A LU M N A: C A N DY R O N C A L L A C A B A N A

FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUIMIC

A

• En las últimas décadas la utilización de la Inmunohistoquímica ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnología esencial en el diagnóstico patológico de rutina. En general y muy especialmente en patología oncológica, son cada vez más las patologías cuyo diagnóstico y clasificación requiere la Inmunohistoquímica. La incorporación de nuevos protocolos de recuperación antigénica y la afluencia constante de nuevos anticuerpos están ampliando notablemente el ámbito de aplicación con nuevas utilidades en diagnóstico y pronóstico.

IMPORTANCIA DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA

• Como técnica de laboratorio la Inmunohistoquímica es de vital importancia para el marcaje selectivo de proteínas y otros elementos que pueden estar presentes, tanto en las membranas celulares, citoplasma, y demás compartimientos citoplásmicos, así como también en la matriz extracelular.

• Es de gran utilidad en la identificación de las estirpes celulares de los tejidos básicos, de receptores de membranas, proteínas citosólicas, y de cualquier otra estructura para la cual se halla desarrollado un anticuerpo específico. Su aplicación es de indiscutible valor en anatomía patológica en el diagnóstico de lesiones tumorales y su pronóstico y en la investigavión en general, sobre todo en la definición del inmunofenotipo de las células de los tejidos.

FUNDAMENTO:

• La técnica de Inmunohistoquímica se fundamenta en la reacción Antígeno - Anticuerpo.

• La técnica se basa en aplicar al tejido o muestra en estudio, el antícuerpo contra el antígeno que se desea detectar, Posteriormente este anticuerpo especifico es a su vez usado como antígeno y marcado con un segundo anticuerpo inespecífico, que se halla unido a un sistema molecular que puede ser detectado mediante una técnica de coloración, En este momento, el examen microscópico del corte histológico o del extendido citológico nos permite determinar la presencia o ausencia del antígeno que buscábamos, y en caso positivo podemos ver en qué lugar exacto del tejido o de las células se encuentra alojado.

REPRESENTACIÓN GRÁFICA SENCILLA DE UNA MOLÉCULA DE ANTICUERPO

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y ANTICUERPOS POLICLONALES

• Los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon indiccidual de plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios fragmentos del antígeno para el que fueron creados. El animal más utilizado para la producción de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal de elección es el ratón, tal vez por motivos económicos.

DIFERENCIAS ENTRE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES. EN LA FIGURA A SE REPRESENTA ESQUEMÁTICAMENTE LOS DIFERENTES SITIOS DE

UNIÓN DE LOS ANTICUERPOS POLICLONALES. EN EL PANEL B SE ESQUEMATIZA LA ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES.

MÉTODOS:

• MÉTODO DIRECTO: un marcador visual, ya sea fluorescente o enzimático, se adhiere químicamente al anticuerpo primario. El anticuerpo primario es el anticuerpo dirigido contra el antigenoque se quiere demostrar.• MÉTODO INDIRECTO: el marcador visual está

unido al anticuerpo secundario. El tejido es expuesto previamente al anticuerpo primario que no es marcado y luego al anticuerpo secundario, el cual es dirigido contra el anticuerpo primario y se unirá con él

MÉTODO DE LA PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA

• Este método usa un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario y un anticuerpo producido en contra, conjugado con la enzima peroxidasa (complejo PAP). El anticuerpo secundario es producido en una especie animal diferente del anticuerpo primario y del complejo peroxidasa-antiperoxidasa y el anticuerpo primario y el complejo peroxidasa-antiperoxidasa provienen de la misma especie animal. Consecuentemente, el anticuerpo secundario actua como puente o anticuerpo eslabon.

MÉTODO EL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA

• Esta técnica usa tres reactivos; un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario que esta químicamente ligado a la vitamina biotina, y un complejo de la glicoproteína avidina que esta ligado a la biotina y peroxidasa. La avidina tiene la habilidad de ligarse con cutro moléculas de biotina, en forma no inmunológica. Esta fuerte afinidad le da al método exelente sensibilidad.

LA FLUORESCENCIA

• Es una forma de luminiscencia entendiéndose ésta última como la emisión de la luz que se produce a partir de una fuente de energía no térmica y bajo el efecto de una excitación.

• La fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquella que presenta determinadas sustancias de forma espontánea sin necesidad de ser modificadas; por ejemplo la lámina elástica de las arterias muestra autofluorescencia en determinadas condiciones).

• En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la fluorescencia, llamándola fluorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tinción histoquímica con sustancias fluorescentes llamadas fluorocromos o uniendo fluorocromos a antígenos dirigidos a anticuerpos tisulares.

