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Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología Molecular

Manual elaborado por Paola Berenice Zárate Segura, César Agustín Jiménez Sierra, Jesús Agustín Badillo Corona y Claudio Garibay Orijel

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

ELABORADO POR:

M. en C. Paola Berenice Zárate Segura

I. Bt. César A. Jiménez Sierra

Dr. Jesús Agustín Badillo Corona

Dr. Claudio Garibay Orijel

Dra. María del Carmen Oliver Salvador

México D. F. Agosto 2009




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Relación de prácticas

PRÁCTICA 1. Bioseguridad

PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN

PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

PRÁCTICA 5. Extracción de ARN

PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano. PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2

PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes

PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido

PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)

PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando Agrobacterium tumefaciens




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PRÁCTICA 1. Bioseguridad

Según la Ley de Bioseguridad de organismos genéticamente modificados publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como:

“Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención que se deben asumir en la realización de actividades con agentes biológicos, con el objeto de prevenir, evitar o reducir los posibles riesgos que dichas actividades pudieran ocasionar a la salud humana o al medio ambiente y la diversidad biológica, incluyendo los aspectos de inocuidad de dichos organismos que se destinen para uso o consumo humano”.

Por otra parte, como Biotecnología moderna se entiende:

“la aplicación de técnicas in vitro de ácidos nucleicos, incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) recombinante y la inyección directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la familia taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección tradicional, que se aplican para dar origen a organismos genéticamente modificados, que se determinen en las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley (1)

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estandarizadas de manera rutinaria para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes. Estas precauciones, deben ser aplicadas por y para TODAS las personas.

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a agentes biológicos infecciosos o sustancias potencialmente contaminantes, mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan para evitar el contacto con estos agentes y sustancias. La utilización de barreras (ej. bata de laboratorio, guantes, lentes de protección, mascarillas, etc.) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente.

C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales biológicos y químicos utilizados en los laboratorios son depositados para su almacenamiento y posterior eliminación sin que se presente ningún riesgo.




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Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2):

Contención

El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales biológico-infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos.

La contención primaria se refiere a la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio a la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad adecuados. La contención secundaria, se refiere a la protección del medio ambiente externo al laboratorio a la exposición a materiales infecciosos. Esta contención se logra utilizando una combinación del diseño de la instalación y de las prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Equipos de Seguridad (Barreras Primarias) Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos. Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de seguridad, un recipiente cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el centrifugado. Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias) El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se encuentran fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio.

Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechosas de los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio (tabla 1).




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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2)

NIVEL Grupo de Riesgo Agentes Prácticas Barrera Primaria

(Equipos) Barrera Secundaria

(Instalaciones) Tipo de

Laboratorio

I

Bajo riesgo individual

Bajo, Riesgo

Comunitario

Que no causen enfermedad en

individuos adultos

saludables (Cepas

silvestres)

Prácticas microbiológicas

comunes

Campana de flujo laminar

Mesa de Laboratorio con servicio de agua y

drenaje.

Enseñanza Básica

II

Moderado riesgo

individual, Riesgo

comunitario limitado

Asociados con enfermedad en humanos, en donde haya riesgo de

infección por heridas

percutáneas, ingestión y

exposición de membrana

mucosa (Shigella,

Staphylococcus, Sporotrix)

NBS 1. Acceso Limitado. Deben

utilizarse señalamientos, se

deben tomar medidas de precaución en material punzo

cortante. Debe contar con manual de Bioseguridad

definiendo procedimientos y

políticas de confinamiento,

desinfección de zonas y materiales y

atención médica.

Gabinetes de Bioseguridad Clase I o II, equipo para

prevenir derrames o difusión de

aerosoles. El personal debe utilizar Bata,

guantes y cubre bocas o careta,

de ser necesario.

NBS 1. Además, debe existir autoclave.

Servicios de salud, Hospital

de nivel primario,

laboratorios de diagnóstico y

Laboratorios de nivel

Universitario

III

Alto riesgo individual, Bajo riesgo comunitario

Agentes autóctonos o exóticos con

riesgo de transmisión por aerosoles y que

causen enfermedades serias o letales

(Brucilla, Hystoplasma)

NBS 2. Acceso controlado.

Procedimientos rutinarios de

desinfección de ropa, desechos y material

previo al lavado.

Todas las anteriores, incluyendo

protección del sistema

respiratorio.

NBS 2, Separación de los corredores de

acceso, puertas dobles (sistema de exclusa).

Debe evitarse la recirculación del aire.

Presión de aire negativa en el área de

trabajo

Laboratorios de Diagnóstico

Especializado.

IV

Alto riesgo Individual, Alto riesgo

Comunitario

Agentes peligrosos o

exóticos con alto riesgo de causar

enfermedad mortal por

transmisión por aerosoles o

agentes similares con forma de transmisión desconocida

(EBOLA, SARS, B. Antracis)

NBS 3. Ropa (trajes) individuales,

equipados en cuartos previos al área de

trabajo. Regadera a la salida del Laboratorio.

Mecanismo de descontaminación del

área de trabajo.

Gabinetes de Bioseguridad Tipo 3. Trajes individuales sellados con sistema de respiración autónomo y

presión de aire positiva

NBS 3. Debe ser una zona aislada, con

sistemas individuales de obtención y

liberación de vacío, sistema de suministro

y descontaminación de aire, generador de energía auxiliar.

Laboratorios que trabajan con

agentes patógenos peligrosos

NBS = Nivel de Bioseguridad




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OBJETIVO

• Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su aplicación activa en el trabajo de laboratorio

ACTIVIDADES

Actividad dinámica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio y las medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos.

Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuados para la utilización de estos equipos.

REFERENCIAS

1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Nueva Ley DOF 18-03-2005

2. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf




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PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN INTRODUCCIÓN

En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, o bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de ADN doble hebra, 40 µg/mL de ARN o 33 µg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra.

En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.

Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad de medir de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de biología molecular para medir volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como micropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 µL, 0.5-10 µL, 10-100µL, 20-200 µL, 100-1000 µL, 1000-5000 µL. .

OBJETIVOS

Objetivo General

• Llevar a cabo al cuantificación de ADN por métodos espectrofotométricos

Objetivos específicos

Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,

Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes pequeños.




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Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de diferente tamaño para la medición de diferentes volumenes.

MATERIALES

1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Agua desionizada Balanza analítica con límite de 0,0001 g Tapas de cajas de petri de plástico Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL) Muestra de ADN en solución de concentración desconocida




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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

MANEJO DE LA MICROPIPETA

Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”. Si es necesario, cambiar el volumen mediante el “dispositivo” del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita).

NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.

1) Partes de la micropipeta a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1. b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura

2) Llenado de la pipeta

a) Colocar una punta según corresponda. b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado. c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si

continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al segundo punto de resistencia “alto” o "tope".

d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.

3) Expulsión de la muestra

a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL. b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo. c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este

procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.




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d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos.

4) Calibración de Micropipeta

La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión y calibración. Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µL y 1000 µL. Para P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 µL. Para P10 revisar 3 y 10 µL.

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas. b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero. c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la

caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a 25ºC, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g, 60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a 0.003 g.

d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen. e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656

g/mL a 25 ° C. f) Calcular la masa esperada para cada volumen

5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%) Valor medio X = Σ Xi /n

donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas

Volumen medio V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad) Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032) Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100 Desviación estándar S = Z . √ Σ(Xi – X)2 n – 1




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Coeficiente de Variación CV= (S*100)/V Límites de tolerancia para micropipetas Volumen (µL)

E% nominal

CV% nominal

5-10 1 0.8

20-50 0.7 0.4

100-1000 0.5 0.2

Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variación de las micropipetas proporcionadas, realice la cuantificación de las muestras proporcionadas.

6) Cuantificación de ADN

Preparación de las muestras.

a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por triplicado con agua Milli Q estéril, en tubos de polipropileno estériles.

b) c) Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas. d) Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas e) Cuantifique las muestras a 260 y 280mn f) Realice los cálculos correspondientes

Muestra Dilución Lectura 260 nm

Lectura 280 nm

Relación 260/280

ADN (ng/µL)

ADN (fg/µL)

ADN (mg/µL)

ADN1 ADN2

REFERENCIAS

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.




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PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

INTRODUCCIÓN Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación. Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes: • Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares • Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado Homogenización de la muestra El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en




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forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN. Extracción de proteínas y lípidos Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo. Precipitación de ácidos nucleicos La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos. OBJETIVOS

Objetivo General

• Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos


• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN • Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la

extracción de ADN • Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa

MATERIALES

• Reactivos y Materiales • Acetato de Sodio (3 M) • Etanol absoluto • Etanol 70% • Fenol • Cloroformo




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• Agua desionizada • TE (pH 8.0) • 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo • Gradillas • Medio LB líquido • Termobloques • Tubos de polipropileno 1.5 mL • Centrifuga • Vortex

Muestras biológicas Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con agitación constante de >200 rpm. Una muestra de suelo. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

IMPORTANTE: Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.

Primera Sesión. Extracción de DNA

Extracción de ADN de E. coli

1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16 h) a 37°C con agitación constante de >200 rpm.

2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL. 3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min. 4. Decantar el sobrenadante. 5. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril al paquete celular. 6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células

(aproximadamente 30 s). 7. Agregar 250 µL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0). 8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 9. Agregar 250 µL de cloroformo. 10. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s. 11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 12. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este




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precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.

13. Agregar 225 µL de cloroformo. 14. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 15. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 16. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12. 17. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa. 18. Agitar en vortex 20 s. 19. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa. 20. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma

orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.

21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento.

22. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la pastilla.

23. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 24. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del

experimento. 25. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,

hasta que todo el etanol haya sido evaporado. 26. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.

Guardar a -20°C.

Extracción de ADN de Suelo

1. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL. 2. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril. 3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células

(aproximadamente 30 s). 4. Agregar 250 µL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0). 5. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 6. Agregar 250 µL de cloroformo. 7. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s. 8. Centrifugar a 19000 G durante 5 min. 9. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.

10. Agregar 225 µL de cloroformo. 11. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 12. Centrifugar a 19000 G durante 5 min. 13. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5




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mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12. 14. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa. 15. Agitar en vortex 20 s. 16. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa. 17. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma

orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.

18. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento.

19. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado. 20. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del

experimento. 22. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,

hasta que todo el etanol haya sido evaporado. 23. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.

Guardar -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR 24. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4). 25. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. 26. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. 27. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

INTRODUCCIÓN

Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.

Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los cuales son detallados a continuación.

(a) Tamaño del ADN:

Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases.

Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño.

(b) Concentración de la agarosa:

Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.

Concentración del gel de agarosa (% w/v)

Intervalo de peso molecular (kpb)

0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2




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(c) Conformación del ADN

El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I).

(d) Corriente aplicada

A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado.

(e) Otros factores

Otros factores que influyen (y que no se discutirán en esta INTRODUCCIÓN) son: la dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis.

OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la cantidad de ADN por densitometría de las bandas en un gel de agarosa


Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa

Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometría

MATERIALES

Materiales y Reactivos • Solución de Agarosa 0.5% w/v • Solución para teñir ADN • Regulador para electroforesis TBE 1X




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• Regulador de carga 6x • 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo • Agua desionizada • Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL) • Muestras de ADN • Cámara de Electroforesis • Fuente de Poder • Marcador de Peso Molecular (100pb)


1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen de gel de 20 mL, si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la concentración del gel)

2. Agregar 100 mg de agarosa 3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente 4. Adicionar 0.5µL de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.) 5. Mezclar 6. Verter la solución en una canastilla para electroforesis 7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla 8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio) 9. Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis 10. Agregar buffer de corrimiento (TBE) 11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no más de 10 µL en total) 12. Colocar las muestras adentro de los pozos 13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min 14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones.

REFERENCIAS


COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES 6x Amortiguador de carga Azul de bomofenol 0.25% (w/v) Glicerina en agua 30% (v/v) TBE Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O Tris base 54 g, Ácido Bórico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL




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PRÁCTICA 5. Extracción de ARN

En una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son homogenizadas en tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido. El rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de muestra y generalmente esta en un intervalo de 4-7 µg/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106 células. OBJETIVOS

Objetivo General

Extraer ARN de diferentes muestras por métodos físico-químicos


Conocer la metodología básica para extracción de ARN,

Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de ARN.

Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa

MATERIALES

Cloroformo: alcohol isoamílico (49:1, v/v) Etanol Isopropanol Nitrógeno liquido Fenol Acetato de sodio (2 M, pH 4.0) Solución D (solución desnaturalizante) Agua desionizada 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Gradillas Termobloques Tubos de polipropileno 1.5 mL Centrifuga Vortex Material biológico Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con agitación constante de >200 rpm. Una planta de tabaco o de lechuga fresca.




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IMPORTANTE: Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.

Sesión 1. Preparación de los cultivos de

1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a 37°C con agitación constante de >200 rpm.

2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga están en condiciones sanas y frescas.

Sesión 2. Extracción de ARN

Preparación del cultivo de E. coli

1. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL. 2. Centrifugar el tubo a 12 000 rpm. durante 2 min. 3. Decantar el sobrenadante. 4. Mantener la pastilla celular en hielo

Preparación del tejido vegetal

5. Cortar cuidadosamente 1-2 g de tejido foliar. 6. Colocar el tejido en un mortero estéril libre de RNAsas y adicionar nitrógeno

líquido. 7. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener un polvo fino. 8. Transferir el macerado a un tubo nuevo estéril.

Extracción de RNA de células bacterianas y vegetales

El tratamiento siguiente es el mismo tanto para las células bacterianas como para el tejido vegetal a menos que se indique lo contrario.

9. Adicionar 3 mL de la solución D. 10. Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador para el

caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de 1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con macerar con un pistilo de plástico pequeño.

11. Transferir el homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de sodio 2 M, 1 mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamílico por cada mililitro de solución D.

12. Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 15 min. 13. Centrifugar a 9000 rpm. por 20 min a 4°C. 14. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.




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15. Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar e incubar a -20°C mínimo 1 hr.

16. Centrifugar a 10,000 g (9000 rpm.) por 30 min a 4°C. 17. Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solución D. 18. Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20°C. 19. Centrifugar 10 min a 4°C. 20. Decantar y adicionar un volumen de etanol al 70%. 21. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 min. 22. Adicionar 50-100 µl de H2O. Almacenar la solución de ARN a -70°C. 23. Estimar la concentración de ARN midiendo la absorbancia de una dilución 1:200 de

la muestra a 260 nm 24. Separar 5 µL de la muestra de ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Solución D 4 M Tiocianato de guanidina 25 mM citrato de sodio 0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio 0.1 M -mercaptoetanol Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 mL de H2O, 17.6 mL de 0.75 M de citrato de sodio (pH 7.0), y 26.4 mL de 10% (w/v) lauril sarcocianato de sodio. En una parrilla a 65°C mezclar los ingredientes con ayuda de agitación magnética, guardar a temperatura ambiente y adicionar 0.36 mL de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50 mL de la solución D justo antes de usar.

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

Cuando se desea introducir un gen para expresión en bacterias, es necesario que este gen se encuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresión deseados. El vector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partír de la cual se purifica. La extracción por lisis alcalina consiste en la lisis de las células utilizando una solución con NaOH y SDS. Posteriormente la separación entre los restos celulares y el ADN se logra por precipitación mediante la adición de una solución de acetato de potasio. Para purificaciones más exhaustivas se utiliza una solución de fenol:cloroformo. Los ácidos nucleicos se separan en la fase acuosa y las proteínas en la fase orgánica. OBJETIVOS Objetivo General

Extraer ADN plasmídico de E. coli.


Conocer la metodología básica para extracción de ADN plasmídico de bacterias. Determinar la integridad del ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa.

MATERIALES Soluciones Solución de lisis alcalina I Solución de lisis alcalina II Solución de lisis alcalina III Ampicilina Etanol Fenol: cloroformo TE (pH 8.0) Medios de cultivo Cajas con medio LB con ampicilina 100 µg/mL Cajas con medio LB




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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL IMPORTANTE: Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.

Sesión 1. Preparación de los cultivos de

1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a 37°C con agitación constante de >200 rpm.

Sesión 2. Extracción de ADN plasmídico

Centrifugar a velocidad máxima por 30 segundos 2 mL del cultivo a temperatura ambiente.

7) Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del medio. 8) Resuspender la pastilla en 100 µL de solución Alcalina I fría, mezclar

vigorosamente con ayuda del vortex. 9) Adicionar 200 µL de solución de lisis II recién preparada, cerrar el tubo y mezclar

invirtiendo el tubo cinco veces, “No usar vortex”. Poner el tubo en hielo 10) Adicionar 150 µL de solución alcalina III fría, cerrar el tubo e invertir el tubo cinco

veces para mezclar. Guardar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR). 11) Centrifugar a máxima velocidad por cinco minutos a 4°C. 12) Transferir el sobrenadante a un tubo limpio. 13) Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y

centrifugar a velocidad máxima por 2 min a 4°C. 14) Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. 15) Precipitar el ADN plasmídico adicionando 2 volúmenes de etanol absoluto, incubar

a -20ºC durante 20 minutos. 16) Centrifugar a máxima velocidad 5 minutos a 4°C. 17) Remover el sobrenadante. 18) Adicionar 1 mL de etanol al 70% (tener cuidado de no resuspender la pastilla), 19) Centrifugar a máxima velocidad por 2 minutos a 4°C. 20) Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir

que la pastilla quede lo más seca posible. 21) Resuspender la pastilla en 50 µL de agua desionizada estéril y guardar a -20°C.

Soluciones Solución de lisis alcalina I 50 mM glucosa 25 mM Tris-Cl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) Guardar a 4°C




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Solución de lisis alcalina II 0.2 N NaOH 1% (w/v) SDS Preparar la solución al momento. Solución de lisis alcalina III 5 M acetato de potasio, 60.0 mL Ácido acético glacial, 11.5 mL H2O, 28.5 ml Guardar a 4°C

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.

La ligación de fragmentes de interés en plásmidos ha sido una metodología presente en casi todos los estudios que tienen que ver con técnicas de Biología Molecular. Se han utilizado diferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre los que se encuentran el pUC 19, pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la inserción de un gen o de un fragmento del gen en un vector, generalmente se lineariza el vector con enzimas de restricción y al mismo tiempo se digiere el gen con las misma enzimas de restricción. Después de la linearización del vector y de la restricción del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa en presencia de ATP para que la enzima catalize la reacción de ligación.

Objetivo General

• Realizar la inserción de material genético dentro de un vector plasmídico.


• Conocer la metodología básica para cortar un vector utilizando enzimas de

restricción. • Conocer la metodología básica para insertar material genético de interés

dentro de un plásmido previamente tratado con enzimas de restricción.

MATERIALES

• Plásmido (cuales • Enzimas de restricción • Material genético de interés. • T4 ADN Ligasa • Buffer de restricción. • Buffer de Ligación. • Termo-Bloque

MÉTODOLOGÍA

Sesión 1. Reacción de restricción

1. En un tubo estéril, adicionar 2 µl de buffer de restricción. 2. Adicionar 200-500 ng de plásmido. 3. Adiciona 1 U de la enzima de restricción. 4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL




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5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el termobloque.

Sesión 2. Reacción de ligación

6. Colocar 2 µL de buffer de ligación en un tubo estéril. 7. Adicionar 1 µL de T4 ADN ligasa. 8. Añadir (100-300 ng) de plásmido previamente tratado con enzima de restricción. 9. Agregar (500-900 ng) del fragmento a insertar deseado. 10. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL 11. Incubar a 22ºC durante 2 horas en el termobloque. 12. Almacenar a -20ºC hasta el momento de su uso.

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener más de 10 millones de copias de una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta. La sensibilidad de ésta técnica requiere de cuidados para que la muestra no esté contaminada previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.

Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con diferentes aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.

Objetivo General

• Obtener un producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).


• Conocer la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de

la reacción en cadena de la polimerasa. • Identificará la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector

en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.

MATERIALES

• Termociclador. • ADN molde • Tubos de polipropileno de 200 µL. • Oligonucleótidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido • Taq DNA polimerasa • Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 µL • 10X PCR buffer • MgCl2 • dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.

MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL

1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200µL de

capacidad en hielo. 2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1.




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Tabla 1. Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa

Concentración final Muestra (µL) Control negativo(µL)

AND molde 10 pg-1 µg 1 µL* -----

Iniciador Sentido 10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL

Iniciador Antisentido10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL

Buffer PCR 10X 1X 5 µL 5 µL

25 mM MgCl2 1-4 mM 6 µL* 6 µL*

dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 µL 5 µL

Agua MilliQ estéril 27.6 µL * 28.6 µL *

Taq polimerasa (5U/ µL) 1.25 U / 50 µL 0.2 µL** 0.2 µL**

*El volumen depende de la concentración final requerida.

** Se coloca al final en la reacción en frío.

3. Mezclar perfectamente la reacción por y centrifugar unos segundos en caso de ser necesario.

4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa: a) 95ºC 2 min b) 95°C 30s (desnaturalización), c) 55°C 30 s (alineamiento), d) 72°C 1 min (elongación) e) Repetir los pasos b a d 30 veces f) 72ºC 4 min. g) 4ºC (refrigerar hasta el momento de uso) 5. Separar el fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa. 6. Verificar que el tamaño amplificado por PCR sea el esperado.

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2

Uno de las metodologías rutinarias en los laboratorios de Biología Molecular es la preparación de células competentes. Las células competentes pueden ser almacenadas y usarse para la propagación de vectores de interés. Hay varios métodos para preparar células competentes pero quizá el más utilizado sea el que se realiza con cloruro de calcio ya que es eficiente, barato y generalemente se obtienen células con altos niveles de transformación.

OBJETIVOS

Objetivo General

Aprender a preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2.


