evacuación de gametos de lapa frutilla _fissurella cumingi reeve, 1849_ y lapa negra
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
Evacuación de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa negra
(Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores químicos y físicos
Luis Gallardo Barraza.
Profesor Guía: Luis Pereira Chávez.
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Evacuación de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa negra
(Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores químicos y físicos
Por Luis Gallardo Barraza.
DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
Aprobado Comisión de Calificación __________________________________ Ernesto Cortés Pizarro Decano __________________________________ Luis Pereira Chávez. __________________________________ Enrique Dupré Moraga __________________________________ Juan Enrique Illanes Bücher Informe entregado como un requisito para obtener el título de Ingeniero en Acuicultura, en la
Facultad de Ciencias del Mar. Universidad Católica del Norte. Sede Coquimbo.
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA
Evacuación de gametos de lapa frutilla (Fissurella cumingi Reeve, 1849) y lapa
negra (Fissurella latimarginata Sowerby, 1835,) mediante inductores químicos y
físicos
Actividad de Titulación Especial presentada para optar al título de Ingeniero en Acuicultura.
Luis Gallardo Barraza.
Coquimbo
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Dedicado a Dina
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RESUMEN
En este trabajo se indujeron a la evacuación de gametos dos especies del
género Fisurella, lapa negra y lapa rosada, con inductores físicos y químicos
que anteriormente habían sido utilizados con éxito en otros moluscos. Se
monitoreó la gravidez de las gónadas de tres sectores diferentes a través del
índice gonadosomático en las localidades: El Totoral, Totoralillo centro y
Maitencillos. Entre diciembre del 2001 y enero del 2002 se indujeron al desove
55 lapas frutillas, mediante 3 métodos de aplicación de peróxido de hidrógeno
(H2O2), el primero de ellos consistió en una inyección intragonadal de H2O2, el
segundo fue con H2O2 en forma externa con la metodología usada por Morse en
1977 y en el tercero se utilizó agua de mar irradiada con luz UV. Además 95
ejemplares de F.latimarginata fueron inducidos al desove con Cloruro de potasio,
H2O2 en forma interna al 3%, Serotonina, shock térmico y luz UV.
La duración total del ciclo gonadal para lapas es de aproximadamente un año,
periodo que puede variar de acuerdo a la subespecies, condiciones climáticas y
alimentación. En las localidades analizadas, se pudo apreciar que se encuentran
animales maduros todo el año, pero los porcentajes mensuales son variables,
donde existen dos períodos de mayor intensidad de maduración y evacuación de
gametos, durante la época invernal y durante los meses de verano, observándose
una mayor actividad durante este último período.
Al comparar la eficiencia de los distintos tipos de inductores se
concluye que los mejores fueron los químicos KCl 0.5M y H2O2 (3%) inyectados
directo a la gónada, por la calidad y cantidad de los gametos evacuados, su
respuesta fue de 1 – 24 horas después de inyectado el inductor.
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TABLA DE CONTENIDOS.
RESUMEN ...................................................................................................................................... 4
TABLA DE CONTENIDOS. ......................................................................................................... 6
1.- INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 7
2.-OBJETIVOS ............................................................................................................................. 20
2.1.- OBJETIVO GENERAL...................................................................................................... 20 2.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS.............................................................................................. 20
3.- MATERIALES Y MÉTODOS. .............................................................................................. 21
3.1.- OBTENCIÓN DEL ÍNDICE GONADOSOMÁTICO (IGS). ............................................................. 21 3.2.-TRASLADO Y MANTENCIÓN DE REPRODUCTORES................................................................. 23 3.3.- INDUCCIÓN AL DESOVE........................................................................................................ 23 MÉTODOS DE INDUCCIÓN AL DESOVE EN F. CUMINNGI ................................................................ 23
3.3.1.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno......................................................................... 24 3.3.2.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) externo ........................................................................ 24 3.3.3 .- Luz ultravioleta........................................................................................................... 24
MÉTODOS PARA LA INDUCCIÓN A LA LIBERACIÓN DE GAMETOS DE F. LATIMARGINATA............... 26 3.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) ............................................................................................. 26 3.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) ............................................................................ 26 3.3.6.- Peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2 3%) ................................................................ 27 3.3.7.- Temperatura:.............................................................................................................. 27 3.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) .................................................................... 27
3.4. RESPUESTA A LOS INDUCTORES............................................................................................ 28 3.5.- FECUNDACIÓN..................................................................................................................... 28
4.- RESULTADOS ........................................................................................................................ 30
4.1.- OBTENCIÓN DEL ÍNDICE GONADOSOMÁTICO (IGS). ............................................................. 30 Caleta Maitencillos ................................................................................................................. 31 Caleta Totoral.......................................................................................................................... 32 Caleta Totoralillo centro ......................................................................................................... 33
4.2. HISTOLOGÍA DEL CICLO REPRODUCTIVO DE AMBAS ESPECIES. .............................................. 34 4.2.1.-Histología de gónada femenina.................................................................................... 39 4.2.2.-Histología de gónada masculina. ................................................................................. 40
4.3.-RESPUESTA A LOS MÉTODOS DE INDUCCIÓN......................................................................... 41 FISSURELLA CUMINGI.................................................................................................................... 41
4.3.1.- Peróxido de hidrógeno externo .................................................................................... 41 4.3.2.-Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno.......................................................................... 41 4.3.2.1:Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 1%.............................................................. 42 4.3.2.2:Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 2%............................................................. 42 4.3.2.3:Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 3%............................................................. 42 4.3.2.4.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 4%.......................................................... 42 4.3.3.- Agua de mar irradiada con luz ultravioleta................................................................. 43
FISSURELLA LATIMARGINATA: ........................................................................................................ 44 4.3.4.- Cloruro de potasio (KCl) ............................................................................................. 44 4.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4) ........................................................................... 44 4.3.6.- Peróxido de hidrógeno 3% (H2O2 3%) ....................................................................... 44 4.3.7.- Temperatura............................................................................................................... 44 4.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV) .................................................................... 44
4.4.-FECUNDACIÓN...................................................................................................................... 45
5.- DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.................................................................................... 49
6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................... 55
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1.- INTRODUCCIÓN Las especies del género Fissurella de las costas de Perú, Chile y sur de
Argentina son numerosas y abundantes, comprendiendo el mayor elemento de la
fauna malacológica de la costa Oeste de América del Sur. En Chile, son conocidas
como “lapas” y tienen un hábitat o nicho único, ocupando la zona submareal e
intermareal. Fissurella maxima, F. cumingi y F. latimarginata habitan
comúnmente desde la zona intermareal baja hasta profundidades de 5 m. La
aparición de estas especies en la zona intermareal se da en áreas no expuestas al
oleaje. lo que facilitó que las lapas fueran parte de la dieta de los pueblos costeros
chilenos desde la prehistoria. (McLean, 1984). En la actualidad alrededor de 10
especies de lapas son extraídas con fines comerciales (pesquería multiespecífica).
La utilización en Chile de las lapas como fuente de alimentación tiene una
antigua data, encontrándose numerosos conchales arqueológicos a lo largo de la
costa. Sin embargo, las capturas comerciales comienzan a tener una importancia
relativa sólo a partir de la década de los ochenta, coincidiendo con la declinación
del recurso loco y la apertura de mercados externos para este recurso.
Las lapas son extraídas por 3 grupos humanos, los mariscadores de orilla que
acceden desde la costa con las mareas bajas y extraen las lapas que se distribuyen
en la zona intermareal, los buzos a resuello que extraen las lapas submareales de
la zona de la rompiente y los buzos hooka que trabajan sobre las poblaciones
submareales propiamente tales (Duran et al, 1987).
En general, existe una escasa información de las características biológicas del
recurso lapa y específicamente los antecedentes reproductivos que son un aspecto
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preponderante para el establecimiento y desarrollo de sistemas de cultivo
productivos de estas especies.
La clase Gastrópoda corresponde a la clase más exitosa de los moluscos y se
estima que emergieron en el Cámbrico hace 550 Ma. Tuvieron una rápida
radiación colonizando exitosamente todos los ambientes del planeta, para lo cual
han desarrollado diversos cambios morfológicos corporales y funcionales de sus
sistemas que les ha permitido utilizar óptimamente el espacio abiótico y los
diferentes sistemas tróficos, siendo actualmente la clase más numerosa entre los
moluscos (Haszprunar, 1988; Bieler, 1992).
