Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

Contenido2.1.1.Medio Slido De Mantencin (Pgy- Agar)42.1.4.Nutrientes Para El Medio De Fermentacin:52.1.5.Sales Para El Medio De Fermentacin : por bibliografa6

I. OBJETIVOS:1.1 OBJETIVOS GENERALES: Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces, empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124, evalundose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de etanol.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS: Disear y preparar el medio liquido de cultivo. Lograr la activacin celular y desarrollo del inoculo Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono Determinar la cintica de generacin de etanol Determinacin del M, qs y los rendimientos del nutriente limitante en clulas y en etanol, adems de las respectivas productividades en clulas y etanol. Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.

II. METODOLOGA EXPERIMENTAL:

2.1. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso.Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis NRRL Y-7124.

Para el Diseo del medio de cultivo:

MacronutrientesC, N, Mg, K y P

Micronutrientes:Zn, Ca, Fe, Cu, Co y Mn

EstadoMedio lquido

Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de cultivo mnimo.

Fuente de carbono y energa (45%): xilosa y glucosa Fuente de N- 9%: Sulfato de amonio Fuente de Mg 0.4% y S 0,25% : Sulfato de magnesio heptahidratado Fuente de K 0.5%: Fosfato dicido de Potasio Fuente de P 2.0%: Fosfato dicido de Potasio

Condiciones de cultivo:

Temperatura: 30C Velocidad de agitacin(Shaker): 120 rpm

2.1.1. Medio Slido De Mantencin (Pgy- Agar)TABLA 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)

NutrienteConcentracin (g/L)Peso (g)

Extracto de levadura30.15

Peptona de casena50.25

Agar201

Extracto de malta30.15

2.1.2. Medio Activacin:

TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de activacin (30 mL y 20mL)

NutrienteConcentracin (g/l)Peso (g)20mlPeso (g)30ml

xilosa50.10.15

Extracto de levadura30.060.09

Extracto de malta50.10.15

Solucin de sales5 ml/L0.1ml0.15ml

T: 30C, N: 120 rpm, la solucin de sales no se agreg por existir precipitacin en el matraz de 500ml

2.1.3. Medio De Fermentacin

Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz. Para una concentracin final: 2 g/l.

TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de fermentacin (200 ml)

NutrienteConcentracin (g/L)Peso (g)200ml

Glucosa0.20.04

Xilosa4.6620.9324

Extracto de levadura30.6

(NH4)2SO430.6

KH2PO420.4

MgSO4-7H2O1.10.22

Tampn citrato20ml

Ajustar pH 4.5

T 30C, N 120 rpm

2.1.4. Nutrientes Para El Medio De Fermentacin: TABLA 04: CALCULODE Nutrientes para el medio de fermentacin (200 ml)ElementoNutrienteP.M.% en% en NutrienteYx/s SoS'o

Clula(g/g) (g/l)(g/l)

CC6H12O618046.57400.85892212.3314.662

N(NH4)2SO41329.2421.212.30.781.57

S(NH4)2SO41320.5524.2444.070.040.08

KKH2PO41362.7528.6810.430.170.35

PKH2PO41362.522.789.110.20.4

Mg(MgSO4.7H2O)2460.39.8732.90.050.11

S(MgSO4.7H2O)2460.5512.9923.620.080.15

Nutriente Limitante: Xilosa

2.1.5. Sales Para El Medio De Fermentacin : por bibliografaTABLA 05: Concentracin de sales para el medio de fermentacionNutrienteConcentracin (g/l)

CaCl2.2H2O2.9

ZnSO4.7H2O0.4

FeSO4.7H2O6.42

CuSO4.5H2O0.25

CoCl2.6H2O0.24

MgSO4.7H2O2.2

HCl0.06

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:3.1. PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE MANTENCINa. Materiales y Equipos:I. Balanza analtica: Las balanzas analticas modernas, que pueden ofrecer valores de precisin de lectura de 0,1 micras a 0,1 mg, estn bastante desarrolladas de manera que no es necesaria la utilizacin de cuartos especiales para la medida del peso.

Lo utilizaremos: En este caso pesaremos todos los compuestos para el medio as que tiene que ser con mucho cuidado.

II. Matraz Erlenmeyer: Es ms seguro que un vaso de precipitado, ya que la estructura del matraz evita perdidas de la sustancia o solucin contenida (agitacin o evaporacin).Es ideal para agitar soluciones. Se puede tapar fcilmente utilizando algodn o tapa.Lo utilizaremos: Este se llena primeramente con agua para diluir todos los componentes pesados.

III. Mechero Bunsen: Se utiliza para calentar, fundir o evaporar sustancias. La llama del mechero que arde correctamente es transparente y tiene un matiz azulado.

Lo utilizamos: Aqu se calienta la mezcla del matraz agitando con la varilla de vidrio y hasta la aparicin de la primera burbuja.

IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII.

Esptula, pipeta: Objetos de ayuda al pesar y medir volmenes respectivamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeo tubo de vidrio con una abertura en la zona superior, y en la zona inferior es cerrado y cncavo. Esta hecho de un vidrio especial que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo los cambios de temperatura muy radicales pueden provocar el rompimiento de tubo (Pyrex)Lo utilizaremos: A estos tubos se le adiciona 6-7 ml de la mezcla e inmediatamente se tapa.

XIII. XIV. XV. XVI. XVII. XVIII. XIX. XX. XXI. XXII. XXIII. XXIV. XXV. Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos 20 cm de longitud que se utilizan para agitar las disoluciones ayudando a que los slidos se disuelvan en los disolventes ms rpidamente.Lo utilizaremos: nos ayuda al calentar la mezcla en el mechero.

