Download - Informe de Enzimas
UNIVERSIDAD DEL QUINDIO
FACULTAD DE CIENCIAS AGROINDUSTRIALES
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
ANALISIS DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES, VEGETALES Y AZUCARES
SAAVEDRA MARLYN VANESSA, GOMEZ LUISA MARIA, ARANA LUISA FERNANDA, AGUIRRE FERNANDO
RESUMEN
Las enzimas en su mayoría proteínas o RNA (ribo enzimas), son catalizadores químicos que agilizan una reacción que envuelve la formación o rompimiento de enlaces químicos. Dentro de esta práctica se analizo la presencia de catalasa en tejidos vegetales y animales, de tal forma que se tomo una muestra de zanahoria e hígado para ser analizados unas en su estado natural y otras luego de ser sometidas a una alta temperatura de lo que se pudo ver que solo en aquellas muestras que se mantuvieron en su estado natural hubo la presencia de la catalasa al ser realizada la prueba con peróxido de hidrogeno. Luego realizamos la hidrólisis del almidón al recolectar varias muestras con diferentes componentes almidón, saliva, acido clorhídrico para encontrar que las enzimas que se encuentran en la saliva (ptialina) que son aquellas que catalizan el almidón rompiéndolo y formando glucosa dentro de esta práctica no lo hicieron, pues a realizar la prueba de fehling y lugol a cada muestra se encontró que lo dicho anteriormente no se cumplía. También se realizo la hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura para esto en dos tubos en un se agrego sacarosa y agua, en otro sacarosa, almidón y agua, luego a los dos se les realizo la prueba de fehling para lo cual se encontró que los dos dieron negativos ante esta prueba. Al terminar la práctica pudimos reconocer como es la actividad enzimática de las diferentes enzimas vistas anteriormente en distintos tipos de alimentos.
ABSTRACT
The enzimas in the main proteins or RNA (ribo enzymes), are chemical catalysts that improve a reaction that wraps the formation or breach of chemical bonds. Inside this practice I analyze the presence of catalasa in vegetable and animal fabrics, in such a way that I take a sample of carrot and liver to be analyzed some in its natural state and others after being submitted to a high temperature of what could see that alone in those samples that were kept in its natural state there was the presence of the catalasa on the test having been realized by peroxide of hydrogen. Then we fulfil the hidrólisis of the starch when several samples gather
with different components starch, saliva, hydrochloric acid to find that the enzimas who think in the saliva (ptyalin) that they are those that catalyze the starch it breaking and forming glucose inside this practice they did not do it, so to realizing the test of fehling and lugol to every sample one thought that the above mentioned thing previously was not fulfilled. Also I fulfil the hidrólisis of the saccharose for the glucosidasa of the yeast for this in two pipes in I add saccharose and water, in other one saccharose, starch and water, then to the two I they realize the test of fehling for which thought that the two gave negatives before this test. On having finished the practice we could recognize since it is the enzymatical activity of different enzymes dress previously in different types of food.
INTRODUCCION
Las enzimas son proteínas que poseen actividad catalítica. Son sintetizados por células vivas y actúan en la totalidad de las reacciones químicas de los organismos, que son de gran importancia dentro del metabolismo. Las reacciones catalizadas por enzimas se verifican en muchos alimentos y pueden actuar positiva o negativamente respecto a la calidad del alimento. Se pueden destacar procesos enzimáticos en la maduración de frutos como en productos cárnicos o lácteos, también en la preparación de masas a partir de harinas y pardeamiento de bebidas alcohólicas. Dentro de esta práctica se busco determinar la forma en que actúan las diferentes enzimas, para esto se realizaron pruebas a diferentes alimentos vegetales y animales, como el hígado y la zanahoria, en ellos se quiso encontrar cual era la mejor manera para determinar la actividad enzimática de la catalasa, está en una enzima que
se encuentra en todos los tejidos vivos animales y vegetales, que actúa como catalizador del peróxido de hidrogeno debido a que este es nocivo para las células, de esto pudimos encontrar que la enzima se encuentra activa en los alimentos cuando están en su estado natural. La hidrólisis del almidón es realizada por la enzima amilasa, sacarasa o ptialina, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-Amilasa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. En esto encontramos que no hubo hidrólisis de almidón por medio de la enzima ptialina ya que no fueron encontrados azucares reductores con lo que se determina si hubo o no actividad enzimática en las muestras, pero si hallamos la presencia de almidón en las diferentes muestras. También se realizo una hidrólisis de la sacarosa por medio de la enzima de la glucosidasa de la levadura, esta enzima cataliza la hidrólisis de
enlaces glucosídicos para generar glúcidos menores. Con lo que se observo que no se dio el resultado esperado pues al realizar las pruebas consiguientes a las muestras esto nos dio como resultado negativo ante la presencia de azucares reductores lo que nos demuestra que no se realiza la hidrólisis.
