UNIVERSIDAD DEL QUINDIO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES

PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

ANALISIS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES, VEGETALES Y AZUCARES

SAAVEDRA MARLYN VANESSA, GOMEZ LUISA MARIA, ARANA LUISA FERNANDA, AGUIRRE FERNANDO

RESUMEN

Las enzimas en su mayoría proteínas o RNA (ribo enzimas), son catalizadores químicos que agilizan una reacción que envuelve la formación o rompimiento de enlaces químicos. Dentro de esta práctica se analizo la presencia de catalasa en tejidos vegetales y animales, de tal forma que se tomo una muestra de zanahoria e hígado para ser analizados unas en su estado natural y otras luego de ser sometidas a una alta temperatura de lo que se pudo ver que solo en aquellas muestras que se mantuvieron en su estado natural hubo la presencia de la catalasa al ser realizada la prueba con peróxido de hidrogeno. Luego realizamos la hidrólisis del almidón al recolectar varias muestras con diferentes componentes almidón, saliva, acido clorhídrico para encontrar que las enzimas que se encuentran en la saliva (ptialina) que son aquellas que catalizan el almidón rompiéndolo y formando glucosa dentro de esta práctica no lo hicieron, pues a realizar la prueba de fehling y lugol a cada muestra se encontró que lo dicho anteriormente no se cumplía. También se realizo la hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura para esto en dos tubos en un se agrego sacarosa y agua, en otro sacarosa, almidón y agua, luego a los dos se les realizo la prueba de fehling para lo cual se encontró que los dos dieron negativos ante esta prueba. Al terminar la práctica pudimos reconocer como es la actividad enzimática de las diferentes enzimas vistas anteriormente en distintos tipos de alimentos.

ABSTRACT

The enzimas in the main proteins or RNA (ribo enzymes), are chemical catalysts that improve a reaction that wraps the formation or breach of chemical bonds. Inside this practice I analyze the presence of catalasa in vegetable and animal fabrics, in such a way that I take a sample of carrot and liver to be analyzed some in its natural state and others after being submitted to a high temperature of what could see that alone in those samples that were kept in its natural state there was the presence of the catalasa on the test having been realized by peroxide of hydrogen. Then we fulfil the hidrólisis of the starch when several samples gather

with different components starch, saliva, hydrochloric acid to find that the enzimas who think in the saliva (ptyalin) that they are those that catalyze the starch it breaking and forming glucose inside this practice they did not do it, so to realizing the test of fehling and lugol to every sample one thought that the above mentioned thing previously was not fulfilled. Also I fulfil the hidrólisis of the saccharose for the glucosidasa of the yeast for this in two pipes in I add saccharose and water, in other one saccharose, starch and water, then to the two I they realize the test of fehling for which thought that the two gave negatives before this test. On having finished the practice we could recognize since it is the enzymatical activity of different enzymes dress previously in different types of food.

INTRODUCCION

Las enzimas son proteínas que poseen actividad catalítica. Son sintetizados por células vivas y actúan en la totalidad de las reacciones químicas de los organismos, que son de gran importancia dentro del metabolismo. Las reacciones catalizadas por enzimas se verifican en muchos alimentos y pueden actuar positiva o negativamente respecto a la calidad del alimento. Se pueden destacar procesos enzimáticos en la maduración de frutos como en productos cárnicos o lácteos, también en la preparación de masas a partir de harinas y pardeamiento de bebidas alcohólicas. Dentro de esta práctica se busco determinar la forma en que actúan las diferentes enzimas, para esto se realizaron pruebas a diferentes alimentos vegetales y animales, como el hígado y la zanahoria, en ellos se quiso encontrar cual era la mejor manera para determinar la actividad enzimática de la catalasa, está en una enzima que

se encuentra en todos los tejidos vivos animales y vegetales, que actúa como catalizador del peróxido de hidrogeno debido a que este es nocivo para las células, de esto pudimos encontrar que la enzima se encuentra activa en los alimentos cuando están en su estado natural. La hidrólisis del almidón es realizada por la enzima amilasa, sacarasa o ptialina, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilasa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. En esto encontramos que no hubo hidrólisis de almidón por medio de la enzima ptialina ya que no fueron encontrados azucares reductores con lo que se determina si hubo o no actividad enzimática en las muestras, pero si hallamos la presencia de almidón en las diferentes muestras. También se realizo una hidrólisis de la sacarosa por medio de la enzima de la glucosidasa de la levadura, esta enzima cataliza la hidrólisis de

enlaces glucosídicos para generar glúcidos menores. Con lo que se observo que no se dio el resultado esperado pues al realizar las pruebas consiguientes a las muestras esto nos dio como resultado negativo ante la presencia de azucares reductores lo que nos demuestra que no se realiza la hidrólisis.

