UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA - FIA

Ao de la PROMOCION DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMATICO"

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIAFACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

LABORATORIO N4: ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA FRENTE A MUESTRAS DE AGUA DE CITRAR Y GLUTAMATO

Presentado por:PILCO MAITA, DENNIS PAULMARTEL VASQUEZ, BRIANPEA HUAMANI, NYLS HEINZPALOMINO OCHANTE, CHRISTIANRODRIGUEZ ASTUHUAMAN, ALEJANDRO

Profesor: CESAR ZAA LIMASCCALIMA -PERU

LABORATORIO N4 CINETICA BIOQUIMICAJunio - 2014ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA EN PRESENCIA DE MUESTRAS DE AGUA DE CITRAR Y GLUTAMATO

1. RESUMEN La fosfatasa alcalina es una enzima que cataliza la hidrlisis del enlace ester fosfrico entre un grupo orgnico y un grupo fosforilo a pH alcalino, lo que libera fosfato al medio. En esta prctica de laboratorio se van a estudiar el comportamiento cintico de la fosfatasa alcalina proveniente del intestino de ratn, en presencia de muestras de glutamato y agua de citrar. Para ello se va emplear como sutrato al p-nitrofenilfosfato, cuya hidrlisis da lugar al pnitrofenol y al fosfato. Tambin emplearemos un reactivo de color para que se pueda cuantificar colorimtricamente a 520 nm. El mtodo que se empleo consisti en preparar 4 tubos con los reactivos segn la Tabla N1 y hacer un duplicado por seguridad, para as estudiar el efecto de estas muestras sobre la concentracin del producto.Los resultados que mostro la investigacin fue que el glumatato era un activador de la enzima, y el agua de Citrar era un inhibidor, posiblemente tena un toxico para la enzima o tal vez contena fosfato cambiando el sentido de la reaccin hasta llegar al equilibrio de la reaccin. Palabras clave: activador, inhibidor, equilibrio qumico, glutamato monosodico, p-nitrofenilfosfato

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2. ABSTRACT

Alkaline phosphatase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of the phosphoric ester bond between an organic group and a phosphoryl group at alkaline pH, which releases phosphate medium. In this lab are to study the kinetic behavior of alkaline phosphatase from the mouse intestine in the presence of glutamate and water samples from citrar. For this we will use as sutrato the p-nitrophenyl phosphate whose hydrolysis leads to pnitrofenol and phosphate. Also employ a reactive color so that you can quantify colorimetrically at 520 nm. The method was to prepare job 4 tubes with reagents according to Table No. 1 and make a duplicate for safety, in order to study the effect of these samples on the concentration of the product. The results showed that the research was glumatato was an enzyme activator, and water was an inhibitor Citrar possibly had a toxic to the enzyme containing phosphate or perhaps by changing the direction of the reaction to reach equilibrium reaction.

Keywords: activator, inhibitor, chemical equilibrium, monosodium glutamate, p-nitrophenylphosphate

3. INTRODUCCIONEl presente trabajo de investigacin se centro en determinar el comportamiento de la reaccin enzimtica en presencia de 2 muestras que elegimos aleatoriamente (el agua de Citrar y el glutamato). Pueden ser activadores o inhibidores segn sea el caso, para esto se tomo en cuenta el grado de variacin de la absorbancia del producto. Si la muestra contiene activadores, entonces la absorbancia tiende a aumentar debido a que pueda contener algn tipo de iones metlicos como los divalentes (Mg2+, Co2+ y Mn2+) o aminoalcoholes que pueden unirse al sitio activo iniciando las reacciones utilizando la fosfatasa alcalina. En caso contrario pueda que la muestra contenga inhibidores que afectan las capacidades de esta enzima o simplemente sobresaturando de fosfato para poder detener la reaccin.. Tambin podemos incluir la presencia de pH neutro o cido, queladores del in metal arriba mencionado, fosfatos inorgnicos, urea y altos niveles de Zn+2.En cuanto a la informacin de otros trabajos, sealan su a su importancia medica, ya que permite diagnosticar enfermedades o afecciones como: enfermedades del hgado, ictericia, deficiencia de vitamina D, enfermedades seas, enfermedades paratiroideas, dolores gstricos y leucemia milgena crnica. Esta prueba tambin se usa para controlar los efectos de las drogas prescritas sobre la funcin renal. Muchas drogas incluyendo los antidepresivos, las pldoras anticonceptivas, los antibiticos y los antiinflamatorios afectan esta funcin. Controlar los niveles de la fosfatasa alcalina en la sangre ayuda, en este caso al mdico a decidir las dosis y puede ayudar a evitar complicaciones que puedan surgir del uso continuo de estos medicamentos. (Medline Plus, 2013)En cuanto a su importancia fisiologa, las fosfatasas participan de casi todos los procesos celulares, funciones biolgicas y control incluidos transcripcin de genes (por ej. construccin del ARN (cido ribonucleico), utilizando una molcula de ADN) y traduccin (por ej. el proceso de formacin de una molcula de protena), movimiento celular, progresin del ciclo celular, metabolismo, apptosis (por ej. un tipo de muerte celular), estabilidad de las protenas, desrdenes citoesquelticos y estabilidad de las protenas.