FLUOROCROMOS.

• Son sustancias químicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta energía procedente de la radiación ultravioleta o del espectro visible. Ello provoca una redistribución de los electrones de las moléculas fluorescentes, puesta de manifiesto por la emisión de una radiación luminosa de longitud de onda distinta aunque dentro del espectro visible.

• Los fluorocromos más utilizados en las técnicas de inmunofluorescencia son:• · Fluoresceína: absorbe luz azul y emite

fluorescencia verde manzana.• · Rodamina: absorbe luz verde y emite

fluorescencia roja anaranjada.

• Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la capacidad de estos últimos para unirse a sus correspondientes antígenos, por ello las fluorocromos ligados a anticuerpos específicos constituyen un medio útil de visualizar los lugares donde reproduce la reacción Antígeno − Anticuerpo.

ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS DIFERENTES

PATOLOGÍAS, DE DIVERSAS ÁREAS

• 1. LINFOMAS• Diagnóstico de tipo de linfoma, linaje B o T, factores

pronósticos, determinación de CD20 para terapias TARGET.

• CD3                                       CYCLIN D1CD5                                       BCL2CD8                                       BCL6CD10                                     KI67CD15                                     CD56CD20                                     TdTCD22                                     CD30CD23                                     DBA44CD43

2. TUMORES DE ORIGEN DESCONOCIDO

• Diagnóstico certero o aproximado de origen de metástasis de tumor oculto, en hígado, pulmón, piel, hueso, ganglio, etc.

• CK7                                     S100CK20                                   WT1CD45                                   PSAVIM                                     AE1/AE3CEA                                    BERP4TTF1                                   EMACA19.9                              GFAPGCDFP15                           CEACK 34BE12                        NSECHR A                               TIROGLOBULINAMELAN A                           CALRETININASYN                                      

3. CANCER DE MAMA

• Es muy importante la determinación del estatus hormonal del tumor para su tratamiento con identificación de receptores de Estrógeno, Progesterona. Así también el HER2 como factor pronóstico y tratamiento que actúan especialmente sobre las células positivas con este marcador. El Ki67 es determinado recientemente para estratificar los tumores de acuerdo al factor de proliferación.

• ERPRHER2KI 67P53

4. NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS

• Diagnóstico de origen linfoide, sarcomatoso, melanocítico o epitelial.• CD45

CK34BE12MELAN AVIM

5. MESOTELIOMA

• Permite diferenciar origen mesotelial de adenocarcinoma metastático en mesotelio, pleura, pericardio, peritoneo.• CALRETININA

CK7WT1BEREP4CEA

6. TIPIFICACIÓN DE TUMORES GERMINALES

• Diagnóstico de distintas líneas de diferenciación en tumores germinales de ovario y testículo• PLAP

AFPHCGCD30VIM

7. SARCOMAS  (TUMORES DE PARTES BLANDAS)

• Permite diagnóstico de origen, Ej. músculo liso, estriado, neural, GIST, vasculares, etc.• VIM

ASMAMYOD1S100CD117CD34CD31CD68DESMINA

8. DIFERENCIACION NEUROENDÓCRINA

• Diagnóstico de tumores neuroendócrinos y su estratificación de acuerdo a su malignidad• NSE

CROMOGRANINA ASYNAPTOFISINA

9. MEDULA ÓSEA

• Diagnóstico de infiltraciones por linfomas, metástasis, leucemias• CD138

AE1/AE3MIELOPEROXIDASACD34

10. CÉLULAS PLASMÁTICA

• Determinación de Mielomas/Plasmocitomas. Monoclonalidad• CD138

KAPPALAMBDA

11. CÉLULAS REDONDAS Y AZULES EN NIÑOS

• Son tumores que morfológicamente pueden ser idénticos pero que perteneces a distintas líneas celulares de origen, por lo que el tratamiento es muy distinto entre ellos, por lo que la IHQ permite su diagnóstico.• CD45

NSES100CK AE1/AE3CD99WT1MYOD1

12. TUMORES DE PIEL

• Permite subclasificar especialmente los tumores de células fusadas dérmicas, como el Dermatofibroma Protuberans clásicamente positivo para CD34, o diferenciar un melanoma fusocelular de otro tumor fusado

• MELAN ACD34S100ASMACD68CK7CK34BE12BERP4

13. CLASIFICACIÓN DE TUMORES RENALES

• Existen tumores renales con características oncocíticas de diferentes pronósticos según su tipo histológico en los cuales la IHQ resulta de mucha utilidad. Así como tumores con diferenciación sarcomatoide, de distinto origen tubular, urotelial, etc.• VIM

AE1/AE3CD10CK7CK34BE12

GRACIAS.