Mgter María Susana VitaliÁrea de Desarrollo de Productos y Procesos

SEGURIDAD VIRAL DE LOS DERIVADOS DEL

PLASMA HUMANO

PRIMER CONGRESO DE LA ASOCIACIÓN URUGUAYA DE TÉCNICOS EN HEMOTERAPIA

DONACION VOLUNTARIA ALTRUISTA

HEMODERIVACION PRIMARIA

HEMODERIVACION SECUNDARIA

INDUSTRIA FARMACEUTICA(más de 1000 donantes)

TECNOLOGIA DESARROLLADA

Albúmina, Gammaglobulinas , factores de la coagulación

BANCO DE SANGRE(donante único)

MÉTODOS FÍSICOS

glóbulos rojos, plasma,

plaquetas, crioprecipitado

EFICACIA TERAPEUTICA

TOLERANCIA CLÍNICA SEGURIDAD BIOLÓGICA

CALIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

SEGURIDAD HISTORIA DE TRANSMISION VIRAL

30’s: hepatitis aguda vacuna fiebre amarilla

40’s: hepatitis sérica transfusión de sangre

70’s: hepatitis a virus B sangre y hemoderivados

80’s: VIH sangre y hemoderivados

90’s: hepatitis noA-noB,

hepatitis C sangre y hemoderivados

00’s: HTLV, VHA, PV B19 sangre y hemoderivados

virus emergentes y reemergentes

VIRUS CELULAS PLASMA VIRUS CELULAS PLASMA HEMODERIVADOSHEMODERIVADOS

VIH SI SI SIVIH SI SI SIVHB SI SI SIVHB SI SI SIVHC SI SI SIVHC SI SI SIVHA SI SI SIVHA SI SI SIPV B19 SI SI SIPV B19 SI SI SICMV SI CMV SI HTLV I-II SI ? ? HTLV I-II SI ? ? VHGVHGTTVTTVVHH8 ? ? VHH8 ? ? CJDv CJDv OTROS ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?OTROS ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

VIRUS TRANSMISIBLES

SEGURIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

BANCO DE SANGRE

Donantes voluntarios Selección del adecuada del donante

Control serológico de cada unidad de sangre

INDUSTRIA FARMACEUTICA Reanálisis serológico Métodos de purificación (BPF y C) Métodos de inactivación viral Control por PCR en plasma y HD

INDUSTRIA FARMACÉUTICAINDUSTRIA FARMACÉUTICA

ALBUMINA-GAMMAGLOBULINAS- FACT. COAGULACIÓN

PLASMA reanálisis serológico

MÉTODOS DE PURIFICACION (Fraccionamiento.Alcohólico, Precipitación química, Procesos Cromatográficos)

Fracc. Alcohólico, Precipitación química, Procesos cromatográficos

MÉTODOS DE INACTIVACION VIRAL Métodos físicos y/o químicos

TÉCNICAS DE PCR

SEGURIDAD SEGURIDAD HEMODERIVADOSHEMODERIVADOS

MÉTODOS DE INACTIVACIÓN VIRAL ESPECÍFICOS

- INACTIVAR LA MAYORIA DE LOS VIRUS ENVUELTOS Y NO ENVUELTOS

- NO MODIFICAR LA ESTRUCTURA O ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA PROTEINA

- NO SER TOXICO, NO GENERAR NEOANTIGENOS

- PERMITIR EL CONTROL Y REGISTRO ADECUADOS

- PREVENIR LA CONTAMINACION CRUZADA

INACTIVACION VIRAL

INACTIVACION VIRALINACTIVACION VIRALPrincipios

ADHESION DEL VIRUS A LA CELULA VIA RECEPTOR

PENETRACION DEL VIRUS A LA CELULA DESNUDAMIENTO DEL VIRUS, EXPOSICION DEL ANv REPLICACION DEL AN viral

TRANSCRIPCION Y TRADUCCION DEL AN viral FORMACION DE NUEVAS PARTICULAS VIRALES LIBERACION AL ESPACIO EXTRACELULAR

REPLICACION VIRAL

INACTIVACION VIRAL

TRATAMIENTOS FÍSICOSTRATAMIENTOS FÍSICOS

TérmicosTérmicosPASTEURIZACION en solución (60ºC-10 h)CALENTAMIENTO SECO a 100ºC-30’ liofilizadoCALENTAMIENTO estado liofilizado con vaporCALENTAMIENTO estado liofilizado con solventes orgánicosRADIACIONES GAMMANANOFILTRACION (método de eliminación)TRATAMIENTOS QUÍMICOSTRATAMIENTOS QUÍMICOSSOLVENTE /DETERGENTE (tri-n-butíl fosfato/ tween 80- Tritón X100- 24ºC 6hs)