MARCO TEORICO

CATALASA

La catalasa en una enzima hemoproteica, que se caracteriza por poseer una estructura tetramérica, en la cual cada subunidad contiene un grupo Hem (Fe). Esta presente en la mayoría de las bacterias aerobias estrictas, facultativas y anaerobias aerotolerantes.

La catalasa manifiesta actividad de peroxidasa, cataliza la oxidación de sustratos acoplada a la reducción de peróxido de hidrogeno, para formar agua y oxigeno molecular. En la prueba de catalasa la reacción se efectua en dos moléculas de peróxido de hidrogeno, una de las cuales actua como sustrato reducido y la otra como donador de átomos de hidrógeno; esto resulta en la formación de agua (sustrato reducido) y oxígeno (donador oxidado). El peróxido de hidrogeno es muy toxico para las bacterias. Generalmente los microorganismos que carecen de citocromos también carecen de catalasa así la mayoría de las bacterias anaerobias no la poseen. (Evelyn Rodríguez, et al, 2005)

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

El almidón es un homopolisacárido de glucosa, cuyos componentes son la amilosa lineal y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa 1-4, liberan maltosa e isomaltosa, que ingresan a la celula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidón forma un complejo de color azul intenso con el yodo. Las cadenas de amilopectina solo dan un color café rojizo y el almidón hidrolizado no da ninguna coloración. Por lo tanto, la ausencia del color azul indica que el almidón ha sido hidrolizado. La

producción de amilasa es útil para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y la Lactobacillus. De igual forma, se aplica a esquemas de diferenciación de algunas bacterias aerobias y anaerobias como Actinomyces, Bacteroides, Clostridium y Fusobacterium.

(Evelyn Rodríguez, et al, 2005)

GLUCOSIDASAS

Son aquellas enzimas que catalizan la hidrólisis de diferentes glúcidos para generar glúcidos menores. Son enzimas extremadamente comunes con papeles importantes en la naturaleza como en la degradación de biomasa, como celulosa y hemicelulosa, en la defensa contra las bacterias, en mecanismos de patogénesis y en el normal funcionamiento celular. Las glucosidadas forman la mayor maquinaria catalítica para la síntesis y rotura de enlaces glucosídicos.

(Jimenez, L. Felipe, Merchant, Horacio, 2003)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PRESENCIA DE CATALASA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES

Se tomo una zanahoria y un hígado los cuales fueron cortados en dos trozos iguales cada uno. Cada muestra se coloco en un tubo de ensayo, se le agrego a cada uno 5ml de agua, luego una muestra de cada alimento en el tubo de ensayo fue

sometida a alta temperatura, después a todas las muestras se les practico la prueba con peróxido de hidrogeno y se observaron resultados.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

Se prepararon seis tubos de ensayo así: 2 tubos de ensayo con almidón, 2 tubos de ensayo con almidón mas 5ml de saliva, y 2 tubos de ensayo con almidón, mas 5ml de saliva y 2ml de acido clorhídrico. Luego de pasados treinta minutos a cada uno se le realizo la prueba de fehling y lugol, después se observaron resultados.

HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR LA GLUCOSIDASA DE LA LEVADURA

Se disolvió 2.5 g de levadura en 20 ml de agua destilada, se reposo durante 15 minutos y luego se filtro. Se prepararon dos tubos, uno con una cucharada de sacarosa y 2ml de agua luego se agito, otro con una cucharada de sacarosa 2ml de agua y 2ml de extracto de levadura, luego se agito, después a los dos tubos se les realizo la prueba de fehling, se observaron resultados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales

Tabla 1. Presencia de catalasa en hígado y zanahoria.