Agua destiladaGlucosa

XXVI. XXVII. XXVIII. XXIX.

Algodn, gasa y capachitos de aluminioOlla a presin: Se introducen los tubos y se afloja las tapas para el intercambio de gases

b. Reactivos y nutrientes:Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124: es una levadura fermentadora de hexosas y pentosas que presenta un rendimiento de etanol de 0.4 gg-1, sin produccin de xilitol.Este cultivo a trabajar nos da referencia para el medio cultivo.

Extracto de levadura: Es un excelenteestimulador del crecimiento de bacterias, esutilizadoen la preparacin demedios de cultivo microbiolgicos. Extracto de Levaduraes la partesoluble en agua deautolisislevadura quees cuidadosamente controladapara preservar laforma naturaldel complejo B.

Extracto de maltaPeptona

3.2. PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:a. Materiales y Equipos:

2 matracesBalanza analtica

Mechero BunsenUna probeta de 100 ml

Varilla de vidrio, pipeta y esptula

XXX. Estufa: La estufa de secado es un equipo que se utiliza para secar y esterilizar recipientes de vidrio y metal en el laboratorio. Se identifica tambin con el nombre Horno de secado.

Agitador orbital- Shaker: Unagitador, a veces llamadomezclador, es un dispositivo que se utiliza en los laboratorios de qumica y biologa para mezclar lquidos o preparardisolucionesysuspensiones

PH metro: es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico para medir elpHde una disolucin. La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina membranadevidrioque separa dossolucionescon diferente concentracin deprotones.

b. Reactivos y nutrientes:Extracto de levadura: Es un excelenteestimulador del crecimiento de bacterias, esutilizadoen la preparacin demedios de cultivo microbiolgicos.

Glucosa: es un azcar que est presente de manera natural en elementos tales como las frutas o la miel. Las frutas tambin poseen otro tipo de azcar natural que se conoce como fructosa.

Solucin de sales

Extracto de malta: Debido a su especial sabor, color y agradable aroma, el extracto de malta se usa ampliamente en la industria alimentaria con el fin de mejorar las propiedades organolpticas, valor nutricional, textura y vida til de los productos.

Alcohol

Agua destilada

3.3. PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:a. Materiales y Equipos:

Matraz 1L.2 matraces de 125 ml

Balanza analticaVarilla de vidrio

Gasa, capachitos y algodn. pH metro

b. Reactivos y nutrientes:Sacarosa: es el trmino apropiado para describir el azcar comn. Dos azcares simples, glucosa y fructosa, se combinan para formar el hidrato de carbono complejo conocido como sacarosa. La sacarosa es fina, incolora, inodora y tiene un sabor dulce. La sacarosa da un impulso de energa rpida para el cuerpo. Es fermentable y absorbe humedad.

Agua destiladaExtracto de levadura

(NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En bioqumica, la precipitacin del sulfato de amonio es un mtodo comn para purificar las protenas al lado de precipitacin selectiva; El sulfato de amonio es extremadamente soluble en agua y as que puede hacer las soluciones muy concentradas que pueden salar hacia fuera las protenas, causando su precipitacin en las concentraciones particulares.

KH2PO4 = fosfato de potasio: Alcohol

Solucin de salesMgSO4.7H2O

c. Equipos

EQUIPODESCRIPCIN

BALANZA ANALTICA

Marca: Adventurer

Unabalanza analticaes una clase debalanzade laboratorio diseada para medir pequeas masas, en un principio de un rango menor del miligramo (y que hoy da, las digitales, llegan hasta la diezmilsima de gramo: 0,00001 g o 0,01 mg).

CENTRFUGA

Marca: P-Selecta

Unacentrifugadoraes unamquinaque pone enrotacinunamuestrapara (porfuerza centrfuga) acelerarladecantacin o lasedimentacinde sus componentes o fases (generalmente una slida y una lquida), segn sudensidad. Es muy usada en laboratorios de control de calidad y en fbricas que elaboranzumosa base dectricos, para controlar el nivel depulpafina, mediante separacin del zumo exprimido.

ESPECTROFOTMETRO

Marca: SigmaModelo: 2-16PKUnespectrofotmetroes un instrumento usado en elanlisis qumicoque sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces deradiacionesy laconcentracino reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para lacuantificacindesustanciasymicroorganismos.

PHMETRO

Marca: Inolab

ElpH-metroes un sensor utilizado en el mtodo electroqumico para medir elpHde unadisolucin. La determinacin de pH consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una finamembranadevidrioque separa dossolucionescon diferente concentracin deprotones. En consecuencia se conoce muy bien la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio delante el pH. Una celda para la medida de pH consiste en un par deelectrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin de la que queremos medir el pH.

AGITADOR MAGNTICO

Marca: ThermolyneModelo: Maxi-mix II

Unagitador magnticoconsiste de una pequea barra magntica (llamada barra de agitacin) la cual est normalmente cubierta por una capa de plstico (usualmenteTefln) y una placa debajo de la cual se tiene una magneto rotatoria o una serie de electromagnetos dispuestos en forma circular a fin de crear un campo magntico rotatorio. Es muy frecuente que tal placa tenga un arreglo de resistencias elctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario para calentar algunas soluciones qumicas.

Fermentador:Marca: SartoriustedinCapacidad: 2 litrosPartes: software, CPU, reactor.

Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biolgicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso qumico que involucra organismos o sustancias bioqumicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aerbico o anaerbio. Estos biorreactores son comnmente cilndricos, variando en tamao desde algunos mililitros hasta metros cbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser tambin un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer clulas o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniera de tejidos.