Otra característica relevante de los gasterópodos es la torsión corporal que
ocurre durante el desarrollo larval, desplazándose la masa visceral en 180º
(sentido contrario al reloj) respecto de la cabeza, pasando de una simetría bilateral
a una asimetría bilateral. Este desplazamiento promueve la atrofia de uno de los
órganos pares, la torsión del aparato digestivo y cordones nerviosos. El ano,
nefridioporo y gonoporo quedan en posición anterior, próximos a la cabeza, y
evacuan en la cavidad del manto.
El proceso de atrofia de los órganos presenta algunas características propias para
algunos grupos de gasterópodos. En Vetigastropodos (Fissurellidae, Haliotidae),
durante el desarrollo embrionario del sistema renogenital, se produce en primera
instancia la atrofia y pérdida de la gónada izquierda con su respectivo gonoducto
y posteriormente la pérdida del nefridio izquierdo (Olivares, 2009).
En general las especies de Fissurella son organismos dioicos, pero en la
especie del Mediterráneo F. nubecula se observó un 17% de reversión sexual tipo
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protándrica (Bacci, 1947). En cambio en F. barbadensis especie del Caribe no se
detectó hermafroditismo (Ward, 1966).
La gónada es única y está localizada en el extremo posterior de la cavidad
visceral, adyacente a la glándula digestiva. El ovario y testículo tienen forma
sacular y poseen un amplio lúmen.
En las observaciones realizadas en las gónadas de diferentes especies de
fisurélidos de Chile, se ha detectado que la proporción sexual es 1:1 a cualquier
tamaño del animal, lo cual permite aseverar que las especies son de sexo separado
y que en ellas no ocurre la reversión sexual durante el crecimiento ni en la
maduración. El ovario es de color verde y el testículo varía en tonalidades de
blanco, según el estado de funcionamiento gonadal (Bretos, 1979; Bretos et al.
1983; 1988; Olivares et al. 1998; Bretos & Chihuailaf, 1990; 1993.)
En la escala de madurez gónadal se distinguen cuatro estados (previtelogenesis,
vitelogenesis, madurez y evacuación), basándose la diferenciación entre ellos en
la predominancia de los elementos celulares durante la gametogénesis. La
fluctuación de éstos, revela una clara actividad reproductiva durante todo el ciclo
anual, estableciendo la presencia de organismos maduros, a través de todo el año
(Olguín et al, 1997), presentando dos desoves parciales al año.
En el género Fissurella, el sistema reproductivo se relaciona con el sistema
excretor. La gónada, de organización en septos, se comunica con la porción distal
del riñón derecho distal por medio del canal renopericárdico que funciona como
conducto genital. Los gametos son evacuados a la cavidad del manto a través de la
apertura renal derecha. Además de transportar los gametos, el conducto genital,
que comunica con el pericardio a través del nefrostoma (Fig. 1). La gónada es un
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saco multilobulado de morfología y tamaño variable, dependiendo del estado de
madurez de los ejemplares, presenta dimorfismo sexual en coloración. En ambos
sexos se encuentra separado de otros órganos de la masa visceral. La gónada
ocupa una posición ventral en la cavidad corporal, por debajo de la glándula
digestiva y el estómago (Collado, 2007).
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C D
Figura 1.- Organización esquemática común del sistema reproductivo. A. Corte transversal. B. Corte dorsal. Abreviaturas: a, ano; c, conducto genital (conducto renopericardial); ct, ctenidium; g, glándula; go, gónada; la, aurícula izquierda; Ik, riñón izquierdo; lko, abertura izquierda del riñón; n, nephrostoma; p, pericardio; ra, aurícula derecha; rk, riñón derecho; rko, abertura riñón derecho; v, ventrículo. (Collado, 2007). C. Testículo, de coloración blanquecina a amarillo pálido, dividido superficialmente en lóbulos irregulares. D. ovario de color verde, cuya superficie está recorrida por surcos superficiales poco profundos que lo dividen parcial e irregularmente (Olivares, 2009).
Las especies del género Fissurella presentan fecundación externa, hecho que
facilita el control de los procesos reproductivos (Huaquin, 1998). Investigaciones
referentes a la biología y técnicas de manejo en especies del género Fissurella en
Chile, para la obtención de gametos maduros y posteriormente larvas viables, son
escasos. De las ocho especies comerciales que se distribuyen en las regiones de
Coquimbo y Valparaiso, existen tres especies de las que se han obtenido juveniles
en laboratorio: F. latimarginata, F. cumingi, y F. costata (Vega et al., 1996).
Vega et al. (1996) trabajaron con F. cumingi y obtuvieron juveniles de lapas en
laboratorio a través de la inducción mediante la inyección de H2O2 interno y H2O2
externo, con macerado de gónadas y temperatura, en machos y hembras; Perez et
al.(2007) lograron inducir el desove de F. nigra con aumento de temperatura
combinado con desecación; Reynoso et al. (2007) obtuvieron un desove
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espontaneo de F. volcano tras acondicionar reproductores durante 40 días;
Huaquin et al (1998) obtuvo gametos de de F.crassa al inyectar las lapas con KCl
siguiendo la metodologia de Horstadius (1973) obteniendo evacuación de
gametos y posterior fecundación al igual que Bustos et al. (1991) y Vega et al.
(1996). Sin embargo, se han presentado dificultades en controlar el desove y la
obtención de gametos; conocimiento importante para planificar cultivos larvales.
Los ovocitos del género Fissurella están protegidos por una membrana rígida o
corion que tiene una función en la fecundación además de protección, esta tiene
un micrópilo, el cual ha sido descrito en varios grupos de invertebrados como
gasterópoda, bivalvia, nemertea y echinodermata, siendo universal en insecta y
cephalopoda (Austin 1965, Tumboh-Operi 1982, Longo 1987, Focarrelli 1988), el
micrópilo es una apertura que permite la penetración de los espermios entre la
envoltura gelatinosa externa y el corión. Los ovocitos de F.cumingi y
F.latimarginata son similares en la presencia de la cubierta gelatinosa a los
descrito para Tegula funebralis por Moran (1997), F. crassa por Huaquin et al.
(1998), Diadora aspera por Hadfield y Strathmann (1996) y F. nigra por Perez
(2007).
Los espermatozoides en gasterópodos tiene una cabeza cónica, un flagelo y su
morfología es del tipo primitivo, según Franzen (1956).
La inducción al desove en gasterópodos marinos del género Haliotis
particularmente ha sido controlado satisfactoriamente, Uki y Kikuchi en 1974
lograron la evacuación de gametos en Haliotis discus hannai con agua irradiada
con luz ultravioleta (UV) y Morse en el año 1977 controló la evacuación de
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gametos de Haliotis rufens adicionando peróxido de hidrógeno al agua de mar
donde estaban los reproductores. Ambos métodos inducen al desove de forma
artificial por mecanismos similares, esto es generando radicales libres de
endoperóxido, HOO - o peróxidos radicales –OO- en el agua de mar lo que activa
la síntesis enzimática de prostaglandinas en abalones (Morse, 1977).
Dentro de los estímulos físicos, el choque térmico es quizá, el método que más
se emplea actualmente en invertebrados debido a que es fácil y económico de
realizar, además ha sido estudiado desde principios del siglo pasado por
investigadores como Nelson (1928) en Ostrea virginica, Prytherch (1929) en
Ostrea gigas (actualmente del género Crassostrea) y Young (1945) en Mytilus
californianus.
Se ha observado que la serotonina (5-HT), siendo un neurotransmisor del
sistema nervioso, es un excelente agente inductor de desove en muchos
invertebrados, en 1982 Matsutani y Nomura indujeron con 5-HT al desove
pectínidos de la especie Patinopecten yessoensis y en 1984 Gibbson y Castagna
experimentaron con Argopecten irradians y otros bivalvos.
Fissurella cumingi (Reeve, 1849) presenta una concha ovalada pero no alta,
(Fig. 2) presenta costillas radiales finas donde las primarias son más prominentes
que las secundarias. Las estrías concéntricas de crecimiento no son regulares. El
orificio apical es central. Su margen interno es cortante y tiene un ancho variable,
de color homogéneo o similar al patrón de color dorsal de la concha, el que
presenta franjas radiales de color rosa a pardo sobre un fondo de tonos grises a
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pardos oscuros. Esta especie presenta rasgos que la hacen semejante a F.
latimarginata y a F. maxima, de allí la complicación en determinarla cuando la
concha se encuentra cubierta de algas. Esta especie tiene la forma general de F.
latimarginata, con un patrón de coloración externa similar al de F. maxima,
aunque un poco más oscura. Sus costillas radiales son más gruesas que en la
primera y un poco más finas que en la segunda. El margen interno, a diferencia de
F. latimarginata, proyecta los rayos de la coloración externa y generalmente no es
grueso como en F. maxima. La diferencia fundamental con éstas y otras especies
de Fissurella radica en el color del borde del pie, que es rosado a púrpura oscuro.
