de la region ITS1-5.8S-ITS2 no fueron

agrupadas correctamente mostraron claramente diferencias en el patron del rep-PCR, donde

se pudo observar que las levadura K.m.1Y9 la cual se salio del grupo de las Kluyveromyces

presenta un patrón diferente al resto de su grupo, ademas las levaduras T.d.1AN5 y

T.d.1AN9 las cuales pertenecen al grupo de las Torulaspora y que en el árbol elaborado

con las secuencias de los ITS se agruparon con Kluyveromyces tienen el mismo patrón que

algunas de las levaduras que se encuentran en el grupo de Kluyveromyces. Esto indica que

un solo nivel de caracterización molecular no es suficiente para su identificación ó

clasificación, por lo que el conjuntar estos datos con el fenotipo productivo sirvió para

elegir a los aislamientos con mejores propiedades fermentativas.

UPGMA

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0


K.m.1Y9

T.d.1D2

T.d.1AN2

T.d.1AN9

T.d.1AN5

K.m.mos5

K.m.mos7

K.m.4Y2

K.m.4D5

K.m.4D3

T.d.1AN1

K.m.1Y11

K.m.4D2

K.m.1AN6

K.m.4D4

K.m.1D5

K.m.1Y1


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


8.5.1. Diversidad genética y productividad de etanol

Con el fin de verificar si el agrupamiento de diversidad genética guardaba correlación con

la capacidad productiva de los aislamientos, se compararon los niveles de producción de

etanol de las S. cerevisiae (Fig. 23), y de K. marxianus y T. delbrueckii (Fig. 24) con su

diversidad genética arrojada por el dendrograma construido a partir del rep-PCR. Como

puede observarse en el caso de S. cerevisiae, si bien no existe una tendencia entre ambos

parámetros, el aislamiento S.c.mosca 3 presentó máxima producción de etanol, y también

tiene un patrón único que se separa en una rama individual.

Figura 23. Comparación de la diversidad genética y la producción específica de etanol de las levaduras

probadas en este trabajo. S.c. (Saccharomyces cerevisiae).

En el caso de K. marxianus y T. delbrueckii (Fig. 24) tampoco pudo observarse una

tendencia clara en cuanto a la comparación de la diversidad genética de los aislamientos

obtenida con la técnica de rep-PCR y su productividad.


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Figura 24. Comparación de la diversidad genética y la producción de etanol de las levaduras Kluyveromyces

marxianus (K.m.) y Torulaspora delbrueckii (T.d.).

Sin embargo se puede destacar a la levadura K.m.1Y9, la cual presenta un patrón rep-PCR

muy diferente a las levaduras de su grupo y fue la mas productiva de todas las

Kluyveromyces, mientras que del grupo de las Torulaspora la levadura T.d.1D2 tiene un

patron rep-PCR singular, muy similar a las del grupo Kluyveromyces, y fue la más

productiva.

Estos resultados indican que, si bien no es posible determinar a priori las características

productivas de un aislamiento simplemente basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí

pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los

aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la

fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso.


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9. DISCUSIÓN

El mezcal es una bebida artesanal mexicana que tiene denominación de origen en varios

estados, incluyendo a Tamaulipas, y sin embargo existen muy pocos estudios acerca de la

microbiología del mismo. Se necesitan más estudios acerca del proceso de elaboración del

mezcal y no solamente durante la fermentación sino también de las otras etapas de

elaboración como son la molienda, el cocido de las piñas y la destilación; sin embargo, es

durante la fermentación que ocurren los procesos biológicos que determinan en gran

medida la calidad final del producto. En este trabajo, se obtuvieron importantes avances en

el conocimiento microbiológico del mezcal de Tamaulipas, caracterizándose la micoflora

presente durante las etapas de fermentación tanto a nivel fenotípico (productivo) como

molecular mediante una técnica de análisis genómico global.

9.1. Caracterización morfológica y molecular

En el mezcal analizado se observó que las levaduras que predominaron en la etapa inicial

de fermentación pertenecen en su mayoría a la especie Kluyveromyces marxianus, la cual

ya no se encuentra en la etapa final, que es cuando se encuentra la mayor concentración de

etanol. De acuerdo a esto, y apoyado por los valores de los índices de diversidad de

Shannon y Simpson, la mayor diversidad se encuentra en la etapa inicial, con ocho especies

diferentes, lo cual indica que, además de las levaduras que se incorporaron al mosto en el

trapiche, en las cubas de fermentación se encuentran presentes una gran variedad de

poblaciones. Esto se debe a la baja concentracion de etanol que se encuentra en esta etapa

sin embargo conforme transcurre la fermentacion estas desaparecen quedando solamente

dos especies como se muestra en los indices de diversidad al final solo se aisló a S.

cerevisiae, la cual tolera altas concentraciones de etanol, y la cual gobernó la etapa final, y

generalmente perece cuando se alcanza una concentración mayor al 12-15% (Fleet, 2003).

Un aislamiento de Z. bailii fue obtenido en la etapa final de la fermentación, y es el primer

reporte de la presencia de esta levadura en mostos de agave. Se sabe que, al igual que las

especies Schizosaccharomyces pombe y Zygosaccharomyces fermentans, puede tolerar


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altas concentraciones de etanol (>10%) y que suelen encontrarse en ambientes vinícolas

(Fleet, 2003). Con respecto al índice de dominancia de Simpson, se corroboró la

observación de que es en la etapa final, de alta concentración etanólica, en donde se

aislaron diez S. cerevisiae y una Z. bailii como se menciono anteriormente.

Haciendo una analogía con el sistema de fermentación vinícola, se ha observado que la

concentración inicial de células usualmente es de 104-10

5 cfu mL

-1 para las especies no-

Saccharomyces y de 102-10

3 cfu mL

-1 para las Saccharomyces, sin embargo conforme

transcurre la fermentación, las no-Saccharomyces desaparecen y las especies de

Saccharomyces aumentan alcanzando alrededor de 107-10

8 cfu mL

-1 al llegar a la etapa

final del proceso (Xufre et al., 2006). Es razonable suponer que en el sistema de mosto de

Agave spp deben presentarse cambios similares de poblaciones. Si bien en este trabajo la

concentración celular no fue medida en los diferentes puntos de muestreo de la

fermentación del mezcal tamaulipeco, sería importante, desde el punto de vista de proceso,

hacer ésta cuantificación, y verificar si la concentración celular de una especie en particular

tienen impacto en las características organolépticas del producto final.

En la fermentación espontánea de bebidas destiladas de Agave spp en general es en las

primeras etapas donde se encuentra la mayor diversidad de especies de levaduras y es

también donde se producen los primeros aromas de esta bebida lo cual es realizado por

levaduras no-Saccharomyces, las cuales pueden producir altas concentraciones de algunos

compuestos que determinan la calidad sensorial de las bebidas alcohólicas. Las especies de

levaduras involucradas en la fermentación de mostos de agave son variables, y no hay dos

tipos de mezcal que tengan el mismo perfil de poblaciones, Por ejemplo, en el caso de

mostos de Agave salmiana (mezcal potosino), se identificaron 4 especies de levaduras

involucradas en el proceso: C. lusitaniae, K. marxianus, P. fermentans y S. cerevisiae (De

León Rodríguez et al., 2006).

En contraste, las poblaciones de levaduras que se encuentran presentes durante cada una de

las etapas de fermentación en el caso del mezcal de Michoacán, se aislaron a Candida

magnoliae, Hanseniospora vineae, H. uvarum, Issatchenkia occidentalis, Kluyveromyces

lactis, y Saccharomyces cerevisiae en 13 diferentes destilerías (Gschaedler Mathis et al.,

2004). En el caso del mezcal de Oaxaca, encontraron a Candida spp., Hanseniaspora spp. y


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S. cerevisiae (Andrade Meneses y Ruiz Teran (2004), citado en Lappe-Oliveras et al.,

2008); en tanto que del mosto de A. fourcroydes de mezcal de Yucatán, se aislaron especies

de Candida spp, C. parasilopsis, C. lusitaniae, Debaryomyces hansenii, Kluyvernomyces

marxianus, Pichia caribbica, P. guilliermondii, Rhodotorula spp., T. delbrueckii y S.

cerevisiae en una fermentación natural (Lappe-Oliveras et al., 2008). Es claro que existe

una gran diversidad ecológica de levaduras que se encuentran presentes en la fermentación

del mezcal de las diferentes regiones de México, y las cuales pueden influenciar la calidad

de esta bebida artesanal, existen especies de levaduras comunes para todas las

fermentaciones de mostos de Agave, es claro que la presencia de levaduras (y Agave spp)

específicos para cada uno de los productos regionales, pueden conferirles propiedades

organolépticas únicas.

La identificacion molecular la cual fue realizada por secuenciacion de las región ITS1-

5.8S-ITS2 mostró consistencia, como era esperado, con la identificación arrojada con la

región 26S ,y solo en pocos aislamientos el producto de PCR de esta región no pudo ser

secuenciada (ver cuadro 4). También se observó que el porcentaje de identidad en general

era más bajo al utilizar la secuencia de la región ITS1-5.8S-ITS2. Se ha reportado evidencia

de que la región ITS1-5.8S-ITS2 contiene variaciones considerables en su secuencia; por

ejemplo, Sujaya et al. (2004) en su trabajo realizado en el vino de arroz, identificaron 51

levaduras, sin embargo tuvieron el mismo problema al intentar secuenciar de forma directa

las regiones ITS esto podría ser debido a la presencia de una heterocopia la cual se piensa

pude ser por que algunas cepas son heterotálicas y contienen dos alelos en un mismo locus.