ACIDOS GRASOS /CAPRILATO DE SODIOBETA PROPIOLACTONA/uv

Demostrar que el método seleccionado es capaz de DISMINUIR LAS INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS TRANSMISIBLES por el plasma

VIRUS RELEVANTES: aquellos que poseen un medio celular donde detectarla infectividad de los virus transmisibles (VIH)

VIRUS MODELO:aquellos que poseen características físico-químicassimilares a los virus transmisibles (virus animales,BVDV, PVP, etc)

INACTIVACION VIRALVALIDACION

VIRUS MODELOS

VIRUS Ac. NUCLEICO

ENVOLTURA RESISTENCIA

VSV RNA SI MEDIA

PARAINFL. RNA SI BAJA

VIH RNA SI BAJA

SINDBIS RNA SI BAJA

PSEUDOR. DNA SI MEDIA

POLIO RNA NO ALTA

EMC RNA NO MEDIA

REOVIRUS RNA NO MEDIA

VHA RNA NO ALTA

SV40 DNA NO MUY ALTA

PV can/por. DNA NO MUY ALTA

1-Fracción II de Cohn

GAMMAGLOBULINAS POLIESPECÍFICAS IM Y EVGAMMAGLOBULINAS ESPECÍFICAS (Antitetánica- Anti-Rh- AntiHBs)

PASTEURIZACIÓN PASTEURIZACIÓN 60ºC- 10hs

2-Fracción IV de Cohn

ANTITROMBINA III

1º Inactivación viral

SOLVENTE / DETERGENTESOLVENTE / DETERGENTE

FACTOR VIIICOMPLEJO PROTROMBÍNICO

2º Inactivación viral

CALENTAMIENTO TÉRMICOCALENTAMIENTO TÉRMICO 100ºC - 30 minutos

Gammaglobulina y ATIII

VDVB (virus diarrea bovina VHS (virus herpes simple) PVP(parvovirus porcino)

Virus Objetivo Virus modelo FR (log)

Virus envueltos

GG / ATIII

VIH VIH >5.0 / 5.2

VHC/VHG VDVB >6.0 / 4.5

VHB VHS-1 >5.7/ 4.4

Virus no envueltos

PB19 PVP >4.0 / 4.1

VHA Polio-2 >6.5 / 4.4

Virus de la Estomatitis Vesicular

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10

Tiempo (h)

Tít

ulo

Vir

al

(lo

g)

Límite de detección VSV

Virus Polio-2

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8 10

Tiempo (h)

Tít

ulo

Vir

al

(lo

g)

Límite de detección Polio-2

CINETICA DE INACTIVACION

nd: no determinado VDVB (virus diarrea bovina VHB (virus herpes bovino) VEB enterovirus bovino

Virus 1-Solvente/

detergente

2-Calor seco

100ºC - 30´

FR (log)

1+2

Virus envueltos

VIH >5.2 >4.0 >9.2

VDVB >4.3 >4.5 >8.8

VHB >5.0 >4.1 >9.1

Virus no envueltos

PVB nd >4.5 >4.5

VEB nd >5.0 >5.0

FACTOR VIII

Inactivation of BVDV (VSV)

0

1

2

3

4

5

6

0 60 120 180 240 300 360

time [min]

viru

s tit

er

[log

10T

CID

50/m

L]

0.3% TNBP/0.2%NaDoc

0,3% TNBP/1%Triton X-100

0,3%TNBP/1,0%Tween 80

0,3%TNBP/1,0%Tween 80 (VSV)

SOLVENTE/DETERGENTEEfecto del detergente

Estudio PEI

Múltiples efectos

• Partición por ppt, adsorción

ayuda filtros

• Inactivación por etanol

• Eliminación y/o inactivación

incompleta(1- 5 log10)

• Escalado a nivel laboratorio es

difícil de lograr

Faccionamiento alcohólico

Parámetros críticos• Concentración de etanol • Temperatura, agitación• Condiciones de filtración • Condiciones de centrifugac.