4. MATERIALES Y METODO4.1 MATERIALES Y REACTIVOSMATERIALESREACTIVOS

Tubos de ensayoFosfatasa Alcalina

Pipeta (100-1000l)Reactivo de color

Pipeta (20-100l)Agua destilada

Vaso de precipitadosP-nitrofenilfosfato

Placa PetriAgua de Citrar

GasaSuero

Tubo de homogenizacinGlutamato

Espectrofotmetro

Varilla de vidrio

1 Tijera

1 Ratn

1 embudo

4.2 PROCEDIMIENTOPaso 1.- De la muestra del ratn del laboratorio, se sigue un protocolo de los cuales se obtiene los intestinos de la muestra, luego se procede a limpiarlos y hacer picadillo para luego mezclarlo con una pequea cantidad de suero fisiolgico para poder molerlo ms fcilmente en el mortero.

Paso 2.- Luego, en el tubo de homogenizacin de vidrio, se procede a presionar con la varilla de vidrio para obtener una solucin casi homognea de la muestra con el suero fisiolgico. Una vez que se tenga la muestra homognea, se filtra la muestra en un vaso con el embudo y la gasa. La parte de la solucin se completa con suero fisiolgico hasta tener 15 ml.

Paso 3.- El tubo con los 15 ml de la muestra, se lleva a centrifugar durante 5 minutos a 4000 rpm, para sedimentar los restos de la muestra y separarla ms finamente de la solucin de intestino.

Por 5 minutos

Paso 4.- Una vez que tengamos listo la enzima (intestino del raton), procedemos a aadir los siguientes reactivos, tal como se especifica en la Tabla N1, en tubos de ensayo por duplicado aadiendo. En este caso podemos empezar vertiendo 100L de sustrato (p-nitrofenilfosfato) en dos tubitos (Blanco y Desconocido).

Paso 5.- A cada tubito con el sustrato, se aade 150 L de agua destilada, se homogeniza y se preincuba en bao Mara a 37C durante 3 minutos.Slo al tubito rotulado con Desconocido se le agrega 6L de la solucin de intestino preparado previamente. En caso del tubo de agua de citrar y del glutamato tambin se le aade 6 L Paso 6.- A continuacin, las mezclas de los tubitos, se incuban por 10 minutos a 37C y se agrega a cada uno 700L de reactivo de color, as como 550L de agua.Paso 7.- Ambas muestras, se llevan al espectrofotmetro para la medicin de su absorbancia.

Preparacin de los tubos x duplicado Proporcin de las mezclas

Tabla N1BLANCODESCONOCIDOAGUA DE CITRARGLUTAMATO

p-nitrofenolfosfato100L100L100L100L

Agua destilada150 L150 L150 L150 L

Agua de CITRAR----100L--

Incubar a 37C por 3 minutosGlutamato----Incubar a 37C por 3 minutos--100L

Incubar a 37C por 10 minutosEnzima (intestino)--6LIncubar a 37C por 10 minutos6L6L

Reactivo de color700L700L700L700L

Agua destilada550L550L550L550L

5. RESULTADOSLos resultados obtenidos de las 4 mezclas por duplicado en el espectrofotmetro son: Tabla N 2GlutamatoAgua de CitrarBlancoDesconocido

PRUEBA N1 0.497 ABS0.614 ABS0.426 ABS0.677 ABS

PRUEBA N 20.601 ABS0.390 ABS0.376 ABS0.505 ABS

6. DISCUSION

En el tubo de ensayo donde se preparo el BLANCO no se aadi los 6L de enzima, por lo que no se genero [producto] , entonces la absorbancia que se vio era proporcional solo a la concentracin del[sustrato]. En el tubo del Desconocido se vio que la Absorbancia era directamente proporcional a la concentracin del [producto] segn la reaccin enzimtica: Figura 1