Shaker: El agitador orbital modelo SAROTIUS STEDIM est diseado para usos generales en laboratorios de anlisis clnicos, industriales, de fsica, qumica y en todo tipo de ensayos que requieran agitar, mezclar, disolver casi todo tipo de lquidos y soluciones con distinto grado de viscosidad. Estn diseados ergonmicamente para ser funcionales y confiables ahora y en el futuro. Su sistema microprocesado, permite un control exacto de la velocidad de giro, independiente de la carga, puesto que supervisa constantemente la velocidad corrigiendo automticamente cualquier variacin de la misma. Posee adems un timer que permite controlar con precisin en el tiempo de la experiencia a realizar. El dispositivo mecnico de agitacin est formado por una base amplia, metlica, con fuertes nervaduras, y una plataforma mvil.

OLLA A PRESIN (AUTOCLAVE)La olla a presin es un recipiente hermtico para cocinar que no permite la salida de aire o lquido por debajo de una presin establecida. Debido a que el punto de ebullicin del agua aumenta cuando se incrementa la presin, la presin dentro de la olla permite subir la temperatura de ebullicin por encima de 100 C . La temperatura ms alta hace que los alimentos se cocinen ms rpidamente llegando a dividirse los tiempos de coccin tradicionales por tres o cuatro. Por ejemplo, un repollo se cocina en un minuto, los porotos verdes en cinco, las papas pequeas y medianas (hasta 200g) pueden tardar unos cinco minutos y un pollo completo no ms de veinticinco. Generalmente, se utiliza para conseguir en un corto periodo de tiempo los mismos efectos de la coccin a fuego lento. AUTOCLAVEUna autoclave es un recipiente de presin metlico de paredes gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a alta presin para realizar una reaccin industrial, una coccin o una esterilizacin con vapor de agua. Su construccin debe ser tal que resista la presin y temperatura desarrollada en su interior. La presin elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 C. La accin conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulacin de las protenas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproduccin de stos, hecho que lleva a su destruccin.

REFRIGERADORA DOMESTICAMARCA: PHILLIPSDESCRIPCION: La funcin de una mquina de refrigeracin es tomar el calor de un ambiente a baja temperatura (en este caso un armario cerrado y aislado trmicamente) y cederlo en el ambiente exterior (para el refrigerador domstico sera la cocina), empleando una fuente de energa externa para mantener el proceso. Un refrigerador es una bomba de calor (como las de agua, bombea calor de un lugar a bajo nivel trmico a otro de mayor nivel), impulsada generalmente por un motor elctrico. Es asimismo posible emplear sales eutcticas o absorcin. ESTUFA ELECTRICA:MARCA: P-SELECTAMODELO: 209DESCRIPCION: Equipo de 75 litros de capacidad, con una cavidad de 500 x 400 x 400 mm, que permite el secado de muestras en un rango de temperatura til comprendido entre 0 y 200 C.La estufa de secado se emplea para esterilizar o secar el material de vidrio y metal utilizado en los exmenes o pruebas, que realiza el laboratorio y que proviene de la seccin de lavado, donde se enva luego de ser usado en algn procedimiento. La esterilizacin que se efecta en la estufa se denomina de calor seco y se realiza a 180 C durante 2 horas; la cristalera, al ser calentada por aire a alta temperatura, absorbe la humedad y elimina la posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biolgica debido a las elevadas temperaturas y a los tiempos utilizados. INCUBADORA ELECTRICAMARCA: P-SELECTAMODELO: 206DESCRIPCION: una incubadora es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiolgicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado ptimo, tales como el contenido de dixido de carbono (CO2) y de oxgeno en su atmsfera interior. Las incubadoras son esenciales para una gran cantidad de trabajos experimentales en biologa celular, la microbiologa y en biologa molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto bacterianos como de clulas eucariotas.

CUADRO DE RESUMEN: MATERIALES A UTILIZAR

InstrumentosMANTENCIONACTIVACIONFERMENTACION

Asa bacteriolgicax

Matracesxxx

Tubos de ensayoxx

Mecheroxx

Rejilla de asbestox

Trpodexx

Pipetax

Shakerxx

Refrigeradora

Estufa elctricax

Incubadora elctricax

Olla a presin (autoclave)xx

Algodnx

Gasaxx

Balanza analticaxx

pH-metroxx

Papel aluminiox

CUADRO DE RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS

MEDIONUTRIENTE

Solido de mantencin(PGY- Agar)Extracto de levadura

Peptona de casena

Agar

Extracto de malta

ActivacinExtracto de peptona

Peptona de casena

K2HPO4

Glucosa

FermentacinGlucosaXilosa

(NH4)2SO4

KH2PO4

MgSO4-7H2O

Solucin de sales

1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDAFES Y/O TAREAS:

VI) RESULTADOS:IDENTIFICACION DE AZUCARES REDUCTORES POR EL METODO DNS

a) ProcedimientoTubo de ensayoDiluir 1:8 de cada vial (0,5 muestra; 3,5 agua)

Tubo de ensayo con tapaColocamos 0,5 de la muestra; 0,5 de DNS

Tomamos lectura y graficamosPasamos a tomar muestra al espectrofotmetro a 540 nmAl minuto 13 lo colocamos al agitador magnticoDejamos reposar por 15 minutosColocamos 5ml de agua destilada para cada tuboEnfriamos por 3 minutos en hielo

Colocamos los tubos en ebullicin por 5 minutos

b) Resultados

CUADRO N6: Datos de absorbancia para curva de calibrado de biomasa con XILOSA Y GLUCOSA

Concentracin(g/L)solucin estndaragua destiladaABS, 540

20.501.274

1.60.40.11.027

1.20.30.20.789

0.80.20.30.529

0.40.10.40.238

0.20.050.450.112

000.50

FIGURA N1: Curva de calibrado de azucares reductores con fuente de carbono XILOSA Y GLUCOSA de la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 .