Esto es una desventaja al utilizar la región ITS1-5.8S-ITS2 para clasificar levaduras. Es por

ello que para los resultados que aquí se reportan, fue muy importante también secuenciar la

región 26S, corroborando de esta manera nuestros resultados y logrando identificar

molecularmente a los 51 aislamientos (cuadro 4).

El análisis filogenético con las dos diferentes regiones ribosomales analizadas en este

trabajo reveló que dos de los aislamientos que fueron clasificados como Torulaspora

delbrueckii con la región 26S, poseen una alta similitud con Kluyveromyces marxianus al

ser identificados con la región ITS1-5.8S-ITS2, lo cual puede sugerir algunos errores en

los reportes en la literatura de estas especies cuando solamente se utiliza esta región para su

clasificación. Estos resultados indican que, en el caso de las levaduras, debieran


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secuenciarse al menos dos regiones, ribosomales o de algún gen constitutivo, para poder

tener certeza de la identidad molecular de los aislamientos.

9.2. Diversidad fenotípica

En la caracterización productiva de las levaduras a las 60 h de cultivo, se pudieron observar

diferencias fenotípicas en el consumo de azúcares, principalmente entre los aislamientos de

las especies de S. cerevisiae, K. marxianus y T. delbrueckii, y todas las levaduras fueron

capaces de producir etanol, no únicamente las pertenecientes a S. cerevisiae. En un estudio

en vino realizado por Clemente- Jimenez et al. (2004), utilizando seis diferentes variedades

de uva, midieron la cantidad de azucar residual en el mosto encontrando que las especies S.

cerevisiae y Candida stellata fueron las que consumieron la mayor cantidad de azúcar, sin

embargo al igual que en nuestro trabajo, todas las levaduras probadas produjeron etanol

pero en cantidades variables. En nuestro caso no se encontró a C. stellata en los mostos de

Agave spp utilizados en la elaboración del mezcal tamaulipeco.

Es conocido que las levaduras de la especie S. cerevisiae tienen actividad killer, es decir

que producen compuestos toxicos para otras levaduras lo cual podria ser una explicación de

que las demas levaduras presentes en las primeras etapas de fermentacion desaparecieran

conforme transcurre este proceso, adicional al conocido efecto del etanol, en el cual la

mayoría de especies, excepto las resistentes, son inhibidas cuando alcanza una

concentración del 5 al 7% en el mosto (Fleet, 2003), y que en mostos de Agave spp puede

llegar a alcanzar concentraciones del doble de ese valor (Díaz-Montaño et al., 2008). En

nuestro caso los aislamientos de S. cerevisiae fueron los que presentan una variabilidad

relativa de hasta un 70% en cuanto a su producción de biomasa, así como en su velocidad

de consumo de azúcares y de producción de etanol, lo cual indica una alta especialización

fenotípica a diferentes condiciones del mosto.

9.3. Diversidad genética y productividad

El uso de la técnica rep-PCR permitió obtener patrones diferenciales para cada una de las

levaduras analizadas, sin embargo, en algunos casos, no fue posible obtener la


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amplificación, lo cual indica que probablemente estos aislamientos no tienen los sitios de

hibridación para los oligonucleótidos utilizados. Las levaduras del grupo Saccharomyces

presentan algunas diferencias en su patrón rep-PCR el cual se pudo observar principalmente

en las levaduras S.c.mosca3, S.c.1D1, S.c.3Y4 y S.c. 3Y8, las cuales presentaron un patrón

muy diferente entre sí y con las demas levaduras. Se observó variación en la identidad

genética de los aislamientos incluidos en la mayoria de las especies involucradas en la

fermentacion del mezcal tamaulipeco, pero especialmente en las especies S. cerevisiae, K.

marxianus y T. delbrueckii. De manera relevante, todas las levaduras aisladas de los mostos

de mezcal tamaulipeco producen etanol, aunque en concentraciones muy variables.

Estos resultados indican que esta técnica rep-PCR es capaz de diferenciar a las levaduras

que se encuentran en los mostos de mezcal, separando a los aislamientos que incluso

pertenecen a la misma especie. Por ejemplo, el aislamiento S.c.mosca3, que presentó la

mayor producciónn de etanol, tuvo un patrón rep-PCR diferente a las demás S. cerevisiae.

Los aislamientos Td1AN5 y Td1AN9, identificadas molecularmente como pertenecientes a

la especie Torulaspora , fueron clasificadas como Kluyveromyces tanto en el arbol de

distancias elaborado con las secuencias de la region ITS1-5.8S-ITS2, como en el árbol

elaborado con el patrón de bandas del rep-PCR, lo cual puede indicar que estos dos

aislamientos no pertenece a Torulaspora como lo indica el arbol de distancias de la region

26S. La levadura K.m.1Y9 la cual se salió del grupo de las Kluyveromyces presenta un

patrón rep-PCR diferente al resto de su grupo. Esto indica que un solo nivel de

caracterización molecular no es suficiente para su identificación ó clasificación, por lo que

el conjuntar estos datos con el fenotipo productivo sirvió para elegir a los aislamientos con

mejores propiedades fermentativas.

Estos resultados indican que, si bien no es posible determinar a priori las características

productivas de un aislamiento simplemente basado en su perfil rep-PCR, sin embargo sí

pueden ser utilizado como un sistema de identificación y etiquetamiento molecular de los

aislamientos, que pudiera ser utilizado en el seguimiento de cada uno durante la

fermentación, para verificar que la población deseada se encuentra presente en el proceso.


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Durante los últimos años han aparecido técnicas novedosas para el estudio de los

microorganismos utilizados en la industria de las fermentaciones, que han permitido

identificar una gran diversidad de especies de interés económico e industrial. La técnica

rep-PCR mostró un gran poder de resolución para los aislamientos probados en este estudio

por lo que es recomendable utilizarla como una caracterización preliminar en las levaduras

(y bacterias) presentes en los mostos para hacer una separación rápida de las diferentes

especies que puedan estar presentes en los mostos de mezcal.


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10. CONCLUSIONES

En este estudio se obtuvieron aislamientos pertenecientes a 9 especies diferentes de

levaduras colectadas en la etapa inicial y final de la fermentación, y se caracterizaron

molecular y fenotípicamente 15 aislamientos de S. cerevisiae, 12 de K. marxianus, 5 de T.

delbrueckii, 6 de P. kluyveri, 5 de C. lusitaniae, 4 de P. guillerrmondii, 2 de P. mexicana, 1

de C. parapsilopsis y un aislamiento que fue tolerante a altas concentraciones de etanol, ya

que fue colectada de la etapa final de fermentación, perteneciente a la especie Z. bailii.

Mediante el uso de la técnica rep-PCR se pudo analizar el genoma de las levaduras más

productivas, encontrando una gran diversidad genética existente entre aislamientos de la

misma especie, como fue en el caso de S. cerevisiae, mientras que en K. marxixnus y

T.delbrueckii existen pocas diferencias aparentes para comparar con esta técnica los

genoma de dichas especies. Sin embargo, el rep-PCR podría ser de gran ayuda para hacer

una comparacion rápida de las levaduras que se encuentran en cada etapa de la

fermentación.

Todas las levaduras produjeron etanol aunque en diferentes concentraciones, que variaron

hasta en dos ordenes de magnitud, pero no hay que descartar la producción de otros

metabolitos influyen considerablemente en el sabor del producto final. El aislamiento

S.c.mosca3 fue el que tuvo la tasa de consumo de azúcares mas alta, y fue por consiguiente

el que presentó la mayor producción de etanol, además de que esta levadura presentó un

patrón en huella genética de rep-PCR diferente a las demás.

Los resultados presentados en este trabajo indican que existe una gran diversidad ecológica

y genética de levaduras que se encuentran presente en las diferentes etapas de la

fermentacion del mezcal que se produce en Tamaulipas, las cuales en su conjunto

determinan las características organolépticas del producto final, y que aunque S. cerevisiae

produce la mayor cantidad de etanol, es indudable que toda una gama de microorganismos

están involucrados en menor o mayor grado en el sabor y olor del producto tamaulipeco.


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11. RECOMENDACIONES

El mezcal, al ser una bebida artesanal, requiere más estudio acerca de las levaduras y otros

microorganismos que se encuentran presentes durante cada una de las etapas de

fermentación, ya que, si bien ya han sido identificadas y analizadas en cuanto a su

productividad en este estudio, requiere corroborarse su implicación productiva en

condiciones reales directamente en la mezcalera.

También se recomienda estudiar por HPLC y por CG otros metabolitos que se sabe están

presentes en los mostos de mezcal, como ésteres y ácidos orgánicos, que son producidos

por levaduras (y bacterias) tales como los ácidos acético, láctico, succínico, málico y

cítrico; así como también es necesario estudiar los alcoholes superiores que podrían estar

presentes en las diferentes etapas de fermentación, y que se sabe tienen un fuerte impacto

en las características organolépticas del producto final.

Existen otras técnicas moleculares con las cuales se puede monitorear a las levaduras del

mezcal tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH) y de caracterización molecular

global mediante el análisis de regiones ribosomales (ARISA), con las cuales se podría hacer

el seguimiento de las especies y de la dinámica poblacional, así como implementar técnicas

más rápidas de caracterización microbiológica de los mostos.


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12. BIBLIOGRAFÍA

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13. APÉNDICE


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


APÉNDICE 1. Aislamientos de levaduras con su clave de identificación y el número de carril en el

que se encuentra en el gel de agarosa de la PCR.