Cromatografía

• Elimina virus envueltos y no envueltos • Eliminación limitada entre 1-4 log10

• Eliminación variable según el virus que se trate

• Eliminación depende capacidad del gel (uso)

• Para evitar contaminación cruzada, correcta sanitización

• Factores críticos:Tamaño de la columna, tipo de gel o matriz, velocidad de flujo, presión, conductividad, composición de la solución de elución

Virus Tamaño (nm)

HIV 80-130 HCV 40-50 HBV 40-45 HAV 28-30 Parvovirus B19

18-26

35nm

50nm

15-20nm

FibrinogenoF VIII

IgGF IX

Tamaño de poro

Factores críticos:Presión, velocidad y tiempo de flujo, carga viral a filtrar, composición de la proteína, concentración, fuerza iónica y temperatura filtración

• Aplicación depende del tamaño de la proteína a filtrar• Condiciones controladas y evitar la agregación de los virus

Producto

NANOFILTRACIÓN

CALIDAD DE MATERIA PRIMACALIDAD DE MATERIA PRIMA

CALIDAD DE LOS HEMODERIVADOSCALIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

ERRORES HUMANOS Y DE LABORATORIO

-Problemas en el sistema análisis/equipos/GLP

-Sensibilidad insuficiente de las técnicas de

control

-Entrenamiento técnico deficiente

SEROCONVERSIONES ATÍPICAS

VARIANTES VIRALES

CAMBIOS EPIDEMIOLÓGICOS

PERÍODO de “ventana serológico”

FACTORES DE RIESGO

HEMODERIVADOSHEMODERIVADOS

ALTO RIESGOALTO RIESGO BAJO RIESGOBAJO RIESGO

F I: Fb, VIII, IX y X

F II: IgsF IV y V: SPPF V: ASH

RECATEGORIZACION

HISTORIA DE USO

LARGA CORTA

ASH - SPP - IgG

F VIII, IX, CP

PCR/VHCen pooles de plasma para la en pooles de plasma para la

producción de hemoderivadosproducción de hemoderivados

IMPLEMENTACION DE NAT

• 1994 1994 Transmisión del VHC por Gammaglobulina No inactivada viralmente (PCR/VHC +)

• FDA: FDA: PCR en productos sin IV • CPMP/ICH: CPMP/ICH: SOGAT/Validación de PCR/VHC

• CPMP/UE: CPMP/UE: PCR/VHC Julio 1999 • WHO/NIBSC: WHO/NIBSC: 100 UI/ml (SI/VHC)

• PEI: PEI: PCR/VHC (Bco de Sgre- DI 5000 UI/ml)• FDA/CBER: FDA/CBER: PCR/VHC y VIH /B. Sgre/ HD/100 UI/ml

• WHO/NIBSC: WHO/NIBSC: SI VIH, VHB, B19, Multiplex. WR• FE: FE: PCR/B19 pooles de plasma para producción de anti-Rh, sensibilidad 10.000 UI/ml

CPMP: Co. de Productores. de Medicamentos de la CE- Sogat: Grupo de Trabajo. sobre la PCRCBER: Ctro de evaluación de biológicos e Investigación. NIBSC: Instituto Nacional de control y de estandares biológicos

Período ventana para VHC

23

53

70

82

98

75

45

28

16

PCR-RNA

ALT

ELISA-3

ELISA-2

ELISA-1

0 20 40 60 80 100 120Ventana (días) Acortamiento

>50días

*

• FORMAR RRHH EN Biología Molecular

• INVERSIONES EN EQUIPAMIENTO

• DISEÑO DE AREAS EXCLUSIVAS DE TRABAJO

• DESARROLLO O DISEÑO DE UN MÉTODO DE PCR

• COSTO/BENEFICIO método Automatizados vs “in house”

• OPTIMIZACIÓN EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD

• VALIDACIÓN SEGÚN REQUERIMIENTOS REGULATORIOS

• IMPLEMENTACIÓN Y LOGÍSTICA DE TRABAJO

DESARROLLO PCR

OPTIMIZACION DE PCR

Controles de amplificación (ADNc) , PCR y Nested

Validez de PCR: ausencia de amplificación del C(+) o CI contaminaciones cruzadas (PP/C (-)

Ensayos de recuperación , control de inhibidores

P500 (+) análisis por duplicado, y apertura de P100

Controles: diluciones de plasmas positivos (100/1000 UI/ml) plasmas con diferentes genotipos, CN

VALIDACIÓN “ in house”

ESPECIFICIDAD Se analizaron 100 pooles de plasma negativos para en ARN/VHC analizados en el laboratorio y pooles de plasma analizados y caracterizados por otra institución

ROBUSTEZ Variaciones en la concentración de reactivos, utilizando equipos diferentes (termocicladores) y distintos operadores, en días distintos utilizando diluciones del SI a una concentración próxima al valor del cut off. Ausencia de contaminación cruzada alternando muestras de plasmas negativas y positivas alternadas bajo estricto cuidados durante la ejecución del análisis.