MARCO TEORICO
CATALASA
La catalasa en una enzima hemoproteica, que se caracteriza por poseer una estructura tetramérica, en la cual cada subunidad contiene un grupo Hem (Fe). Esta presente en la mayoría de las bacterias aerobias estrictas, facultativas y anaerobias aerotolerantes.
La catalasa manifiesta actividad de peroxidasa, cataliza la oxidación de sustratos acoplada a la reducción de peróxido de hidrogeno, para formar agua y oxigeno molecular. En la prueba de catalasa la reacción se efectua en dos moléculas de peróxido de hidrogeno, una de las cuales actua como sustrato reducido y la otra como donador de átomos de hidrógeno; esto resulta en la formación de agua (sustrato reducido) y oxígeno (donador oxidado). El peróxido de hidrogeno es muy toxico para las bacterias. Generalmente los microorganismos que carecen de citocromos también carecen de catalasa así la mayoría de las bacterias anaerobias no la poseen. (Evelyn Rodríguez, et al, 2005)
HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
El almidón es un homopolisacárido de glucosa, cuyos componentes son la amilosa lineal y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa 1-4, liberan maltosa e isomaltosa, que ingresan a la celula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidón forma un complejo de color azul intenso con el yodo. Las cadenas de amilopectina solo dan un color café rojizo y el almidón hidrolizado no da ninguna coloración. Por lo tanto, la ausencia del color azul indica que el almidón ha sido hidrolizado. La
producción de amilasa es útil para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y la Lactobacillus. De igual forma, se aplica a esquemas de diferenciación de algunas bacterias aerobias y anaerobias como Actinomyces, Bacteroides, Clostridium y Fusobacterium.
(Evelyn Rodríguez, et al, 2005)
GLUCOSIDASAS
Son aquellas enzimas que catalizan la hidrólisis de diferentes glúcidos para generar glúcidos menores. Son enzimas extremadamente comunes con papeles importantes en la naturaleza como en la degradación de biomasa, como celulosa y hemicelulosa, en la defensa contra las bacterias, en mecanismos de patogénesis y en el normal funcionamiento celular. Las glucosidadas forman la mayor maquinaria catalítica para la síntesis y rotura de enlaces glucosídicos.
(Jimenez, L. Felipe, Merchant, Horacio, 2003)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PRESENCIA DE CATALASA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES
Se tomo una zanahoria y un hígado los cuales fueron cortados en dos trozos iguales cada uno. Cada muestra se coloco en un tubo de ensayo, se le agrego a cada uno 5ml de agua, luego una muestra de cada alimento en el tubo de ensayo fue
sometida a alta temperatura, después a todas las muestras se les practico la prueba con peróxido de hidrogeno y se observaron resultados.
HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
Se prepararon seis tubos de ensayo así: 2 tubos de ensayo con almidón, 2 tubos de ensayo con almidón mas 5ml de saliva, y 2 tubos de ensayo con almidón, mas 5ml de saliva y 2ml de acido clorhídrico. Luego de pasados treinta minutos a cada uno se le realizo la prueba de fehling y lugol, después se observaron resultados.
HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR LA GLUCOSIDASA DE LA LEVADURA
Se disolvió 2.5 g de levadura en 20 ml de agua destilada, se reposo durante 15 minutos y luego se filtro. Se prepararon dos tubos, uno con una cucharada de sacarosa y 2ml de agua luego se agito, otro con una cucharada de sacarosa 2ml de agua y 2ml de extracto de levadura, luego se agito, después a los dos tubos se les realizo la prueba de fehling, se observaron resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales
Tabla 1. Presencia de catalasa en hígado y zanahoria.
