WESTERN BLOT(inmunoelectrotransferencia)

Virología DiagnósticaJiménez Mendoza Víctor Hugo

Sistema de identificación, separación y semicuantifiacación de moléculas basado en la aplicación de tres fundamentos.– 1. Separación de moléculas por electroforesis– 2. Transferencia de las moléculas separadas hacia

un papel absorbente– 3. Revelado mediante un ensayo inmunoenzimático

(dot-ELISA)

Detección altamente específica.

Edwin Southern desarrolló la técnica de identificación de ADN (Southern blot).

Después se de desarrolló una técnica para la detección de ARN (Northern blotting).

W. Neal Burnette bautizó la técnica para proteínas (Western blot). Fue descrita desde 1979 por J. Gordon.

1° ELECTROFORESIS

Transferencia

Para que las proteínas estén accesibles a la detección del anticuerpo

Se transfieren a membranas de nitrocelulosa o de PVDF (polivinildienofloruro)

Se somete a un campo eléctrico para transferir.

Las proteínas quedan sobre la superficie de las membranas.

Pude ser transferencia húmeda o semiseca

3. Detección (Blotting)

Se identifica específicamente la proteína que se busca.

Se utiliza un anticuerpo monoclonal u otra molécula a fin conjugada con enzima

Se observa la formación de manchas o bandas

Se pude semicuantificar por análisis de bandas

3. Detección (blotting)

1) Se bloquea la superficie de la tira

– BSA 1%– Tween 20– Leche descremada 5%

2) Se agrega el conjugado o el primer anticuerpo. 3) Se adiciona el sustrato de la enzima

– 4,2-Cloronaftol (para HRP)

3. Detección (blotting)

Otras formas de revelado

– Detección radiactiva– Por fluorescencia– Por quimioluminiscencia

Bibliografía

• Colls M. Julio. “Técnicas de Dx en Virología. Ed. 4ta Editorial Díaz de Santos. Madrid España, pp. 278-293

• ENZYME-ASSISTED IMMUNOELECTROBLOTTING (IEB OR WESTERN BLOTTING) E.P. Rybicki and Maud Purves. Department of Microbiology University of Cape Town, 1996