INMUNOHISTOQUIMICA

INTRODUCCIN

En las ltimas dcadas la utilizacin de la Inmunohistoqumica ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnologa esencial en el diagnstico patolgico de rutina. En general y muy especialmente en patologa oncolgica, son cada vez ms las patologas cuyo diagnstico y clasificacin requiere la Inmunohistoqumica. La incorporacin de nuevos protocolos de recuperacin antignica y la afluencia constante de nuevos anticuerpos estn ampliando notablemente el mbito de aplicacin con nuevas utilidades en diagnstico y pronstico.

DEFINICINLa inmunohistoqumica se refiere al proceso en el que se usan anticuerpos para detectar antgenos en un corte o seccin de tejido biolgico. Utilizando la unin especfica de los anticuerpos con los antgenos, es posible localizar y visualizar dichos antgenos diana en cortes histolgicos gracias a los anticuerpos especficos marcados con fluorforos o enzimas (sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin), siendo estas ltimas las ms utilizadas en inmunohistoqumica.La inmunohistoqumica, tambin llamado marcaje inmunohistoqumico, se utiliza comnmente en diferentes tipos de aplicaciones tales como: Diagnstico de clulas anormales presentes por ejemplo, en diferentes estadios de enfermedades (cncer, entre otras) Desarrollo de frmacos, para evaluar la eficacia del frmaco, la deteccin de la variacin de la actividad de las dianas de cada enfermedad. Investigacin biolgica, para conocer la ubicacin y la colocalizacin de una protena dentro de las diferentes partes de una clula (ncleo, citoplasma o membrana, etc.)Los biomarcadores especficos son caractersticos de cada evento celular, tal como la proliferacin o la apoptosis, que son las causas de la anormalidad celular.

Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos.

IMPORTANCIA DE LA INMUNOHISTOQUMICA

Como tcnica de laboratorio la Inmunohistoqumica es de vital importancia para el marcaje selectivo de protenas y otros elementos que pueden estar presentes, tanto en las membranas celulares, citoplasma, y dems compartimientos citoplsmicos, as como tambin en la matriz extracelular. Es de gran utilidad en la identificacin de las estirpes celulares de los tejidos bsicos, de receptores de membranas, protenas citoslicas, y de cualquier otra estructura para la cual se halla desarrollado un anticuerpo especfico. Su aplicacin es de indiscutible valor en anatoma patolgica en el diagnstico de lesiones tumorales y su pronstico y en la investigacin en general, sobre todo en la definicin del inmunofenotipo de las clulas de los tejidos.

FUNDAMENTO

La tcnica de Inmunohistoqumica se fundamenta en la reaccin Antgeno - Anticuerpo.El anticuerpo es el reactivo fundamental y la disponibilidad de antisueros, fracciones de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales que permiten marcar antgenos celulares y tisulares es cada vez mayor.Los anticuerpos pertenecen a un grupo de protenas denominadas Inmunoglobulinas, presentes en cinco clases y sintetizadas por clulas conocidas como Plasmocitos, que no son mas que un ltimo grado de diferenciacin de los linfocitos B.Loa anticuerpos monoclonales son producidos por un clon indiccidual de plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios fragmentos del antgeno para el que fueron creados. El animal ms utilizado para la produccin de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal de eleccin es el ratn, tal vez por motivos econmicos.La reaccin antgeno - anticuerpo en la tcnica inmunohistoqumica es incolora y para hacerla evidente, se utilizan algunos mtodos como la fluorescencia, las reacciones enzima-sustrato que convierte al cromgenosin color en un compuesto coloreado que permite identificar el lugar donde se depositaron los anticuerpos utilizados.

En las tcnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en formalina.

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES

Los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon individual de plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios fragmentos del antgeno para el que fueron creados. El animal ms utilizado para la produccin de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal de eleccin es el ratn, tal vez por motivos econmicos.

METODOS DE VISUALIZACIN DEL COMPLEJO ANTGENO/ANTICUERPOHay varias opciones disponibles para visualizar el complejo anticuerpo-antgeno en inmunohistoqumica:

1. MTODO DIRECTO:Un marcador visual, ya sea fluorescente o enzimtico, se adhiere qumicamente al anticuerpo primario. El anticuerpo primario es el anticuerpo dirigido contra el antgeno que se quiere demostrar.El mtodo de deteccin directo, slo requiere una nica etapa de incubacin con el antgeno y una sola etapa de lavado. El marcador generalmente resulta en la produccin de una sustancia colorada o en un aumento en la cantidad de luz emitida a una longitud de onda determinada, si el antgeno est presente. En el caso de ausencia de antgeno no hay unin del anticuerpo primario marcado y por lo tanto no hay seal.La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin.