(Guzman, 1998). McLean (1984) en su revisión sistemática de las especies de
Fissurella, considera a F. stellata Reeve, 1850 como un sinónimo de F. cumingi,
aunque la figura de F. stellata de Riveros-Zuñiga (1951) parece ser F. peruviana.
Esta especie es conocida con los nombres de "lapa frutilla" y “lapa rosada” por lo
característico del color del pie.
Su distribución según McLean (1984) va desde Matarani (Perú) hasta Mehuín
(Chile).
Figura 2.- Concha de F. cumingi, se observa el orificio apical central y franjas radiales no muy gruesas.
Fissurella latimarginata
(Sowerby, 1835) presenta
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el cuerpo protegido dorsalmente por una concha calcárea secretada por el manto
(Olivares, 1995), la concha es cónica y más aguzada en su parte anterior, con su
orificio apical medianamente grande y ovalado (Fig. 3). La superficie externa es
ornamentada con bajas, finas y poco espaciadas estrías radiales, en un fondo de
color púrpura oscuro. El interior de la concha es blanco, con el borde grueso (que
puede ser angosto en ejemplares de gran tamaño), uniforme y de color púrpura.
Los costados del pie y manto son de un color negro intenso, con prolongaciones
de color amarillo en el borde del manto. Sus tentáculos también son de color
amarillo intenso.
Especie que habita normalmente la franja inframareal del litoral, sobre rocas y
entre el cordón de Lessonia nigrescens, aunque es más abundante en la zona
infralitoral. Los juveniles de la mayoría de las especies de Fissurella muestran en
la concha dos rayos blancos, uno a cada lado del orificio apical. Esta característica
es bastante evidente en ésta especie y de allí, probablemente, algunos autores
reconocen la variedad "biradiata" (Guzman, 1998).
Estudios realizados por Acuña (1977) en la localidad de Tocopilla concluyeron
que esta especie puede alcanzar longitudes máximas de 65 mm., aunque según
McLean (1984) pueden alcanzar los 115 mm. Bretos (com. pers., 2002) señala la
importancia de esta especie en el sur del país, donde es el soporte de la pesquería
local. Se distribuye desde Pimentel (Perú) hasta el río Bío Bío Chile (Mclean,
1984).
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Figura 3.- Fissurella latimarginata se observa las prolongaciones del manto y tentáculos de color amarillo intenso.
En la última
década se ha extraído un
promedio anual de 2.939
± 585 ton de Fissurella
spp. y desde el año 2000,
menos del 10% del
desembarque pesquero se
ha desglosado con las
denominaciones
vernaculares de lapa
negra, reina y rosada, las cuales corresponden a las especies F. latimarginata, F.
maxima y F. pulcra o F. cumingi, respectivamente (Bretos, 1988; Osorio, 2002;
Sernapesca, 2007). Parte de la comercialización se realiza directamente al público
como producto fresco entero y fresco desconchado eviscerado; pero
mayoritariamente se destina a la industria pesquera, la cual procesa el músculo del
pie en la forma de fresco refrigerado, congelado y en conserva (Osorio, 2002). El
procesamiento industrial implica la pérdida total de los caracteres de las especies,
resultando imposible su distinción. (Olivares et al, 2006).
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Figura 4.- Desembarque total anual de lapas durante los años 1998-2009 (Sernapesca, 2009)
Las líneas de elaboración con que se está exportando el recurso, son
básicamente conserva, congelado, fresco enfriado y deshidratado. Sin embargo, a
la luz de las estadísticas oficiales la producción parece ser monoespecífica,
destacando por sobre todas las líneas de elaboración, la conserva. En este sentido
cabe destacar que el precio en el mercado internacional de la tonelada de conserva
mantiene un valor promedio (US$ 8.500/t) que no difiere significativamente del
congelado y fresco enfriado, no así de la línea de elaboración deshidratado, la que
alcanza un valor por sobre los US$ 120.000/t. (FIP Nº 2005-39, 2007).
El mercado, tanto nacional como internacional, no presenta mayor interés en el
recurso, que justifique un desarrollo de la pesquería en términos de aumento del
esfuerzo. No obstante esto, durante el 2004, producto del incremento del precio
del dólar, y consecuentemente el incremento del precio en playa. Se intensificó la
actividad extractiva en la zona norte, alcanzándose capturas por sobre el promedio
histórico, situación que varió notablemente durante el 2005, producto de la caída
del dólar y la sobresaturación del mercado, debiendo las empresas en algunos
18
casos sacrificar el margen con que manejan el precio del recurso a nivel nacional,
situación que se prolonga durante el 2006. (FIP Nº 2005-39, 2007).
Desembarques de F.latimarginata y F. cumingi
0
50
100
150
200
250
1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010
años
tone
lada
s
F. cumingi
F.latmarginata
Figura 5.- Desembarque de Lapas negras y rosadas (Sernapesca, 2009).
La única medida de protección de la lapa es la restricción en la talla de
extracción, la que es de 65 mm. Esta normativa sin embargo, no ha tenido mayor
efecto en la conservación de las Fisurellas debido a que se aplica al género,
existiendo diferencias significativas en los tamaños promedios de las distintas
especies. Lo anterior se ha visto reflejado en un aumento de las zonas de
sobreexplotación llevándolas a la extinción o reducción de sus densidades a
niveles de riesgo para la pesquería. Este riesgo ha aumentado debido a que desde
1986 la lapa se viene perfilando como un producto alternativo del loco
(Concholepas concholepas) en el mercado nacional y en los mercado asiáticos.
Los desembarques chilenos de fissurélidos son en promedio de 2.200 toneladas
anuales, alcanzando un máximo de 5.500 ton. en 1993 y 4.760 el año 2004. Esta
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mayor demanda, ha generado una tendencia al alza en los precios de exportación
de los productos con mayor valor agregado (fresco enfriado y conserva).
Tabla I: Exportaciones de lapas (Fissurella spp.) congeladas
Año Cant (KN) Monto (US) 2005 22.709,50 569.709,37 2006 86.187,95 772.852,93 2007 225.663,35 1.925.564,67 2008 153.338,60 1.847.181,51 2009 215.299,08 2.749.703,13
Fuente: ProChile
Tabla II: Exportaciones de lapas (Fissurella spp.) preparadas
Año Cant (KN) Monto (US)
2007 644.578,20 5.040.268,46 2008 573.303,14 4.724.394,99 2009 707.036,24 5.689.327,71
Fuente: ProChile
La creciente demanda por fisurélidos hace oportuno y conveniente desarrollar
tecnologías de producción intensiva.
La base para crear cultivos intensivos es dominar la liberación de gametos,
concentraciones y condiciones de fecundación y producción de juveniles para lo
cual se debe experimentar en base a experiencias realizadas en individuos del
mismo género, familia u especies. Basado en bibliografía, se decidió probar con
distintos inductores al desove que habían dado éxito en la liberación de gametos
de diferentes gastrópodos marinos, de la mano del seguimiento de la madurez
gonadal de forma histológica y con el cálculo del índice gonadosomático de las
diferentes poblaciones de Fissurellas sp.
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2.-OBJETIVOS 2.1.- OBJETIVO GENERAL
Comparar y evaluar la inducción a la evacuación de gametos de F.
cumingi y F. latimarginata con inductores químicos y físicos aplicado en
distintas concentraciones.
2.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar el período de madurez sexual de diferentes poblaciones de F.
cumingi y F. latimarginata a través del índice gonadosomático (IGS).
- Determinar el efecto de distintos tipos de inductores físicos y químicos para la
liberación de gametos de F. latimarginata y F. cumingi.
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3.- MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1.- Obtención del índice gonadosomático (IGS). Durante los meses de mayo del 2001 a julio del año 2002, en el
marco del proyecto Fondef “Innovaciones tecnológicas para repoblamiento y
producción de lapas chilenas de exportación (Fisurella latimarginata y F.
Cumingi) en áreas de manejo y Centros de cultivo”, se recolectaron mensualmente
30 individuos adultos de F. cumingi y 30 adultos de F.latimarginata de las
siguientes localidades de áreas de manejo:
Figura 6.- Mapa que muestra caletas donde se realizó el estudio del IGS.
• Caleta Maitencillo, sindicato de trabajadores independientes de pescadores
artesanales, Región de Valparaíso. (Fig. 6)
• Caleta El Totoral, sindicato de trabajadores independientes de buzos y
pescadores artesanales, Región de Coquimbo.
• Caleta Totoralillo centro, asociación gremial de buzos, asistentes y
pescadores artesanales, Región de Coquimbo.