Y=0.6461X-0.0052

CUADRO N7: resultados de absorbancia por el mtodo DNS utilizando vialesTIEMPO(h)ABS, 540SUSTRATO(gr/L)

0.000.7979.934598114

1.580.7068.807779998

3.520.7689.575502231

5.470.7519.364997748

6.520.6948.659188598

7.680.7499.340232515

8.700.7599.464058681

FIGURA N2: Grafica de consumo de sustrato de la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando como fuente de carbono GLUCOSA y XILOSA.

CUADRO N8: Seleccin de datos parar el mtodo DNS utilizando vialesTIEMPOABS, 540S (gr/L)

0.000.7979.934598114

3.520.7689.575502231

6.520.6948.659188598

FIGURA N3: Grafica corregida del consumo de sustrato a travs del tiempo de la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando como fuente de carbono GLUCOSA y XILOSA.

Podemos notar que la concentracin del azcar a disminuido conforme pasan las horas, deduciendo as que la concentracin celular aument, por ello el metabolismo aceler y el consumo de sustrato por la levadura aumenta, este consumo lo hace principalmente para mantenimiento y para generacin de biomasa celular.

FIGURA N4: Graficas corregidas del consumo de sustrato a travs del tiempo de la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando con diferentes fuentes de carbono

De la grfica podemos observar que la curva [ ] sustrato con fuente de carbono xilosa, cae primero debido a que su concentracin de azcar disminuye ms rpido conforme pasan las horas a comparacin de las dems grficas, esto se debe a que a ms consumo ms crecimiento. Ahora se observa un decaimiento en el consumo rpido del sustrato, en las 2 primeras horas para los que trabajaron con fuente de carbono xilosa , a diferencia de la glucosa esto se debe a que el extracto de levadura prefiere a la glucosa, y con la xilosa demora ms en consumirla.

DISCUSIONES

El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentracin inicial del sustrato limitante, esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro de carencia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores que la mxima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar su estructura interna a las nuevas condiciones.

Segn Brigham, en el estado natural del microbio, cuando su fuente de nutrientes esenciales est restringida y detecta que los recursos son limitados, entra en el 'modo de almacenamiento de carbono' para su uso posterior. "Lo que hace es tomar cualquier carbono disponible, y lo almacena en forma de un polmero.

CINETICA DE BIOMASA POR PESO SECO

CUADRO N8: Datos De La Curva De Calibrado De Biomasa con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono.DilucionABS (640 nm)X (g/L)

01:010.3170.1

0.3130.12

0.3080.1

0.3120.08

01:010.31250.1

01:020.1670.05344

01:040.0790.02528

01:080.0420.01344

01:100.0360.01152

FIGURA N05: Curva De Calibrado De Biomasa con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono.

Dnde:

Y: Absorbancia 640 nmX : Biomasa g.L-1

La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes de un bioproceso ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances de masa de cualquier proceso biolgico.Los resultados obtenidos podemos decir que esta bien ya que la relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de microorganismos. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Con esto podemos decimos que nuestra grafica sali correcta ya que tiende a la ley de beer, obteniendo una ecuacin de Y=0.32X.Segn Toro (2005), la relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para diluciones de microorganismos. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones.Segn Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato nos dice: El mtodo del espectofometro aquel que nos dar una recta que contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin del parmetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de mtodos rpidos, Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibracin (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partculas.

DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL METODO ENZIMATICO

a) MATERIALES:

Viales Espectrofotmetro Pipeta Micro pipeta Viales de plstico Quit de glucosa

b) FUNDAMENTO DEL MTODO:

La enzima glucooxidasa cataliza la oxidacin de glucosa a gluconato y perxido de hidrgeno. La concentracin de glucosa es proporcional al H2O2, este puede medirse aparendolo con un indicador de peroxidasa. La determinacin de glucosa se efecta mediante el mtodo de Trinder segn las siguientes reacciones:

c) PROCEDIMIENTO:< El contenido de los viales en 1:8(0.5ml de muestra y 3.5 de agua, y colocarlo en tubos de ensayo rotulados>DILUIR

< 30 micro litros de la disolucin a cada vial de plstico >AGREGAR

< 3 ml de del reactivo dado por el mtodo >AGREGAR

COLOCAR

< Bao mara por 10 min >

< En espectrofotmetro a 505nm >LEER

d) RESULTADOS Y DISCUSIONES:Utilizando la curva de calibrado del mtodo enzimtico, reemplazamos en absorbancia para encontramos los g/L de glucosa

TABLA : Datos de concentracin de glucosa con fuente de carbono de XILOSA Y GLUCOSATIEMPOABS[ ] GLUCOSAg/l

00.000.00

1.5832.006.13

3.5160.000.00

5.4660.000.00

6.5161.103.36

7.6830.000.00

8.700

FIGURA: consumo del sustrato GLUCOSA en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA Y GLUCOSA como fuente de carbono.

TABLA : Datos de concentracin de glucosa con fuente de carbono de GLUCOSATIEMPOABS*[ ] GLUCOSA(g/L)

01.2643.87254

0.051.3284.068627

0.11.123.431372

0.151.2083.700980

0.21.2483.823529

0.25-0.68-2.08333

0.31.2083.700980

FIGURA: consumo del sustrato GLUCOSA en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono

En los resultados obtenidos de la determinacin de glucosa por el mtodo enzimtico observamos que existieron muchos error por parte de la mano de obra que ejecuto el mtodo, la curva de glucosa debera solo bajar, sin embargo en ambis casos con glucosa y xilosa y con solo glucosa sube, por lo tanto debe de hacerse mejor uso del mtodo.