Muestra Reacción con H2O2

Hígado hervido-

Hígado sin hervir+

Zanahoria hervida-

Zanahoria sin hervir+

Los proceso enzimáticos en la

preparación y conservación de los

alimentos son controlados en la

mayor parte de los casos por la

temperatura. En aquellos en los que

tiene consecuencias negativas sobre

aroma, color textura o valor nutritivo,

son, bien frenados por el uso de

temperaturas bajas, o bien eliminados

por inactivación térmica de las

enzimas (Dieter&Grosch, 1988). Al

hervir el hígado y agregarle peróxido

de hidrogeno se pudo observar que

no hubo ningún reacción, es decir fue

negativa, debido a que la enzima fue

desnaturalizada porque se sometió al

altas temperaturas. Esta enzima es

obtenida a partir de hígado y de

microorganismos, tiene importancia

como enzima auxiliar para la

destrucción de H ₂O ₂:

2H ₂O ₂2H ₂O+O ₂

Dieter&Grosch). De esta manera el

peróxido de hidrogeno (2H ₂O ₂¿

produce dos moléculas de agua

(2H2O) más una molecula de oxigeno

(O2) de esta forma hay liberación de

oxígeno debido a que la catalasa está

actuando sobre el peróxido de

hidrogeno.

Por lo tanto como al enzima es la

encargada de catalizar el peróxido de

hidrogeno esta se inactivo y no hubo

catálisis del agua oxigenada, es decir

la reacción fue negativa. Por lo tanto

no hubo desprendimiento de oxígeno.

Por consiguiente al agregarle agua

oxigenada al hígado sin hervir se

pudo observar burbujeo siendo la

reacción positiva debido a que la

catalasa estaba presente en el

hígado, como se explicó

anteriormente esta enzima se puede

obtener de este tejido animal, por

esto la enzima realiza la oxidación del

peróxido formando agua y liberando

oxígeno, así se pudo observar que el

burbujeo es debido al

desprendimiento de oxígeno.

El pre-tratamiento habitualmente

utilizado para detener proceso

enzimático en frutas y hortalizas

consiste en escaldado con agua

caliente o con vapor vivo. Las

temperaturas de escaldado suelen

oscilar entre 77 y 82 °C en aunque

ocasionalmente se utilizan

temperaturas hasta 96°C (Hart&

Fisher, 1991). Cuando se sometió la

zanahoria a altas temperaturas hubo

una destrucción enzimática ya que al

agregarle el peróxido de hidrogeno no

se observó burbujeo por tanto no

hubo catálisis por parte de la catalasa

frente al reactivo H ₂O ₂, en tanto no

hubo desprendimiento de oxígeno,

esto quiere decir que la reacción fue

negativa.

El hecho de que el tratamiento

térmico inhiba total o parcialmente la

reacción, sugiere que es de

naturaleza enzimática (Hart& Fisher,

1991). Cuando se llevó a cabo el

análisis de hacer reaccionar el

peróxido de hidrogeno con la

zanahoria sin hervir se pudo observar

que hubo burbujeo porque la enzima

esta activa pues es su estado natural,

por lo cual hubo desprendimiento de

oxígeno dando positiva la reacción

frente al peróxido, aunque en menor

proporción que en el hígado, ya que

este es una fuente de obtención de la

enzima y esto nos indica que tiene un

alto contenido de catalasa respecto a

la zanahoria.

2. Hidrólisis del almidón por enzimas hidroliticas de la saliva:

Tabla 2. Hidrólisis del almidón por enzimas hidroliticas de la saliva.

Lugol Benedit

Tubo número. 1+

Tubo número. 1-

Tubo número. 2+

Tubo número. 2-

Tubo número. 3+

Tubo número. 3-

Se prepararon dos (2) tubos numero

uno (1) con solución de almidón, al

primero se le agrego el reactivo lugol

para determinar presencia de

almidones este dio un resultado

positivo. Esto es debido a que el

almidón reacciona químicamente con

iodo para producir un color azul

oscuro cuando las moléculas de iodo

se insertan en los huecos de las

moléculas espiralada del almidón

(amilosa). Este resultado es debido a

que la molécula absorbe más luz

visible excepto azul, (Olivas. E. &

Alarcón L. R., 2004). Al siguiente tubo

numero uno (1) que también era una

solución de almidón se le realizo la

prueba de benedit para determinar la

presencia de azucares el resultado

fue negativo debido a que la prueba

de benedit es para determinar

azucares reductores y no de

polisacáridos, porque para la

determinación de azucares

reductores se debe realizar la prueba

de benedit por lo tanto en el almidón

debe dar negativo si no ah sido

hidrolizado (Maraculla. M. J & Goñi

M. F., 1994).

Se prepararon dos tubos numero dos

(2), uno con una solución de almidón

con adicción de saliva, este tubo se

dejo en reposo treinta minutos

(30min), después de haber

transcurrido ese tiempo se le agrega

lugol para determinar almidones y el

resultado es positivo, esto pudo

haberse dado debido a la cantidad de

adicción de saliva a la muestra ya

que esta es la encargada de

hidrolizar el almidón por estar

presente la enzima responsable de

dicha reacción, por lo tanto debió

presentar una hidrólisis y arrojar un

resultado negativo, ya que la amilasa

salival (o ptialina) hidroliza el almidón,

transformándolo en maltosa, pasando

previamente por unos compuestos

intermedios denominados dextrinas

(Maraculla. M. J & Goñi M. F., 1994).