Las lapas fueron colectadas del submareal e intermareal. Se obtuvieron
mediante buceo apnea, se midió la longitud de la concha con un vernier de
precisión 0,05 mm., seleccionando aquellas de mejor textura y color del pie con
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un rango de tamaño de 6 a 10 cm. Los individuos recolectados se trasladaron al
laboratorio húmedo de la Universidad Católica del Norte (UCN) en heladeras o en
bandejas de polipropileno cubiertas con esponjas húmedas y/o cubierta con
macroalga fresca (Macrocystis sp).
Una vez en laboratorio, se limpiaron con un cuchillo común, retirando los
epibiontes y algas adheridas a la concha (Gelidium chilensis, Procamium spp. y
cirripedios), y luego se depositaron en estanques con flujo de agua, aire abierto y
continuo, como el de la Fig. 7.
Figura 7.- Estanque rectangular con flujo de agua abierto utilizado para recibir reproductores.
Mensualmente se
analizaron 30 individuos de F.
cumingi y 30 de F. latimarginata,
se determinó para cada ejemplar la longitud máxima y ancho de la concha,
utilizando un vernier con precisión 0,05 mm., además se determinó el peso total,
peso de partes blandas, peso del pie y peso de gónada a través de una balanza
semi-analítica digital marca Libror con precisión 0,01 gr. Para el cálculo del
índice gonadosaomático (IGS) se utilizó la siguiente formula:
( )( ) 100∗=gblandaspartesPeso
ggonadaladePesoIGS (Bretos, 1988)
Además, se realizó una descripción macroscópica de la anatomía interna de las
lapas.
Paralelamente se extrajo una porción de la gónada de aproximadamente
1 cm3, para análisis histológicos. Para el tratamiento de las muestras, cada porción
de la gónada se fijó en solución Davidson durante 24 horas. Luego, aplicando la
técnica de Martoja & Martoja-Pierson (1967), el tejido gonadal fue deshidratado
en alcohol al 70%, aclarado en xilol e incluido en parafina (punto de fusión 57°-
23
60°C ) de cada bloque se obtuvieron cortes paralelos al eje basal de la gónada de
5µm de espesor. Los cortes se tiñeron con hematoxilina férrica de Harris y eosina
acuosa amarillenta, se conservaron en refrigeración para su análisis.
3.2.-Traslado y mantención de reproductores Una vez que el IGS en la población del Totoral fue superior o igual a 12%, en
los meses de diciembre del 2001 y enero del 2002, se recolectaron 55 lapas
frutillas y 95 lapas negras con una longitud de concha superior a 60mm., las que
fueron transportadas a las dependencias de la UCN. Al llegar, fueron recibidas en
tres estanques rectangulares de 733 litros que contenían diatomeas bentónicas de
la bahía de La Herradura asentadas en su superficie (Fig. 7).
3.3.- Inducción al desove Los reproductores se limpiaron, midieron y pesaron, posteriormente se
ubicaron en una esponja húmeda durante una hora antes de someterlos a la
inducción a la evacuación de gametos. Las inducciones se realizaron en el
laboratorio húmedo, donde las lapas se mantuvieron hasta 36 horas en
observación. (Fig. 8)
Figura 8.- Estructura de madera utilizada para sostener los acuarios con circuito abierto de agua de mar para la inducción al desove.
Los métodos de inducción al desove en F. cumingi fueron los siguientes:
24
3.3.1.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno
Se utilizaron 20 acuarios, con un individuo cada uno, donde se inyecto en la
parte posterior izquierda del pie directo a la gónada un volumen de 1,0 mL de
H2O2 para esto, se utilizaron 4 concentraciones diferentes de H2O2. Estas
concentraciones fueron 1,0%, 2,0%, 3,0% y 4,0%, cada concentración se replicó
en 5 lapas. Luego de la inyección, cada lapa se ubicó en un acuario individual
donde se esperó la respuesta al inductor.
3.3.2.- Peróxido de hidrógeno (H2O) externo
Siguiendo el método que uso Morse en 1977 con Haliotis rufescens, se
utilizaron 15 acuarios de 12 litros cada uno, cada acuario con una lapa en su
interior, se subió el pH al agua de mar a 9,1, adicionando un volumen de 1,1 mL
de hidróxido de sodio (NaOH) a una concentración de 1M (mol soluto/litro de
agua destilada) por cada litro de agua de mar. Luego de 10 minutos se adicionaron
3 concentraciones diferentes de peróxido de hidrógeno, cada solución fue aplicada
a 5 acuarios. El H2O2 utilizado fue Pedrogen 30 % (PA) marca Riedel-de Haën
con PM= 34.01 gr/mol con una concentración del 30%, este fue diluido en agua
destilada para obtener concentraciones de 6%, 8% y 10%, para esto se utilizó la
formula de dilución C1*V1=C2*V2 donde C es la concentración del soluto y V
el volumen. Cada concentración fue adicionada a 5 acuarios, en volúmenes de 3
mL. por litro de agua de mar. Estas condiciones se mantuvieron por 2,5 horas,
donde transcurrido este tiempo las lapas fueron trasladadas a acuarios con agua de
mar fresca, donde se esperó la respuesta al inductor.
3.3.3 .- Luz ultravioleta
Se utilizaron 15 acuarios, previo a la inducción, se inspeccionó el equipo del
filtro de luz ultravioleta, marca Life Gard modelo QL-40 con una potencia de 40
watts y una dosis germicida aplicada de 30.000 µwatts.seg/cm2 (Fig. 9) la
inspección consistió en ver la vida útil de la lámpara y revisar en la hoja de vida
de ella cuantas horas había sido utilizada anteriormente, se limpió el tubo y las
partes internas de la tubería de PVC. El equipo se ubicó a una distancia de 20 cm.
de la estructura donde se encontraban los acuarios. Se utilizaron 3 caudales
diferentes que pasaron por la luz, estos caudales fueron 0,5 L/min, 1,0 L/min y 1,5
25
L/min, cada caudal abasteció a 5 acuarios, y las lapas se mantuvieron en estas
condiciones durante 36 horas.
Figura 9.- Equipo de luz ultravioleta utilizado durante las experiencias de inducción al desove
en F. cumingi y F. latimarginata.
Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi método de inyección
de H2O2 intra-gonadal.
Inyección intra-gonadal Estanques con individuos
H2O2 (1%)
H2O2 (2%)
H2O2 (3%)
H2O2 (4%)
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
26
Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi método externo de
aplicación de peróxido de hidrógeno (H2O2) proveniente de compuesto químico.
H2O2 diluido en el agua de mar Estanques con individuos
H2O2 (6%) externo
H2O2 (8%) externo
H2O2 (10%) externo
Esquema de experiencia realizada con Fissurella cumingi método externo de
aplicación de peróxido de hidrógeno (H2O2) proveniente de agua irradiada con luz
ultravioleta (fotólisis del agua de mar).
Caudal irradiado con luz U.V. Estanque con individuos
0.5 L/min.
1.0 L/min.
1.5 L/min.
Los métodos para la inducción a la liberación de gametos de F. latimarginata
fueron los siguientes:
3.3.4.- Cloruro de potasio (KCl)
Esta solución fue aplicada a dos grupos de 18 ejemplares, fueron inyectados
con 1 mL de KCl 0,5 M. un grupo se inyectó directo a la gónada, el otro fue
inyectado en el músculo del pie.
3.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4)
Esta neurohormona se inyectó directamente a la gónada en 12 reproductores
en una concentración de 0,2 mM en un volumen de 0,5 mL.
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
27
3.3.6.- Peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2 3%)
Un grupo de 18 reproductores fueron inyectados con H2O2 directo a la gónada
en una concentración de 3 % en un volumen de 0,5 mL.
3.3.7.- Temperatura
Para la inducción a la liberación de gametos mediante el aumento de
temperatura, se utilizó un calentador de agua que lentamente aumentó la
temperatura del agua (6,1 ºC en 7 horas), desde un valor inicial de 14,8 ºC.
3.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV)
Para el proceso de inducción a liberación de gametos mediante la utilización de
irradiación UV. El agua circulante en los estanques de mantención de
reproductores fue irradiada durante 12 hrs. en forma continua, una vez concluido
este período se mantuvo en observación durante 24 hrs. para una posible
respuesta.
Esquema de la experiencia realizada con Fissurella latimarginata
Inyección intra-gonadal H2O2 (3%)
Inyección intra-gonadal KCl (0.5M)
Inyección al pie KCl (0.5M)
serotonina + gónada
Caudal irradiado con luz U.V. 1.5 L/min
Incremento Tº 6.1ºC en 7 horas
28
3.4. Respuesta a los inductores Como criterio de respuesta a los distintos tipos de inductores físicos y
químicos de ambas especies de lapas se consideraron los siguientes aspectos:
1. ¿Existe o no evacuación de gametos?