Conocerá la metodología básica para hacer células competentes de Escherichia coli

con CaCl2. Determinará la viabilidad de las células competentes de Escherichia coli con CaCl2.

MATERIALES

- CaCl2 (0.1 M) - Espectrofotómetro - Gradillas para tubos - Hielo - Medio LB líquido - Micropipetas de 200 µL y 1000 µL - Puntas para micropipetas de 200 µL y 1000 µL - Termo-bloques - Tubos de polipropileno 1.5 mL estériles - Ultracentrífuga


1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas de agar LB

2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de médio LB e incubar a 37°C con agitación a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).




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3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación, hasta que la densidad óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)

4. Transferir 50 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por 10 min a 4°C.

5. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min

6. Decantar el sobrenadante

7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío)

8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.

9. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min a 4°C.

10. Decantar el sobrenadante

11. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete celular en 1-2 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío.

12. Las células competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48 h a 4ºC.

13. Para periodos de almacenamiento más largos, guardar en alícuotas de 100 µL en tubos estériles de 1.5 mL.

14. Guardar la células competentes a -70ºC. Las células se mantienen viables por aproximadamente 3 meses.

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes

La ligación de fragmentos de ADN interés en plásmidos ha sido una metodología fundamental en casi todos los estudios de transformación de organismos. Se han utilizado este tipo de plásmidos como el pUC 19 linearizado con enzimas de restricción específicas, una vez hecho esto se realiza una reacción de ligación plásmido-inserto con la enzima ligasa.

El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para ser propagado. Los metodos más utilizados para la INTRODUCCIÓN de DNA en células competentes es la electroporación y la que involucra choque térmico. Las células preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son las que se utilizan mayormente. El proceso consiste en preparar la células (Práctica 9) y después incubarlas con el vector a introducir, seguido de un choque térmico. Este método es eficiente y generalmente da rendimientos aceptables para la inserción de vectores después de una reacción de ligación.

Objetivo General

• Realizar la transformación de células competentes con un plásmido extraído por lisis alcalina.


• Conocer la metodología básica para transformar células competentes con un

plásmido bacteriano • Determinar la eficiencia de transformación de células competentes de

Escherichia coli preparadas con CaCl2.

MATERIALES

• Células competentes • Incubadora • Placas de agar LB-Ampicilina • Reacción de PCR (Práctica 8) • Termo-Bloque (Práctica 7) • Plásmido




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A. Muestra de interés

1. Adicionar 4 µL de reacción de PCR a un tubo de polipropileno. 2. Adicionar 1 µL del buffer de ligación. 3. Adicionar 1 µL del Plásmido. 4. Mezclar la reacción suavemente. 5. Incubar por 16 h a 4°C. 6. Adicionar todo el contenido del tubo a un tubo que contiene células competentes. 7. Mezclar el tubo suavemente. 8. Incubar a -20ºC durante 20 min. 9. Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min. 10. Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min. 11. Adicionar 800 µL de medio LB. 12. Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora. 13. Agregar 200 µL en una placa con medio LB Ampicilina 14. Sembrar por extensión con varilla. 15. Incubar la caja durante 16 h a 37ºC

B. Control de viabilidad y control negativo

16. Colocar 200 µL de células competentes. 17. Mezclar el tubo suavemente. 18. Incubar a -20ºC durante 20 min. 19. Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min. 20. Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min. 21. Adicionar 800 µL de medio LB. 22. Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora. 23. Agregar 200 µL en una placa con medio LB Ampicilina y 200 µL a una caja con

medio LB 24. Sembrar por extensión con varilla. 25. Incubar la caja durante 16 horas a 37ºC

REFERENCIAS





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PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido

El western blot es una técnica inmuno enzimática utilizada en biología molecular para la detección de proteínas en muestras crudas o extractos celulares. Esta técnica tiene múltiples aplicaciones, tanto en el área de investigación como en la de diagnóstico clínico, en donde es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.

La técnica consiste en realizar la separación de las proteínas de la muestra por electroforesis en gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.i nitrocelulosa), ya sea por gravedad, difusión o un campo eléctrico.

Una vez en la membrana, la proteína es identificada mediante un inmunoensayo, en donde se liga a la proteína de interés un anticuerpo específico contra ella ligado a una enzima, la cual permite la detección.

OBJETIVOS Objetivo General

• Conocerá y realizará la técnica de westtern blot para detección de proteína

mediante la reacción antígeno-anticuerpo. Objetivos específicos

• Conocer la metodología básica para realizar electroforesis en gel de

poliacrilamida. • Conocer la metodología básica para realizar una electrotransferencia. • Conocer la metodología básica para detectar proteínas por medio de un

inmunoensayo.


A. Tratamiento de la muestra.

1. A una muestra de concentración conocida de proteína (ya sea antígeno o anticuerpo) se le adiciona amortiguador de muestra hasta un volumen final de 85 µl.

2. Añadir 10 µl de solución de azul de bromofenol y 5 µl de ß-mercaptoetanol. 3. Incubar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.




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B. Preparación del Gel.

4. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes. 5. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel. 6. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando

el persulfato de amonio y el temed al final. 7. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y

alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.

8. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo. 9. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas.

Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.

C. Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel.

10. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y esta en la cámara. 11. Preparar amortiguador decorrida 1x. 12. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa hasta

cubrir los electrodos. 13. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 µl de muestra y marcador

de peso molecular en los pozos. 14. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder. 15. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador. 16. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida

alcance el final del gel. 17. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la

cámara. 18. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador de

transferencia. NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teñido para observar el corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.

