LABORATORIO BIOQUÍMICA DE LOS ALIMENTOS No4

“PEROXIDASAS Y POLIFENOLOXIDASA”

RESUMEN

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La peroxidasa es una homoproteína altamente específica para el aceptor de hidrogeno, que es el peroxido de hidrogeno, pero es muy inespecífica en cuanto al sustrato donador que utiliza, que puede ser una de muchas sustancias, por ejemplo: fenoles, aminofenoles diaminas, indofenoles, leucocolorantes, ascorbato e incluso ciertos aminoácidos como tirosina.

La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno oxireductasa, cataliza la oxidación difenoles en presencia de oxigeno molécular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en plantas. La localización de la enzima en las células de las plantas depende de la especie y estado de madurez. La distribución de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales puede ser diferente ya que la proporción de enzimas solubles varía con la madurez.

En este práctico se estudio la actividad de la peroxidasa en acelga y rábanos según el método descrito en la metodología de este informe, además se estudio la Actividad de Polifenoloxidasa en papas y porotos verdes

Índice

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1 Introducción. 5

2 Objetivos. 6

3 Materiales y metodología. 6 - 7

4 Resultados y discusión. 7 - 12

5 Conclusiones y recomendaciones. 12

6 Bibliografía o Webgrafía. 12

7 Anexos. 13

INTRODUCCIÓN

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La peroxidasa es una homoproteína altamente específica para el aceptor de hidrogeno, que es el peroxido de hidrogeno, pero es muy inespecífica en cuanto al sustrato donador que utiliza, que puede ser una de muchas sustancias, por ejemplo: fenoles, aminofenoles diaminas, indofenoles, leucocolorantes, ascorbato e incluso ciertos aminoácidos como tirosina.

La reacción se puede seguir de la siguiente manera:

Donador reducido + H2O2 peroxidasa donador oxidado + 2H2O

Esta enzima se encuentra en la mayoría de las plantas y en ciertos microorganismos, pero es escasa en los tejidos animales. Se observa la actividad de la peroxidasa en la leche (lactoperoxidasa), en los leucocitos (leucoperoxidasa) o mieloperoxidasa), en la placenta una de las formas más activas en la peroxidasa del rábano.

El mecanismo de acción es sumamente parecido al que se propone para la catalasa, a través de la formación de un complejo. Más aun, en este caso son diversos los complejos los complejos que se forman entre la enzima y el peroxido de hidrogeno de que sea capaz de reaccionar con el donador reducido.

La polifenol oxidasa recibe muchos nombres debido a la gran diversidad de sustratos que emplea. Técnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su reacción se puede describir de la siguiente manara:

2 o- difenol + O2 polifenol oxidasa 2O-quinona + 2 H2O

Esta enzima puede llevar a cabo la oxidación directa aerobia de compuestos mono y difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3, a-dimetil fenol, 4-terbutilfenol). También puede atacar a o-difenoles y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular 120.00, con un centro de cobre.

La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor actividad: acido clorhídrico, catecol, quercitina, piragalol, acido cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reacción de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidándose y polimerizándose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos.

Es difícil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que pueden atacar a los mismos substratos. De Sin embargo utilizando papa como fuente de las enzimas, la reacción de la peroxidasa es mucho más rápida,

cosa que puede permitir la observación de las dos acciones

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OBJETIVOS

Objetivo GeneralDeterminar la actividad de la peroxidasa y polifenoloxidasa

Objetivos Específicos

-Determinación de la peroxidasa en acelga y rábano - Determinación de la polifenoloxidasa en papa y poroto verde

MATERIALES Y METODOLOGÍA

1. Actividad de peroxidasa

a) Se coloca en un mortero un trozo de rábano, triturarlo hasta homogeneizar y luego filtrar para obtener su jugo.

b) Se coloca 0.1 ml de guayacol líquido junto con 0.2 ml de H2O2 al 2% y 4.7 ml de agua destilada a un tubo de ensayo.

c) Dentro de un tubo, se coloca 1 ml de jugo de rábano, filtrado y diluido (1:10) y 4 ml de agua.

d) Se Mezclan los tubos b) y c).

e) Se Vacian rápidamente la mezcla a la cubeta del espectrofotómetro y medir la absorbancia cada 20 segundos hasta obtener 6 ó 7 puntos a una longitud de onda de 470 nm.

f) Graficar absorbancia v/s tiempo para obtener así la cinética de la reacción

2. Ensayo de la polifenoloxidasa

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Extracción de la enzima

Se pesan 10 g de muestra los cuales se colocan en un vaso homogenizador para su trituración, luego se le agrega buffer fosfato 0.2 M (pH 6.5) con polivinilpolipirrolidona al 4 % (p/v) y Triton X100 al 1% (v/v), luego se homogeniza la mezcla hasta lograr una pasta, la cual se filtra en un paño doble, éste filtrado se coloca en hielo. Luego se llenan los ependorfs con el filtrado y se centrífuga a 12000 r.p.m. por 10 min. Transcurrido este tiempo se saca el extracto y este se coloca en tubos de ensayo para su posterior análisis (en hielo).

Actividad enzimática

Se debe preparar una solución de catecol 0.15 M en buffer fosfato 0.05 M (pH 6.5), se toman 0.4 ml de extracto y se le agrega 3 ml de solución de catecol 0.15 M, el blanco se prepara con los 3 ml de solución de catecol mas 0.4 ml de agua destilada. La lectura se realiza a 420 nm y la reacción se lleva a cabo a 25 ºC. Graficar las lecturas de absorbancia v/s tiempo para obtener así la cinética de la reacción

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Actividad de la peroxidasa.