2. Identificación de sexo del reproductor
3. Viabilidad de gametos (formas definidas o indefinidas)
4. Cantidad de gametos
5. Se midieron los ovocitos (diámetro)
6. En machos se observó motilidad efectiva y morfología de los espermios.
3.5.- Fecundación
Cuando evacuaron los gametos, se recogieron desde el fondo los ovocitos a
través de una espiga de vidrio con manguera mediante sifoneo, luego fueron
trasvasijados a un acuario limpio y tamizados (tamiz de 300 µm.) posteriormente,
se tomó una muestra para contar los huevos y según la morfología que
presentaban, se obtuvo la cantidad de huevos viables por hembra. Los criterios
para determinar la viabilidad de los huevos fueron:
• Núcleo definido
• Forma esférica del corion
Los espermatozoides fueron colectados a un vaso precipitado, determinando su
densidad por mL con un hematocitometro, se observó su movilidad y utilizando
una relación de 10 espermatozoides por ovocito aproximadamente. Se realizó la
mezcla en un acuario completándose con agua fresca. Transcurridos 15 minutos,
nuevamente fueron tamizados a 100 µm, para evitar la poliespermia y eliminar
focos de contaminación. Se contaron los huevos fecundados observando el cierre
del micropilo en la periferia del corion (Fig. 23), dando comienzo al lavado de
huevos. Transcurridos 30 minutos, cuando los huevos decantaron, se eliminaron
los huevos que permanecían flotando y se repuso el nivel de agua, estos lavados
se realizaron 5 veces. Durante todo el proceso de fecundación, se utilizó agua
microfiltrada e irradiada con luz ultravioleta.
29
Primer día
Transcurridas 24 horas postfecundación se comenzó con los cambios de aguas
los que fueron efectuados cada 6 horas en forma parcial (80% del contenido total
del acuario cada vez), dejando una densidad aproximada de 20 larvas/mL. Se
utilizaron 5 acuarios, para lo cual se ocupó un tamiz de 100 micrones sumergido
en agua para no dañar las larvas. En cada lavado, se realizó un monitoreo del
estado de las larvas y de la mortalidad con un microscopio Nikon Alphaphot ys y
un proyector de perfiles Nikon 758475. En los monitoreos también se tomaron
fotografías con un microscopio Nikon Fluophot HFX-IT con cámara Nikon FX-
35A.
Segundo día
Se continuó con cambios totales del contenido de agua de los acuarios, la que
fue vertida suavemente sobre un tamiz de 60 µm recuperando de esta forma los
huevos y larvas recién eclosionadas. Luego de ser lavados, estos fueron devueltos
al acuario con agua fresca (12 litros cada acuario). Este día también se realizó la
selección o cosecha de larvas nadantes, la que se realizó mediante sifoneo de las
larvas ya eclosionadas que se encontraban nadando en la columna de agua, estas
fueron trasladadas a otro acuario.
30
4.- RESULTADOS
La gónada es un saco multilobulado de morfología y tamaño variable,
dependiendo del estado de madurez de los ejemplares. En ambos sexos, la gónada
está bien separada de otros órganos de la masa visceral. La gónada ocupa una
posición ventral en la cavidad corporal, por debajo de la glándula digestiva y el
estómago.
En este estudio se obtuvo un total de 788 individuos de Fisurella cumingi de
las diferentes poblaciones en estudio de las cuales 399 eran machos y 389
hembras, mientras que de la especie F.latimargimata se recolectaron 796 lapas,
donde 385 fueron hembras y 411 machos, resultando una proporción sexual de 1:1
para ambas especies (Fig. 10).
Figura 10.- Proporción sexual de F. cumingi y F. latimarginata en este estudio
4.1.- Obtención del índice gonadosomático (IGS). La duración total del ciclo gonadal para lapas es de aproximadamente un año,
periodo que puede variar de acuerdo a la subespecies, condiciones climáticas y
alimentación.
Los valores de IGS obtenidos de cada muestreo se promediaron, obteniendo su
respectiva desviación estándar, y se graficaron para determinar sus variaciones.
Se estimó que las gónadas estaban maduras cuando los valores de IGS fueron
superiores al 10% en la mayoría de los casos, y que el desove se produce cuando
este IGS disminuye abruptamente. Los IGS por localidades fueron:
Proporción sexual Fissurella cumingi
HEMBRA MACHO
Proporción sexual Fissurella latimarginata
HEMBRA MACHO
31
Caleta Maitencillos
En F. cumingi como en F. latimarginata se observa que existen dos periodos
claros de reproducción durante el año, uno mas intenso que otro, se observaron en
invierno valores superiores al 6% en hembras y 10 % en machos. En verano se
observaron valores superiores a 10% en hembras de F.latimarginata, mientras que
en F. cumingi las hembras superaron el 15 %. En machos en época estival el IGS
supero el 15% en ambas especies (Fig.11 y Fig.12).
Figura 11.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en caleta Maitencillo, Región de Valparaíso (2000-2001)
0
5
10
15
20
25
Junio Ju
lio
Agosto
Septie
mbr
e
Octu
bre
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febre
ro
Marz
oAbr
il
May
oJu
nio
Meses
IGS
Hembras
Machos
Figura 12.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata en caleta Maitencillo , Región de Valparaíso (2001-2002)
-5
0
5
10
15
20
25
Junio
Julio
Agosto
Septiem
bre
Octubr
e
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febre
ro
Mar
zoAbr
il
May
oJu
nio
Meses
IGS
Hembra
Machos
32
Caleta Totoral
Se observan dos periodos de reproducción uno de mayor intensidad en enero,
donde las hembras de ambas especies alcanzan IGS del 12% y los machos
superiores al 15%, mientras que en agosto existe otro periodo donde las hembras y
machos de F.cumingi alcanzan IGS del 12% , en tanto F.latimarginata en machos
como hembras alcanza un IGS del 10%.(Fig. 13 y Fig.
14)
Figura 13.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en Caleta Totoral, Región de Coquimbo (2001 - 2002)
048
12162024283236
Junio
Agosto
Septie
mbr
e
Octubr
e
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febre
ro
Mar
zoAbr
il
May
oJu
nio
Meses
IGS Hembra
Macho
Figura 14.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata de caleta Totoral IV Región (2001 - 2002)
0
4
8
12
16
2024
28
Junio
Agosto
Septie
mbre
Octubr
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Enero
Febre
ro
Mar
zoAbr
il
May
oJu
nio
Meses
IGS Hembras
Machos
33
Caleta Totoralillo centro
Se observa para F. latimarginata un periodo reproductivo en el mes de
noviembre , donde las hembras alcanzan IGS del 10%, en tanto los machos llegan
al 12%, en marzo se observa otra alza del IGS donde los machos alcanzan un 12%
mientras que las hembras el 15%. En F.cumingi en el mes de diciembre se observa
un periodo reproductivo en que el IGS alcanza un 15% en machos como en
hembras, en el mes de marzo se alcanzo el máximo IGS muestreado, existiendo
un alza en hembras que superan el 20% y en machos superior al 15% (Fig. 15 y
Fig. 16).
Figura 15.- Valores de IGS de Fissurella latimarginata en Caleta Totoralillo Centro IV Región (2001-2002)
05
10152025
Octu
bre
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febre
ro
Mar
zoAbr
il
Mayo
Junio
Meses
IGS
Hembras
Machos
Figura 16.- Valores de IGS de Fissurella cumingi en Caleta Totoralillo Centro, Región de Coquimbo (2001-2002).
05
101520253035
Octubre
Novie
mbre
Diciem
bre
Enero
Febre
ro
Marz
oAbr
il
May
oJu
nio
Meses
IGS Hembras
Machos
34
En general, en cada uno de los lugares analizados se observó un
comportamiento similar en los valores de IGS en las dos especies estudiadas,
donde se observan valores relativamente altos en los meses de invierno (agosto),
el cual disminuye a finales de éste y comienzo de primavera, reiniciando su
ascenso alrededor de los meses de octubre y noviembre.
Los resultados muestran en todos los casos, un ciclo reproductivo continuo y
asincrónico. Con tendencia a dos temporadas de evacuación, observando que en
ambas especies para un mismo lugar los periodos de desove y gametogénesis son
similares por lo que están estrechamente ligados a los parámetros ambientales del
lugar.