STANDARD SECUNDARIO Plasma PCR/VHC (+) +) (663.876 UI/ml Amplicor HCV Monitor, Roche) Plasma analizado contra el SI: 554.452 UI/ml

Potencia relativa: dilución 10E-04 101.587,13 (60.751,26- 166.232,66)

POOL DE PLASMA DE PRODUCCION 5000 donantes 100 UI/ml) MAXI-POOLES (500 unidades)

Mini pooles (100 unidades)

ALGORITMO DE CONTROL

500 500 500 500 +500 + 500

100 100100100 +100 + 100

50 50 ++ 50 25 25 25 ++

Midi pooles (50/25 unidades)

25 unidades individuales unidad positiva (+)

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

• POEs: POE minipooles, conservación, prevención de contaminaciones cruzadas, preparaciones de referencia, equipos, controles, evaluaciones estadísticas).

• VALIDACIÓN de la PCR y de los equipos (guía ICH de validación)

• REACTIVOS: registro de todos los reactivos utilizados (Tº, Nºlote,fecha)

• CONTROLES: Control positivo, que posee una concentración equivalente a 3 veces el cut- off Control de corrida o working reagent NIBSC/WHO y controles internos (referencias secundarias) evaluados frente al SI. Control negativo, ausencia de ARN/VHC

• CONTROLES DE CALIDAD EXTERNOS: participación en programas de calidad nacional y/o internacional

• CALIFICACIÓN DEL PERSONAL: capacitación y validación trabajo realizado

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

Instituto Superior de la Sanidad de Italia

1-External Quality Assesment (EQA/3) Vox Sang 82: 211 (2002)Control de la eficiencia en la detección RNA/VHC por NAT, de las productoras de hemoderivados, laboratorios de equipos diagnósticos y bancos de sangre.

2-External Quality Assesment (EQA/4) Vox Sang 85: 114 (2003)Control de la eficiencia en la detección de los 6 genotipos principales del VHC por NAT.

3-External Quality Assesment (EQA/5) Vox Sang 87: 91 (2004)Control de la eficiencia en la detección RNA/VHC, VIH por NAT, de las productoras de hemoderivados, laboratorios de equipos diagnósticos y bancos de sangre.

Proficiency testing study of European Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines Directorate for the quality of medicines (EDQM)(EDQM)

PTS: determinación de VHC en pool de plasma (2005-2008)

MUESTRAS 20 viales con muestras duplicadas negativas y positivas con genotipos VHC 1, 3a, 4a, 6a con 100, 32, 20, 10 UI/ml

25 LABORATORIOS PARTICIPANTES15 OMCLs (autoridades de control), 10 productores de HD

RESULTADOSSatisfactorio para todos los genotipos y con excelente sensibilidad para el genotipo 3a

CONTROL DE CALIDAD EXTERNOS

PCR/B19 en pooles de plasma para la en pooles de plasma para la producción de producción de gammaglobulina anti-Rhgammaglobulina anti-Rh

0

5

10

15

20

25

30

Range B19-DNA [geq/mL]

%

PC

R-p

osit

ive P

oo

ls

< 103103-104 104-105 105-106 106-107 107-108 >108

222 of 372 pools B19-DNA positive

Schmidt et al. 2001. Vox Sang. 81:228-235

Detection of B19 DNA in Plasma Pools(PEI Study)

FE: requiere sensibilidad de 10.000 UI/ml en pool de plasma (anti-Rh)

Método semicuantitativo “ in house” Acido Nucleico es tipo ADN

SENSIBILIDAD 282 pb PCR - 101 pb Nested < 3000 UI/ml

ANALISIS DE POOLES P 100 unidades

P 50 unidades

P 25 unidades

UNIDAD POSITIVA

PARVOVIRUS B 19

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO B19 (2005-2008)

PTS 064: determinación de Parvovirus B19 en pool de plasma

MUESTRAS 1 viales 107, 2 con 105 , 1 con 104 , 2 con 103 y 1 con 102 UI/ml 1 vial con A6 (106) y muestras negativas