El otro tubo dos (2) se le agrego el

reactivo de benedit para la

identificación de azucares reductores

como se dijo anteriormente por esto

como no hubo hidrólisis del almidón

por parte de la ptialina el resultado

fue negativo, sin embargo el

resultado debió ser positivo por lo

explicado anteriormente.

Se prepararon dos tubos número (3)

los cuales tenían solución de almidón

mas saliva mas adición de acido

clorhídrico (HCl), el primer tubo tres

(3) se le realizo la prueba de lugol

para determinar la presencia de

almidones el resultado fue positivo,

debido a que el HCl inactiva las

enzimas (proteínas), desestabilizando

su estructura terciaria y cuaternaria

(Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M.,

2006). Por presentar un pH acido ya

que las enzimas son inactivadas a

cambios bruscos de pH y

temperatura. Así pues al adicionarle

el reactivo de benedit se obtuvo el

resultado negativo, debido a que no

hubo una hidrólisis del almidón en

maltosa, que es u azúcar reductor

que se puede identificar con dicho

reactivo, (Maraculla. M. J & Goñi M.

F., 1994).

3. Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.

Tabla 3. Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.

Muestra Benedit

Tubo A -

Tubo B

-

En el Tubo A se tenía una muestra

de sacarosa diluida en agua, se le

adiciono reactivo de benedit se

obtuvo un resultado negativo puesto

que este reactivo es para determinar

azucares reductores y este disacárido

no tiene poder reductor por carecer

de carbonos anomericos, además la

sacarosa para pasar a ser reductor

debe ser hidrolizada para que se

rompa en sus monómeros fructuosa y

glucosa que al agregarle benedit y

calentar durante aproximadamente

unos minutos se pudo observar que

arrojaron valores negativos, . Por

consiguiente en el tubo B que tenia la

misma solución mas adicción de la

enzima glucosidasa, se obtuvo un

valor negativo, esto pudo ser debido

a la cantidad de reactivo utilizado y al

tiempo de calentamiento del tubo ya

que debía ser mas prolonga entre 2-4

minutos para que se produjera el

cambio de coloración de azul a

marrón indicando la presencia de

glucosa. Las aldosas y también las

cetosas en medio alcalino, son

capaces de oxidarse a ácidos

adónicos, con lo que pueden reducir

determinados reactivos. Entre las

múltiples posibilidades, son muy

comunes las reacciones de reducción

del ion cúprico (azul intenso en medio

alcalino) a ion cuproso (rojo ladrillo,

insoluble). Las conocidas reacciones

de Fehling y de benedit siguen este

esquema. Por sus propiedades

químicas se clasifican en reductores,

cuando conservan un grupo aldehído

o cetona libre, y no reductores si no

les queda libre ningún grupo aldehído

o cetona, (Maraculla. M. J & Goñi M.

F., 1994).

Conclusiones

Las enzimas a altas

temperaturas mayores de 77°c

se desnaturalizan y se vuelven

inactivas en cambios bruscos

de PH

La catalasa se encuentra en

los tejidos vegetal y animal

estando en su estado natural

Los procesos enzimáticos se

llevan a cabo en presencia de

oxigeno de lo contrario su

actividad disminuye

Las enzimas funcionan

correctamente dentro un

limitado rango de temperatura

y pH.

BIBLIOGRAFIA

Evelyn Rodríguez Cavallini, et all, 2005, Bacteriología General: Principios Y

Prácticas de Laboratorio, Editorial Universidad de Costa Rica, pág. 195, 196,197

Jimenez, L. Felipe, Merchant, Horacio, 2003,biología celular y molecular, person

educación de México, pág. 23

Hart. L.F & Fisher J.H, 1991, Análisis modernos de los alimento, Editorial Tipo

Línea S.A, Zaragoza, pag. 117, 124, 528.

Farr. H. C, 1996, Terapias de oxígeno para una optima salud y vitalidad, Lasser

Pres Mexicana. S.A de C.V., pag. 61-71.

Olivas. E. & Alarcón L. R., 2004, Manual de prácticas de Microbiología básica y

Microbiología de alimentos, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, México,

pag. 35-36.