Clave Número de carril

26S

Número de carril

ITS1-5.8-ITS2

S.c.D2 1 1

S.c.D3 2 2

S.c.D4 3 3

S.c.D5 4 4

S.c.D6 5 5

Z.b.3Y1 6 6

S.c.3Y2 7

S.c.3Y3 8 7

S.c.3Y4 9

S.c.3Y5 10 8

S.c.3Y8 11

T.d.1AN2 12 9

K.m.1Y1 13 10

K.m.1Y9 14 11

P.m.1Y14 15 12

T.d.1D2 16 13

C.l.1AN4 1 1

T.d.1AN1 2 2

P.m.1AN3 3 3

T.d.1AN5 4 4

K.m.1AN6 5 5

T.d.1AN9 6 6

S.c.1D1 7 7

K.m.1D5 8 8

C.p.1Y7 9 9

P.k.1Y10 10 10

K.m.1Y11 11 11

P.g.1Y12 12 12

P.g.1Y15 13 13

P.k..1Y16 14 14

C.l.4AN1 15 15

C.l.4AN6 16 16

P.g.4AN2 17 17

C.l.4AN3 18 18

P.k.4AN5 19 19

P.g.4AN7 20 20

K.m.4D2 21 21

K.m.4D3 22 22

K.m.4D4 23 23

K.m.4D5 24 24

P.k.4D6 25 25

P.k.4D7 26 26

K.m.4Y2 27 27

S.c.4Y3 28 28

C.l.4Y4 29 29

P.k.4Y6 30 30

S.c.mosca3 31 31

S.c.mosca1 32 32

S.c.mosca6 33 33

K.m.mosca7 34 34

K.m.mosca5 35 35


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APÉNDICE 2. Análisis de varianza del consumo específico de azúcares. Agrupamiento "T" Media N Levadura

A 77.55 4 P.m.1AN3

B 60.5 4 P.g.4AN2

B 59.6 4 K.m.4D2

C B 56.575 4 C.l.1AN4

C B D 53.05 4 K.m.4D5

C E D 48.625 4 K.m.1Y11

C E D 48.475 4 K.m.4D3

E D 46.5 4 T.d.1AN5

E D 46.3 4 S.c.D5

E D 46.25 4 T.d.1AN1

F E D 45.3 4 K.m.1D5

F E D 44.45 4 K.m.4D4

F E G 43.525 4 T.d.1D1

F H E G 43.025 4 C.l.4AN3

F H E G 43 4 K.m.1Y9

I F H E G 41.025 4 K.m.mosca5

I F H G J 39.825 4 K.m.4Y2

I F H K G J 37 4 P.k.1Y10

I F H K G J 36.675 4 K.m.1Y1

I L H K G J 34.95 4 K.m.1AN6

I L H K J 34.325 4 T.d.1D2

I L K M J 32.375 4 P.k.1Y16

I L K M J 32.225 4 C.p.1Y7

L K M J 32 4 S.c.3Y2

L N K M J 31.7 4 S.c.3Y5

L N K M 30.375 4 C.l.4AN1

L N K M 30.075 4 S.c.mosca6

L N K M 30.05 4 T.d.1AN2

L N K M 29.725 4 S.c.mosca3

L N K M 28.7 4 S.c.3Y8

L N K M 28.575 4 K.m.mosca7

L N M 27.8 4 S.c.4Y3

L N M 27.5 4 C.l.4AN6

L N O M 27.05 4 Z.b.3Y1

P N O M 25.325 4 T.d.1AN9

Q P N O M 24.6 4 S.c.3Y4

Q P N O 23.125 4 S.c.D2

Q P O R 18.45 4 P.g.1Y12

Q P R 17.725 4 S.c.mosca1

Q P R 17.375 4 P.k.4AN5

Q S R 15.8 4 P.k.4Y6

S R 14 4 P.m.1Y14

S R 13.925 4 S.c.D4

T S R 12.8 4 P.g.1Y15

T U S R 11.75 4 S.c.3Y3

T U S R 10.225 4 P.k.4D6

T U S 8.275 4 S.c.D6

T U S 8.2 4 P.k.4D7

T U S 8.1 4 S.c.D3

T U 4.95 4 C.l.4Y4

U 3.575 4 P.g.4AN7


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


APÉNDICE 3. Imágenes de las levaduras utilizadas en este estudio divididas en dos grupos las que

tienen células redondas y las de células ovaladas, objetivo 100 X

Células Redondas


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________



_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Células Ovaladas


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________



_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


APÉNDICE 4. Secuencias obtenidas por secuenciación y secuencias de referencia utilizadas para

la elaboración de los árboles de distancias génicas de las dos diferentes regiones.

Región 26S de ADN ribosomal.

>FJ360521_Neurospora_crassa

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT

GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA

AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT

ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG

GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG

AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG

TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT

ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA

AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA

GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT

CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC

AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC

CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA

ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC

TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT

ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA

CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC

ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG

GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG

ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT

ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT

AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA

TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC

TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA

AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT

ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA

GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT

TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG

CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA

CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT

AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG

AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT

TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG

AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT

AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT

GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT

CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT

TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG

CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA

TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA

CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG

CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC

TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG

GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT

TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA

ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC

TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT

AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT

GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA

TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA

CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC

GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA

CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA

GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC

TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG

ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA

AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA

GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC

GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA

GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC

ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG

GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG

GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT

TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC

CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG

GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC

AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG

ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG

TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA

ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA

GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG

CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC

TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC

CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT

CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT

GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG

GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT

CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA

TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG

TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG

GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG

AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG

CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG

CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA

AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC

GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG

CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG

GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT

AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG

GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA

ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC

GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT

CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG

GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG

GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA

GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG

AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG

CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA

GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG

GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG

CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT

TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC

GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG

AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC

TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG

TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT

TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA

TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>K.m. 1D5

GGCATGCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA

GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG

ATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA

AGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAA

AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTT

TTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGA

CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>EU439450_Kluyveromyces_marxianus

TGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAAG

AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT

CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG

CTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAA

GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT

AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT

GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>T.d. 1AN1

GGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGTGGAGTGGTAATTTGTAGA

AGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT

CCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG


GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGGAATT

TCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTATATC

CTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC

TTGAAACACGGACCA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>K.m. 1Y11

GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGAAG

AAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAT

CCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG


GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAGTTTT

AGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGGACT

GAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCCC

>K.m. 4D2

CGGGGCTGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA






CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA

>K.m. 4D3

GGGCGATGCCCTTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAGTAATTTGA

AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG

GATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA

AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA

AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCAG

TTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGGG

ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>K.m. 4D4

CGGGGGTTTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTGA






ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAA

>K.m. 4D5

CGGGTGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGATGTAATTTGAA

GAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGCCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG





CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>K.m. 4Y2

GGGGGATGCCTTAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCGAGAAGTAATTTG

AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA

GGATCCCAGTTATTTGTAAAGTGCTTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA

AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGCGTTTGCTTCGGCTTTCGCTGGGCCAGCATCA

GTTTTAGCGGTTGGATAAATCCTCGGGAATGTGGCTCTGCTTCGGTAGAGTGTTATAGCCCGTGGGAATACAGCCAGCTGG

GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAATCACGGACCA

>K.m. mosca7

CCGGTATGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGA






ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>K.m. mosca5

CCCACGGGATGCCTAGTACGGCGATGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTAGAGAGGTAATTTGA

AGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGACAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG





ACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCAACGGACC

>K.m 1Y1

AGGGAATGTCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTGAA






CTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAA

>K.m. 1Y9

AGGGAATGCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAAATTTGAAAATCTGGCGTCTTCGACGTAAGAGAAGTAATTT

GAAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTAGAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA





GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCA

>T.d. 1AN5

GGGGGGATTGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT

GTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG

AGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC

TAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG

AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGG

GGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTG


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


TTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCC

GCCCGTCTTGA

>K.m. 1AN6

ATTTGGGGCTTTAGTTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCTTCGACGTCCGAGTTGTAATTTG

AAGAAGGCGACTTTGTAGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA





GACTGAGGATTGCGACTTTTGTCAAGGATGCTGGCGTAATGGTTAAATGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGACCA

>T.d. 1AN9

TCCCAGGGAAGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT

AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG

GATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA


AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGGGGG

AATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTGTTA

TATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC

CGTCTTG

>T.d.1AN2

GGGGGTTTCCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCACATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAGGTGATTTGT

AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCTTTGAAAATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG






CGTCTTGAAAACACGGACCA

>EU879961_Torulaspora_delbrueckii

CGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAAT

TTGTAGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC

GAGGATCCCAGTTCTTTGTAAAGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT

CTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGT

GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTGG

GGGAATCTCGCAGCTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCTGCAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGT

GTTATATCCTGTAGAAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACTTTACGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGC

CGCCCGTCTTGAACCACCGGACCAAA

>T.d.1D2

CGGGAAAGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGT

AGAAGGTAACTTTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG






_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________



CGTCTTGAACCACCGGACCKAA

>S.c. 1D1

GGGTATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG

AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA

GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA

GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA

AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAAT

CTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAG

CCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGT

CTTGA

>S.c. 4Y3

CGGGTCAAGCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGATGTAATTTG

GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA

GGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT


AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGG

AATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTA

TAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCC

CGTCTTGAAACCACGGACC

>S.c. mosca3

ACCGGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTG

GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA






CGTCTTAAAACACGACCA

>EU556339_Saccharomyces_cerevisiae

TGCGTGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT

GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCG

AGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC


AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGG

GAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATT

ATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGC

CCGTCTTGAACAACGGACCAAA

>S.c. mosca1

AGGGGGGATGCCTTCTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCAGAGAAGTAATTTG

GAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTTTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA





_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________




CGTCTTCA

>S.c. mosca6

GGGTTATGCCCTTATACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGG

AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAG

GAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA


AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGA

ATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTAT

AGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCC

GTCTTGAAMCMMSGGRACCATGAG

>S.c.3Y4

CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGG

AGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCTaTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG

AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA


AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAA

TCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATA

GCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCG

TCTTGAA

>S.c. 3Y8

CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT

GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGA






CGTCTTGAACAaaCGGACCAA

>S.c. D2

CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT

TGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGC

GAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCAT


GAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGG

GGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTAT

TATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCG

CCCGTCTTGAACCMMSSRRMAMCA

>S.c. D3

GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT





_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________





CCCGTCTTGAAACCC

>S.c. D4

AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT







CCGTCTTGAAACCGCGAACCA

>S.c. D5

CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT







CCGTCTTG

>S.c. D6

GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT







CCGTCTTGAACACACGGGACCA

>S.c.3Y2

CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAG

AGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG

TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAG


GTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATC

TCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGC

CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTC

TTGAAaaacccGGaACCAAA

>Z.b. 3Y1

CCCACGGATGCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAATCTGGTACCTTCGGTGCCGAGTTGTAATTTGTA

GAAGGCGACTCTGGGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGG

ATCCCAGTTCTTTGTAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________



AAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGA

ATCTCGCAGTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGA

CGAACTTATAGTCCAGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTA

TATGCCGCCCGTCTTGACCAAACGGACA

>AJ966343_Zygosaccharomyces_bailii

TACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAAGGCGACTCTG

GGGCTGGTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTATGGCGAGGATCCCAGTTCTTTG

TAGAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC

GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATT

GTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGCGCCCCTCGCCTCTCGTGGGTGGGGGAATCTCGCAGTTCACT

GGGCCAGCATCAGTTTTGGCGGCAGGATAAATCCCTGGGAATGTAGCTCTACCACTTCGTGGCGGACGAACTTATAGTCC

AGGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGAATGCGACTTTTAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCT

TG

>S.c. 3Y3

CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATT







CCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA

>Sc. 3Y5

ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT







CCGTCTTG

>P.k. 1Y10

AGGGGCTTGCTCTGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAG

GTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG

TCGACACCTGTGAGGCCCTTTTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT

AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC

ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGG

GTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGT

AGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGT

CTTGAAACACGGACCCC

>AY305665_Pichia_kluyveri

CAAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGTAAATTGCAGGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCCAG

TCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAKCGTGCATGTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCG


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


AGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAA

GTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCCGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGG

GCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGTGTGGGGTTTTCCCTCCGGGCCAGACCCCCGGTTTCCC

GTTGCAGGACCTAAGGACAACCTAGTGTACCAGTAGTGCTCCCATCGAGTTCGCCCGCCATTATCGTACCCTTTTATGAAT

GTCTGGTTGTGTCCGGGGTATTTGTCT

>P.k. 4AN5

AGGGCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG

TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT

CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA

AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA

CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACAKGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG

TTTTTCCTGGKYCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA

GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC

TTGAACCACGGAC

>P.k. 4D6

GAATTGCCCTCAGTAGCGGGCGAGTGAAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTAGAAAATTGCA

GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCAT

GTCGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGC

TAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAG

CACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTG

GGTTTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTT

GTAGATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCC

GTCTTGAAACACGGAC

>P.k. 4D7

CAGGATGCCTTCATAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGG

TTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGT

CGACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTA

AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCA

CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGT

TTTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA

GATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTC

TTGAACACGGACCA

>P.k. 4Y6

AGGTCATGCCTCGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAATCTCACCTAGTGTGCGAGTTGAAAATTGCAGGT

TGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATGTC

GACACCTGTGAGGCCCTTCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAA

ATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCAC

GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGGTT

TTTCCTGGGCCAGCATCGGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTAG

ATGCTGCGTATGGGGACCGAGGGCTGCGGCGGACTCGTTTCGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCT

TGAACCACGGACCA

>P.g.1Y12

CGCCTTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCCAAGCTCAATTTGAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGATAGTAATTTGAAGAT

TGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCC


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCT

AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT

ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCCGC

ACTTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGCCT

GCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGYCTTGA

AACACGGACCCA

>EU177574_Pichia_guilliermondii

GGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG

AAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG

ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA


AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA

CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT

AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT

CTTGAAACACGGACC

>P.g.1Y15

AGGTGATGCTTATAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGTAATTTGAA

GATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGAT

GCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAA

GCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAA

AGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGACCC

GCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTATAGC

CTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGTCTT

GAAACACGGACCAM

>P.g. 4AN2

AATGGGCCTTTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAAGCTCAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTAGAGAGGATTTGA

AGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGACAATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG

ATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA


AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA

CCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTAT

AGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCGT

CTTGAAACACGGACCAC

>P.g. 4AN7

CGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGCCTTCGGTGTCGAGATGTAATTT

GAAGATTGTAACCTTGGGGTTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA

GATGCCCAATTCTATGTAAGGTGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT


AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTTTGAGATCAGACTCGATATTTTGTGAGCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTG

ACCCGCAGCTTATCGGGCCAGCATCGGTTTGGGCGGTAGGATAATGGCGTAGGAATGTGACTTTACTTCGGTGAAGTGTTA

TAGCCTGCGTTGATGCTGCCTGCCTAGACCGAGGACTGCGATTTTATCAAGGATGCTGGCATAATGATCCCAAACCGCCCG

TCTTGAAACACGGACCA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>P.m. 1AN3

CGAGGATGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTT

GAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA

GATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCT

AAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGA

AAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAG

GATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGC

GTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACC

>P.m.1Y14

TTCAAGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAATAGCTCAATTTGAAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTG

AAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAG

ATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTA

AAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAA

AAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTGGTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGG

ATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCTGGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCG

TCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTAATCTCTTTAGGGAACGTWTTYGGCRACWYKCKCR

MYWWSMSTMTGYSRCSRYYCCKRYSSYYKYRSSWYSYYAG

>EU809452 Pichia mexicana

ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAATAGCTCAAATTTGA

AATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATTTGAAGAAGGTATCTTTGGTTTTGGCTCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGG

ACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGAGATGCCCAATTCCATGTAAAGTTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGG

AATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAG

GAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGGTCAGACTTG

GTTTTACCAGGCCAGCATCAGTTTGGATGGCAGGATAATAGCTTAGGAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTATAGCCT

GGGTTGATACTGCCTGTCTAGACTGAGGACTGCGTCTTTGACTAGGATGCTGGCATAATGACCTTAAGCCGCCCGTCTTGA

AACACGG

>C.l.4AN1

AGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGTCT

GAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTGCA

CCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCG

AGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTG

TTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAGACGGGGGGAACAAGGGCTAAAGAA

TGTGGCGCGCACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCTCACTAACACCTCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAGGACG

CTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACACGGACCA

>AY894825_Clavispora_lusitaniae

GGATTGCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGT

GGTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCT

TTGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATT

GGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGA

AATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCAAATAAACGGGGGGGATAAGGGGGA

AAGAATGTGGCGCGTGCCTTCGGGTACGCGTGTTATAGCTTTCTCTAATACCCCCATGTTTGTTTGAGGCCTGCGATTCTAG

GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>C.l.4AN3

CGGTCATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTTTCGTGGT

CTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTTTG

CACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGC

GAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATT

GTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCGAGA

ATGTGGCGCGCACCTTCGGGCGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAGGAC

GCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAACCACGGACCA

>C.l. 4Y4

AGGGTATGCCCAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCTGCGGGAATTGTAATTTGAAGGTATCGTG

GTCTGAGTCGGCCGCGCCCAAGTCCATTGGAACATGGCGCCTGGGAGGGTGAGAGCCCCGTCCGGCGCACGCCGACTCTT

TGCACCGCGGCTCCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTG

GCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAA

ATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACGGTTTTACCGGGCCAGCGTCGAAAAGGGGGGAGGAACAAGAACTCG

AGAATGTGGYGYGYACCTTCGGGTGCGCGTGTTATAGCTCGTGTTGACGCCTCCATCCCTTTTCGAGGCCTGCGATTCTAG

GACGCTGGCGTAATGGTTGCAAGCCGCCCGTCTTGAAAACACGGAC

>P.k. 1Y16

GATTATGCTCGTCAGTAAGCGGCGAGTGAGCGGCAGAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAGAAGAGGGTGCA

GGTTGGAGTCTCGGGTTAGACGTGTGTGAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCACTGAGGGTGAGAGCCCCGTAGCGTGCATG

TCGACACCTGTGAGGCCCTTCTCACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCT

AAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGC

ACGTGAAATTGTTTAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGATTTACGCATCGTTGCCTCTCGTGGGCGGCGCTCTGGG

TTTTTTCTGGTTCAGCATCCGTTTTCGTTGCAGGATAAGGACAATTGGAATGGGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCCTTTTGTA

CATGCTGCGKATGGGGACCGAAGGCTGTGGCCGACTCCTTTCCTCTCGGGAGCTGGCCCCACGGCGCTTTATCGCCCCCCC

TGAAACAAAYAACACACA

>C.p. 1Y7

TGTCTGTCCTTTATAAACGGCGATTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTAGAGAAGTAATTT

GAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGATGA

GATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATC


AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGCCT

CTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTAT

AGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCCG

TCTTGAAACACGGACCAC

>EU605804_Candida_parapsilosis

AGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGCACTTTCAGTGTCCGAGTTGTAAT

TTGAAGAAGGTATCTTTGGGTCTGGCTCTTGTCTATGTTTCTTGGAACAGAACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTGCGAT

GAGATGTCCCAGACCTATGTAAAGTTCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCA

TCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAG

TGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGAGATCAGACTTGGTATTTTGTATGTTACTCTCTCGGGGGTGGC

CTCTACAGTTTACCGGGCCAGCATCAGTTTGAGCGGTAGGATAAGTGCAAAGAAATGTGGCACTGCTTCGGTAGTGTGTTA

TAGTCTTTGTCGATACTGCCAGCTTAGACTGAGGACTGCGGCTTCGGCCTAGGATGTTGGCATAATGATCTTAAGTCGCCC

GTCTTGAAACACGGACCA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Región ITS1-5.8S-ITS2 de ADN ribosomal