Al pesar la gónada, se observó la presencia en ella del trematodo Proctoeces
spp. que en algunos casos tenia completamente parasitada las gónadas de las
lapas.
Los resultados muestran que en ambas especies y sexos el sistema reproductivo
se relaciona con el sistema excretor ya que al momento de la inducción algunos
reproductores reaccionaron con fecas inmediatas. No se detectaron diferencias
anatómicas marcadas del sistema reproductivo que permitan diferenciar las
especies inequívocamente por lo que este sistema tiene bajo valor taxonómico a
nivel específico.
4.2. Histología del ciclo reproductivo de ambas especies.
En forma general la descripción de los estados de desarrollo de los gametos
observados es la siguiente:
Hembras:
En los ovarios se distinguieron los siguientes tipos celulares: ovogonias,
ovocitos premaduros y ovocitos maduros . El desarrollo de estos citos se presenta
en forma de “racimos” originados a partir del epitelio germinativo.
Las ovogonias son células pequeñas cuyo diámetro fluctúa entre 4 y 20 µm, de
forma esférica, el citoplasma es delgado y el núcleo es grande, esférico y de
35
posición relativamente central, con la cromatina condensada en pequeños gránulos
basófilos.
Los ovocitos previtelogénicos son de tamaños que fluctúan entre 30 y 55 µm.,
Poseen un citoplasma fuertemente basófilo que se prolonga en un pedúnculo que
los mantiene unidos al epitelio germinativo, lo que les confiere un aspecto
piriforme. El núcleo es grande, esférico u ovalado. Éste ocupa una posición apical
en la célula y presenta la cromatina condensada en gránulos pequeños y difusos,
de características basófilas. El nucléolo es esférico y de posición central.
Los ovocitos premaduros son en su mayoría de forma esférica, ya que se han
desprendido del epitelio germinativo, su diámetro varía entre 60 y 90 µm. En este
estadío celular es posible distinguir el inicio de la formación de gránulos de vitelo,
los que se tiñen de un color rosado suave por ser eosinófilos. Comienza a aparecer
una cubierta gelatinosa que rodea al ovocito.
El núcleo de estas células puede encontrarse en posición central o excéntrica
con un nucléolo eosinófilo.
Los ovocitos maduros son fácilmente reconocidos en las preparaciones
histológicas, puesto que se caracterizan por la presencia de una cubierta gelatinosa
gruesa, de coloración blanca (sin respuesta a la tinción usada) que se encuentra
rodeando la cubierta vitelina. Los ovocitos maduros además, presentan un gran
vitelo fuertemente eosinófilo, con núcleo de forma irregular y de posición
generalmente central en estado de vesícula germinativa. El diámetro celular de
estos ovocitos varía entre 90 y 120 µm alcanzando los 180 µm una vez liberado,
considerando la cubierta gelatinosa y los 300 µm con la envoltura gelatinosa.
En las preparaciones histológicas de gónadas maduras, las células
predominantes son los ovocitos maduros. Debido a su gran tamaño y elevado
número en el interior del ovario, se comprimen unos a otros adoptando formas
irregulares. Por esta razón, los otros tipos celulares (ovogonias, ovocitos
previtelogénicos y ovocitos premaduros) que siempre están presentes, se
encuentran entre los ovocitos maduros y generalmente es posible observarlos sólo
cercanos al epitelio de recubrimiento de la gónada. Esta condición es una
característica clave para reconocer el grado de madurez que presentan las
36
gónadas, presencia de ovogonias en individuos inmaduros, ausencia de ellas en
individuos maduros.
Machos:
En la gónada masculina se distinguieron los siguientes tipos celulares:
espermatogonias, espermatocitos, espermátidas y espermatozoos. Estas células se
generan desde el interior de numerosas “varillas germinativas”, las cuales se
forman por evaginación del tejido conectivo denso hacia el interior del testículo.
Este tejido es rodeado por el epitelio germinativo. Las varillas se encuentran
distribuidas irregularmente en el interior de la gónada. Cada una de éstas contiene
los cuatro tipos celulares; los primeros estadíos se ubican en la porción central de
las varillas y los estadíos subsecuentes se ordenan hacia la parte externa, de tal
forma que en el extremo más distal de las varillas se localizan los espermatozoos
con sus colas dirigidas hacia el lúmen de la gónada.
Las espermatogonias son células esféricas u ovales con un diámetro promedio
que varía entre 2 y 8 µm. Poseen un núcleo esférico grande y de posición central
que presenta granulaciones basófilas; el nucléolo es grande y muy basófilo.
Los espermatocitos son células esféricas, pequeñas de aproximadamente la
mitad del tamaño de las espermatogonias. Los espermatocitos presentan núcleos
con distintos estados de concentración de la cromatina, producto de las divisiones
reductivas.
Las espermátidas son células pequeñas (1 a 2 µm.), de forma esférica que
posteriormente se hacen ovales; el núcleo es alargado u oval. La zona apical de las
células ovales es fuertemente eosinófila y marca el comienzo del desarrollo del
acrosoma.
Los espermatozoos se encuentran siempre en grandes concentraciones y se
distribuyen ordenadamente formando paquetes de espermios parecidos a una
“espiga de trigo”. La cabeza está compuesta por un acrosoma, que mide 2 µm. y
en las preparaciones histológicas se presenta intensamente eosinófilos y un núcleo
fuertemente basófilo.
Escala de madurez sexual en machos.
37
Madurez inicial: Septos gonadales con línea germinativa amplia, integrada por
espermatogonias basales, enseguida espermatocitos en varias capas en ordenación
radial centrifuga hacia el antro gonadal y eventualmente espermátidas redondas de
núcleo pequeño.(Fig. 18 A)
Madurez avanzada: septos gonadales con líneas germinativas amplias, aumentan
las espermátidas alongadas representadas por largas espigas radiales, las colas de
las espermátidas se orientan hacia el antro.(Fig. 18 B)
Madurez total: Los septos gonadales la línea germinativa es predominante, la
altura de las espigas de espermátidas alongadas es mayor que la banda radial.
(Fig. 18 C)
Evacuación inicial: Son caracteristicos los diferentes grados de desorganización
de las espigas de espermátidas alongadas, y estan siendo liberadas . el espacio es
mayor por la evacuación de espermatozoides , aun cuando se conservan masas de
espermatozoides que eventualmente van a ser evacuados de la gónada.
Evacuación total: se observa una banda de espermatogonias sustentadas en los
septos de paredes perivasculares engrosadas. (Fig.18 D)
Escala de madurez sexual en hembras
La escala de madurez gonadal utilizada distingue cuatro estados. En este
estudio, la diferenciación de estados se basó principalmente en la predominancia
de los elementos celulares durante la gametogénesis.
Los estados de madurez de las especies de fisurelidos, incluidos en este trabajo
fueron los siguientes:
38
Estado I Previtelogénesis
Abundantes ovogonias en el epitelio germinativo. Predominio de oocitos
previtelogénicos y en menor proporción de oocitos en fase temprana de la
vitelogénesis. El ovario presenta en este estado escasos ovocitos en vitelogénesis
tardía y maduros. Pared folicular generosa (Fig. 17 A).
Estado II Vitelogénesis
Predominio de ovocitos vitelogénicos tempranos y en vitelogénesis y en menor
proporción vitelogénicos tardíos. Escasos ovocitos previtelogénicos y maduros.
Pared folicular mas delgada que en estado I ( Fig. 17 B).
Estado III Madurez
Escasos ovocitos previtelogénicos y en vitelogenésis temprana. Se caracteriza
por la abundancia de oocitos maduros y en menor cantidad los oocitos
vitelogénicos tardíos. La pared folicular es nítida y delgada ( Fig. 17 C).
Estado IV Evacuación
Este estado se reconoce por el incremento en el número de oogonias y el
predominio de oocitos previtelogénicos y maduros. En menor proporción oocitos
previtelogénicos tempranos. Pared folicular más gruesa que la etapa precedente.
(Fig. 17 D)
39
4.2.1.-Histología de gónada femenina.
Figura 17.- Histología de la gónada femenina de Fissurella cumingi, se observa el estado de previtelogénesis (A), con abundantes ovocitos previtelogénicos y ovogonias (40X), en el recuadro B se observa el estado de vitelogénesis con predominio de ovocitos vitelogenicos (100X), en C se ve el estado de madurez con gran cantidad de ovocitos maduros(100X) y en D la evacuación con abundantes ovogonias y algunos ovocitos residuales(40X).
ovogonias
Ovocitos previtelogénicos
Ovocitos vitelogénicos
Ovocitos maduros
A B
C D Septo gonadal
Envoltura gelatinosa
Cubierta gelatinosa
40
4.2.2.-Histología de gónada masculina
Figura 18.- Histología de la gónada masculina de F. cumingi A) madurez inicial integrada por espermatogonias y espermatocitos en ordenación radial centrífuga alrededor del vaso sanguíneo del septo (100X). B) Madurez avanzada espermatidas avanzadas ordenadas en espigas(100X). C) Madurez total representada por abundantes y largas espigas de espermatidas avanzadas(100X). D) Evacuación total representada por espermatogonias(100X).