2. MTODO INDIRECTO

Usando un anticuerpo secundario conjugado ya sea a una enzima o a un marcador fluorescente. El marcador visual est unido al anticuerpo secundario. El tejido es expuesto previamente al anticuerpo primario que no es marcado y luego al anticuerpo secundario, el cual es dirigido contra el anticuerpo primario y se unir con .El mtodo de deteccin indirecto es un proceso ms largo que el directo, ya que se compone de dos etapas de incubacin y de lavado en lugar de una sola etapa con la deteccin directa. Comprende:

Un primer perodo de incubacin (aproximadamente 1 h) con el anticuerpo primario no marcado (primera capa), durante el cual una pequea fraccin del anticuerpo se une al antgeno diana en el tejido. Por consiguiente, el exceso de anticuerpo primario no unido se elimina mediante un lavado y se aade un anticuerpo secundario marcado (segunda capa). Un segundo perodo de incubacin (de nuevo 1h), durante el cual el exceso de anticuerpo secundario marcado se elimina por lavado y la cantidad de marcador asociado con el anticuerpo primario se cuantifica. En la ausencia de antgeno no hay unin del anticuerpo primario y por consiguiente no hay unin del anticuerpo secundario, y por lo tanto no se obtiene seal.

Ambos mtodos son vlidos y presentan cada uno pros y contras en comparacin con el otro. Te proponemos un estudio de los pros y los contras de cada mtodo en la siguiente tabla:

METODO DIRECTOMETODO INDIRECTO

VENTAJADESVENTAJAVENTAJADESVENTAJA

Rpido porque slo se usa un anticuerpo y se necesitan menos etapas. Unin especfica del anticuerpo secundario (no hay reactividad cruzada).

Disminucin de la variabilidad del ensayo y mejora de la calidad de los datos. Falta de sensibilidad para detector bajos niveles de expresin del antgeno. Necesidad de marcar cada anticuerpo primario para cada antgeno de inters: consume tiempo y es costoso.

La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse afectada adversamente por el marcaje.

No hay flexibilidad en la eleccin marcador del anticuerpo primario de un experimento a otro.

Amplificacin de seal mnima.

Altos conocimientos cientficos especializados requeridos. Mayor nivel de sensibilidad y genera una seal ms intensa. Una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles comercialmente.

Mxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene, ya que no est etiquetado.

Mayor amplificacin de la seal debido a la unin de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. Unin no especfica del anticuerpo secundario y alto ruido de fondo. El uso de un anticuerpo secundario requiere pasos adicionales de bloqueo y de control.

3. METODO DE LA PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA

Este mtodo usa un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario y un anticuerpo producido en contra, conjugado con la enzima peroxidasa (complejo PAP). El anticuerpo secundario es producido en una especie animal diferente del anticuerpo primario y del complejo peroxidasa-antiperoxidasa y el anticuerpo primario y el complejo peroxidasa-antiperoxidasa provienen de la misma especie animal. Consecuentemente, el anticuerpo secundario acta como puente o anticuerpo eslabn.

4. METODO EL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINAEsta tcnica usa tres reactivos; un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario que esta qumicamente ligado a la vitamina biotina, y un complejo de la glicoprotena avidina que esta ligado a la biotina y peroxidasa. La avidina tiene la habilidad de ligarse con cuatro molculas de biotina, en forma no inmunolgica. Esta fuerte afinidad le da al mtodo excelente sensibilidad.

ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA LA DETERMINACION DE LAS DIFERENTES PATOLOGIAS, DE DIVERSAS AREAS

1. LINFOMASDiagnstico de tipo de linfoma, linaje B o T, factores pronsticos, determinacin de CD20 para terapias TARGET.

CD3 CYCLIN D1CD5 BCL2CD8 BCL6CD10 KI67CD15 CD56CD20 TdTCD22 CD30CD23 DBA44CD43

2. TUMORES DE ORIGEN DESCONOCIDODiagnstico certero o aproximado de origen de metstasis de tumor oculto, en hgado, pulmn, piel, hueso, ganglio, etcCK7 S100CK20 WT1CD45 PSAVIM AE1/AE3CEA BERP4TTF1 EMACA19.9 GFAPGCDFP15 CEACK 34BE12 NSECHR A TIROGLOBULINAMELAN A CALRETININASYN

3. CANCER DE MAMAEs muy importante la determinacin del estatus hormonal del tumor para su tratamiento con identificacin de receptores de Estrgeno, Progesterona. As tambin el HER2 como factor pronstico y tratamiento que actan especialmente sobre las clulas positivas con este marcador. El Ki67 es determinado recientemente para estratificar los tumores de acuerdo al factor de proliferacin.ERPRHER2KI 67P53

4. NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADASDiagnstico de origen linfoide, sarcomatoso, melanoctico o epitelial.CD45CK34BE12MELAN AVIM