>FJ360521_Neurospora_crassa

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATATATATTTTTCTTACTTTCCTTCTACCTTTTTACTTTTGTAATGTCTT

GCCCCCTTAGTAAGCTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTATTCTTCTTTTCGTCCTCTTGTTCTACCTCCAAATCTTTATTAGGTA

AGGGCGTTTATAAAGTAAATAAACACTTTTAGAGTAGTAGGAGCCGGATTATAACAAGGGTAGAGGTTTTTTTTATAAAT

ATAGGAAGAAGAAGGTATTCGGAGGCGACTAAGTCGATCAACTAGAACCTATACGGTCTTGAATGAATTGTTAGGGAAGG

GCAGGTAAATAATTGATAGTAGGAAAGAAGAAAAAGAAGAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGAAATTTTGAAAGTAGTAG

AAGAAGAAGGGTAGTAGAATTTAGGGGGTATAAATAGTTAGTAGAGTAGGTAGGGTGTTAGGTGGCTTTGGTTGTATGGG

TAGGGAGGATATGTTGAGGTTAGTATATTAATAAAGAAGGTTGAATTGGTAAATGTAAAAAGAAAAAGATAAGAGTAAT

ATGAATACTTTTGGTATAGTTATAAGATGTTGTAAATTATATTAGGGAAGATAAAAAGTAGTTAGCTTTTTACTTAGTGGA

AACGTAGTTTGAGTGGACGCTGTAGGGTAGGCACGTCTGCTTTATATAAGAAAGGCGCGGCCGAGGTTGAAAAGGTGGAA

GAGGGAAAGGCAGTGAAGGGTGGTACTTACCGAGTGCAGGGTAGGCAAGAACGACCGGGTAGGTAAGGAAGGCGCAAT

CGACCTTTGGAAGCCGAAGTTTTGAAAAGGAAAATTGCGAGTAGGTAGCGCTTATTAAGTGTAGGGTAGGTAAGAACTAC

AGGGTAGGTACGACGGGCCTGTATGAGAAAGGTAAGATCAAAGTTGAAAAGAAAAAAGTAGTAGGCGGGTAGTACCTAC

CGAGTGCAGGGTAGGCAGGAATGACCGGGTAGGCAAGGAAGGCGCAACCAACTTGACGAGGAAGGCGTGGTCTTTGTGA

ACTTGGAGCGAGATTCCTGAGAAGGTGCGACCCAGTTGGGTGGCTGGGTGGCCGTGAGTCGATTTTTAAAATTTCCCATAC

TGGGGAATTTCGCGGGAGTTGAAAAGTCGCGGCTCAGACCGTCGGGCCGCACCGTCCCCAGACTCGAGGTCGAAGGGAAT

ACAAGAAGGAGCGGCGGAGAGCAATGGGAAAGAGCGAGCGGTAAGACTGCTCGGTCGTCCCTGCCTCCGGCTCCCTCTTA

CAGGTGTGGGCAAGGACGTACAGGGCCTGCTCCACCTGGAAGCCTTCTGCGGGAGGGCTGCTCTGGCCTGTGGCCTAGGC

ACCTTCCCGCGGTAACCTGCAAAGGAAACCAAGTTCCAGTTCATGGAGCGTTGTTATCGCGTGGCTCCCTACGGTCTGCCG

GGGAGTCAACGTTAACAGCGCGAGCCACCTCAGCACCGTTCCAGCAAGGGCTCTGCCTCTGCCGGGCGGCATCTGAGAAG

ATCCTGCAGGCGCTAGGGAGTACCCCATAAGCGCCGAGGGGTGGGCTCTGTGGATGACTGGCCGCTGGCCAAACTTATCT

ACAAGCCGCCGGGGGGTACCGGCCAGCTGGGGAAGCCTTCGGGCAGAACCTTCTGTGCTGGGCCTCCTCTTGGGGCGCAT

AGGCGGTGTGCGAGAGGCGCTCTGCGCTCTCCCGTCCTCCTGCCGACCGCGCTCTGGGGAATTCAGGAGGGGAAAGCAGA

TGCGTGTCTCGAGGCAAGTTCGGCCCTGCCGTACGAGCTTCGGACCGCCTACCTTCGTAACTTTGTGAACTCTTCCGCTCGC

TTGCGAGCGGTTGGCCTTTCCAGGCGCACGATAGTTACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTA

AGCCATGCATGTCTAAGTTTAAGCAATTAAACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATAGT

ACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTA

GATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTAACTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCTGGCGATGGT

TCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGACGGCTGGGTCTTGGCCAGCCATGGTGACAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG

CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA

CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT

AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTG

AGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCTCGGCCCGTCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGACTGGGTCGGGCCTTTT

TTCCTGGAGAACCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCGTGAACAAATCAGATCGCTCAAAG

AAGGCCTATGCTCGAATGTACTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGT

AATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACT

GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGT

CTTAACCATAAACTATGCCGATTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGATAAATCAAAATGT

TTGGGCTCCTGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTG

CGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGA

TTTCGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAA

CCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGG

CAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACACAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGC

CGGAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTGTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCC

TAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG

GCTCAGTGAGGCTTCCGGACTGGCCCAGGGAGGTCGGCAACGACCACCCAGGGCCGGAAAGCTATCCAAACTCGGTCATT

TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


ACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGAAAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTC

TCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAAT

AAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT

GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCA

TTTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA

CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC

GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAA

CGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCTTCGGCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGGAAGCTTTTGGTGA

GGCACCTTCTGAGTCCCCTGGAACGGGGCGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTATAGTCGGATGCCGATCCAATGTAAAGC

TCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCAAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAG

ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGCACGTGAAATTGTTGA

AAGGGAAGCGTTTGTGACCAGACTTGCGCCGTTCCGATCATCCGGTGTTCTCACCGGTGCACTCGGGACGGCTCAGGCCA

GCATCGGTTTTGGCGGGGGGATAAAGGTCCGGGGAACGTAGCTCCTCCGGGAGTGTTATAGCCCCGGGCGTAATGCCCTC

GCCGGGACCGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGA

GTCAAGGTTTTGCGCGAGTGTTTGGGTGTAAAACCCGCACGCGTAATGAAAGTGAACGTAGGTGAGAGCTTCGGCGCATC

ATCGACCGATCCTGATGTATTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCGTTAAGCCTTGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTG

GATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATCTGAGCATG

GGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTACCGCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCAGTGTTGTTCTTCAGTTT

TATGAGGTAAAGCGAATGATTAGGGACTCGGGGGCGCTTTTTAGCCTTCATCCATTCTCAAACTTTAAATATGTAAGAAGC

CCTTGTTACTTAATTGAACGTGGGCATTCGAATGTACCAACACTAGTGGGCCATTTTTGGTAAGCAGAACTGGCGATGCGG

GATGAACCGAACGCGGGGTTAAGGTGCCGGAGTGGACGCTCATCAGACACCACAAAAGGCGTTAGTACATCTTGACAGC

AGGACGGTGGCCATGGAAGTCGGAATCCGCTAAGGACTGTGTAACAACTCACCTGCCGAATGTACTAGCCCTGAAAATGG

ATGGCGCTCAAGCGTCCCACCCATACCCCGCCCTCAGGGTAGAAACGATGCCCTGAGGAGTAGGCGGCCGTGGAGGTCAG

TGACGAAGCCTAGGGCGTGAGCCCGGGTCGAACGGCCTCTAGTGCAGATCTTGGTGGTAGTAGCAAATACTTCAATGAGA

ACTTGAAGGACCGAAGTGGGGAAAGGTTCCATGTGAACAGCGGTTGGACATGGGTTAGTCGATCCTAAGCCATAGGGAA

GTTCCGTTTCAAAGGGGCACTTGTGCCCCGTGTGGCGAAAGGGAAGCCGGTTAACATTCCGGCACCTGGATGTGGGTTTTG

CGCGGCAACGCAACTGAACGCGGAGACGACGGCGGGGGCCCCGGGCAGAGTTCTCTTTTCTTCTTAACGGTCTATCACCC

TGAAAACAGTTTGTCTGGAGATAGGGTTTAATGGCCGGAAGAGCCCGACACTTCTGTCGGGTCCGGTGCGCTCTCGACGTC

CCTTGAAAATCCGCGGGAGGGAATAATTCTCACGCCAGGTCGTACTCATAACCGCAGCAGGTCTCCAAGGTGAACAGCCT

CTGGTTGATAGAACAATGTAGATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACTTCGGGAAAAGGATTGGCTCTAAGGGTT

GGGTACGTCGGGCTTTGGGCAGACGCCCTGGGAGCAGATCGCCACTAGCCGGGCAACCGGCCGGCGGCTTTCAGCATCCG

GGTGCAGAAGCCCTTAGCAGACTTCGGTCGTCCGGCGTACGTTTAACAACCAACTTAGAACTGGTACGGACAGGGGGAAT

CTGACTGTCTAATTAAAACATAGCATTGCGATGGCCAGAAAGTGGTGTTGACGCAATGTGATTTCTGCCCAGTGCTCTGAA

TGTCAAAGTGAAGAAATTCAACCAAGCGCGGGTAAACGGCGGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAATGCCTCG

TCATCTAATTAGTGACGCGCATGAATGGATTAACGAGATTCCCACTGTCCCTATCTACTATCTAGCGAAACCACAGCCAAG

GGAACGGGCTTGGCAGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGACATTGTGAAAAGACATAGG

AGGTGTAGAATAGGTGGGAGCTTCGGCGCCGGTGAAATACCACTACTCCTATTGTTTTTTTACTTATTCAATTAAGCGGGG

CTGGATTTTCGTCCAACTTCTGGTTTTAAGGTCCTTCGCGGGCCGACCCGGGTTGAAGACATTGTCAGGTGGGGAGTTTGG

CTGGGGCGGCACATCTGTTAAACCATAACGCAGGTGTCCTAAGGGGGGCTCATGGAGAACAGAAATCTCCAGTAGAACAA

AAGGGTAAAAGTCCCCTTGATTTTGATTTTCAGTGTGAATACAAACCATGAAAGTGTGGCCTATCGATCCTTTAGTCCCTC

GAAATTTGAGGCTAGAGGTGCCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGCGTTCATAGCGACGTCG

CTTTTTGATCCTTCGATGTCGGCTCTTCCTATCATACCGAAGCAGAATTCGGTAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGG

GAACGTGAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACCTCATCGCAATGGTAATTGAGCTT