D. Montaje de la cámara de electro transferencia y electro transferencia.

19. Incubar fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de espesor) en amortiguador de

transferencia 30 min. antes de iniciar el montaje de los cartuchos. 20. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor al de los geles.

Este procedimiento debe ser llevado a cabo con guantes. Colocar en un recipiente con amortiguador de transferencia.

21. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y cuidadosamente, marcar sobre la membrana, con lápiz, el frente decorrida y el número de carril del gel.

22. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras scotch, dos papeles filtro, el gel, la membrana de nitrocelulosa, dos papeles filtro más y dos fibras scotch más. Hay que eliminar cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes capas.




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23. Colocar el cartucho en la cámara de electrotransferencia de manera que el gel quede hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+).

24. Llenar la cámara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado. 25. Cerrar la cámara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,

cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60ºC. 26. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.

NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teñir una de ellas para observar la transferencia de las proteínas antes de proseguir con el siguiente paso.

E. Reacción inmunoenzimática

27. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y agregar l solución de

bloqueo, de manera que cubra completamente la membrana. Incubar 2 horas a temperatura ambiente con agitación continua.

28. Retirar la solución de bloqueo y realizar 3 lavados con PBS-Twen de 5 min. cada uno, con agitación continúa.

29. Incubar la membrana con la solución de proteína complementaria a la que se encuentre unida en la membrana (si se tiene antígeno en la membrana, incubar con solución e anticuerpo, y viceversa) durante 2 horas.

30. Retirar la solución de proteínas y repetir el paso 28. 31. Se adiciona a la membrana la solución de avidina – HRP (peroxidasa de rábano) y se

incuba por 2 horas con agitación continua. 32. Retirar la solución de conjugado y repetir el paso 28. 33. Se incuba la membrana en la solución de cromógeno / sustrato en agitación continua

hasta que aparezcan las bandas. 34. Se enjuaga la membrana con agua desionizada y se deja secar.

REFERENCIAS





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ANEXO I

Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)

Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15

Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5

Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75

Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)

Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26 mL

Amortiguador pH 6.8 0.5 mL

Agua desionizada 1.22 mL

Persulfato de amonio 0.01 mL

TEMED 0.02

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

• Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%

Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4° C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico.




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• Amortiguador del gel separador pH 8.8

Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

• Amortiguador del gel separador pH 6.8

Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

• Amortiguador de corrida 5X / SDS

Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.

• Amortiguador de muestra pH 6.8

Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a 100 mL.

• Persulfato de amonio al 10%

Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.

• Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL

Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar en refrigeración.

• Solución teñidora

Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el metanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.

• Solución desteñidora

Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de agua desionizada.

• Amortiguador de transferencia

(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2 M y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con agua bidestilada. Guardar a 4 ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar hasta 3 veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.

• Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)

Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl. Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB se




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prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato de sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con agua desionizada.

• Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)

A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.

• Solución de bloqueo.

Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardar a –20 °C.

• Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%

Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml con agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ámbar.

• Solución cromógeno / sustrato

Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS, agregar 25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara inmediatamente antes de usarla.




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ANEXO II

PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO.

INTRODUCCIÓN. Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos está principalmente presente en la fracción gamma de las proteínas del suero. Desde entonces se han diseñado diferentes métodos para la obtención de esta fracción sérica. Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos específicos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antígenos. Así, los anticuerpos pueden ser precipitados por la adición del antígeno en estado soluble, o ser adsorbidos al antígeno previamente insolubilizado. En ambos casos, el complejo resultante puede disociarse por modificación del pH a valores entre 2.5 y 4.0 ó 9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentración de sales o la concentración del antígeno soluble. Después, los anticuerpos se recuperan por alguno de los métodos de separación inespecífica. Las separaciones inespecíficas están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos. Entre estos métodos, los más utilizados son la precipitación con etanol, con sulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato de celulosa, gel de almidón, etc.), cromatografía de intercambio iónico y filtración en tamices moleculares. Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. Generalmente, se considera que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado de pureza. La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido como “salting out”, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insolubiliza y precipita. OBJETIVO. Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitación con sulfato de amonio a una saturación final del 33% y detección por medio de un gel de electroforesis con gradiente desnaturalizante.




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MATERIALES. Material por grupo: 1 centrífuga clínica. 6 agitadores magnéticos 5.0 mL de BaCI2 al 10%. 1 parrilla con agitación. Material por equipo: 10 mL de suero de conejo 10 mL de suero de humano. 20 mL de solución sobresaturada de sulfato de amonio. 5.0 mL de NaOH 2N. 50 mL de solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8. 20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8. Papel indicador de pH. Tubo para diálisis. 10 cm de hilo grueso. 2 tubos falcón de 15 mL, graduados. 2 vasos de p.p. de 100 mL 2 pipetas serológicas de 5.0 mL. 1 pipeta serológicas de 1.0 mL. 2 pipetas Pasteur y bulbo de hule. 1 matraz Erlenmeyer de 25 mL. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N. 2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un vaso de p.p., medio volumen de la solución sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN CONSTANTE. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%. 3. Continuar con la agitación durante 10-15 min después de terminar la adición del sulfato de amonio. 4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcón y centrifugar los tubos a temperatura ambiente a 3500 rpm. durante 15 min. 5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del suero. 6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5. 7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4. 8. Disolver en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la mitad o un tercio del volumen original del suero.




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9. Dializar contra SSRB en frío (4° C) y con agitación, durante 2 días, realizando 2 cambios diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para saber si efectivamente se eliminó el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de diálisis se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera completa si ya no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario. 10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm. durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado. 11. Guardar las gamma globulinas para la separación de isotipos. 12. Determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford. 13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas. REFERENCIAS. Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods in Immunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor. Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoquímica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa

Médica Mexicana.