p-Nitrofenilfosfato p-Nitrofenol + fosfato[sustrato] [producto] + [fosfato] Sin embargo vemos que : ABS (Desconocido) > ABS (Blanco), lo que tericamente se debe cumplir, debido a que en el desconocido se genera mas sustrato y en el blanco no se genera debido a ausencia de enzima. Con respecto al glutamato, podemos decir: ABS 0.601 (glutamato) > ABS 0.501 (desconocido). Adems segn otra investigacin el grupo Glutamato monosodico (Ajinomoto) aument los niveles sricos de la fosfatasa alcalina en un experimento con ratas hembras durante 7 meses. (Contini, M.; 2012) Entonces se puede afirmar que el glutamato mono sdico haya aumentado la actividad de la enzima, probablemente por que contena iones Na+ y por su grado de solubilidad o disociacin del glutamato. Con respecto al agua de CITRAR podemos decir que el agua contena inhibidores, ya que la ABS 0.390 ( Agua de Citrar) < ABS 0.505 (Desconocido), pero no podemos decir que tipo de inhibidores tenia ya que no tuvo la oportunidad de analizar la muestra. Es muy probable que tenga algn tipo de toxico para la enzima o tambin pueda ser por presencia de fosfatos, ya que aumentar la cantidad de [fosfato], esto producira un cambio en la reaccin desplazndose a la izquierda o en el sentido inverso para llegar al equilibrio qumico. p-Nitrofenilfosfato p-Nitrofenol + fosfato [sustrato] [producto] + [fosfato]

7. CONCLUSIONES Se llego a la conclusin que el glutamato monosodico influye de maner apositiva a la reaccin enzimtica del p-Nitrofenilfosfato con la enzima Fosfatasa alcalina, debido a que tenga un cofactor. Se concluye que el agua de Citrar tiene inhibidores debi a la baja absorbancia que mostro en la Prueba N 2, sin embargo en la prueba N1 mostro una absorbancia muy alta (probablemente el agua contiene Mg+ 2 o Ca+2, dependiendo del grado de tratamiento de agua, si es agua tratada debera tener menos dureza y menos quelatos) y lo mas creible sea que tenga presencia de algn fosfato, ya que el agua de CItrar donde recogimos estaba expuesto a la atmosfera. Con respecto al Blanco y al Desconocido, era de esperarse que la ABS (Desconocido) fuera mayor que al ABS Blanco, debido a presencia/ ausencia de enzima que se preparo previamente. Con respecto a su importancia tiene varios, ya sea en el mbito medico como indicador de enfermedades. Los altos niveles de fosfatasa en la sangre indican enfermedades en los huesos, hgado, en el sistema biliar o enfermedades serias. Los niveles anormalmente bajos son sntomas de un desorden gentico conocido como la hipofosfatasia, que resulta en deformidad de los huesos, e incluso lleva a la muerte si no es tratada. Esta enzima, tambin se utiliza como control de la adecuada pasterizacin de la leche y crema, dado que la fosfatasa alcalina se inactiva por calentamiento

8. AGRADECIMIENTOSEn primer lugar agradezco de manera especial al profesor Cesar Zaa, por su paciencia y apoyo incondicional en el transcurso de los ensayos de los laboratorios realizados y por brindarnos la oportunidad de conocer ms acerca de las enzimas y su importancia en el ambiente.Agradezco tambin a los seores encargados del laboratorio, quienes nos facilitaron la libre disposicin de los materiales sin ocasionar perdida alguna, salvo el grato recuerdo que nos llevamos.9. BIBLIOGRAFIA

BARCENA J.A:,GARCIA C., PADILLA A. y OTROS Caracterizacin cintica de la fosfatasa alcalina , Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba, 2012, pag 1-3 CONTINI M. del C, MILLEN N. y NAHIEU S.; Antropometra, metabolismo y estado oxidativo en ratas hembras con obesidad inducida por glutamato monosdico oral; Laboratorio de Investigaciones Fisiologicas Experimentales (LIFE). Facultad de Bioqumica y Cs Biolgicas. Universidad Nacional del Litoral. Ciudad Universitaria. Paraje El Pozo. CC 242. Santa Fe (3000). Revista FABICIB Vo.l 16 ; ao 2012; Pag.47 -5910. LINKOGRAFIA http://www.ehowenespanol.com/fosfatasa-alcalina-sobre_51280/ http://www.ehowenespanol.com/fosfatasa-alcalina-sobre_51280/ http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8180/publicaciones/bitstream/11185/7236/1/FABICIB%2016_pag_47_59_resumen.pdf

CUESTIONARIO CINTICA BIOQUMICA1. INFORMACIN ACERCA DE LA ENZIMA (ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL)