La existencia de una enzima en un alimento, o su diferenciación frente a otro enzima presente en él, solo puede ser demostrada por métodos indirectos a través de la medida de actividad catalítica. Por esta razón es totalmente necesario el más profundo análisis de los parámetros que influyen sobre la velocidad de cada reacción enzimática.

Esta velocidad de reacción depende de la concentración de todos los participantes de dicha reacción (enzima, sustrato, hidrogeniones, activadores e inhibidores), de la fuerza iónica y las constantes dieléctricas de los solventes (agua por lo general) y de la temperatura.

Los datos de reacción enzimática obtenidos para Acelga mediante espectrofotometría a 470[nm] se tabularon, como lo muestra la Tabla 1.

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(Tabla 1)

Seguido, se graficó mediante los valores de absorbancia versus el tiempo de reacción enzimática Figura 1, demostrando que a medida que avanza el tiempo, la peroxidasa reacciona con el sustrato provocando el pardeamiento enzimático en la muestra.

(Figura 1) Gráfico absorbancia actividad enzimática de peroxidasa a 470[nm]

Por otra parte, respecto a los datos obtenidos utilizando la misma técnica, pero con rábanos, tabulados en la Tabla 2, a la misma cantidad de tiempo de medición en el espectrofotómetro, se observa que inicialmente la muestra presenta signos claros de una baja actividad enzimática y que en el trascurso de los segundos esta avanza de manera muy rápida, provocando un mayor pardeamiento enzimático.

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Tiempo Absorbancia0 0.254

20 0.39740 0.46460 0.51780 0.565

100 0.613120 0.662

Tiempo Absorbancia0 0.369

20 0.52140 0.65460 0.76880 0.869

100 0.955120 1.03

(Tabla 2)

Seguido, se graficó mediante los valores de absorbancia versus el tiempo de reacción enzimática (Figura 2), Visto de otra forma, como lo muestra la Figura 2, el incremento abrupto de esta actividad enzimática en los rábanos, puede ser provocado por la no inactivación de las enzimas peroxidasas además de caracterizarse por ser enzimáticamente activos

(Figura 2) Gráfico absorbancia actividad enzimática de peroxidasa a 470[nm]

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Actividad de Polifenoloxidasa

Al revisar los datos obtenidos en el ensayo de la polifenoloxidasa medidos en espectrofotómetro a 420[nm], los datos obtenidos en poroto verde (Tabla 3), permite inferir que el nivel de absorbancia que presento la muestra es alto, como se muestra en la Figura 3, lo que nos indica que la acción de la enzima fue efectiva sobre el producto.

Tiempo Absorvancia0 1.24

20 1.3540 1.38760 1.45680 1.534

(Tabla 3)

La PPO es una enzima que presenta una variada gama de formas moleculares (isoenzimas). Uno de los sistemas más estudiados y del cual se obtuvo por primera vez una preparación homogéneamente pura de PPO, es el rábano.

Una alta absorbancia demuestra que el pardeamiento enzimático fue considerablemente mejor en comparación con la experiencia anterior, dado que hubo un aumento en la temperatura y la adicción de reactivos que facilitan el catalanismo enzimático (Figura 3).

Figura 3: Gráfico absorbancia actividad enzimática de polifeniloxidasa a 420[nm] en poroto verde.

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A continuación con la muestra de papa se realizó el mismo procedimiento, dando las siguientes absorbancias que se muestran en la tabla 4, y como podemos apreciar las absorbancias son menores que en las muestras de porotos verdes, esto se debe a una menor actividad enzimatica.

Tiempo Absorbancia0 0.92

20 1.01640 1.04960 1.07880 1.134

100 1.183(Tabla 4)

Se procedió a graficar la absorbancia dando el siguiente grafico (figura 4).

Figura 4: Gráfico absorbancia actividad enzimática de polifeniloxidasa a 420[nm]

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Se considera que las polifenoloxidasas tienen como función originar la oxidación de diversos sustratos. Esta acción puede ocurrir como final de la cadena metabólica respiratoria, de modo análogo al de la citocromo oxidasa (que también contiene cobre). Por ejemplo, parece que en la patata, alrededor de un tercio de los fenómenos de oxidación respiratoria se deben a la actividad de la polifenoloxidasa.

Además, las reacciones de pardeamiento enzimático representarían un papel de protección contra microorganismos; en efecto, se considera que los polímeros coloreados, que se forman rápidamente cuando un tejido vegetal se lesiona, lacera o infecta, pueden constituir una defensa contra la penetración de microorganismo o incluso retardar su proliferación.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La velocidad de reacción depende de la concentración de todos los participantes de dicha reacción

La peroxidasa reacciona con el sustrato provocando el pardeamiento enzimático en la muestra y depende del factor tiempo

actividad enzimática en los rábanos, es provocado por la no inactivación de las enzimas peroxidasas

el nivel de absorvancia de la muestra de papa es menor que la de los porotos verdes.

WEBGRAFIA

http://reportesparaestudiantesdequimica.blogspot.com/2008/03/peroxidasa-y-polifenol-oxidasa.html

http://www.actiweb.es/postcosecha/archivo8.pdf

http://ftp.censa.edu.cu/revistas_censa/rpv/v18n3/p183-188.pdf

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ANEXOS

Absorbancia en el poroto verte.

Inicialmente las absorbancias obtenías eran de 8 tomas, como muestra la siguiente tabla.

Absorbancia

Desprecio (*)

1.24 1.35

1.244 *1.348 *1.387 1.488 *1.456 1.534

Los valores despreciados son porque la enzima empieza agotar sus sustratos, esto daba un margen muy grande en la medición.

Desarrollo cuestionario

¿Cuáles son los factores que están implicados en una reacción enzimática?

R. Los factores que influyen sobre la actividad enzimática son la Temperatura, el pH, la Concentración de Sustrato, la concentración de enzimas, los cofactores y las coenzimas

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