AGTACGAGAGGAACCGCTCATTCAGATAATTGGTTTTTGCGGTTGTCCGACCGGGCAGTGCCGCGACGCTACCATCTGCTG

GATAATGGCTGAACGCCTCTAAGTCAGAATCCATGCCAGAACGCGATGATACCTCCAGCACGTTGTAGACGTATAAGAAT

AGGCTCCGGCCTCGTATCTTAGCAGGCGATTCCTCCGTTGGCCTTGAAGTGGCCAGCGGTAATTCGCGTATTGTAATTTTA

ACACGCGCTGGATCAAATCCTTTGCAGACGACTTAGATGTGCGAAAGGGTCCTGTAAGCAGTAGAGTAGCCTTGTTGTTAC

GATCTGCTGAGGGTAAGCCCTCCTTCGCCTAGATTTCCCAGTGGAAGGGTCCGCCTAACAAGCGGGCATTTACTGGGGGGT

CCCCCCGAGACTTGGTTGCCAGAGCCCGAGAGGGCGAAAGCGCCTTGCCGGAGGGAAAGTGCAGGGTAAGCAGGGACAG


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


GAAGGGGACTTGGTCAAGTTCAGCATCTCCCGGGTTTGGACGACGTTGCCCTGGGGGCGCGGGCGGGCCGGGCATAAGGG

GTCTGCCGTACCAGCAGCCAGCCTGCAGAAGGCTCGGTGGCTATGCATGGCACATGCCCGGGGAAGCGTCGACCGGCGCA

GTGTACGCGGGCACGGCCGGGCCGGGCCTTTGCAAGTCTTGGTGGCTGCGGTAGGTAGGGTAGGCAAGAGCGACCGACCG

AGCGGCGGCGGGGCAGGAGCGACCGGGTAGGCGAGCAATTTTTGGGCAAGCTTGCAGTTCTGGACAAGTGAATGCATTCG

CGACCGGGTTGGGTGCGGCGCCGGGTAGGCAAGCGCGTTCGAATCGTACAAGGTGGCGTAGAGAAGAGAGGGTAGGCAA

GTGCGTCCGGGCGGGTTAGGTGTGTAGGGTAGGCAGGCGCGTCTGGGCATGGAATTTTTGTGTAGATGGTGGCTGCATTG

GGAAGGCAAGGGCGAGGGCCTGTGCAGGGTAGGTAAGAAGGACCGAGAGGCTTGGGGGGGCCAAGGGGTTGCTTTCCAG

CTCCTACTGGGAGGGGCTTGTTGAAGGAAAGGGTAGGGTGATAGTAGGAGGGGGTAGGTAAGTAAAGAAGCTATGTGGT

TGAGTAAAGGTATTTGTAGCCTTTTTATTAGAAGATGTAGTAGGGTAGGTAGGAAAAGGTTGTACGGGATTGTGTTTTTAC

GTGAGGTAAAGGTATAAAGGGGGAGGCTATCTTTTTGATTTCTGGGTAGGCGAGGCGGTAGGTAGGCTACTTGGGCTGGG

AATGGTTTAGTCTTTAGGGGGGGAGCGAAAATTTCTTTCTTCTTTTTCTTTTCCTTTTTTATTTATTTATTTTTTTTCTTTCTTC

TTTTTCTCCTCCCTCTTTCTTCTTCCTACTTTTATCCTCTTTATTACTCTTCCTCCTCCCTTTCCTTTCCTCTCCGTCTTCCTTCG

TTTTGGTCCTTTTTTTCTTTTCTCTTCCTTTTTCTTTTTTCTTTTTAGCTTTTAACCTCTTTTTAGGGCTTTCCTCTCTTAATATT

TCTTTCCTTATACCTCCAAACCCCCCTCCGTTCCCTTCTTTTGTATTATATCTATACAAGGATAAAAAAGTAATATGATTAA

TATGTAAATAAAATAAAGAAGGTTCTTATTCTTCTTTTCTTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

>EU145764_Saccharomyces_cerevisiae

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AGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAAC

GGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCA

ACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCA

AAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA

GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTT

GGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTT

AACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA

CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGT

CTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAG

GA

>K.m. 1Y9

CTATAGGGCGAATTGGGCCCGGCGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCGCGGGGAATTCGATTTCCTCCGCTTATTGA

TATGCTTAAGTTCAGCGGGTACACCTACCTGATTTGAGGTCAAACTTCGAGAGTTTTGGTTAAAGCCGTATGCCTCAAGGA

GACAAACACCAGCGAGTCTTTATAACACCTATGAGTCTCTATGACCCAAGCTTACCACGAATTGGCGCAAACCTAAGACG

TAGATGTGCAAGAGTCGAGTCCATAGACTTGACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGCTAGCCACTTTCAAGTT

AACCCGAGACGAGTATCACTCACTACCAAACCCAAAGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAAACAGGCATGCCCCCTGG

AATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTTGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCACAATACATATCGCTACTTCGC

TGCGTTCTTCATCGATGCGAGTAAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATATTAAATTTTATAGTATAATAGTTTCT

CATAATACAAAATATTGTTTGTGTTTATGTCCACTGGAGAGACGAGCTCTCCAGGGAAGTAGTTCATAGAGAAAAAACTC

CATTGTGTTTAGGATGAGAAATAGAAAACTGATAGCAGAGAATCAAGAACTGGCCGCGCAATTAAGCGCAGGCCTTGTTC

AGACGATTCCCCCAGTAATCTATTCATTCA

>S.c.D2

ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAG

CCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGC

TTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATT

CGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGT

AACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC

GATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCA

TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGG


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTT

TACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTT

CTTAAAGTTTGACCTCAAA

>S.c.D3

CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGG

GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAG

AGTTTTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGTATTTTCCTATCTTTTCAACTTTT

TCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAAC

AAGAATTTTCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAAAACA

CATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTAT

TCCTGGGGGCTTGGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGTAATAAATT

TTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAATTGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGT

CTTTTTGGGTTTAACCACCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAAAGCGTCTAG

GCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGACCCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAA

GATAAA

>S.c3Y3

ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAGGCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGC

GCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAG

GACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGG

GGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATT

TTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT

GAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG

CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGG

ATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGG

CTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAAGTTTG

ACCT

>P.m.1Y14

ATTggGcCggCGGgGGAAAAAAAaCCCATAcACACAGtGTTTTTTGTTTATTAAAAAAActgttGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGG

GCCAGAGGTAAaAAcGtAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTAATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAA

ATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATG

AATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGC

GTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCA

AGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGG

TAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

AgGCGGAGGAAGATCTTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTT

TTTGTTTATTaAgAACTATTGCTTTGGCTTgGcGcAGTcGGGCAGAGGTTcTACGTAAcTTCAATTTTAATTGAATgTTATTTTA

TccGttTCATTTtTTtAtTAATTaAAAaAATCcTCAAcTTTcACAcGActtTGGTTccCttttAAAaccCAAgCGATAaTAaaTtGAAtTGATTT

>EF568069 Pichia_mexicana

GATCATTACAGTTATTACTTTCTACCAGCGCTTAATTGCGCGGTGGAAAATAACCCATACACACAGTGTTTTTTGTTTATTA

CAAGAACTATTGCTTTGGCTTGGCGCAAGTCGGGCCAGAGGTTACTACGTAAACTTCAATTTTTAATTGAATTGTTATTTTA

ATACAGTTGTCAATTTGTTTGATTAAATTCAAAAATAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAT

GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC

CTTTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCTTGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAG

TCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCAAGAGTGTACTAGATAGTACTACCTGTTATTCAATGTATTAGGTTTATC


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


CAACTCGTTGAACGACTGGGCGTAAGTTTCTGGTAATTGGCTCGGCCTTACAACAACAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGG

TAAGATTACCCGCTGAACTTAA

>S.c.D4

CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGG

AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG

ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCAAATCTTTGCAACTTTTTC

TTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAA

GAATTTTCGTAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCA

GCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTC

CAGGGGGCAKGCCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTG

AAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCG

TTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAAAAGCGTCCTAG

GCGAACAATTGTTTTAAAGTTTGACCCTCAAATCAGGTAGGAGKACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGA

GAGAGTACAAAATTTTTATATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGGMMGRGAGCTTT

>S.c.3Y4

CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGA

GATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGT

GAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACT

TTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAA

AACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA

ACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG

GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTA

ACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTAC

GGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAAAAAGAGCGTC

TAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC

>S.c. 4Y3

CAAAATTTATAATTTTGAAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAAGCTTTTACCKGGCAAGAAAAAAAGAAAGG

GAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGA

GATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT

CTTTGGGCATTCAAGCAATCGGGCCCCAGAGGAAACAAACACAAAAATTTTTTTTTTTTCTTAAATTTTTTGTCAAAAACA

AAATTTTTCKTAACGGGAATTTTTAAAATTTAAAAAATTTTCAACAACGGATCTCTGGGTTCCCCCATCGATAAAAACCCC

ATCGAATTGCGATACGTAAGGTGAATTGCAAATTCCCGGGAATCATCAAAACTTTAACCCCCCTTGGCCCCCCTTGGTTTT

CCAGGGGGCGGGCCTGTTTGAGCGTCTTTTCCTTCTCAAACTTTCTGTTGGGAAGGGAGGGATCCTCTTTGGAGTAAACTT

GAAATTGCGGGCCTTTTCTTTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTC

GTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGG

CGAACAATGKTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCTTAACAAAAAGCGGGGGAGAA

AA

>S.c. 3Y8

TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGG

AGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAG

ATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCT

TTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAG

AATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG

CGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCC

AGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


ATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTT

TTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGA

ACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGAT

CATTAAAGAAATTTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT

>S.c.3Y2

CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGA

GTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT

CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTG

GGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAA

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AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAG

GGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAAT

TGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTT

AGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA

>S.c.3Y5

TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGGAGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGG

GGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAAC

CGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTA

ACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAA

AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAA

TTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT

CTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCC

AAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTA

TACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT

>S.c.D5

CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTTTCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGG

GAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGGCGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAA

TATTTCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGTTTTCACAGCTTAGCAACTTTTT

CTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGTACCAAACACAAAAAATTTCATTTCTGCATTAATTTTTAGCCAAAAAC

AAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTCTCGCATCGATTAACACCC

CACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTCCGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTAT

TCCGGGGGGCAGGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCTCTTAGTAGTTAACTT

GAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAATAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTC

TTTTTAGGTTTAACCACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAAAAGCTTCTAGG

CCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCCCCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAA

AAAG

>K.m 1Y1

TATATTGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCCCTGCTA

TCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGG

ACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATC

TCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCT

TTGAACGCACATTGCGCCMTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGT

AGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGSTGCKTGTCAAGTCTA

TGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAAGTGTTA


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


TAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGACATACGGCTTTAACAAAAACTCTCAAAGTGTGAGCTCATATCAGGTAGGA

GTATCCACTGAACTTAAGCATATCTATAAGCGGGGGGAAGA

>EF568057_Kluyveromyces_marxianus

TGAATGAATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTGCTATCA

GTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACA

TAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT

TGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTG

AACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGT

GAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGG

ACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAA

AGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTA

CCCGCTGAACTTAA

>K.m. 1AN6

CTAGATACTGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCT

CATCCTAAAAAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAAT

ATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA

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CTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCT

CGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCAC

ATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTT

TGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAG

CATATCAATAAAGCGGGGGAAGG

>T.d. 1AN9

TATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATGGCGCGGCCAGTTTTGATTCTCTGCTATCAGTT

TTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAA

ACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG

TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAAC

GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAG

TGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACT

CGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGA

CTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCC

GCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGGAGAAAAG

>K.m. 1D5

AGAAGATGTGATGATAGATTACTGGGGGAATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCTTGATTCTCTG

CTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGT

GGACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGA

TCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAAT

CTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTG

GTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTC

TATGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGT

TATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAG

GAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGGAGAAGG


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>K.m. 1Y11

ATGAATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAGT

TTTCTATTTCTCATCCTAAACAAAAAGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATA

AACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG

GTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAA

CGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGA

GTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGAC

TCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAG

ACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACC

CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGGAGAG

>AB469378 Torulaspora delbrueckii

CTAAAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCTGGTTCAAGACCAGCGCTTAATTGC

GCGGTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGTCTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAG

TTTTCTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATT

ATTATAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCA

TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT

GCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACT

CTGTCAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTA

ATACCGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAAC

GATTTATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAA

TACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAACGGGAAGAGAAAGGGTCAT

>T.d. 1AN5

AGATACTGGGGGATCGTCTGACAGGCTGCGCTAATTGCGCGGCAGCGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTCTCATCCTA

AAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAATATTTTGT

ATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGA

ACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGG

TATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTCTCGGGTT

AACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCACATCTAC

GTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGTTTGTCTC

CTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATC

AATAAGCGGAAAAAG

>K.m. 4D2

ATGATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTGATTCTCTGCTATCAGTTTT

CTATTTCTCATCCTAAACACAAAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAAC

ACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC

TCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCA

CATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGA

TACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGA

CTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTC

GCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCT

GAACTTAAGCATATCATTAAAAGGGGA

>K.m. 4D3

ATGATAGATACTGGGTGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTCGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATT

TCTCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAA

ACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


ATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATT

GCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACT

CGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCT

TGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTG

GTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAAC

TTAAGCATATCAATAAAAGGGGGAG

>K.m. 4D4

CGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTGAGATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTT

CTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC

AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT

CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC

GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG

TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG

CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT

GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTT

AAGCATATCAATAAAGGGGAGAGAAGG

>K.m. mosca7

TGATAGATACTGGCGGATCGTCTGACAAGGCCTGCACTTAATTGCGCGGCCAGTCGAATCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC

TCATCCTAAAACAAGAGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAAC

AATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT

CGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGC

GCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCG

TCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTG

CACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGT

GTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGGAGTACCCGCTGAACT

TAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA

>K.m. mosca5

ATATGATGATAGATTACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTTAGATTCTCTGCTATCAG

TTTTCTATTTCTCATCCTAAACACAATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACAT

AAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT

GGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGA

ACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTG

AGTGATACTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGA

CTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAA

GACTCGCTGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTAC

CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAACGGAGGAGAAAAGGA

>K.m. 4Y2

GATGATAGATACTGGGGGATCGTCTGAACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCCAGTTAGAGTCTCTGCTATCAGTTTTCT

ATTTCTCATCCTAAAACAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACAC

AAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTC

GCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACA

TTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATA

CTCGTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACT

CTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGC


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


TGGTGTTTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGA

ACTTAAGCATATCAATAAGGCGGGAAGAAGGAT

>K.m. 4D5

TGATAGATACTGGGGGATCGTCTGACAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCAGGCGAACCTCTGCTATCAGTTTTCTATTTC

TCATCCTAAAAAAGGGGGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAA

TATTTTGTATTATGAAAAACTATTATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG

ATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGC

CCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTC

TCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCA

CATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATTCGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGT

TTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAAAACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAA

GCATATCAATAAAGGGAGAAGAAGGAT

>T.d.1AN2

GAGATCTATATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAAGGGGCG

GTTGCGGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAACATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTT

CTACACAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTA

TAAACCAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGA

TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC

CCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGT

CAAGGGTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATAC

CGAATTGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTT

ATCGTTTGTTTGAGCTTTTCGCATACGCAATCCGGCGAACAATACTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCC

GCTGAACTTAAGCATATCA

>T.d. 1D2

ATCTTATGATGAGTTAGAGGACGTCTAAAGATACTGTAAGAGAGGATCAGGTTCAAGACCAGCGTAAAATGGGCGGTTGC

GGCTTGGTTCGCCTTTTGCGGAATATGACTTTTCTCGTTGTTAACTCTACTTCAACTTCTACAACACTGTGGAGTTTTCTACA

CAACTTTTCTTCTTTGGGAAGATACGTCTTGTGCGTGCTTCCCAGAGGTGACAAACACAAACAACTTTTTATTATTATAAAC

CAGTCAAAACCAATTTCGTTATGAAATTAAAAATATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAG

AACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTG

GTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACAATCATGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTGTCAAGG

GTTAACTTGAAATTGCTAGCCTGTTATTTGGTTGTGATTTTGCTGGCTTGGATGACTTTGTCCAGTCTAGCTAATACCGAAT

TGTCGTATTAGGTTTTACCAACTTCGGCAGACTGTGTGTTGGCTCGGGCGCTTTAAAGACTTTGTCGTAAACGATTTATCGT

TTGTTTGAGCTTTTCGCATACG

>EF151440_Pichia_guilliermondii

GCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTT

TAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGT

TCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAAC

GCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAG

TGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATG

TATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAG

TTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGGGATCTTAAGTATTCTTTTGCCA

GCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATAAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCTAGAGATGGTT

GGGCGAGGTTTTACAAAACACATTTAATTATTTTT


_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>P.g.1Y12

TGCAGCGCTACTGCGCGGCGAGAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAATCTAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAG

GTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAAC

AACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATC

ATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCC

GGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCT

GTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTAC

AACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAACGTACCGACGAAGGGATCTTA

CAGTATTCTTTTGCCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGT

TTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCAGAGGTTTACAAAACACAATTTAATTATTTT

>P.g.1Y15

GTGCGGAAGGTTCAAAGGTGTATTCTTTTGCGGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAG

AACTAAGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTAAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCA

AATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA

GTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCT

GTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAG

TATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGG

ATATTTCTGGTATTGTAGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTT

ATGCATATCAATAAGCGGAGGAAAATCTAGTAGTCGTGTTTGCAGTACTTAGCTTCCGAGTGAAATCTCACCCACATAAA

GTCTATATGATAAGTCTTGCTTTCGTTGGCTTGGGATAGAGATGCGGAGG

>P.g. 4AN2

AAGGGTTTTCTTTTTGCGGCGCTTAACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTATAGCTTTG

GGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTAAACAAGGCACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTA

ATCTTCAAAACTTTCAACAACGGACTTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATT

GCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCA

TTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGG

TAGTACTTGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGGGTGGCGGGATATTTCTGGTAT

TGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT

AAGCGGAGGGGGGGATCTTACAGAAATCTGTTGCCAGCGATTAACGGCGCGGCGAAAAACCTCACCACAGTGTCTTTTTG

ATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGAAAGGGTGGGGCAGAGGGTTTAAAACACATTTAAGTAT

>P.g. 4AN7

GGGTATTCTTTTGCCGCGCTTACTGCGCGGCGAAAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTG

GCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTT

CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAG

ATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCT

CTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGT

ACTGGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTT

GGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTTGCATATCTATAACCG

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_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________


>P.k. 1Y10

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>P.k. 4D7

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>P.k. 4AN5

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>P.k. 4D6

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>P.k. 4Y6

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>P.k. 1Y16

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>DQ104732_Pichia_kluyveri

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>C.p. 1Y7

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>Z.b. 3Y1

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14. GLOSARIO

ADN. Molécula de gran peso molecular que está constituida por tres sustancias distintas:

ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del tipo pentosa y una base nitrogenada cíclica

que puede ser púrica (adenina o citosina) o pirimidínica (timina o guanina).