22 LABORATORIOS PARTICIPANTES 10 OMCLs (autoridades de control), 12 productores de HD

TÉCNICAS2 “in house”, otros automatizados y real time

RESULTADOSSatisfactorio para todas las concentraciones y detección de la variante A6

Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines (EDQM)

VIRUS EMERGENTES Enfermedades Infecciosas Emergentes

EIE a cualquier enfermedades (latente) que en las dos últimas décadas haya incrementado su incidencia en humanos: viruela, dengue y nuevas como SARS y HHV-8

CATEGORIA 1: ETT con prevalencia y/o incidencia significativa de casos documentados factor pánico público alto o bajo a la enfermedad (Chagas, HTLV I/II, VHC , WNV)

CATEGORIA 2: ETT con prevalencia y/o incidencia baja de casos documentados factor pánico público alto o bajo a la enfermedad (HHV8, B19, Dengue, vCJV)

CATEGORIA 3: ETT casos no documentados de transmisión factor pánico público alto a la enfermedad (Sars- WNV)

Profesionales de la medicina transfusional deben estar en ESTADO VIGILANTE para poder monitorear un agente emergente.

ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES

• Guerra ganada contra ENFERMEDADES INFECCIOSAS (Viruela, Lepra, Polio)• Guerra sigue pendientes: 15-25 mill pers/año mueren enfermedades infecciosas (prematuros y niños)

Enfermedades reemergentes (enfermedades nuevas que atacan nuevamente): tuberculosis, dengue, cólera, paludismo, difteria, meningitis meningocóccica, fiebre amarilla

Enfermedades emergentes: SIDA, hepatitis C y E, CJD, fiebre hemorrágica Ebola, legionelosis, criptosporidiasis, OMS Cuál es el freno ???

DETECCIÓN RÁPIDA + REACCIÓN INMEDIATA =

Resultado complejo

ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES

OMS propone:

- Mejorar la infraestructura y los sistema de salud pública

- Fomentar la formación de técnicos en epidemiología - Formar técnicos en brotes y epidemias

- Procurar que los gobiernos reaccionen con la diligencia necesaria para contener brotes y epidemias

- En lo posible intensificar las vacunaciones

PLASMAHUMANO

CONTROL MARCADORES VIRALES

MÉTODOS DE INACTIVACIÓN VIRAL

PCRCONTROL ARNv

VHC - CJDv

VIRUS EMERGENTESOtros ???......

RIESGO 0 ??

Virus del SIDA/ hepatitis NA NB

1980/1990

1990/2000

>2000

BIOSEGURIDAD

VIRUS ENVUELTOS VIRUS DESNUDOS

HEMOFILICOS

VHB (1970) Coinfecc/VHC (1980-vacunados)

VIH (1985) Inact Viral

VHC (preval. Acs elevada) Vacunación ???

VHA (Leve, más agresiva pac.VIH)

PV B19 (elevada prevalencia, crítico en pac.VIH) Vacunación??? UN PROBLEMA RESUELTO ??

IMPACTO DE LA INACTIVACION VIRAL

BANCO DE SANGREDonantes voluntariosSelección del donante

Control serológico

INDUSTRIA FARMACÉUTICAReanálisis serológico

BPFC métodos de purificación Métodos de inactivación viral/ NAT

USO TERAPÉUTICOAnálisis previo de cada caso particular

AUTOSUFICIENCIA

PASADO

marcadoresserológicosvirales

métodos deinactivación viral

PRESENTEPRESENTE

marcadoresmarcadoresserológicosserológicosviralesvirales

métodos demétodos deinactivación inactivación viralviral

NAT/VHC/VIHNAT/VHC/VIHNAT/VHB ?NAT/VHB ?NAT/B19NAT/B19

FUTUROFUTURO

marcadoresmarcadoresserológicosserológicosviralesvirales

métodos demétodos deinactivación inactivación viralviral

NAT/VHC/VIHNAT/VHC/VIHNAT/VHB/B19NAT/VHB/B19NAT/ NAT/ múltiplesmúltiplesinmunoPCRinmunoPCRDNA chipDNA chip

GRACIAS !!!

María Susana Vitali

Magister en Ciencias Químicas Área de Desarrollo de Productos y Procesos UNC-HEMODERIVADOS svitali@hemo.unc.edu.ar