Espermatogonias
Espermatocitos
Espermátidas en forma de espigas
Vaso sanguíneo del septo
A B
C D
41
4.3.-Respuesta a los métodos de inducción
Fissurella cumingi
4.3.1.- Peróxido de hidrógeno externo
Sólo individuos machos respondieron al estimulo del peróxido disuelto en el
agua. Su evacuación se caracterizó por la escasa cantidad de espermatozoides, no
respondió ninguna hembra al estimulo.
4.3.2.-Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno
Al inyectar lapas con H2O2 éstas respondieron de forma positiva. Al
introducirlas al agua, emergen burbujas desde el orificio apical de la concha,
transcurridos 15 minutos en los individuos con respuesta, existió una primera
evacuación, la cual se caracterizó por la mala calidad de los gametos.
Transcurridas 12 horas, continúa la evacuación de gametos, donde la respuesta a
las distintas concentraciones se diferenció por él número de individuos con
evacuación de gametos como también la cantidad y calidad de gametos (tabla
III).
TABLA III: Cantidad y calidad de los gametos evacuados por hembras y machos de F. cumingi
frente al estimulo H2O2 interno con distintas concentraciones.
Peróxido de hidrógeno interno
1% 2% 3% 4% Total de huevos evacuados 43000 545000 1059520 31000
Total de huevos viables 18700 378600 928000 3870 Total de huevos fertilizados 7500 18930 648000 0
Cantidad espermios 250000 300000 1,44*10E8 0
Individuos inducidos 5 5 5 5 Respuesta machos 1 2 2 2 Respuesta hembras 3 3 2 2
42
4.3.2.1: Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 1%
Cuatro individuos tuvieron evacuación de gametos, las hembras desovaron
43.000 huevos, donde sólo el 43% fue viable, el macho se caracterizó por desovar
espermatozoides de mala calidad ya que su mayoría presentaba poca movilidad.
4.3.2.2: Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 2%
Existió evacuación de gametos de individuos, las hembra desovaron 545.000
huevos pero los machos desovaron espermatozoides de mala calidad. Hubo un
aborto donde los espermios, que fueron expulsados en forma de grumos, no
sobrepasaron la concha de la lapa y al observarlos al microscopio no presentaron
movilidad.
4.3.2.3: Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 3%
Con ésta concentración, existió respuesta de 4 individuos. El desove de las
hembras fue de muy buena calidad y la evacuación de gametos de uno de los
machos también, cabe señalar que acá se produjeron tenues evacuaciones de
gametos de las hembras, al cabo de 18 horas se produjo un desove sincronizado de
hembras, es decir que comenzaron a desovar las hembras al mismo tiempo y gran
cantidad de gametos al momento de encender las luces las luces del laboratorio,
régimen que se utilizó en todos los métodos de inducción.
4.3.2.4.- Peróxido de hidrógeno (H2O2) interno al 4%
Se observó evacuación de gametos, caracterizándose por la mala calidad de
éstos, sólo abortos se produjeron en machos y hembras (Fig. 19).
43
Figura 19.- Gametos femeninos abortados por Fissurella cumingi con inyección de
peróxido de hidrógeno.
4.3.3.- Agua de mar irradiada con luz ultravioleta
Ningún individuo respondió a este estimulo como muestra tabla IV.
Tabla IV: Respuestas positivas de F.cumingi a los diferentes tratamientos.
TRATAMIENTO
Lapas
estimuladas Lapas c/evacuación de gametos
Porcentaje de respuestas positiva
Peróxido hidrógeno interno
1% 5 4 (1M, 3H) 80% 2% 5 5 (2M, 3H) 100% 3% 5 4 (2M, 2H) 80% 4% 5 4 (2M, 2H) 40%
Peróxido hidrógeno externo
6% 5 1M 20% 8% 5 2M 40%
10% 5 1M 20%
Luz ultravioleta 0.5 litros/min 5 0 0% 1.0 litros/min 5 0 0% 1.5 litros/min 5 0 0%
44
Fissurella latimarginata:
4.3.4.- Cloruro de potasio (KCl)
Presentó respuestas positivas, hubo respuesta de 8 hembras y 5 machos, las
respuestas se presentaron 24 horas después de ser inyectado el químico (Tabla V).
4.3.5.- Serotonina (C14H19N502.H2 SO4)
No hubo respuesta positiva al estímulo.
4.3.6.- Peróxido de hidrógeno 3% (H2O2 3%)
La respuesta a éste inductor fue positiva, con evacuación de gametos tanto de
hembras como de machos. De 18 individuos estimulados, 8 tuvieron respuesta
positiva: 5 machos y 3 hembras (Tabla V).
4.3.7.- Temperatura
No hubo respuestas positivas para este estímulo.
4.3.8.- Agua irradiada con luz ultravioleta (UV)
Sólo hubo una respuesta de un macho para ésta estimulación, caracterizándose
por la escasa cantidad de espermios.
Tabla V: Respuestas positivas en los tratamientos de inducción al desove en lapa negra
TRATAMIENTO Lapas
estimuladas Lapas c/evacuación de gametos
Porcentaje de respuestas positiva
Peróxido hidrógeno 3% inyección a la gónada
18 8 (5M, 3H) 46%
KCl(0.5 M) inyección a la gónada
18 13 (5M, 8H) 68%
KCl(0.5 M) inyección al pie
18 0 0%
Serotonina 12 0 0% Luz ultravioleta 0,5 litros/min
12 1M 7%
Temperatura 12 0 0%
45
4.4.-Fecundación Los ovocitos de F. cumingi se caracterizaron por presentar una forma esférica,
poseyendo una envoltura gelatinosa (Fig. 20) con un diámetro promedio de
320.52 ± 9.51 µm y un diámetro sin envoltura de 222.4± 8.91 µm (n= 155), se
destaca la presencia de un micropilo entre la membrana plasmática y la cubierta
gelatinosa, el cual está encargado de permitir el paso de los espermios en la
fecundación, cuando existe fecundación, el micropilo se cierra (Fig. 21). Los
espermios son de tipo primitivo donde su región acrosomal es cónica y cuando
son viables se aprecia su gran movilidad.
Figura 20.- Partes de un gameto femenino de Fissurella cumingi, observándose la vesícula germinativa, la membrana plasmática y la cubierta gelatinosa.
Sólo con el método de inyección de H2O2 y KCL se pudieron mezclar los
gametos para observar y analizar el cierre del micropilo y posterior división
celular de los huevos, con las concentraciones de 1% y 2% existió un porcentaje
de huevos que presentaron cierre del micropilo, pero después no existió división
celular.
Al mezclar los gametos obtenidos con la inyección de H2O2 al 3%, se observó
una gran cantidad de huevos fecundados con desarrollo larval. Desde el comienzo
46
se diferenció la superioridad de la calidad de éstos con respecto a los demás
gametos obtenidos.
Figura 21.- Micropilo cerrado
47
Figura 22.- huevo no fecundado, se observa micropilo roto.
Figura 23.- Gametos fecundados.
48
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
n° de huevos
Concentraciones (%)
N° de huevos fecundados posterior a la inyección de H2O2 interno
huevos evacuados 43000 545000 1059520 31000
huevos viables 18700 378600 928000 3870
huevos fecundados 7500 18930 648000 0
1 2 3 4
Figura 24.- Gráfico que muestra la diferencia existente entre las distintas concentraciones
utilizadas en la inducción con H2O2 interno.
49
5.- DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.
La variación mensual del IGS es un buen indicador para estudiar los ciclos
reproductivos en moluscos, ya que muestra los cambios gonadales a través del año
(Grant y Tyler, 1983). Sin embargo, como único indicador debe ser utilizado
solamente cuando los ciclos de maduración son sincrónicos. Cuando el ciclo
reproductivo que se estudia es asincrónico, es necesario el uso de observaciones
histológicas para obtener una mejor comprensión del proceso reproductivo.
(Morricone, 1999).