ADNr. Se refiere a la región de ADN donde se encuentran los genes que codifican para la

formación de los ribosomas, generalmente se encuentran en arreglos de cabeza a cola

empezando con el mediano 18S, después el pequeño 5.8S y posteriormente el grande 26S,

separados por los espaciadores internos ITS.

ADN Taq polimerasa. Es una enzima que se extrae de la bacteria Thermus aquaticus para

la replicación del ADN, la Taq ADN polimerasa, es ampliamente utilizada por sus

propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR.

Acido nucléico. Biomolécula formada por macropolímeros de nucleótidos, o

polinucleótidos. Está presente en todas las células y constituye la base material de la

herencia que se transmite de una a otra generación.

Alambique. Del árabe al - ambiq, y este a su vez del griego ambicos = vaso), es el sistema

de destilación más utilizado. El equipo consta de una caldera o pota de cobre, de capacidad

variable, un capacete condensador prolongado en un cuello de cisne (o trompa de elefante),

un condensador refrigerante cilíndrico (bidón) provisto en su interior de un serpentín de

cobre, conectable al cuello de cisne y con salida para el destilado en su parte inferior y una

base para el condensador refrigerante.

Arbol filogenetico. Es un árbol que muestra las relaciones de evolución entre varias

especies u otras entidades que se cree que tuvieron una descendencia común. Un árbol

filogenético es una forma de cladograma.

Bioedit. Es un programa bioinformatico editor de secuencias el cual permite la

manipulación y análisis de múltiples secuencias y contiene aplicaciones que facilitan su

alineamiento entre otras.

BLAST. Es un programa informático que emplea un algoritmo heurístico lleva a cabo un

alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de proteínas. El programa es

capaz de comparar una secuencia problema (también denominada en la literatura secuencia

query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos.

Cepa. Es un grupo de aislamientos caracterizados de un microorganismo. Esencialmente

esto se aplica a aislamientos del laboratorio, cultivos o selección, raza, variedad.

Dendrograma. Tipo de representación gráfica o diagrama de datos en forma de árbol

(Dendro=ramas) que organiza los datos en subcategorías que se van dividiendo en otros

hasta llegar al nivel de detalle deseado (asemejándose a las ramas de un árbol que se van

dividiendo en otras sucesivamente).

Destilación. La destilación es el procedimiento más utilizado para la separación y

purificación de líquidos, y es el que se utiliza siempre que se pretende separar un líquido de

sus impurezas no volátiles.

Diversidad. La variación entre las especies, es lo que les ha permitido a las poblaciones

adaptarse a cambios climatológicos, así como a diferentes condiciones ambientales, la

existencia de una amplia variedad de especies (diversidad de especies) de plantas, animales

http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-mezclas.shtml

http://www.monografias.com/trabajos13/mapro/mapro.shtml


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y microorganismos en su hábitat natural, o en comunidades con un particular medio

ambiente (diversidad ecológica) o bien variaciones genéticas entre las especies (diversidad

genética).

Electroforesis. Migración de partículas a través de una matriz (usualmente polimérica)

debido a un diferencial de campo eléctrico.

Espectrofotómetro. Instrumento empleado para medir la cantidad de luz de una longitud

de onda específica que es absorbida por una solución.

Etanol. Es un alcohol que se presenta como un líquido incoloro e inflamable con un punto

de ebullición de 78.5°C. Al mezclarse con agua en cualquier proporción, da una mezcla

azeotrópica. Su fórmula química es CH3-CH2-OH, principal producto de las bebidas

alcohólicas como el vino (un 15% aproximadamente), la cerveza (5%) o licores ( hasta un

50%).

Fermentación. Conversión biológica anaeróbica (sin oxígeno) de las moléculas orgánicas,

generalmente hidratos de carbono, en alcohol, ácido láctico y gases, mediante la acción de

ciertos enzimas que actúan bien directamente o como componentes de ciertas bacterias y

levaduras.

Fermentación alcoholica. Es un proceso biologico de fermentación en ausencia de aire

originado por la actividad de microorganismos que procesan los hidratos de carbono para

obtener como productos finales el etanol dioxido de carbono en forma de gas y ATP.

Fermentación maloláctica. Es el proceso por el cual el ácido málico presente en las frutas

se transforma químicamente en ácido láctico; por medio de bacterias de origen láctico

existentes de forma natural en el entorno, o en el interior de la fruta misma.

Fructosa. Es una forma de azúcar encontrada en las frutas y en la miel. Es un

monosacárido con la misma fórmula empírica que la glucosa pero con diferente estructura.

Gen. Segemento de ADN que codifica una cadena polipeptidica o una molecula de ARN.

Glucosa. Es un monosacárido con fórmula empírica C6H12O6, la misma que la fructosa

pero con diferente posición relativa de los grupos -OH y O=. Es una hexosa, es decir, que

contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto es, el grupo carbonilo está en el

extremo de la molécula. Es una forma de azúcar que se encuentra libre en las frutas y en la

miel.

HPLC. Cromatografía líquida de alta eficiencia emplea una fase móvil que es un líquido

que fluye atravéz de una columna que contiene una fase líquida

Índice de diversidad. Parámetro matemático para medir la biodiversidad de un ecosistema.

Levadura. Hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para

realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Pares de bases. Dos nucleótidos opuestos y complementarios en las cadenas de ADN y

ARN que están conectadas por puentes de hidrógeno.

Mega 4. Es una herramienta bioinformatica para trabajar con alineamiento de secuencias

manual y automaticamente para la realización de arboles filogeneticos empleando

secuencias de las bases de datos, también estima rangos de evolución molecular y

examinando las hipotesis evolutivas.

http://es.wikipedia.org/wiki/Alcohol

http://es.wikipedia.org/wiki/%C2%B0C

http://es.wikipedia.org/wiki/Agua

http://es.wikipedia.org/wiki/Mezcla_azeotr%C3%B3pica

http://es.wikipedia.org/wiki/Mezcla_azeotr%C3%B3pica

http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono




http://es.wikipedia.org/wiki/Hidroxilo

http://es.wikipedia.org/wiki/Bebida_alcoh%C3%B3lica

http://es.wikipedia.org/wiki/Bebida_alcoh%C3%B3lica

http://es.wikipedia.org/wiki/Vino

http://es.wikipedia.org/wiki/Cerveza

http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruta

http://es.wikipedia.org/wiki/Miel

http://es.wikipedia.org/wiki/Monosac%C3%A1rido

http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Monosac%C3%A1rido

http://es.wikipedia.org/wiki/F%C3%B3rmula_emp%C3%ADrica


http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno

http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Fructosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidroxilo

http://es.wikipedia.org/wiki/Carbonilo

http://es.wikipedia.org/wiki/Hexosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Aldosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Carbonilo

http://es.wikipedia.org/wiki/Az%C3%BAcar

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruta

http://es.wikipedia.org/wiki/Miel

http://es.wikipedia.org/wiki/Fungi

http://es.wikipedia.org/wiki/Unicelular

http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidratos_de_carbono


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Mezcal. Del náhualtl metl e izcalli que significa agave cocido al horno. Es una bebida

alcoholica tradicional mexicana a base de agave.

Mosto. Es el zumo de la uva sin fermentar. También nos podemos referir como las piñas

del agave que son molidas y puestas a fermentar, o cualquier otro sustrato vegetal rico en

azúcares fermentables.

Oligonucleótido. Secuencia de ácido nucléico o de una molécula relacionada que sirve

como punto de partida para la replicación del ADN.

Polimorfismo. Diferencias en la secuencia de ADN entre individuos. Variaciones genéticas

que ocurren en mas del 1% de la población pueden ser consideradas útiles para la

identificación de individuos o para el análisis de genomas con alto porcentaje de similitud.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Técnica de análisis del genoma mediante la

amplificación ilimitada de porciones específicas del ADN, aunque sean minúsculas. Es un

método revolucionario de amplificación exponencial del ADN por la intervención de una

enzima termoestable, la Taq polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985

por lo que se le concedió en 1993 el premio Nobel. Es el proceso fundamental para la

secuenciación del Proyecto Genoma Humano.

Rep-PCR. Técnica molecular genómica donde se utilizan oligonucleótidos degenerados

que por PCR y visualización en luz UV producen patrones de bandeo característico para

cada especie.

Secuencia de ADN. Orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los nucleótidos

que constituyen el ADN y que cifra toda la información genética. Cuando es codificante

(exón), define el orden de los aminoácidos que forman la proteína correspondiente.

SSCP. Es un proceso donde los productos de PCR son desnaturalizados en cadena simples

de ADN, luego renaturalizados para favorecer los apareamientos intracatenarios y

finalmente analizados en un gel de Poliacrilamida. La estructura de ADN adoptara una

conformación y permitirá la diferenciación en el gel.

Trapiche. Es un molino artesanal utilizado para extraer el jugo de determinados frutos

como el agave.

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