infección natural de lutzomyia cayennesis cayennesis con parásitos
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Infección natural de Lutzomyia cayennesis cayennesis con parásitos tripanosomatídeos (kinetoplastida: trypanosomatidae en Los Montes de
María, Colombia.
Resumen
Se determino la presencia de flebotomíneos naturalmente infectados con parásitos tripanosomatídeos en Los Montes de María, Colombia, región endémica de leishmaniosis visceral y cutánea. Los especímenes se colectaron usando trampas de luz tipo CDC y trampas de papel con aceite de ricino. Se identifico 6 especies de Lutzomyia entre los 159 flebotomíneos recolectados.
L. evansiL. cayennensis cayennensisL. trinidadensis
L. atroclavataL. gomeziL. dubitans
Un grupo de 9 se le amplificó un segmento de DNA de 800 pb del gen que codifica el RNA de la subunidad pequeña ribosomal (ssrRNA) de la familia Trypanosomatidae.
Introducción
La leishmaniosis es una enfermedad emergente y reemergente producida por el parasito tripanosomatídeo Leishmania, el cual es transmitido al hombre por distintas especies de flebotomineos del genero Lutzomyia. Cada año se diagnostican en Colombia mas de 18000 casos nuevos de leishmaniosis. En la costa caribe colombiana, la leishmaniosis cutanea y viceral constituyen un importante problema de salud publica por carácter endemico de la region, en especial en Los Montes de Maria.
Hasta la fecha se han encontrado 9 especies flebotomineas naturalmente infectadas con Leishmania spp.
• L. longipalpis (1912)• L. evansi (1924)• L. infantum (1908)• L. spinicrassa (1969)• L. braziliensis (1911)• L. trapidoi (1952)• L. yuilli (1972)
• L. gomezi (1931)• L. panamensis (1926 y 1972)• L. umbratilis (1977)• L. guyanensis (1954)• L. hartmanni (1957)• L. colombiensis (1991)• L. cayennensis cayennensis
Métodos
Área de estudio
La investigación se desarrollo en el área rural del municipio de Ovejas. Este municipio se encuentra ubicado sobre Los Montes de María a una altura de 277 m. Sus características son bosque seco tropical, temperatura promedio 26,7 °C, y precipitaciones de 1114,8 mm anuales.
Colección e identificación de Lutzomyia spp.
Los muestreos se realizaron durante los meses de marzo y abril de 2005, con trampas de luz tipo CDC entre 18:00 y 06:00 hrs y trampas de papel impregnados con aceite de ricino, se efectuaron capturas de flebotomineos en el interior de viviendas. Los especímenes fuero preservados en etanol 70%
La cabeza, una ala y los últimos segmentos abdominales se enviaron para la clasificación taxonómica.
Extracción de ADN
De acuerdo con la taxonomía, las hembras fueron puestas en tubos de eppendorf en grupos de 2 a 9 ejemplares por especies. El DNA se extrajo. El contenido del vial fue homogenizado con un micropistilo de plastico en 60 μL de buffer de lisis e incubado a 65°C por 30 min, se adicionaron 14 μL de acetato de sodio 8 M, se incuba en hielo 30 min y se centrifuga a 13442 g por 10 min.
El sobrenadante se recolecta para la precipitación del DNA con 200 μL de etanol absoluto a 4°C durante toda la noche.
Centrifugar a 13442 rpm por 20 min, se retira el sobre nadante y el precipitado se lava con 200 μL de etanol al 70% y después con 200 μL de etanol absoluto.
El DNA se seca a temperatura ambiente, se resuspende en 50 μL de agua estéril.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Para la reaccion de amplificacion se emplearon los cebadores SSU561F y SSU561R, se amplifico un segmento de DNA de 800 pb del gen que codifica el RNA de la ssrRNA de Trypanosomatidae.
La PCR se realizo en un Vt de 25 μL que contiene un buffer de PCR 1X, 25 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Tap DNa polimerasa, 5 μL del DNA extraidoy 20 pM de cada cebador.
La mezcla fue incubada en un termociclador Hybaid PCR Express.
Se realiza una desnaturalización inicial del ADN a 94°C durante 3 min, seguido por 35 ciclos consistentes de desnaturalización por 1 min a 90°C, alineamiento durante 1 min a 50°C y extension a 72°C por 1 min, finalmente con una extension de 10 min a 72°C, se incluyo un control negativo y uno positivo constituido de ADN de Leishmania infantum.
Del producto amplificado se tomaron 12 μL que fueron mezclados con 2 μL de buffer de carga (azul de bromofenol) y analizados mediante electroforesis en gel de agarosa 1% en buffer TBE (Tris base, acido borico, EDTA) 0.5X.
Los productos se separaron durante 50 min a 80 v y se visualizaron con un transluminador de luz ultravioleta, previa tincion con 0.5 μL de bromuro de etidio.
Las muestras produjeron un producto aproximadamente 800 pb.
Resultados
Se identificaron 6 especies de Lutzomyia entre los 159 flebotomineos recolectados.
L. e
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2 1 10
159 Especies de Lutzomyia
Discusion
Se ha colectado especimenes de Lutzomyia cayennensis cayennensis infectados con promastigotes no identificados.
Se demuestra por primera vez para la region de Los Montes Maria, la ocurrencia de parasitos tripanosomatideos en Lu. cayennensis cayennensis.
En Los Montes Maria una de las especies flebotomineas mas abundantes dentro del domicillios es Lu. evansi, seguido por Lu. cayennensis cayennensis.
Este flebotomineo desempeña algun papel en el mantenimiento del ciclo de transmision de la enfermedad.