“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N°5

IDENTIFICACIÓN DE HONGOS MEDIO AMBIENTALES y CULTIVO EN CÁMARA

HÚMEDA

Integrantes:

20111360 Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye20091001 Flores Calderon, Elvis Hedim20120456 Norabuena Damian, Juan Bernardo20100472 Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N°5

Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm

2013

I. INTRODUCCIÓN

Se sabe que el hongo es un organismo que prospera en diversos ambientes,

incluyendo el aire e interiores. Y este se desarrolla mejor en condiciones cálidas,

mojadas y húmedas, también se propaga y reproduce por esporas, las cuales

sobreviven en condiciones ambientales que no favorecen el crecimiento normal de

hongo, permaneciendo dormantes hasta que las condiciones ambientales se

tornen favorables.

Algunas personas son sensibles a los hongos debido a las toxinas que estas

liberan, su exposición a estas personas puede causarle síntomas como congestión

nasal, irritación de los ojos o hasta reacciones más severas para las que tengan

graves alergias.

Al interior de la casa, el crecimiento del hongo puede ser disminuido manteniendo

los niveles de humedad por debajo del 50% y ventilando las áreas por donde se

circula. Esto ya que el aire es el medio de diseminación tanto de hongos como de

otras sustancias que a la vez pueden estar cargadas de diversos grupos de

microorganismos.

Para esta práctica anteriormente se aislaron muestras de diversos ambientes en el

hogar como la cocina, los cuartos, el baño y también del bus en el que se viaja.

Cada placa Petri con agar sabouraud fue incubada por 1 semana

aproximadamente, posteriormente se identificaron los hongos presentes en cada

una. Se encontró que en su mayoría existen los hongos de tipo Aspergillus sp y

Penicillium sp.

Adicionalmente se realizó un cultivo en cámara húmeda a partir de los hongos

obtenidos en las placas, para poder hacerle un seguimiento sobre su desarrollo

vegetativo.

Objetivos:

Determinar los géneros de hongos más frecuentes presentes en el medio

ambiente.

Mediante la observación macroscópica, establecer características típicas

para poder reconocerlas en adelante.

Determinar las características del desarrollo vegetativo de los hongos a

través de un cultivo en cámara húmeda y mediante observaciones

periódicas al microscopio

II. MARCO TEÓRICO

Los hongos:

Son hongos filamentosos que se encuentran en aire libre como en interiores, existe

desde hace miles de años. El moho crece mejor en condiciones cálidas, mojadas y

húmedas, se propaga y reproduce mediante esporas. Estas pueden sobrevivir en

condiciones ambientales desfavorables como la resequedad, que no beneficien el

crecimiento normal del moho.

Algunas personas son sensibles a los mohos. La exposición a los mohos puede

causar síntomas como congestión nasal, irritación de los ojos o resuello. Las

reacciones severas pueden ocurrir entre trabajadores expuestos a grandes

cantidades de mohos en los lugares de trabajo, como en el caso de los granjeros

que trabajan todo el día alrededor del heno mohoso. Algunas reacciones severas

pueden incluir fiebre y dificultad para respirar. Las personas con enfermedades

crónicas, como enfermedad obstructiva de los pulmones, pueden presentar

infecciones de moho en los pulmones.

Los mohos se encuentran en diversos ambientes y pueden ser detectados, tanto

en interiores como al aire libre, durante todo el año. Las condiciones húmedas y

cálidas favorecen el crecimiento del moho. Al aire libre pueden encontrarse en

áreas o lugares húmedos sombreados donde hay descomposición de hojas o de

otro tipo de vegetación. En los interiores pueden encontrarse en lugares donde los

niveles de humedad son altos como los sótanos o las duchas. Los tipos más

comunes de mohos son Cladosporium sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Mucor sp

y Aternaria sp.

Aspergillus sp:

Este microorganismo es la causa más frecuente de “Aspergilosis” en humanos y

animales. En individuos sin inmunocompromiso puede actuar como un potente

alérgeno o causar infecciones localizadas de los pulmones. En pacientes

inmunocomprometidos (alteración del sistema inmunologico) la inhalación de

esporas puede producir una aspergilosis invasora de los pulmones o de los senos

paranasales

Cladosporium sp:

Este hongo con más frecuencia en el aire y uno de los hongos alergénicos

respiratorios más importantes, se le implicado en casos de asma y fiebre. Se le

asocia a los casos de rinitis en loso que los síntomas no parecen coincidir con la

cantidad de polen de gramíneas.