La determinación del índice gonadosomático es una forma eficaz de determinar
el estado de madurez sexual de una población de Fissurella cumingi, en el sector
del Totoral (Región de Coquimbo) los resultados que nos entregó el IGS indican
que existen dos desoves parciales en un ciclo reproductivo continuo, teniendo un
alza en invierno (agosto) y otro mayor en verano tal como lo habían indicado
Andrade en 1995, Olguin en 1996, Bretos 1979 y Brown en 1997 encontrándose
individuos sexualmente maduros durante todo el año. Esto nos dice que en los
periodos de mayor desarrollo gonadal poblacional, vale decir, cuando el IGS es
más alto, existe mayor cantidad de individuos sexualmente maduros, época
adecuada para buscar reproductores del medio ambiente natural, mientras se busca
la forma de madurar las lapas en ambiente controlado, encontrando el alimento y
condiciones ambientales adecuadas para la maduración.
Las fluctuaciones observadas avalan la presencia de un patrón rítmico en el
cual se detectan dos desoves poblacionales en el año. No obstante, se encontraron
individuos sexualmente maduros durante todo el año, coincidente con lo señalado
50
para F. cumingi (Bretos, 1979; Brown, 1997) y F. latimarginata (Brown,1997).
Siguiendo un patrón reproductivo similar como en otra especie F. barbadensis
(Ward, 1966), que tiene dos ciclos de reproductivos.
En términos reproductivos, la fracción adulta de estas especies presenta un
ciclo continuo y asincrónico, con tendencias a dos temporadas de evacuación, las
cuales no son coincidentes entre las distintas especies a lo largo de su distribución
geográfica.
El comportamiento reproductivo en relación a la temperatura es similar a la
observada en F. máxima (Bretos et al. 1983), F. crassa (Huaquin et al. 1998) y F.
nigra (Perez et al .2007). Como se ha observado en F. latimarginata y F.
cumingi, la madurez gonadal se relaciona con cambios graduales en la
temperatura del agua de conformidad con la ley de Orton, lo que indica que un
cambio gradual en la temperatura del agua induce a la gametogénesis, mientras
que un cambio rápido provoca el desove (Giese y Pearse 1974).
Sobre la base de los resultados obtenidos para Fissurella nigra (Perez, 2007),
F. cumingi, F. latimarginata y F.crasa (Huaquin,1998) se puede concluir que los
ciclos de cría son comunes a los de arqueogastrópodos y otras especies del género
Fissurella que habitan en la costa chilena (Perez, 2007).
Los antecedentes obtenidos, tanto a nivel microscópico (histología), como
macroscópico (IGS), presentan coincidencias en la determinación de épocas de
desove. Sin embargo, se puede afirmar, que este último representa en forma
aproximada el grado de maduración, debido a que está influenciado por la
estructura de talla, de esta manera, asociando ambas fuentes de información
obtenida del estudio realizado en las localidades analizadas, se puede apreciar que
existen dos períodos de mayor intensidad de maduración y evacuación de
51
gametos, durante la época invernal y durante los meses de verano, observándose
una mayor actividad durante este último período.
La presencia en la gónada del parásito Proctoeces lintoni, se observa
predominantemente en la especie Fissurella cumingi durante todo el ciclo anual.
Esta situación podría tener efectos negativos no comprobados sobre el
rendimiento reproductivo de la especie tanto en el medio natural así como bajo
condiciones de laboratorio.
El peróxido de hidrógeno disuelto en el agua de mar induce al desove en
machos y hembras de Haliotis rufescens y Nordotis gigantea, donde el posible
mecanismo es el estímulo directo de la síntesis enzimático de la prostaglandina
endoperoxidasa (Morse et al 1977; Tanaka 1979; Hahn 1989), en Fissurella
cumingi Vega et al 1996, tuvieron éxito en el desove con H2O2 combinado con
macerado de gónada. En este experimento sólo dio resultados positivos en machos
aunque los espermios obtenidos fueron escasos y con poca motilidad.
El peróxido de hidrógeno inyectado directo a la gónada en F. cumingi y F.
latimarginata dio resultados positivos, al igual que Vega et al en 1996, en una
concentración del 3% logrando buenas fecundaciones y posteriores desarrollos
larvales en ambas especies pudiendo controlar el desove de estas especies cuando
los IGS poblacionales son altos.
Se sabe que el agua irradiada con luz ultravioleta induce al desove en varios
moluscos (Kikuchi & Uki 1974; Kagawa & Nagahama 1981;Seki 1980). Pero los
datos avalan que no es efectiva por si sola para F. cumingi y F. latimarginata
como tampoco ha sido efectivo en pruebas hechas por Moss en 1995 para Haliotis
iris.
52
La inyección de Cloruro de Potasio directo a la gónada es un buen inductor al
desove en F. latimarginata y F.crassa (Huaquin 1998), por la contracción de los
musculos lisos, ocasionando abortos en reproductores inmaduros, lo que permite
controlar el desove solo en poblaciones maduras.
La inducción al desove con agua irradiada con luz ultravioleta, mostró que en
F.cumingi no es eficaz como si lo es en otros moluscos y especialmente los del
género Haliotis perteneciente a la misma súper familia que las Fissurellas, debido
que los requerimientos fisiológicos necesitan oxidantes específicos que no son
entregados por la fotólisis del UV.
Con los resultados obtenidos con agua irradiada con luz ultravioleta y peróxido
de hidrógeno adicionado al agua de mar, se concluye que las necesidades
fisiológicas de las lapas en la ciclooxigenación del ácido araquidónico para la
conversión a endoperóxido prostaglandina y posterior biosíntesis de
prostaglandinas, no son las mismas que en otros gastrópodos del género Haliotis,
por lo cual se debe experimentar con otro tipo de oxidantes para buscar mejores
resultados (Hahn 1989).
Los resultados positivos obtenidos con inyección de peróxido de hidrógeno
pueden suponer la activación de la enzima endoperóxido prostaglandina en las
gónadas de ambas especies estudiadas, lo que produjo la evacuación de gametos.
Teniendo en cuenta que existió diferencia entre las concentraciones utilizadas,
donde la concentración mayor produjo muchos abortos, por lo cual se debe buscar
la concentración óptima.
53
La rápida descomposición del peróxido de hidrógeno, al ser inyectado en
individuos de Fissurella cumingi y F. latimarginata, no causa la muerte en ellos
ya que actúa una catalasa que descompone el H2O2 en H2O, con lo cual los
reproductores pueden ser acondicionados para futuros desoves.
Al comparar numéricamente la cantidad de huevos fecundados con las
distintas maneras de suministrar peróxido, se concluye que la concentración al 3%
fue altamente superior en cantidad y calidad debido que fue la única
concentración de H2O2 con la que se logró desarrollo embrionario. Aunque con la
concentración al 2% hubo respuesta positiva del 100% de los individuos, la
calidad de estos gametos fue baja lo que puede ser por el azar de la elección de
los reproductores. Para tener mayor seguridad del estado de la gónada y poder
diferenciarla sexualmente, se puede realizar una punción gonadal (Huaquin, 1998)
antes de la inducción y observarla al microscopio y así tener mayor éxito en la
fecundación.
A los métodos de inyección de H2O2 u otro oxidante se pueden adicionar
factores adicionales que influyen en la evacuación de gametos en lapa, como
inducirlos en oscuridad y después (tiempo determinado) aplicarles gran cantidad
de luz, ya que se comprobó con experiencias paralelas que las lapas frutillas son
fotosensibles y este estrés ayuda para el desove sincronizado de la especie en
condiciones controladas.
Al momento de la fecundación se debe tener en cuenta la edad en horas de los
espermatozoides y ovocitos, porque si estos son muy viejos la calidad de ellos
decrece y la posibilidad de fecundación también. De ahí la importancia de lograr
54
un desove sincronizado de machos con hembras. Si los espermatozoides son
evacuados antes que los ovocitos, se recomienda bajar la temperatura para así
lograr mayor cantidad de huevos fecundados.
Al comparar la eficiencia de los distintos tipos de inductores se concluye que
los mejores inductores son los químicos KCl 0.5M y H2O2 (3%) inyectados
directo a la gónada y que su respuesta es 1 – 24 horas después de inyectado el
inductor.
La comunicación del ovocito con el exterior es a través del micropilo, lugar
por donde penetra el espermatozoide para fecundarlo, la gelatina tiene poros y la
cubierta externa presenta marcas especiales observadas en microscopia de barrido
como pequeñas huellas finas de la superficie. Estas marcas, poros u otras
ornamentaciones y detalles de la cubierta de los ovocitos son especificas, es decir
cada especie tiene sus propios tipos de marcas definidas (Huaquin, 1997).
Es fundamental poder lograr la sincronización en el desove, para lo cual se
deben sumar a los inductores químicos, indicios ambientales que ocurren en el
desove y la posterior fecundación externa de las fissurellas en su ambiente natural.
55
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