Maraculla. M. J & Goñi. M. F., 1994, Bioquímica humana, segunda edición,

Editorial Reverte, S.A, Barcelona, Pag. 76,195.

Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M., 2006, Segunda edición, Fundamentos de

bioquímica metabólica, Madrid, pag. 161.

ANEXOS

¿Qué tejidos presentan desprendimiento de oxigeno?

El tejido animal sin hervir y el tejido vegetal sin hervir debido a que las enzimas

están activas pues en su estado natural se encuentra la catalasa.

¿Cuál de los tejidos presenta mayor actividad?

Los tejidos que mayor actividad presentaron fueron el hígado porque es una

fuente de obtención de la enzima como también se puede obtener de

microorganismo, en el tejido vegetal hube menor actividad enzimática.

¿Por qué la reacción es negativa cuando cocemos las muestras?

La reacción es negativa cundo sometemos a altas temperaturas las muestras

debido a que las enzimas por ser proteínas se desnaturalizan cuando son

sometidas a temperaturas entre 77 y 96°C.

Frecuentemente utilizamos agua oxigenada como antiséptico y se observa que al

aplicarla a una herida se produce un burbujeo, ¿qué está ocurriendo? ¿Por qué se

utiliza el agua oxigenada como antiséptico?

El peróxido de hidrógeno en bajo grado (3 por ciento) es muy conocido por la

mayoría de nosotros. Cuando lo aplicamos de manera externa, en una herida hace

burbujas, esto se debe al oxígeno que sale de la solución. El peróxido de

hidrogeno no sólo oxigena el cuerpo el cuerpo produciendo modestas cantidades

de oxigena sino que también tiene una extraordinaria capacidad de estimular las

enzimas oxidantes, que a su vez pueden cambiar la composición química de otras

sustancias (como virus y bacterias) sin que aquellas mismas cambien. En vez de

proporcionar más oxigeno a las células, la presencia del peróxido de hidrogeno

aumenta el proceso de oxidación celular natural, el cual incrementa la capacidad

de usar el oxigeno disponible. Cuando el óxido de hierro no está presente, lo cual

sucede la mayor parte del tiempo, el Dr. Farr ha encontrado que el peróxido de

hidrogeno se convierte normalmente en oxigeno por la enzima catalasa, lo que

produce el peróxido de hidrogeno beneficioso para el cuerpo. La acción de la

catalasa sobre el peróxido de hidrógeno es añadir un electrón en presencia de

hidrogeno, el agua pura y el oxigeno diatónico. El oxigeno se reduce de nuevo a

superóxido y después a peróxido de hidrógeno y otra vez comienza la reacción.

Una molécula de catalasa puede convertir millones de moléculas de peróxido en

oxigeno y agua en cuestión de segundos y es la primera línea de defensa del

cuerpo contra la formación de radicales libres hidroxilo (Farr, H. C, 1996).

¿En qué tubo se demuestra la actividad de la enzima de la saliva? ¿Cómo se demostró?

En los tubos 2 y 3 por el método de tinción con el lugol al haber presencia de almidones

¿En qué tubo se ha inactivado la enzima? ¿Por qué no ha actuado?

Por presentar un pH acido ya que las enzimas son inactivadas a cambios bruscos de pH y temperatura. Así pues al adicionarle el reactivo de benedict se obtuvo el resultado negativo.

¿Qué reacción química se ha producido en el tubo B?

Se obtuvo un valor negativo, esto pudo ser debido a la cantidad de reactivo utilizado y al tiempo de calentamiento del tubo ya que debía ser mas prolonga entre 2-4 minutos para que se produjera el cambio de coloración de azul a marrón indicando la presencia de glucosa.

Imagine que se preparo un tubo C que contenga: sacarosa, agua, extracto de levadura y calientas manteniendo la ebullición 10 minutos. Formula una hipótesis de lo que crees que ocurrirá en ese tubo. ¿Cómo comprobarías tu hipótesis?

El oxígeno al ser sometido al calor disminuye su cantidad por lo que es inevitable

que la levadura pierda su capacidad de propagarse y asi se detenga el proceso

del consumo de la sacarosa no permitiendo la producción de alcohol . en el caso

de la cerveza es muy susceptible a sufrir mutaciones. Particularmente en su

capacidad de flocular y de utilizar la maltosa azúcar que constituye alrededor del

15% de los azucares fermentables por lo que

en este caso la levadura deja de ser adecuada para el proceso y no puede ser recirculable.