No es un agente infeccioso importante, pero en climas cálidos, puede producir

infecciones cutáneas, subcutáneas y queratitis. Estas infecciones tienen un

desarrollo lento y su tratamiento incluye exeresis quirúrgica de los tejidos

afectados.

Penicillium sp:

La inhalación de esporas de Penicillium en concentraciones comparables a la de

una exposición natural puede inducir asma en individuos sensibles. Los penecilos

crecen sobre los alimentos, ya sea de origen vegetal o animal. Lo que causa

alergias son las micotoxinas, estas consumidas regularmente, aun en cantidades

mínimas, causan lesiones irreversibles en riñón, hígado, cerebro y tienen actividad

teratogenica.

Alternaria sp:

Este hongo una de más infecciosas puede provocar lesiones cutáneas y

subcutáneas después de traumatismos en personas con inmunosupresión. Se han

observado infecciones invasoras sistemáticas en pacientes con sida. Las lesiones

cutáneas se curan espontáneamente con la mejora o la resolución de los factores

subyacentes del enfermo. El tratamiento se basa en la administración intravenosa

de concentraciones elevadas de anfotericina B-desoxilicato durante varias

semanas.

Hongos en frutas y verduras:

La mayoría de las frutas son sensibles a varias especies de hongos pero algunas de estas especies de hongos, pero algunas de estas especies afectan solo a una clase de fruta. En la práctica, los aspectos externos de los distintos tipos de lesiones son denominados enmohecimientos, son difíciles de diferenciar

Las principales formas de enmohecimientos y alteraciones que se producen son:

o Húmeda: producida por Rhizopus

o Seca: originada por Gleosporium y Sclerotinia

o Frutas de pepita (pera y manzadas): se debe a Fusarium, Botrytis,

Alternaria Cladosporium, Penicillium.o Amarga: Gleosporium , Trichotechium

o Roña o moteada: Venturia y Fusicladium

Método de aislamiento de hongos de aire:

Es la forma más sencilla su aislamiento consiste:

Elegir un punto determinado del ambiente de estudio.

Destapar la placa Petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a 10 min, vuelva a tapar la placa , rotular el lugar de muestreo

En el laboratorio incubar las placas en una estufa de 30ªC por 4 a 5 días.

Transcurrido el tiempo, examine las placas y realizar una descripción, detallada de las mismas.

Una desventaja es que las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) obtenidas no se pueden relacionar con el volumen de aire.

Método de cámara húmeda

Un dispositivo para cultivo de cámara húmeda es un sistema esterilizado que consta de una placa Petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio en “U” que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Asépticamente se secciona una pequeña porción de medio de cultivo estéril (agar sabouraud), y se coloca sobre la lámina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparación se cubre con otra lámina y el papel filtro se humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20-25 °C) por 4 o 5 días. En la presente práctica se observara el crecimiento mitótico de los filamentos para solo 2 días después de la incubación.

Agar Sabouraud

Este medio de cultivo es utilizado para cultivos de mohos y levaduras patógenas y no patógenas. Utiliza la peptona, la tripteina y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol, el pH es acido, de pH 5.6±0.2, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es un agente solidificante.

Sus características:

Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogéneo, libre deslizamiento.

Medio de cultivo preparado: color ámbar claro , ligeramente opalescente sin precipitado

III. PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio 1: Identificación de hongos medio ambientales

Materiales.-

Aislamientos de hongos medio ambientales en placas de agar sabouraud.

Procedimiento.-

Observación macroscópica

1. Observar el típico desarrollo de hongos en medio de cultivo. Cada una de

las masas de forma definida que puede observar constituye una colonia.

2. Contra el número total de colonias que aparecen en cada placa. Se asume

que cada colonia desarrollada proviene de una espora captada del aire.

3. Establecer los tipos morfológicos más saltantes entre las colonias

presentes. Obtenerlos de acuerdo a la observación de las características

externas en ellas (color, forma y aspecto de la colonia en el haz y envés

de la placa).

4. Determinar la frecuencia de cada tipo morfológico con respecto al número

total de colonias.

5. Describir cada tipo morfológico detallando color, forma, aspecto y

cualquier otra característica saltante que se observe.

Observación microscópica

1. Observar en el microscopio compuesto en pequeño y mediano aumento

las características de cada tipo morfológico.

2. Determinar en detalle los tipos de hifas presentes y las diferenciaciones de

hifas en estructuras nutricionales, estructuras de reproducción, de

resistencia, etc.

3. Con ayuda de un Manual de Identificación de hongos hacer una

aproximación válida para determinar los géneros aislados.

4. Elaborar con detalle los esquemas correspondientes.

Ejercicio 2: Cultivo en cámara húmeda

Materiales.-

Placas Petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.