2.2.1 Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa1. Materiales y equipos Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin Espectrofotmetro pH metro Gasa y algodn Centrifuga Tubos de ensayo Capachos de papel aluminio

1. Procedimiento:30ml de caldo (medio rico + biomasa) a un matraz de 1L contenido 270ml de medio definido. Una muestra de 5ml del caldo. 3ml para el tubo de espectrofotmetro y el resto se le agreg al tubo de centrifugado.5ml del medio de cultivoAbsorbancia a 640nm y pHINOCULAR EXTRAER EXTRAERSEPARAR MEDIR COMPLETARCENTRIFUGARVERTER Y GUARDARA partir de este paso se determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.El sobrenadante en viales y ponerlos en refrigeradorA la mxima velocidad por 20 minutos Con el fin de despus determinar el consumo de sustrato

Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero. La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin en el medio de fermentacin. Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera:

3ml para el tubo de espectrofotmetro y el resto se le agreg al tubo de centrifugado.5ml del medio de cultivoAbsorbancia a 640nm y pH5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.El sobrenadante en viales y ponerlos en refrigeradorA la mxima velocidad por 20 minutosEXTRAERCENTRIFUGARCOMPLETARMEDIRSEPARAR

VERTER Y GUARDAR

1. ResultadosDespus de medir la muestra (cada 2 horas) a travs del espectrofotmetro, se obtuvieron los siguientes resultados: (Grupo A3)

CINTICA CULTIVO CELULAR POR LOTESPlan de Muestreos y Registro de Datos

Da de la experiencia: 05/05/2015 Microorganismo: Pichia stipitis Fuente de carbono: Mezcla de xilosa y glucosa PH: 4.5 Temperatura: 30C N RPM: 120 rpmNHORATIEMPO (horas)Absorbancia(640 nm)

19:34 a.m.00.017

211:09 a.m.1.750.019

313:05 a.m.3.710.036

415:02 a.m.5.680.025

516:05 a.m.6.710.083

617:15 a.m.7.810.040

718:16 a.m.8.820.023

Se observa en la grfica, que en la sexta hora hubo error de calibracin de la mquina, por ello se explica el descenso en la curva de cintica. Es por ello que no se coger ese punto, para poder ubicar las fases de crecimiento microbiano.

BCAA: Fase lag o de latencia.B: Fase log o de crecimiento exponencial.C: Fase estacionaria.D: Fase de muerte celular.D

Se observa que la fase estacionaria no se presenta, debido a que no se tom la muestra en intervalos de tiempos menores, es decir, a cada hora.

1. Clculo de la Productividad Celular:Productividad Mxima Q maxEvaluada en la fase Exponencial:

Productividad Total:Evaluada en todo el crecimiento Microbiano:

1. Calculo de la velocidad mxima de crecimiento exponencial ( mx)TABLA N 06: Linealizacin de la fase exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124 de la tabla N 05t (horas)X (g/L)Ln (X/X0)

1.750.006080.111225

3.710.011520.750305

6.710.026561.585627

FIGURA 04: Linealizacin de la Fase Exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia Stipitis NRRL Y-7124.

La ecuacin lineal es: y = 0.2957 xReemplazando las variables segn las grficas:

Entonces s: mx. = 0.2957 h-1

1. Clculo del tiempo de duplicacin:

Reemplazando:

Esto es: td =2.344 horasTabla N04: Parmetros cinticos y rendimientos determinados en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando xilosa como fuente de carbono.Parmetro cintico y rendimientosValor obtenido experimentalmente

m (h-1)0.2957

td (h)2.344

Qmx x/s (g/L*h)

Xmax (g/l)0. 0.259375

1. Variacin del pH durante el crecimiento celular:Tabla N 05: Variacin del pH Respecto al Tiempo

TiempopH

14.5

7.54.557

COMPARACIN CON OTROS RESULTADOS, TENIENDO XILOSA Y GLUCOSA (POR SEPARADO) COMO FUENTE DE CARBONO

GRUPO A1: Obtencin de etanol con Pichia stipitis, utilizando Xilosa como fuente de carbono.TABLA N 05: Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124.t (horas)ABS (640 nm)X (g/L)

00.0240.0750

1.50.0310.0969

3.50.0430.1344

5.50.030.0938

6.50.0260.0813

7.50.0370.1156

FIGURA 3: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la xilosa.

FIGURA 4: Curva Corregida de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la xilosa.

C. Clculo de la Productividad Celular:Con referencia a los datos de la tabla N 05Productividad Mxima: Evaluada en la fase Exponencial:

Productividad Total:Evaluada en todo el crecimiento Microbiano:

D. Calculo de la velocidad mxima de crecimiento exponencial ( mx)TABLA N 06: Linealizacin de la fase exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124 de la tabla N 05t (horas)X (g/L)Ln (X/X0)

1.50.09690.25619

3.50.13440.58333

FIGURA 04: Linealizacin de la Fase Exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia Stipitis NRRL Y-7124.

La ecuacin lineal es: y = 2.3317 xReemplazando las variables segn las grficas:

Entonces: mx. = 2.3317 h-1E. Calculo del tiempo de duplicacin:

Reemplazando:

Esto es: td =0.2972 horasTabla N04: Parmetros cinticos y rendimientos determinados en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando xilosa como fuente de carbono.Parmetro cintico y rendimientosValor obtenido experimentalmente

m (h-1)2.3317

td (h)0.2972

Qmx x/s (g/L*h)0.01875

Xmax (g/l)0.1344

A. Variacin del pH durante el crecimiento celular:Tabla N 05: Variacin del pH Respecto al Tiempo

TiempopH

14.5

7.54.557

GRUPO A2: OBTENCIN DE ETANOL CON PICHIA STIPITIS, UTILIZANDO GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO.FIGURA 3: Curva de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.