Muestra Reacción con H2O2
Hígado hervido-
Hígado sin hervir+
Zanahoria hervida-
Zanahoria sin hervir+
Los proceso enzimáticos en la
preparación y conservación de los
alimentos son controlados en la
mayor parte de los casos por la
temperatura. En aquellos en los que
tiene consecuencias negativas sobre
aroma, color textura o valor nutritivo,
son, bien frenados por el uso de
temperaturas bajas, o bien eliminados
por inactivación térmica de las
enzimas (Dieter&Grosch, 1988). Al
hervir el hígado y agregarle peróxido
de hidrogeno se pudo observar que
no hubo ningún reacción, es decir fue
negativa, debido a que la enzima fue
desnaturalizada porque se sometió al
altas temperaturas. Esta enzima es
obtenida a partir de hígado y de
microorganismos, tiene importancia
como enzima auxiliar para la
destrucción de H ₂O ₂:
2H ₂O ₂2H ₂O+O ₂
Dieter&Grosch). De esta manera el
peróxido de hidrogeno (2H ₂O ₂¿
produce dos moléculas de agua
(2H2O) más una molecula de oxigeno
(O2) de esta forma hay liberación de
oxígeno debido a que la catalasa está
actuando sobre el peróxido de
hidrogeno.
Por lo tanto como al enzima es la
encargada de catalizar el peróxido de
hidrogeno esta se inactivo y no hubo
catálisis del agua oxigenada, es decir
la reacción fue negativa. Por lo tanto
no hubo desprendimiento de oxígeno.
Por consiguiente al agregarle agua
oxigenada al hígado sin hervir se
pudo observar burbujeo siendo la
reacción positiva debido a que la
catalasa estaba presente en el
hígado, como se explicó
anteriormente esta enzima se puede
obtener de este tejido animal, por
esto la enzima realiza la oxidación del
peróxido formando agua y liberando
oxígeno, así se pudo observar que el
burbujeo es debido al
desprendimiento de oxígeno.
El pre-tratamiento habitualmente
utilizado para detener proceso
enzimático en frutas y hortalizas
consiste en escaldado con agua
caliente o con vapor vivo. Las
temperaturas de escaldado suelen
oscilar entre 77 y 82 °C en aunque
ocasionalmente se utilizan
temperaturas hasta 96°C (Hart&
Fisher, 1991). Cuando se sometió la
zanahoria a altas temperaturas hubo
una destrucción enzimática ya que al
agregarle el peróxido de hidrogeno no
se observó burbujeo por tanto no
hubo catálisis por parte de la catalasa
frente al reactivo H ₂O ₂, en tanto no
hubo desprendimiento de oxígeno,
esto quiere decir que la reacción fue
negativa.
El hecho de que el tratamiento
térmico inhiba total o parcialmente la
reacción, sugiere que es de
naturaleza enzimática (Hart& Fisher,
1991). Cuando se llevó a cabo el
análisis de hacer reaccionar el
peróxido de hidrogeno con la
zanahoria sin hervir se pudo observar
que hubo burbujeo porque la enzima
esta activa pues es su estado natural,
por lo cual hubo desprendimiento de
oxígeno dando positiva la reacción
frente al peróxido, aunque en menor
proporción que en el hígado, ya que
este es una fuente de obtención de la
enzima y esto nos indica que tiene un
alto contenido de catalasa respecto a
la zanahoria.
2. Hidrólisis del almidón por enzimas hidroliticas de la saliva:
Tabla 2. Hidrólisis del almidón por enzimas hidroliticas de la saliva.
Lugol Benedit
Tubo número. 1+
Tubo número. 1-
Tubo número. 2+
Tubo número. 2-
Tubo número. 3+
Tubo número. 3-
Se prepararon dos (2) tubos numero
uno (1) con solución de almidón, al
primero se le agrego el reactivo lugol
para determinar presencia de
almidones este dio un resultado
positivo. Esto es debido a que el
almidón reacciona químicamente con
iodo para producir un color azul
oscuro cuando las moléculas de iodo
se insertan en los huecos de las
moléculas espiralada del almidón
(amilosa). Este resultado es debido a
que la molécula absorbe más luz
visible excepto azul, (Olivas. E. &
Alarcón L. R., 2004). Al siguiente tubo
numero uno (1) que también era una
solución de almidón se le realizo la
prueba de benedit para determinar la
presencia de azucares el resultado
fue negativo debido a que la prueba
de benedit es para determinar
azucares reductores y no de
polisacáridos, porque para la
determinación de azucares
reductores se debe realizar la prueba
de benedit por lo tanto en el almidón
debe dar negativo si no ah sido
hidrolizado (Maraculla. M. J & Goñi
M. F., 1994).
Se prepararon dos tubos numero dos
(2), uno con una solución de almidón
con adicción de saliva, este tubo se
dejo en reposo treinta minutos
(30min), después de haber
transcurrido ese tiempo se le agrega
lugol para determinar almidones y el
resultado es positivo, esto pudo
haberse dado debido a la cantidad de
adicción de saliva a la muestra ya
que esta es la encargada de
hidrolizar el almidón por estar
presente la enzima responsable de
dicha reacción, por lo tanto debió
presentar una hidrólisis y arrojar un
resultado negativo, ya que la amilasa
salival (o ptialina) hidroliza el almidón,
transformándolo en maltosa, pasando
previamente por unos compuestos
intermedios denominados dextrinas
(Maraculla. M. J & Goñi M. F., 1994).