Agua destilada estéril.

Dispositivo para cultivo en cámara húmeda.

Mechero de alcohol.

Procedimiento.-

1. Utilizando una aguja de kölle o estilete, picas una colonia y extraer una

fracción mínima de esporas o micelio.

2. En forma aséptica depositar la fracción sobre la porción de agar dispuesta

en el portaobjetos de la cámara húmeda.

3. Con ayuda de una pinza estéril cubrir cuidadosamente la preparación con

la lámina cubre objetos.

4. Humedecer el papel filtro de la placa con agua destilada estéril.

5. Incubar la placa a temperatura ambiente (20 - 25 °C).

6. Examinar diariamente al microscopio de lámina sembrada hasta verificar el

completo desarrollo del hongo. Retirar cada vez la lámina del cultivo de la

cámara húmeda y una vez realizada la observación devolverla a su lugar

cuidando de mantener la humedad constante, de ser necesario añadir más

agua al sistema.

7. Observar la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificaciones del

micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras

de reproducción.

8. Con ayuda de un Manual de Identificación de hongos determinar el género

correspondiente.

9. Elaborar en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.

IV. OBSERVACIONES y RESULTADOS

IV.1Identificación de hongos medio ambientales

IV.1.1 Observación macroscópica:

PLACA 1:

Lugar de exposición: Dormitorio

Tiempo de exposición: 15 minutos

Tiempo de incubación: 7 días

Tipos morfológicos de las colonias presentes y sus característicasNúmero total 5 coloniasColor Turquesa Verde petróleo Marrón amarillentoFrecuencia 2 2 1Forma Circular Circular CircularAspecto Aterciopelado Aterciopelado Algodonoso

PLACA 2:

Lugar de exposición: Cocina

Tiempo de exposición: 15 minutos

Tiempo de incubación: 7 días

Tipos morfológicos de las colonias presentes y sus característicasNúmero total 45 coloniasColor Verde petróleo CremaFrecuencia 2 43Aspecto Aterciopelado AgamuzadoForma Circular Circular

IV.1.2 Observación microscópica

PLACA 1División: AscomicetoGénero: Penicillium spTipo de hifas: SeptadasTipo funcional: ConidióforoTipo de estadío: ConidiasG.A.: 400X

PLACA 1División: AscomicetoGénero: Aspergillus spTipo de hifas: AceptadasTipo funcional: ConidióforoTipo de estadío: Conidias

G.A.: 400X

PLACA 2División: AscomicetoGénero: Cladosporium spTipo de hifas: SeptadasTipo funcional: ConidióforoTipo de estadío: ConidiasG.A.: 400X

IV.2Cultivo en cámara húmeda

Día 04 de octubre:

a) Penicillium sp

Vista de 100X

Vista de 400X

b) Cladosporium sp

Vista de 100X

Vista de 400X

V. DISCUSIONES

V.1 Identificación de hongos medio ambientales

En la placa Petri con agar sabouraud se logró aislar hongos del medio

ambiente más comunes encontrados en lugares como la cocina y el dormitorio

de la casa, como se muestra en la figura 1.

Para cada cepa identificada, se muestran características macroscópicas,

microscópicas y el género.

V.1.1 Penicillium sp

a) Características macroscópicas:

Las colonias presentaron color turquesa, algo

aterciopelado y forma circular. Reverso incoloro a amarillo,

pequeñas gotas incoloras.

b) Características microscópicas:

Con conidios ramificados, terminantes en fiálides. Presenta

conidióforos de tipo terverticilado.

Figura1.cosmopolitas.

a. b.

V.1.2 Aspergillus sp

a) Características macroscópicas

Las colonias se observaron de color marrón amarillento,

de aspecto algodonoso y forma circular.

b) Características microscópicas

Conidióforos cortos, de paredes lisas con cabezas

conidiales columnares. Fiálides aglomeradas, conidios

globosos a subglobosos.

V.1.3 Cladosporium sp

a) Características macroscópicas

Las colonias presentaron color verde petróleo,

aterciopeladas y de forma circular, en el centro presenta

una elevación.

b) Características microscópicas

Conidióforos anchos y poco ramificados. Poseen

ramoconidios con septos. Los conidios tienen pared

verrugosa.

Figura 2. Penicillium sp. 2a. Penicillium sp macroscópicamente. 2b. Penicillium sp microscópicamente.

Figura 3. Aspergillus sp.3a. Aspergillus sp macroscópicamente. 3b. Aspergillus sp microscópicamente. 400X.

a. b.

a. b.