FIGURA 4: Curva Corregida de Crecimiento Microbiano de Picchia stipitis NRRL Y-7124, utilizando como fuente de carbono a la glucosa.

A. Clculo de la Productividad Celular:Con referencia a los datos de la tabla N 05Productividad Mxima: Evaluada en la fase Exponencial:

Productividad Total:tiempo (horas)Absorbancia (640nm)X (g/L)

00.0280.00896

1.810.0380.01216

3.20.0480.01536

5.280.0330.01056

6.750.0340.01088

7.90.0320.01024

8.850.0380.01216

Evaluada en todo el crecimiento Microbiano:

B. Calculo de la velocidad mxima de crecimiento exponencial ( mx)TABLA N 06: Linealizacin de la fase exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia stipitis NRRL Y-7124 de la tabla N 05Tiempo (horas)X (g/L)Ln(X/X0)

1.810.012160.30538

3.20.015360.53899

FIGURA 04: Linealizacin de la Fase Exponencial del Crecimiento Microbiano de Pichia Stipitis NRRL Y-7124.

La ecuacin lineal es: y = 0.1685XReemplazando las variables segn las grficas:

Entonces: mx. = 0.1685 h-1C. Calculo del tiempo de duplicacin:

Reemplazando:

Esto es: td =4.1136 horasCUADRO RESUMENTABLA N10: PARAMETROS CINETICOS OBENIDOS UTILIZANDO COMO FUENTE DE CARBONO XILOSA, GLUCOSA Y MEZCLA DE XILOSA Y GLUCOSA CON PICHIS STIPITIS.PARMETROXILOSAGLUCOSAXILOSA Y GLUCOSA

m (h-1)2.33170.0023020.2957

td (h)0.29720.000361582.344

Qmx x/s (g/L*h)0.018750.1685

Xmax (g/l)0.13440.024920. 0259375

PH4.5574.5574.557

Como se observa en el cuadro resumen, la levadura Pichia stipitis presenta una mayor m utilizando xilosa como fuente de carbono, debido a que esta bacteria es afn con esta fuente de carbono, adems presenta un menor rendimiento con glucosa. Hay mayor productividad utilizando una mezcla de xilosa con glucosa como fuente de carbono, que utilizando solo xilosa o solo glucosa como fuente de carbono.

DISCUSIONESLee, Kim et.al (2000) nos dice que con la Pichia stipitis Y-7124, se obtuvo que la tasa de consumo de azcar y tasa de crecimiento especfico eran ms altos en el medio que contiene glucosa que en el medio que contiene xilosa.Las actividades especficas de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa fueron mayores en el medio con xilosa que glucosa, lo que sugiere su induccin por xilosa.Tasa de crecimiento especfico mxima y rendimiento de etanol se lograron en 30 g concentracin de xilosa / L sin formacin de subproductos tales como xylitol y cido actico mientras que una concentracin mxima de etanol se obtuvo a 130 g / L xy perder.La adicin de un inhibidor de la respiratoria, la rotenona, aumentaron la concentracin mxima de etanol en un 10% en comparacin con el experimento de control.Con el fin de evaluar el patrn de etanol inhibicin en la tasa de crecimiento especfico, se aplic un modelo cintico basado en las ecuaciones de Luong.

Las concentraciones de etanol fueron tan bajo como 3 g / L para ambos casos, lo que podra atribuirse a aero-condiciones de cultivo bic causadas por alta agitacin velocidad.Un rendimiento de etanol terico en condiciones microaerbica es idntico para la glucosa y xilosa, 0,51 g etanol / g de glucosa o xilosa [14].Pareca queP.stipitis no tiene ningn efecto Crabtree que provoca la formacin de etanol como enS.cerevisiaebajo condiciones de cultivo aerbicas.En el caso de una mezcla de glucosa y xilosa, glucosa fue utilizado por primera vez porP.stipitis(Fig. 2).Despus de de- glucosa terminacin, xilosa se consuma con muy baja etanol rendimiento basado en xilosa.La glucosa pareca inhibir la xilosa utilizacin porP.stipitis.Las actividades especficas de XR y se midieron XDH esencial para la utilizacin de xilosa en tanto la glucosa como la xilosa medios de comunicacin (Fig. 3).Como se muestra enFig.3, las actividades especficas de XR y XDH eran muy bajo en el medio de glucosa, mientras que mucho mayor en el medio xilosa.La relacin entre la concentracin de etanol y tasa de crecimiento especfico era hiperblica para glucosa y parablica para xilosa.Una concentracin de etanol mxima a la que las clulas no lo hicieron crecer era 33,6 g / L para la glucosa y 44.7 g / L de xilosa.

PRODUCCION DE ETANOL

A. PROCEDIMIENTOEXTRAER

FILTRARLLEVAR AL VIALMEDIR

Se elabor una curva de calibrado para el etanol.

Figura. Representacin de una curva de calibrado de etanol, donde se muestra el rea vs la concentracin de etanol.De la curva de calibrado se obtuvieron los siguientes datos.Y =aX + b

a =6.872274e-006

b =-0.3801215

R2=0.9981825

R =0.9990908

Despus de obtener el tiempo de retencin para el etanol que es de 4.7 aproximadamente; se pas a determinar los tiempos de retencin en las muestras mediante la lectura del CG.B. RESULTADOS

Las grficas que a continuacin se presentan son las obtenidas para las muestras del grupo A. En el eje de las abscisas est el tiempo en minutos.

