INFLUENCIA DE LA PREDOMINANCIA RACIAL SOBRE LA COMPETENCIA DE MADURACION, FECUNDACION

Y DESARROLLO IN VITRO DE OVOCITOS BOVINOS.

Presentado por:

Dra. Aixa Urdaneta

Maracaibo, mayo de 2012.

Universidad del Zulia

Facultad de Ciencias Veterinarias

Unidad de Biotecnología Animal

Laboratorio de Fecundación in vitro

Ganadería de Doble Propósito. Programas de cruzamiento. Limitaciones en la producción bovina.

Adaptación al medio. Bos indicus vs. Bos taurus.

Camargo y col., 2007, encontraron en vacas Holstein (B. taurus) que el estrés calórico parece reducir la competencia ovocitaria y las tasas de fecundación reduciendo el desarrollo del embrión y mala fertilidad en los meses de verano a diferencia del ganado Cebú (B. indicus) que está mejor adaptado al medio, demostrando una máxima tolerancia al calor y mejor rendimiento reproductivo.

Torres-Junior y col.,2008, Señalan que el estrés calórico ejerce un efecto

nocivo retardado sobre el desarrollo folicular, niveles de progesterona y competencia ovocitarias en ganado B. indicus a diferencia del B. taurus, donde el estrés calórico causa un deterioro inmediato sobre el desarrollo folicular.

Estrés calórico

Daño en la comunicación intercelular. Afectación de la competencia del ovocito. Viabilidad de las células de la granulosa y de la teca interna. Cambios en la esteroidogénesis. Folículos antes de su reclutamiento. Prolongación de los efectos del estrés térmico.

? Estrés calórico

La capacidad de desarrollo de ovocitos mamíferos esta influenciada por diversos factores: endocrinos, nutricionales, morfológicos, ambientales, entre otros y además es evidente la influencia del componente racial sobre los procesos fisiológicos del embrión y los gametos que los originan.

Dada la importancia de la ganadería mestiza en la región y el

país, toma relevancia el hecho de poder caracterizar la influencia del componente racial sobre la capacidad de desarrollo del ovocito bovino.

OBJETIVO GENERAL:

• Determinar la influencia de la Predominancia racial sobre la competencia de maduración, fecundación y desarrollo in vitro de ovocitos bovinos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: • Evaluar la tasa de maduración de ovocitos provenientes de bovinos con

predominancias raciales diferentes.

• Determinar la competencia de fecundación que presentan los ovocitos provenientes de bovinos con predominancias raciales diferentes.

• Evaluar la tasa de división embrionaria in vitro de ovocitos provenientes de bovinos con predominancias raciales diferentes.

Maduración in vitro: Recolección y obtención, selección y maduración in vitro (Báez y col., 2008)

(Hernández- Cerón y col., 2004). (Holyoak y col., 1998).

Atm. 5% CO2 aire saturado de

humedad 24 hrs 38.5ºC

Tamaño adecuado Citoplasma claro y

homogéneo 2 capas de cel. cúmulus

TCM 199

suplementado

Cúmulus

expandido

Fecundación y cultivo in vitro: (Parrish y col., 1988 (Xiang-Dong Zi y col., 2007).

Pajuelas 37ºC x 30 seg

Lavado TL-Semen, 39 g x

5 min.

Lavado TL-FIV

FECUNDACIÓN in vitro TL-FIV + 30 µg/mL Heparina + SFB

5% CO2, 38.5ºC

MIV

20 – 25 ovocitos x gota

24 h

DI= 5 l = 1x106

spz/mL

Lavado TL-Semen

CULTIVO in vitro SOF + 5 mg/mL BSA + SFB + piruvato

, 5% CO2 38.5ºC Muestra de FIV:

aceto-orceína al 1%

Muestra de MIV: aceto-orceína al 1%

Tinción y evaluación de la tasa de maduración in vitro: (González y Gil, 2000).

Ovocitos Inmaduros Ovocitos Maduros

VG (400X) MI (400X) MII + CP (400X) Telo I (400X)

Ovocitos Degenerados

TeloI (400X) MI (400X) Material degenerado (400X)

Material Nuclear ausente (200X)

Evaluación de la tasa de división embrionaria (48hpi): (Rocha y col., 1998).

4 cél.

1 cél. 2 cél. 3 cél.

Embriones divididos (50X)

Análisis estadístico:

Obtención, selección y maduración in vitro

Fecundación in vitro

Cultivo in vitro

Tasa de maduración in vitro (24h)

Tasa de división embrionaria (48 hpi)

Tasa de fecundación in vitro (17 hpi)

P< 0,01

P< 0,05

Test χ2 del SAS®

0

20

40

60

80

100

120

140

Bostaurus

Bosindicus

Nº de COCs totales evaudados

Total ovoc. Maduros

Total ovoc. Inmaduros

Total ovoc. degenerados

Grafico 1: Progresión meiótica de ovocitos bovinos de ambos predominios raciales. Peláez y col, 2010

Tasa de MIV Báez y col., (2009) 74.22 %

Pirela y col., (2009) 65.09% y 13.0% de degenerados

a

a b

b

a,b diferencias significativas (P< 0,01)

Tasa de maduros: Bos indicus 66.93% Bos taurus 43.10%

Tasa de inmaduros: Bos indicus 27.56% Bos taurus 51.72%

Tasa de MIV 55.55%

0

20

40

60

80

100

120

Bos taurus Bos indicus

Nº de ovoc. totales evaudados

Total ovoc. Penet

Total ovoc. No penet

Total ovoc. Penet anormales

Grafico 2: Evaluación de Fecundación de ovocitos bovinos de ambos grupos raciales con predominancias fenotípicas Bos taurus y Bos indicus.

b a

Tasa de FIV 38.0%

Tasa de FIV: Chávez y col., (2009) 12.21%. Hashimoto y col., (2002) 75%.