5. MESOTELIOMAPermite diferenciar origen mesotelial de adenocarcinoma metasttico en mesotelio, pleura, pericardio, peritoneo.CALRETININACK7WT1BEREP4CEA

6. TIPIFICACION DE TUMORES GERMINALESDiagnstico de distintas lneas de diferenciacin en tumores germinales de ovario y testculoPLAPAFPHCGCD30VIM

7. SARCOMAS (TUMORES DE PARTES BLANDAS)Permite diagnstico de origen, Ej. msculo liso, estriado, neural, GIST, vasculares, etc.VIMASMAMYOD1S100CD117CD34CD31CD68DESMINA

8. DIFERENCIACION NEUROENDCRINADiagnstico de tumores neuroendcrinos y su estratificacin de acuerdo a su malignidad.NSECROMOGRANINA ASYNAPTOFISINA

9. MEDULA SEADiagnstico de infiltraciones por linfomas, metstasis, leucemias.CD138AE1/AE3MIELOPEROXIDASACD34

10. CLULAS PLASMTICADeterminacin de Mielomas/Plasmocitomas. Monoclonalidad.CD138KAPPALAMBDA

11. CLULAS REDONDAS Y AZULES EN NIOSSon tumores que morfolgicamente pueden ser idnticos pero que perteneces a distintas lneas celulares de origen, por lo que el tratamiento es muy distinto entre ellos, por lo que la IHQ permite su diagnstico.CD45NSES100CK AE1/AE3CD99WT1MYOD1

12. TUMORES DE PIELPermite subclasificar especialmente los tumores de clulas fusadas drmicas, como el Dermatofibroma Protuberans clsicamente positivo para CD34, o diferenciar un melanoma fusocelular de otro tumor fusado.MELAN ACD34S100ASMACD68CK7CK34BE12BERP4

13. CLASIFICACIN DE TUMORES RENALESExisten tumores renales con caractersticas oncocticas de diferentes pronsticos segn su tipo histolgico en los cuales la IHQ resulta de mucha utilidad. As como tumores con diferenciacin sarcomatoide, de distinto origen tubular, urotelial, etc.VIMAE1/AE3CD10CK7CK34BE12

VENTAJAS:Las tcnicas inmunohistoqumicas enzimticas permiten una localizacin ms precisa de las reacciones, ya que la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta tcnica.

DESVENTAJAS:Existe presencia de reaccin inespecfica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcingenos y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren estandarizacin precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares).

Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma tcnica, pero con omisin del paso de incubacin con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tincin de un gran nmero de casos simultneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarizacin de las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.

Un elemento importante a considerar es la ptima preservacin del tejido y por ende de los antgenos. La mayora de los antgenos se conservan adecuadamente despus de la fijacin en formalina e inclusin en parafina. Algunos son ms lbiles y slo se detectan en cortes de congelacin.

Uno de los problemas actuales con estas tcnicas no es la tcnica en s, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretacin de los resultados. Los errores de interpretacin disminuyen a nivel aceptable cuando el patlogo y sus colaboradores tienen experiencia en estas tcnicas y los resultados se analizan a la luz de los dems hallazgos clnico-patolgicos.

INMUNOHISTOQUMICA, UN PROCESO TODAVA LIMITADO POR LA DISPONIBILIDAD DE PRODUCTOSHoy en da, una gran variedad de anticuerpos est disponible comercialmente, pero slo unos pocos se comercializan directamente con un marcador. Ese es uno de los problemas a los que los cientficos se tienen que enfrentar cuando realizan ensayos de inmunohistoqumica.Como los mtodos de deteccin directos e indirectos son procesos complejos y costosos para los usuarios finales para marcar un anticuerpo, algunos kits de marcaje han sido desarrollados por varias empresas. Sin embargo, esta solucin todava tiene algunas limitaciones, ya que slo ofrecen la posibilidad de marcar un nmero limitado de anticuerpos con un nmero limitado de marcadores y por tanto, no siempre se ajustan a las necesidades de los usuarios finales para la deteccin de una diana especfica, o requieren el uso de equipos de deteccin, que por consiguiente les convierte en una solucin cara.

Por lo tanto, los cientficos todava estn limitados en sus avances en este mbito de investigacin, ya que no tienen una solucin eficaz, universal y econmica que les permita realizar sus inmunoensayos con cualquier tipo de anticuerpos y cualquier tipo de marcador, superando las dificultades de marcaje convencional como la prdida de anticuerpos, la orientacin, etc.

BIBLIOGRAFIAhttp://escuela.med.puc.cl/publ/patologiageneral/Patol_125.htmlhttp://www.medic.ula.ve/histologia/laboratorios/inmuno.htmhttp://nitzipper.com/es/nitzipper-aplicaciones-bioconjugacion/inmunohistoquimica.html