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PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo ligado a enzimas (ELISA)

El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en inglés (enzyme linked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.En este método se utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad de unión específica al antígeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reacción de oxido-reducción, en la cual el sustrato se transforma en un producto colorido. En este sistema el antígeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase sólida insoluble (micro pozos, tubos o perlas de polivinilo o estireno). El método de ELISA tiene aplicaciones muy variadas, lo cual lo hace muy versátil: diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o parasitarias, cuantificación de hormonas, cuantificación de haptenos, titulación de anticuerpos en bajas concentraciones, determinación de anticuerpos no precipitantes Existen diversas variantes del método de ELISA, como son los métodos directo, indirecto y en “sándwich”, y el método de ELISA competitivo. Estos permiten la determinación de antígenos en fluidos biológicos, a excepción del método indirecto con que se detectan anticuerpos. En los métodos directos, el anticuerpo dirigido específicamente contra el antígeno es el que lleva unida la enzima. En cambio en los métodos indirectos, el conjugado enzima-anticuerpo reacciona con el primer anticuerpo, el cual ya reaccionó con el antígeno. En el método de sándwich, el conjugado antígeno anticuerpo reacciona con el antígeno que se ha unido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la fase sólida. El o los componentes que no reaccionaron se eliminaron por lavados; por último se adiciona el sustrato de la enzima y se mide la intensidad del color desarrollado, el cual es proporcional a la magnitud de la reacción antígeno-anticuerpo. OBJETIVOS Objetivo General

El alumno conocerá y realizará la técnica de ELISA para detección de antígeno o

anticuerpo. Objetivos específicos

Conocerá la metodología básica para adsorber antígenos en micro placas de ELISA. Ligará antígenos o anti anticuerpos conjugados a antígenos adsorbidos en placas de

ELISA. Determinará la presencia del antígeno deseado por la reacción de una enzima

conjugada a anticuerpo.




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MATERIALES

Estufa regulada a 37 °C. Placas de ELISA de poliestireno (fase sólida) Antígeno “H” u “O”, solución al 5% en solución salina 0.85%. Pipetas automáticas de 20-200 ml Anticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRP Suero humano control positivo y suero humano control negativo Sustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2 al 30% (v/v) en 10 ml de regulador de citratos 0. XM pH 5.0 Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina ó 2% de albúmina sérica bovina (BSA), en regulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6 Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05% Tween 20. Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de 0.25% de gelatina.


Método de ELISA indirecto.

1. Adicionar 0.2 mL de antígeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4°C durante 24 horas para permitir la adsorción del antígeno a la fase sólida.

2. Eliminar las soluciones por inversión de la tira de pozos, y desechar el líquido remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.

3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solución de lavado. Dejar los pozos llenos con esta solución durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solución de la manera descrita en el paso 2. Repetir dos veces más con el fin de eliminar todo el antígeno no adsorbido.

4. Bloquear con 0.1 mL de una solución de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a 37°C durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbió el antígeno.

5. Repetir el paso 2. 6. Adicionar 0.1mL de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo.

Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37°C durante 30 minutos para permitir la reacción antígeno-anticuerpo.

7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccionó. 8. Adicionar 0.1mL de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a 37°C

durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los anticuerpos humanos que se hayan unido al antígeno en la fase sólida.

9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado. 10. Adicionar 0.1 mL de una solución recién preparada del sustrato de la enzima: H2O2 al

0.04% en regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al




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0.04% (como cromógeno). Incubar en oscuridad para permitir la reacción enzimática y el consecuente desarrollo de color (Nota: el cromógeno es fotosensible)

11. Detener la reacción enzimática adicionando 12 mL de H2SO4 8N en cada pozo. 12. Determinar la presencia o ausencia del antígeno de interés contra los controles de

manera visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.

REFERENCIAS

1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:43 2. Kemeny D. M. (1991) A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-

215. 3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme linked immunosorbet assay

(ELISA). A guide with abstracts of microplate application. Dynatech Laboratories, Inc. 4. Profesores del Departamento de Inmunología (1992) Manual de Prácticas de

Inmunología. ENCB, IPN pp.47-51.




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Práctica 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando

Agrobacterium tumefaciens

INTRODUCCION La modificación genética de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la generación de especies resistentes a condiciones de estrés (sequía, estrés osmótico, etc), la mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminoácidos o precursores de vitaminas, etc), obtención de plantas para fitoremediación (remoción de metales pesados), la obtención de variedades con flores de color no convencional, la producción de alguna proteína o metabolito con propiedades terapéuticas (vacunas, anticuerpos, alcaloides, etc). Esta última es de gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción de metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto de los sistemas de producción. Algunas de estas ventajas son: el costo de producción es en muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, proteínas más complejas (anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteína que requieren un procesamiento postraduccional, etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas y granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento. La modificación genética de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos los cuales pueden ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se encuentra el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol (PEG) con lo cual se facilita la introducción del material genético. Sin embargo, el tratamiento con PEG tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de células con pared celular intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente en cultivo in vitro). Entre los métodos físicos se encuentran principalmente la microinyección y el bombardeo de micropartículas (también conocido como biobalística). Este último, que consiste en la introducción del material genético al interior del núcleo utilizando micropartículas aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular importancia en la última década, a pesar del costo elevado, debido a que es altamente efectivo y reproducible. A pesar de ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear de plantas es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies relacionadas como A. rhizogenes y A. vitis son patógenos no destructivos de plantas que tienen la capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1]. Desde el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A. tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha sido fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas. Durante el proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN (ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la síntesis de aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son utilizados por A.