Figura. Lectura en el CG para la muestra 2 del grupo A-1.

Figura. Lectura en el CG para la muestra 4 del grupo A-2.

Figura. Lectura en el CG para la muestra 4 del grupo A-3.

Como se observa en las grficas de las figuras, no hay presencia de etanol. Esto seguramente pas porque la pequea cantidad de etanol que se encontraba en la muestra se pudo haber evaporado. Esta evaporacin se pudo haber dado por que los viales no se cerraron correctamente, adems que la congelacin no fue la adecuada. Otra causa es que la levadura no logr producir la cantidad de etanol que se esperaba. Para poder decir que haba presencia de etanol en las muestras, el tiempo de retencin debio ser aproximadamente de 4.7 minutos; pero como se puede ver en las grficas, el pico mximo se da casi en el minuto 7. Con esto se concluye que hubo otro reactivo en la muestra pero no fue etanol. Segn bibliografa, el tiempo de retencin obtenido podra ser para acetona o isopropanol.

CINETICA DE BIOMASA Y CONSUMO DE SUSTRATO

FIGURA 05: Cintica de Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono.

Al inicio de la fermentacin los azcares se espera que sean altos ya que la bacteria an no consume el sustrato y el metabolismo es lento. En las horas siguientes, el metabolismo se acelera y el consumo de sustrato por la bacteria aumenta, este consumo lo hace principalmente para mantenimiento y para generacin de biomasa celular.

En la presente grafica se puede observar la relacin que existes entre el crecimiento microbiano y el consumo de sustrato podemos observar que el microorganismo cuando consume ms rpido el sustrato ah se da el crecimiento exponencial.El crecimiento exponencial depende parcialmente de la concentracin inicial del sustrato limitante, esto implica que el cultivo pasa de un estado en el cual crece con exceso de sustrato a otro de carencia de sustrato, de manera que los periodos a velocidades menores que la mxima no son suficientemente largos para permitir al organismo ajustar su estructura interna a las nuevas condiciones.FIGURA 05: Cintica de Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA Y GLUCOSA como fuente de carbono.

Ahora se observa un decaimiento en el consumo rpido del sustrato, en casi las 6 primeras horas, ahora pero se observa que el microorganismo sigue creciendo, esto se debe al extracto de levadura, una fuente rica en aminocidos, vitaminas, minerales. Asimismo, vemos que se llevara a cabo a la produccin de etanol la que tambin sirve de medio para esta levadura para producir otros cidos, en otro proceso fermentativo. Pero lamentablemente esto no pudo obtener ya que quizs el mtodo empleado los componentes voltiles de las clulas pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta.La levadura Pichia Stipitis fermenta directamente la xilosa a etanol requiriendo para ello un nivel de oxigenacin muy bajo pero a su vez sumamente bien controlado para la produccin optima de este alcohol, pero otra parte una fraccin considerable del substrato de xilosa es convertido en xilitol.Podemos dar otro motivo por el cual no se obtuvo etanol, ya que se requiere una mnima tasa de oxigeno lo cual no se dio, ya que por falta de experiencia dejamos entrar oxgeno a los caldos que tenamos.

FIGURA 05: Cintica de Crecimiento de biomasa y consumo de sustrato la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de carbono.

Haciendo una breve comparacin con otro experimento realizado (Ethanol production from xylose by Pichia stipitis NRRL Y-7124 in a stirred tank bioreactor)Durante los experimentos, el nivel de oxgeno disuelto en el medio fue de cero para todos los niveles de oxigenacin, posiblemente indicando que todo el oxgeno suministrado se consume rpidamente por la levadura. Los perfiles de fermentacin para el consumo de los azcares, el crecimiento celular, y la produccin de etanol se muestran en laFigura 1.P.stipitisera capaz de consumir glucosa y xilosa azcares en todas las pistas de fermentacin;sin embargo, no se observ consumo de arabinosa durante el tiempo de fermentacin considerado.En todos los ensayos, la glucosa se consume en los iniciales 12 h de fermentacin, excepto en el plazo de ms bajo coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (ensayo 1), en la que el consumo de sustrato era ms lenta que en las otras carreras, lo que requiere alrededor de 24 h para el total consumo de este hexosa.Xilosa tambin se consuma lentamente en este ensayo (consumo de 65% al final de la fermentacin).

Fuente: www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010466322011000100016Comparacin de la concentracin de oxgeno en Influencia de la concentracin de oxgeno en la produccin de etanol a partir de la fermentacin de mezclas D-glucosa/D-xilosa e hidrolizados de aserrn de Curupa por Pichia stipitis CBS 5773Influencia de la concentracin de oxgeno.La produccin de biomasa deP. stipitisCBS 5773 fue estudiada bajo la influencia de la concentracin de oxgeno. En la Figura 4 se puede observar que la mxima concentracin de biomasa fue producida en condiciones aerobias durante un periodo de 48 horas en un sustrato compuesto por glucosa y xilosa con una proporcin (1:19) g/L. En condiciones aerobias la produccin de biomasa celular fue de 8.81 g/L y la mxima velocidad de crecimiento en estas condiciones fue de 0.27 h-1a las 10 horas de fermentacin. En condiciones microaerobias la biomasa celular despus de 48 horas fue de 7.65 g/L y la mxima velocidad de crecimiento en estas condiciones fue de 0.23 h-1a las 10 horas de fermentacin (Figura 4)

Aireacin: Es un factor muy importante, ya que contribuye considerablemente al adecuado crecimiento de los microorganismos. El oxgeno es especialmente necesario cuando se lleva a cabo una fermentacin por lotes con altos niveles de azcares que requieran un crecimiento prolongado de la levadura, o en procesos continuos, ya que la levadura es incapaz de crecer por ms de cuatro o cinco generaciones en condiciones totalmente anaerbicas (Kosaric et al, 1987, 603). Para ello, es necesario disponer de un sistema adecuado de agitacin, de tal forma que haya un contacto permanente entre las clulas y el sustrato nutritivo; asimismo, es importante desalojar el dixido de carbono que se va produciendo, ya que en concentraciones relativamente pequeas inhibe el crecimiento celular.