Estructura: (FAl; E.C.3.1.3.1) Como muchas enzimas, la fosfatasa alcalina es una glicoprotena. Su estructura difiere dependiendo de donde se origina. La fosfatasa de los huesos se ve distinta de la del hgado. Estas distintas estructuras se llaman isozimas. En general, la fosfatasa alcalina es un dmero que contiene subunidades casi idnticas conteniendo cada una dos molculas de cinc. Una molcula de Zinc es muy unida, dando a la estructuraestabilidady la otra lo es menos, lo que le da propiedades catalticas.Funcinal: Son una superfamilia de metaloenzimas homodimricas. La fosfatasa alcalina es la enzima responsable de la retirada de grupos de fosfatos de varias molculas, como los alcaloides, los nucletidos y las protenas. Aunque la funcin de la fosfatasa alcalina es ampliamente estudiada y usada en laboratorios, la magnitud de su significancia biolgica permanece de alguna forma en el misterio y es rea de estudio. La fosfatasa alcalina juega un papel importante en la calcificacin de los cartlagos y de los huesos. Esta cataliza la hidrlisis del ter del cido fosfrico causando una supersaturacin de iones de fosfato. Se cree tambin que la fosfatasa alcalina participa en la reabsorcin de los huesos removiendo una capa de fosfato que est presente en la superficie de estos. La fosfatasa alcalina tambin tiene su rol en la sntesis de protenas dentro de las clulas. Tambin lo es en la sntesis del ADN, ya que es capaz de hidrolizar tanto al ADN como al ARN

2.QU FACTORES AFECTAN LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA?La fosfatasa alcalina es una enzima que puede ser afectado por la temperatura que puede desnaturalizar en el peor de los casos, tambin el pH (pH ptimo entre 9 y 10), la presencia de catalizadores, cofactores que pueden acelerar la reaccin, o tambin la presencia de toxicos o inhibidores que pueden afectar negativamente a la reaccin enzimtica. Tambin el exceso de fosfato que puede parar la reaccin o al haber tanto sustrato puede que la enzima llegue a un estado de saturacin.

3. ALTERACIN DE LOS NIVELES NORMALES. PATOLOGASLos resultados normales pueden deberse a las siguientes afecciones.Los niveles de fosfatasa alcalina superiores a los normales pueden ocasionar : Obstruccin biliar Afecciones seas Tumores seos osteoblsticos,osteomalacia, consolidacin de unafractura Enfermedad heptica ohepatitis Ingerir una comida grasosa si usted tiene el tipo de sangre O o B Hiperparatiroidismo Leucemia Linfoma Enfermedad de Paget Raquitismo SarcoidosisLos niveles de la fosfatasa alcalina (hipofosfatasemia) inferiores a los normales: Hipofosfatasia Desnutricin Deficiencia deprotena Enfermedad de Wilson

4. RELACIN CON LA TOXICIDAD AMBIENTALNo presenta una toxicidad significativa o riesgo significativo, salvo niveles altos o niveles bajo, que si pueden afectar a la salud, respecto al dao ambiental no se tiene mucha informacin, sin embargo hoy en dia se hay investigaciones que priorizan mas sus usos y futuras aplicaciones en vez de analizar sus daos. Con respecto a la hora de hacer pruebas con el espectrofotmetro, hay otros reactivos que acompaan al p- nitrofenilfosfato que si pueden presentar un riesgo como la: Dietanolamina, cloruro de magnesio que son nocivo por ingestin y en caso de contacto con la piel, lavarse inmediata y abundantemente con agua. En caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al mdico.

5. IMPORTANCIA ECOLGICAEn cuanto a su importancia fisiologa, las fosfatasas participan de casi todos los procesos celulares, funciones biolgicas y control incluidos transcripcin de genes (por ej. construccin del ARN (cido ribonucleico), utilizando una molcula de ADN) y traduccin (por ej. el proceso de formacin de una molcula de protena), movimiento celular, progresin del ciclo celular, metabolismo, apptosis (por ej. un tipo de muerte celular), estabilidad de las protenas, desrdenes citoesquelticos y estabilidad de las protenas.En cuanto a importancia ambiental puede influir en los fosfatos en suelo marino y su remocin de aguas residuales), en cuanto a las aves influye en sus ciclos de fertilidad, en cuanto a alimentos influye en la pasteurizacin de la leche) y como herramienta analtica, seguirn dando a cabo al desarrollo de varias tcnicas inmuno enzimticas, para beneficio de las ciencias biolgicas.6. ROL ANTE LOS XENOBIOTICOSLas fosfatasas alcalinas (FAl; E.C.3.1.3.1) son una superfamilia de metaloenzimas homodimricas que hidrolizan mono esteres orto fosfricos unidos a nucletidos, protenas y muchos otros sustratos, a pH entre 8-11 y en presencia de iones Zn+2 y Mg+2. Se inhiben con Be++, Fe++, Cu++ y varios poli aniones. Varios estudios han confirmado su carcter pleiotrpico, pero nuevos estudios estructurales, cinticos y genticos revelan nuevos roles metablicos y funcionalesLa concentracin de Fosfatasa Alcalina y/ o isoenzimas, ha sido explotada como marcador de varios fenmenos biolgicos en ciencias biomdicas (e.g. funcionalidad renal, heptica y sea), respecto a los xenobioticos depender del tipo de sustancia, para que la fosfatasa alcalina pueda degradar sustancias o posibles contaminantes como en la remocin en aguas residuales.

LABORATORIO N3 CINETICA BIOQUIMICA