El otro tubo dos (2) se le agrego el
reactivo de benedit para la
identificación de azucares reductores
como se dijo anteriormente por esto
como no hubo hidrólisis del almidón
por parte de la ptialina el resultado
fue negativo, sin embargo el
resultado debió ser positivo por lo
explicado anteriormente.
Se prepararon dos tubos número (3)
los cuales tenían solución de almidón
mas saliva mas adición de acido
clorhídrico (HCl), el primer tubo tres
(3) se le realizo la prueba de lugol
para determinar la presencia de
almidones el resultado fue positivo,
debido a que el HCl inactiva las
enzimas (proteínas), desestabilizando
su estructura terciaria y cuaternaria
(Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M.,
2006). Por presentar un pH acido ya
que las enzimas son inactivadas a
cambios bruscos de pH y
temperatura. Así pues al adicionarle
el reactivo de benedit se obtuvo el
resultado negativo, debido a que no
hubo una hidrólisis del almidón en
maltosa, que es u azúcar reductor
que se puede identificar con dicho
reactivo, (Maraculla. M. J & Goñi M.
F., 1994).
3. Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.
Tabla 3. Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de la levadura.
Muestra Benedit
Tubo A -
Tubo B
-
En el Tubo A se tenía una muestra
de sacarosa diluida en agua, se le
adiciono reactivo de benedit se
obtuvo un resultado negativo puesto
que este reactivo es para determinar
azucares reductores y este disacárido
no tiene poder reductor por carecer
de carbonos anomericos, además la
sacarosa para pasar a ser reductor
debe ser hidrolizada para que se
rompa en sus monómeros fructuosa y
glucosa que al agregarle benedit y
calentar durante aproximadamente
unos minutos se pudo observar que
arrojaron valores negativos, . Por
consiguiente en el tubo B que tenia la
misma solución mas adicción de la
enzima glucosidasa, se obtuvo un
valor negativo, esto pudo ser debido
a la cantidad de reactivo utilizado y al
tiempo de calentamiento del tubo ya
que debía ser mas prolonga entre 2-4
minutos para que se produjera el
cambio de coloración de azul a
marrón indicando la presencia de
glucosa. Las aldosas y también las
cetosas en medio alcalino, son
capaces de oxidarse a ácidos
adónicos, con lo que pueden reducir
determinados reactivos. Entre las
múltiples posibilidades, son muy
comunes las reacciones de reducción
del ion cúprico (azul intenso en medio
alcalino) a ion cuproso (rojo ladrillo,
insoluble). Las conocidas reacciones
de Fehling y de benedit siguen este
esquema. Por sus propiedades
químicas se clasifican en reductores,
cuando conservan un grupo aldehído
o cetona libre, y no reductores si no
les queda libre ningún grupo aldehído
o cetona, (Maraculla. M. J & Goñi M.
F., 1994).
Conclusiones
Las enzimas a altas
temperaturas mayores de 77°c
se desnaturalizan y se vuelven
inactivas en cambios bruscos
de PH
La catalasa se encuentra en
los tejidos vegetal y animal
estando en su estado natural
Los procesos enzimáticos se
llevan a cabo en presencia de
oxigeno de lo contrario su
actividad disminuye
Las enzimas funcionan
correctamente dentro un
limitado rango de temperatura
y pH.
BIBLIOGRAFIA
Evelyn Rodríguez Cavallini, et all, 2005, Bacteriología General: Principios Y
Prácticas de Laboratorio, Editorial Universidad de Costa Rica, pág. 195, 196,197
Jimenez, L. Felipe, Merchant, Horacio, 2003,biología celular y molecular, person
educación de México, pág. 23
Hart. L.F & Fisher J.H, 1991, Análisis modernos de los alimento, Editorial Tipo
Línea S.A, Zaragoza, pag. 117, 124, 528.
Farr. H. C, 1996, Terapias de oxígeno para una optima salud y vitalidad, Lasser
Pres Mexicana. S.A de C.V., pag. 61-71.
Olivas. E. & Alarcón L. R., 2004, Manual de prácticas de Microbiología básica y
Microbiología de alimentos, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, México,
pag. 35-36.