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tumefaciens como fuente de carbono y nitrógeno. El T-DNA esta localizado en el plásmido Ti (Plásmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que además contiene los genes vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las raíces infectadas mediante un mecanismo semejante al de A. tumefaciens. En este caso el plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido inductor de raíces; root inducing plasmid). Un hallazgo crucial que permitió el diseño de vectores para la transformación genética de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que sólo las secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo. Algunos o todos los genes bacterianos del T-DNA pueden ser removidos originando vectores desarmados, los cuales pueden transformar células vegetales sin los síntomas generales de la infección bacteriana [3]. OBJETIVOS Objetivo general

Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium tumefaciens.




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Conocer el principio básico de la modificación genética nuclear de plantas utilizando un vector binario.

Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención de plántulas modificadas genéticamente.

Conocer y llevar a cabo la metodología para la identificación de plantas modificadas genéticamente.

MATERIALES Materiales biológicos

• Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un derivado del plásmido pBIN 19, el cual contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del péptido de transferencia RbcS y se encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene además el gen nptII que codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere resistencia a kanamicina en las células portadoras del gen.

• Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario desarmado que porta los genes vir.

• Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de cultivo a 25°C durante 4-6 semanas.

• Primers para la amplificación total o parcial por PCR del gen nptII. Equipos

• Campana de flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,

Material de laboratorio

• Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas, cajas Petri desechables, algodón, bisturí, pinzas de disección, papel filtro, papel aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un horadador de 0.5 cm de diámetro.

Reactivos y medios de cultivos

• Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100 mg/mL, etanol al 70%, solución de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre

• (solución al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biología molecular.




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Primera sesión. Preparación de material y medios de cultivo Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición de soluciones y reactivos) ampicilina 100 mg/mL kanamicina 100 mg/mL estreptomicina 100 mg/mL carbamicilina 500 mg/mL Medio LB Medio NBM 5 cajas petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL. 5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie 50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL. 50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0 5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos 5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500 µg/mL.

Segunda sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio sólido. 1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estría simple en una de las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina. 2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con medio LB con kanamicina y estreptomicina. 3. Incubar ambas cajas a 28 ºC por 36-48 h.

Tercera sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio líquido. 1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de medio LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitación constante (200 rpm.) a 28ºC durante 36-48 h. Cuarta sesión. Preparación de Agrobacterium y modificación genética de N. tabacum

1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo

experimental de la tercera sesión a 7500 rpm. por 10 min. a 4 ºC en un tubo de estéril de 50 mL.




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2. Decantar el sobrenadante 3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo). 4. Disectar 3-4 hojas de plántulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia. 5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas petri. 6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener explantes

de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma rápida y evitando dañar de manera excesiva el tejido.

7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión de A. tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.

8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro estéril.

9. Colocar los explantes en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia arriba. Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el medio.

10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.

Quinta sesión. Transferencia de explantes a medio de selección

1. Después de 48 h tomar los explantes (cuarta sesión) y transferirlos a las cajas de Petri con medio NBM (kan 100 µg/mL, car 200 µg/mL). Tener cuidado de que los explantes mantengan la misma orientación y de dañarlos lo menos posible.

2. Colocar las cajas en incubación a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 3-4 semanas.

Sexta sesión. Preparación de material y medios de cultivo

Preparar el siguiente material: Medio NBM 5 cajas petri con medio LB y antibioticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL. 5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie 50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL. 50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0 5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos 5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500 µg/mL.




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Séptima sesión. Transferencia de explantes a medio de selección fresco

a. Después de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con kanamicina 100 µg/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientación y de no dañar el tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son demasiado grandes, transferirlos a dos cajas.

Octava sesión. Transferencia de transformadas a medio para formar raíces

a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a medio MSB5 con kanamicina (100 mg/mL) y carbenicilina (200 mg/mL) para favorecer la formación de raíces.

Novena sesión. PCR confirmatoria de la inserción del transgén

a. Tomar una porción de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 µL de solución (2 µL buffer 10X, µL dNTP 2mM, 2.5 µL de primer F (3pm/ µL), 2.5 µL de primer R (3pm/ µL), 3 µL MgCl2 25mM, 1 µL Taq pol 1u/µmol y 7 µmol agua). Realizar estos pasos en hielo.

b. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min. a 94 °C, 35 ciclos de 30s a 94°C, 30 s a 55°C, 30s a 72°C y 1 ciclo de 5 min. a 72°C.

c. Almacenar a -70°C o a -20°C.

Décima sesión. Análisis de productos de PCR en gel de agarosa

a. Prepara un gel de agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor. b. En el pozo número 1 del gel correr el marcador de peso molecular c. Correr el producto de PCR obtenido en la novena sesión en un gel de agarosa al

1%. d. Correr también controles negativos y positivos a la par. e. Teñir el gel con Rojo Texas.

BIBLIOGRAFIA. [1] Valderrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformación de plantas mediada por Agrobacterium: “Ingeniería genética natural aplicada”. Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.




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[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to Agrobacterium infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1. Proceedings of the Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-10440. [3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153. [4]Bioline. HyperLadder I. Bandas de referencia para un gel de 1% agarosa. www.bioline.com/images/guides/ladderguide/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009 [5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe, in Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology

instituto politÉcnico nacional unidad profesional ......inmediato del laboratorio a la exposición...

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