Méo y col., (2007) 69,6%. Chohan y Hunter, (2004) 49,4% . González y col., (2000) 41,17% .

Penetrados normales: Bos indicus 43.68%. Bos taurus 31.96%.

Penetrados anormales: Bos indicus 41.74%. Bos taurus 46.39%.

No penetrados: Bos indicus 23.30%. Bos taurus 17.52%.

a,b diferencias significativas (P< 0,05)

Hansen y col., (2001) el éxito de la fecundación in vitro se reduce durante los periodos cálidos del año, en

vacas mestizas Angus/Holstein en EE.UU. El genotipo puede tener efectos importantes sobre la magnitud del estrés calórico en todo animal y en respuesta al choque térmico en los tejidos.

Plachot, (2000) determino que en ambos grupos experimentales (Bos taurus y Bos indicus) se observaron ovocitos que son fecundados de manera asincrónica y ovocitos polispérmicos con tres pronúcleos que las anomalías más frecuentemente observadas en fecundación in vitro.

Eberhardt y col., (2008) concluyó (según trabajos previos de Barros y col. (2006) que los embriones fecundados con semen Nelore son más capaces de sobrevivir al calor en las primeras etapas de desarrollo que los fecundados con Angus, siendo esto resultado de la contribución genética de los ovocitos y los espermatozoides.

0

100

200

300

400

500

600

Bostaurus

Bosindicus

Nº Total de Cig. A CIV

Nº Total Embr. Div. A las 48 hrspih

Total Embr. 2 Cél

Total Embr. ˃2 Cél

Grafico 3: Evaluación de división de embriones bovinos de ambos grupos raciales con predominancias fenotípicas Bos taurus y Bos indicus 48 horas post-inseminación.

Tasa de división (48 phi): 33.70%

B. indicus: 36.12% B. taurus: 32.30%

Tasas de división embrionarias: Torrres-Junior y col., (2007) 74.6%. Paula-Lopes y col., (2003) 75.5%.

Rivera y Hansen, (2001) 85%.

% de división: Rocha y col., (1998),

Brahman (B. indicus) 77%. Holstein (B. taurus) 24.6%.

Sirad y Blondin, (1996) una baja tasa de desarrollo podría deberse a la selección de los

COCs previo a la maduración, etapa en la cual se debería ejercer una estricta evaluación sobre la calidad morfológica tanto de las células del cúmulus como del ovoplasma.

Edwards y Hansen, (1997); Krininger y col., (2002). Los embriones bovinos son más sensibles al choque térmico en las primeras fases de división.

Hammond y col., (1996), (1998); Gaughan y col., (1999) los embriones de ganado Brahman son más capaces de sobrevivir al aumento de la temperatura que los embriones de Angus y Holstein, dos razas termosensibles.

Camargo y col., (2007) existen diferencias reproductivas entre hembras Bos indicus y Bos taurus, debido a que existen significativas y evidentes diferencias en la transcripción de la expresión de la proteína Hsp 70.1 proteína de choque térmico (Hsp).

Pegorer y col., (2007) afirman que ovocitos de hembras puras B. indicus, cuenta con el potencial para resistir al estrés calórico del futuro embrión, pero no está del todo claro la misma participación del ovocitos descendientes de hembras mestizas.

Block y col., (2002) Actualmente se ha estudiado el efecto que ejerce el macho sobre la

calidad embrionaria. Se ha demostrado que embriones producidos in vitro utilizando ovocitos Brahman (Bos indicus) fecundados con semen Angus (Bos taurus) fueron más termotolerantes que embriones producidos por inseminación con ovocitos Holstein con semen Angus (Bos taurus).

Roth y col., (2001) la baja fertilidad en temporadas cálidas se ha atribuido a efectos retardados del estrés por calor en el verano obteniendo ovocitos de mala calidad y un bajo desarrollo de embriones en temporadas frescas.

Los resultados derivados de este estudio señalan que el ganado con predominancias racial Bos indicus presenta mejores porcentajes de maduración y fecundación in vitro, que el ganado predominantemente Bos taurus.

La capacidad de maduración in vitro de los ovocitos provenientes de vacas mestizas con predominancia racial Bos indicus mostraron ser más competente para reiniciar la meiosis en comparación con los ovocitos provenientes de vacas mestizas con predominancia racial Bos taurus.

La competencia para ser fecundados que presentaron los ovocitos

con predominancia racial Bos indicus supero a la de los ovocitos procedentes de hembras mestizas Bos taurus.

La tasa de división embrionaria a las 48 hpi para ovocitos Bos

indicus madurados y fecundados fue mayor que la división embrionaria alcanzada por ovocitos proveniente de hembras con predominancia racial Bos taurus.

Evaluar la capacidad de desarrollo de los ovocitos con predominancias fenotípicas de ambas especies hasta el estadio de blastocito y al igual que su tasa de eclosión.

Continuar estudios de apoptosis y ultraestructurales en ovocitos que

permitan determinar si la baja competencia en el desarrollo obtenida en el grupo con predominancia fenotípica Bos taurus se pueden explicar por diferencias en la constitución celular. Por otra parte llevar a cabo estudios moleculares en ovocitos madurados in vitro, ya que fue en esta donde se observaron las mayores diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos.

Realizar estudios donde se evalúe el componente masculino, es decir, el

componente racial del espermatozoide y sus posibles interacciones en la capacidad termotolerante de los embriones producidos in vitro.