Maraculla. M. J & Goñi. M. F., 1994, Bioquímica humana, segunda edición,
Editorial Reverte, S.A, Barcelona, Pag. 76,195.
Pertierra. G. A. & Rivera T. J. M., 2006, Segunda edición, Fundamentos de
bioquímica metabólica, Madrid, pag. 161.
ANEXOS
¿Qué tejidos presentan desprendimiento de oxigeno?
El tejido animal sin hervir y el tejido vegetal sin hervir debido a que las enzimas
están activas pues en su estado natural se encuentra la catalasa.
¿Cuál de los tejidos presenta mayor actividad?
Los tejidos que mayor actividad presentaron fueron el hígado porque es una
fuente de obtención de la enzima como también se puede obtener de
microorganismo, en el tejido vegetal hube menor actividad enzimática.
¿Por qué la reacción es negativa cuando cocemos las muestras?
La reacción es negativa cundo sometemos a altas temperaturas las muestras
debido a que las enzimas por ser proteínas se desnaturalizan cuando son
sometidas a temperaturas entre 77 y 96°C.
Frecuentemente utilizamos agua oxigenada como antiséptico y se observa que al
aplicarla a una herida se produce un burbujeo, ¿qué está ocurriendo? ¿Por qué se
utiliza el agua oxigenada como antiséptico?
El peróxido de hidrógeno en bajo grado (3 por ciento) es muy conocido por la
mayoría de nosotros. Cuando lo aplicamos de manera externa, en una herida hace
burbujas, esto se debe al oxígeno que sale de la solución. El peróxido de
hidrogeno no sólo oxigena el cuerpo el cuerpo produciendo modestas cantidades
de oxigena sino que también tiene una extraordinaria capacidad de estimular las
enzimas oxidantes, que a su vez pueden cambiar la composición química de otras
sustancias (como virus y bacterias) sin que aquellas mismas cambien. En vez de
proporcionar más oxigeno a las células, la presencia del peróxido de hidrogeno
aumenta el proceso de oxidación celular natural, el cual incrementa la capacidad
de usar el oxigeno disponible. Cuando el óxido de hierro no está presente, lo cual
sucede la mayor parte del tiempo, el Dr. Farr ha encontrado que el peróxido de
hidrogeno se convierte normalmente en oxigeno por la enzima catalasa, lo que
produce el peróxido de hidrogeno beneficioso para el cuerpo. La acción de la
catalasa sobre el peróxido de hidrógeno es añadir un electrón en presencia de
hidrogeno, el agua pura y el oxigeno diatónico. El oxigeno se reduce de nuevo a
superóxido y después a peróxido de hidrógeno y otra vez comienza la reacción.
Una molécula de catalasa puede convertir millones de moléculas de peróxido en
oxigeno y agua en cuestión de segundos y es la primera línea de defensa del
cuerpo contra la formación de radicales libres hidroxilo (Farr, H. C, 1996).
¿En qué tubo se demuestra la actividad de la enzima de la saliva? ¿Cómo se demostró?
En los tubos 2 y 3 por el método de tinción con el lugol al haber presencia de almidones
¿En qué tubo se ha inactivado la enzima? ¿Por qué no ha actuado?
Por presentar un pH acido ya que las enzimas son inactivadas a cambios bruscos de pH y temperatura. Así pues al adicionarle el reactivo de benedict se obtuvo el resultado negativo.
¿Qué reacción química se ha producido en el tubo B?
Se obtuvo un valor negativo, esto pudo ser debido a la cantidad de reactivo utilizado y al tiempo de calentamiento del tubo ya que debía ser mas prolonga entre 2-4 minutos para que se produjera el cambio de coloración de azul a marrón indicando la presencia de glucosa.
Imagine que se preparo un tubo C que contenga: sacarosa, agua, extracto de levadura y calientas manteniendo la ebullición 10 minutos. Formula una hipótesis de lo que crees que ocurrirá en ese tubo. ¿Cómo comprobarías tu hipótesis?
El oxígeno al ser sometido al calor disminuye su cantidad por lo que es inevitable
que la levadura pierda su capacidad de propagarse y asi se detenga el proceso
del consumo de la sacarosa no permitiendo la producción de alcohol . en el caso
de la cerveza es muy susceptible a sufrir mutaciones. Particularmente en su
capacidad de flocular y de utilizar la maltosa azúcar que constituye alrededor del
15% de los azucares fermentables por lo que
en este caso la levadura deja de ser adecuada para el proceso y no puede ser recirculable.