ANALISIS DE Ph DURANTE LA FERMENTACION

pHTiempo h.

4.51

4.5577.5

La variacin del pH fue debido a la produccin de metabolitos producto de la fermentacin la cual estuvo en mayor concentracin que los iones H+ que se libera al consumir el cloruro de amonio, lo cual implica que en vez que el pH baje este tienda a subir y se vuelva casi un pH neutro. Las levaduras crecen bien en medios con el pH ajustado entre 3.5 y 3.8, el grado de tolerancia a los cidos vara segn la cepa y la especie, desde pH 2.2 a 8.0. (Pelczar J. Michael, 1982)En los medios de cultivo, los nitritos forman a pH inferior a 6 acido nitroso que es toxico para las clulas. La mayor parte de los aminocidos pueden ser utilizados como fuente de nitrgeno. Sin embargo, segn los aminocidos, la tasa de crecimiento de la levadura vara. Las mezclas de aminocidos permiten un mejor crecimiento que un solo aminocido. Si estn disponibles simultneamente varias fuentes de nitrgeno estas no van hacer utilizadas a la misma velocidad sino que la levadura va a consumir preferencialmente la mejor. (COOPER 1982) define una buena fuente de nitrgeno por tres criterios: penetracin rpida, conversin rpida en la clula con el mnimo de tapas en amoniaco o acido glutmico o en los dos y sin efecto secundario toxico.

V) CONCLUSIONES: Como hemos observado en los resultados, la experiencia de cultivo celular por lotes en matraces empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124 con diferentes fuentes de carbono (glucosa, xilosa, glucosa y xilosa), no se obtuvieron los resultados esperados, es decir no obtuvimos la produccin de etanol ni un crecimiento de biomasa significativo, llegando a la conclusin de que; las condiciones dadas al cultivo no fueron las adecuadas.

la disponibilidad de oxgeno que se comprob que es el factor ms importante que afecta la fermentacin de azucares por levadura. Es decir el nmero de revoluciones por minuto; al ser un cultivo micro aireado y conociendo que a ms revoluciones por minuto hay ms aireacin, una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124 debe trabajarse con menos revoluciones ya que a 120 se considera una aireacin alta

La preparacin de medios de cultivo, no fue la adecuada, la solucin de sales junto con la presencia del extracto de levadura ayuda a produccin de etanol, el no agregar la solucin de sales fue uno de los obstculos para el microorganismo de producir de etanol

Se logro la activacin celular de Pichia stipitis NRRL Y-7124 y el desarrollo del inoculo, as como determinar cintica de crecimiento de la biomasa (cantidades mnimas) y consumo de sustrato.

Se determin la cintica de consumo de las fuentes de carbono y lo de los parmetros cinticos como el max, Qmax, Q.

VI) BIBLIOGRAFIA TORO R. (2005), Manual de Introduccin al Laboratorio De Microbiologa, editorial universidad de caldas,2005.

Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato- determinacin de masas en procesos biolgicos- Articulos tcnicos.(http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/tvolke/00_Determin-BM.pdf)

Biotechnol. Bioprocess. Eng. 2000, 5: 27-31 - Department of Molecular Science and Technology, Ajou University, Suwon 442-749, Korea - Enari, T. M. and M. L. Suihko (1984)

Ethanol production of pentose and hexoses from cellulose materials. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1: 229-240. - Vol. 28, No. 01, pp. 151 - 156, January - March, 2011 - Martnez, A., Rodrguez M. E., York S. W.

Determinacin de parmetros de co-cultivo de scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la fermentacin de residuos lignocelulosicos para la obtencin de bioethanol Ana Karina Castillo Plata

1. ANEXOS, clculos: HALLANDO EL % EN CLULAS: se sabe la frmula del m.o.:CH1,79 O0,6 N0,17ELEMENTOPeso molecularCantidadPeso (g)% por elemento

C1211246.57

H11.791.796.95

O160.69.637.25

N140.172.389.24

TOTAL(g)25.77

Peso (g) = peso molecular * cantidad

Calculando el porcentaje por elemento por tablas para bacterias:ElementoPorcentajePROMEDIO

S0.1 10.55 %

Mg0.1 0.50.3%

K1 4.52.75%

P2 - 32.5%

Fe0.02-0.20.11%

HALLANDO EL % EN NUTRIENTE:

HALLANDO EL % Y X/S: (solamente para el carbono multiplicar la formula de rendimiento por 0.5)

HALLANDO EL % S0:

Dato: C0= 10%Cf= 10% (2) =0.2Cf-Co= biomasa=2-0.20=1.8

HALLANDO EL % S0: menos al limitante

HALLANDO TIEMPO DE FERMENTACION: con dato terico de um

CALCULOS CURVA DE CALIBRADO DE MASA

Dilucin 1:4Dilucin 1:20.3125 0.10.079 X

0.3125 0.10.167 X

Dilucin 1:10Dilucin 1:8

0.3125 0.10.036 X

0.3125 0.10.042 X

69