Se observaron muestras de diferentes géneros que a simple vista parecían

iguales y otras nos, como se muestra en la figura 1; sin embargo, al microscopio

éstas mostraban diferencias por lo que siempre es necesario un estudio

detallado al microscopio. De necesitarse una clasificación evolutiva o taxonómica

se requeriría de métodos de genética como la de secuenciación de bases.

En la figura 2 se puede observar a colonias de hongos más comunes que

pudimos identificar, estas son del genero de Penicillium sp, según Soriano

(2007) esta especie es muy común en suelo, en vegetación en descomposición

y aire. Además suele ser considerada como una de las principales especies

causantes del biodeterioro de alimentos y otro tipo de sustratos.

Se pudo observar que en ambas placas Petri crecieron hongos del género

Cladosporium sp, por lo tanto se puede considerar esta especie como

cosmopolita, al igual que la otra especie muy común Aspergillus sp.

V.2 Cultivo en cámara húmeda

El primer día de cultivo se pudo observar poco crecimiento, muy pocas hifas.

En el segundo día ya se veía un aumento de hifas en el caso del Cladosporium

estas eran septadas.

Según Forbes y col. (2007) la velocidad de crecimiento de los hongos es

importante para su identificación, pero este puede variar según la cantidad de

inoculo presente en la muestra, así que es necesario utilizarla junto con otras

características.

De acuerdo con estudios realizados en Norteamérica y Europa, las esporas de

Cladosporium están circulando en el ambiente todo el año. Sin embargo, la

concentración o la población es extremadamente baja durante el invierno. El

crecimiento de las especies de Cladosporium son diferentes dentro de las

casas y otros edificios depende de la concentración de los ambientes externos.

Figura 4. Cladosporium sp. 4a. Cladosporium sp macroscópicamente. 4b. Cladosporium sp microscópicamente

La concentración también puede estar influenciada por las fuentes interiores

del crecimiento.

VI. CONCLUSIONES

Se logró demostrar que los hongos son organismos cosmopolitas ya que el

muestreo se dio en diferentes lugares a diferentes horas y las colonias

presentadas en las placas mostraban repeticiones de las mismas que al

microscopio se reconocía que pertenecían al mismo género. El caso más

frecuente fue Cladosporium sp. el cual presentaba coloración verde

petróleo y Aspergillus sp que presenta color marrón amarillento.

Se demostró que la clasificación de hongos se basa en la observación de

hifas, si estas son septadas o aseptadas; si presenta conidios o

esporangios, la forma y el tamaño de estos; etc. Además si presenta

esporangios, observar alguna zona que presente rizoide o no.

Se determinó que en el crecimiento vegetativo hay ausencia de órganos

reproductivos, y al pasar los días el hongo presentará hifas vegetativas

indiferenciadas en los extremos

VII. BIBLIOGRAFIA

BONIFAZ, A. 1991. Micología médica básica. Editorial Méndez. 2a edición.

México D.F.

FORBES, B., Sahm W. 2007. Diagnostico microbiológico. Editorial Médica

Panamericana. 12a edición .España.

GRANDA, E. M. 2011. Pontificia Universidad Católica del Ecuador-PUCE,

Evaluación del efecto de la presencia de hongos en la calidad del aire

como causa del síndrome enfermo en las edificaciones antiguas de la

PUCE. Ecuador. p 34-37. Consultado 8 de octubre del 2013. Disponible en

http://www.puce.edu.ec/documentos/Investigacion/2011/PUCE-

Investigacion-2011-BIO-Hongos-Calidad-del-aire-PUCE.pdf

SORIANO, J. M. 2007. Micotoxinas en alimentos. Ediciones Díaz de

Santos. España.

Los mohos en el medio ambiente 2003, Department of Health and Human

Services (en línea), EEUU, consultado 8 jun. 2013. Disponible en

http://www.cdc.gov/mold/es/pdfs/faqs.pdf

VIII. CUESTIONARIO

VIII.1 De la observación de hongos del medio ambiente

1. Haga una descripción morfológica de 5 géneros de hongos del medio

ambiente considerando las características de desarrollo en medio de

cultivo y las características observadas al microscopio.

Aspergillus: Presentan conidióforo corto, liso, vesícula con fiálides,

uniseriada, ocupando 2/3 de la vesícula. Los conidios en cadenas forman

una compacta columna sobre la vesícula, son de color verde, finamente

rugosos, globosos o subglobosos. La textura de las colonias es

aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o

beis. El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete

días a un verde azulado por la producción de conidias. El reverso de la

colonia es incoloro.

Fusarium: El color de las colonias es blanco, crema, pardo claro o pardo

rojizo mezcladas con zonas de color púrpura; raramente en cepas de

aislamientos clínicos pueden presentar masas mucosas verdes azuladas,

formadas por macroconidias que nacen de esporodoquios. La textura es

algodonosa o lanosa.

Se caracteriza por presentar conidióforos de esporodoquios cortos,

ramificados. Conidióforos de hifas aéreas generalmente no ramificados,

muy largos, reducidos a una simple fiálide más o menos cilíndrica, en cuyo

ápice se puede encontrar un conidio no desprendido. Macroconidias en

masas mucosas, hialinos, mayormente con tres septos, ligeramente

curvados, fusiformes, pero con extremos más o menos redondeados.

Mucor: El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo

cambia a marrón. El reverso de la colonia es blanquecino. La textura es

algodonosa. Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por

presentar esporangióforos, esporangios. Carecen de apófisis, estolón y

rizoides. Las columnillas son hialinas, siendo visibles si el esporangio se

encuentra intacto. Los esporangios son esféricos o redondos y de color

gris a negro, estando llenos de esporas.

Rhizopus: Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas.

El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los

esporangióforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm,

generalmente están en grupos, formando verticilos en cuya base se sitúan

los rizoides. Las apófisis pueden estar presentes pero son poco evidentes.

Presentan esporangios esféricos, los cuales son de color gris pardusco a

negro. La columnilla es subesférica. Las esporangiosporas son angulares

y con estrías longitudinales, grisáceas, subesféricas o elipsoidales.

Penicillium: Este género se caracteriza por formar conidios en una

estructura ramificada semejante a un pincel que termina en células

conidiógenas llamadas fiálides. En la figura 5.1 se esquematizan los tipos

de conidióforos del género Penicillium, cuyas ramificaciones se ubican

formando verticilos. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es

monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas,

rámulas, métulas y fiálides. Los conidios generados en fiálides suelen

llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la fiálide, al dividirse el

núcleo, se extiende simultáneamente el extremo apical que luego se

estrangula separando a la espora recién formada. Se llama conectivo a la

porción de pared que une entre sí a los conidios permitiendo la formación

de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el

microscopio óptico. Las colonias de Penicillium son circulares si no hay

impedimento alguno para su crecimiento, con un borde neto muchas veces

sin fructificación y mostrando el color del micelio. Éste es generalmente

blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, púrpura o pardo

claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios

formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con

pequeños haces (fascículos) de conidióforos. En unos pocos casos los

haces miden varios milímetros (coremios) con el extremo constituido por

las cadenas de esporas.

2. Los nombres genéricos de muchos hongos son derivados de

características morfológicas. ¿De cuáles derivarán los nombres de

Penicillium, Aspergillus y Rhizopus?

El primero deriva de “penicillius”, que significa “pincel” en latín, ya que la

estructura fructífera asume esta forma. El segundo fue dado por el

sacerdote y biólogo italiano Pier Antonio Micheli, quien al ver la estructura

reproductiva del hongo le pareció un hisopo de los usados para salpicar

agua bendita. Estos, en latín, se llaman “aspergillus”, sustantivo que

proviene del verbo latino “spargere”, que significa “esparcir, salpicar”. El

tercero se llama así ya que en griego “ρήιζω” es “raíz”, en referencia a las

“raíces” de este hongo.

3. ¿Por qué razón algunas de las colonias aisladas del medio ambiente

no desarrollan esporas en el medio de cultivo utilizado?

Porque el agar muchas veces satisface las necesidades nutritivas del

hongo, por lo que este se extiende de manera vegetativa. Este

comportamiento se puede entender considerando que la producción de

esporas es un proceso altamente energético y de dispersión, por lo que

mientras haya nutrientes necesarios y suficientes, se priorizará el

crecimiento vegetativo.

VIII.2 Cultivo en cámara húmeda

1. ¿Cuál es la ventaja del empleo de la cámara húmeda en el cultivo de

hongos?

Permite aislar pequeñas cantidades de hongos para separarlos y proceder

a su identificación a través de la observación de las estructuras

vegetativas, que al ser pocas son más fáciles de observar; a la vez que se

exigió el crecimiento de cuerpos fructíferos y las estructuras reproductivas

se observaron con mayor claridad.

2. ¿Existen diferencias entre los hongos a nivel de crecimiento y

diferenciación del micelio?

Sí, ya que no solo se distinguen entre especies, si no que entre grupos se

puede observar diferente tipo de colonización. Los basidiomicetos

desarrollan la mayor complejidad al formar estructuras erguidas y

altamente especializadas. Dependiendo de la estructura del micelio, se

puede asignar el espécimen a un orden taxonómico.